암 관련 피로에 미토 콘 드리 아 기능의 역할 평가

Cancer Research

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Summary

우리의 목표는 암 환자의 피로와 관련 된 미토 콘 드 리아 기능 장애를 평가 하는 실용적인 프로토콜을 개발 했다. 이 혁신적인 프로토콜 임상 사용 관련 표준 정 및 기본적인 실험실 절차에 최적화 되어 있습니다.

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Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

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Abstract

피로 공통 이며 조건에 영향을 미치는 대부분의 암 환자를 쇠 약. 날짜 하려면, 피로 남아 제대로 없는 진단 특징을 객관적으로 측정이 상태의 심각도 테스트 합니다. 여기는 PBMCs 피로 암 환자에서 수집의 미토 콘 드리 아 기능을 평가 하기 위한 최적화 방법에 설명 합니다. 조밀한 extracellular 플럭스 시스템 및 호흡 저 해제의 순차 주사를 사용 하 여, 우리 검사 PBMC 미토 콘 드 리아 기능 상태 측정 기저 미토 콘 드리 아 호흡, 예비 호흡기 용량 및 에너지 표현 형, 설명 스트레스에 대응 하는 기본 에너지 통로. 신선한 PBMCs 표준 정을 사용 하 여 임상 설정에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 전체 분석 결과 복잡 한 생 화 확 적인 기술의 참여 없이 4 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 또한,는 재현할 수 데이터를 얻기 위해 필요한 정규화 방법에 설명 합니다. 간단한 절차 및 정규화 방법 제시 동일한 환자 및 잠재적인 치료 효과 평가 하는 시간 포인트 사이 비교 될 수 있는 재현 가능한 데이터의 생성에서 반복된 샘플 컬렉션에 대 한 허용.

Introduction

피로 암 환자1의 삶의 질에 부정적인 영향이 우세 하 고 비참 한 상태 이다. 이 날짜에 암 피로 가난 하 게 정의 된 유적과 환자2주관적인 보고에 의존. 따라서, 객관적 임상 설정3,4에서 피로 특성을 쉽게 적응 진단 실험실 테스트를 식별 하는 긴급 한 필요가 있다.

미토 콘 드리 아 기능 장애를 포함 하 여 여러 기본 메커니즘을 피로5제안 되었습니다. 미토 콘 드리 아 발전소 세포, 산화 인 산화를 통해 세포 에너지의 95%를 제공 하 고 칼슘 신호, apoptosis, 면역 신호 및 다른 세포내 신호 이벤트6 의 규칙에 중요 한 역 . 따라서 장애인된 미토 콘 드리 아 생체 및 결함 에너지 생산에 피로에 기여할 수 있습니다. 이 가설을 지원, 이전 연구는 만성 피로 증후군7환자에서 미토 콘 드리 아 DNA에 돌연변이 관찰. 피로의 병 태 생리 기원 중앙 신경 조직 또는 주변 조직, 골격 근육8,9, 같은 거짓말 여부 불분명 남아 있지만 방법은 현재 없습니다 직접 정확 하 게 평가 하 미토 콘 드 리아 기능 장애, 다 셀에 피로 관련 된.

미토 콘 드리 아 기능 연구에 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 사용 하 여 여러 가지 이점을 제공 합니다. 첫째, PBMCs는 표준 정을 사용 하 여 임상 설정에서 쉽게 사용할 수 있으며 기본적인 실험 기법을 사용 하 여 신속 하 게 격리 될 수 있습니다. 둘째, 혈액 컬렉션 수집 근육 생 검 등 다른 조직 보다 적게 침략 적 이다. 따라서, 혈액 샘플을 수집할 수 있습니다 동일한 환자에서 반복적으로 시간이 지남에, 치료 효과의 경도 평가 용이. 흥미롭게도, PBMCs에서 미토 콘 드리 아 기능 동물 모델10신장 미토 콘 드 리아 상태와 상관 잘 될 것으로 보인다. 또한, 면역 세포 미토 콘 드리 아 다른 질병 조건11,12에서 조직의 변화를 탐지 하기 위한 프록시로 사용 되었습니다. 순환 하는 면역 세포에서 미토 콘 드리 아 특히 면역성이 있는 기능에 있는 변화에 과민 하 고 면역 신호 분자 cytokines13,,1415같은 있습니다. 예를 들어 류 마티스 급성 염증 성 질병을 가진 환자에서 PBMCs 높은 기준선 산소 소비14전시 관찰 되었습니다. 반면, 산소 소비는 패 혈 증16를 포함 하 여 조직의 염증 상태 환자에서 분리 된 PBMCs에서 감소 되었다. 염증 성 조건 하에서 자유 래 디 칼 역 기능 mitochondria 제작한 더 높은 산화 스트레스와 장기 염증17에 기여할 수 있습니다. 산화 긴장에서 뿐만 아니라 에너지 생산에 미토 콘 드리 아의 역할 암 환자 13피로 공부에 대 한 프록시로 미토 콘 드리 아 기능을 사용 하 여 잠재적인 유틸리티를 나왔다.

생 화 확 적인 기술, 미토 콘 드리 아 막 잠재력 측정, 또는 임상 설정5, 에서 쉽게 적응 되지 않을 수 있습니다 특정 세포 인구의 절연을 활용 하는 미토 콘 드리 아 기능을 검사 하는 이전 연구 14,18. 최근 몇 년 동안, 세포 외 유출 분석 실험의 개발 연구자를 쉽게 허용 하 고 정확 하 게 응답 호흡 억제제19,20 의 자동된 주입으로 산소 소비 속도 (OCR)에 변화를 검사 , 21 , 그러나 22., 이러한 연구의 대부분은 특정 세포 유형에 대 한 디자인과 높은 처리량 대형 임상 설정에 적용 되지 않을 수 있습니다. 이 원고에서 우리는 임상 사용에 대 한 미토 콘 드리 아 기능을 조사 하기 위한 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다.

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Protocol

현재 연구 (NCT00852111)에 의해은 기관 검토 위원회 (IRB)의 국립 보건원의 건강 (NIH), 베 데스 다, 메릴랜드 승인 되었다. 이 연구에 등록 참가자 euthymic 남자 18 세, 이전 전립선의 유무에 관계 없이 비 전이성 전립선 암 진단을 받은 사람과 했다 외부 광속 방사선 요법 (EBRT) 받을 예정. 만약 그들이 진보적인 질병 상당한 피로 일으킬 수 있는 잠재적인 참가자 제외 됐다 지난 5 년 이내 정신 질병을 했다, 했다 교정된 hypothyroidism 또는 빈 혈, 또는 두 번째 종은 했다. 진정 제, 스테로이드, 또는 비 스테로이드 항 염증 제 대리인을 사용 하는 개인도 제외 했다. 건강 한 제어 혈액 샘플 NIH 부의 수혈 의학에는 IRB 승인 프로토콜 (NCT00001846)에서 건강 한 기증자 로부터 얻은 했다. 모든 참가자는 Magnuson 임상 연구 센터는 NIH에서 보충 했다. 서명 된 서 면된 통지 해준 동의 연구 참여 전에 얻은 했다.

1. 미토 콘 드리 아 기능 측정 준비 (실험의 1 일)

  1. 센서 카트리지 수 화 ( 재료의 테이블; 대략적인 기간을 참조: 5 분).
    1. 패키지에서 센서 카트리지를 제거 합니다. 400 μ Calibrant 솔루션으로 각 자 채우기 다음 유틸리티 플레이트의 각 음에 200 μ Calibrant 솔루션을 추가 합니다.
    2. 지금 그것에 있는 Calibrant 솔루션 유틸리티 접시에 센서 플레이트를 반환 합니다. 하룻밤 비 CO2 37 ° C 배양 기에서 카트리지를 하이드 레이트.
      참고: 센서 카트리지 4 h의 최소 및 최대 72 h 화 될 필요가 있다.

2. 임상 샘플 준비 (실험의 주 2)

  1. 13 항목 기능 평가의 만성 질환 치료-(EBRT 개시) 전에 기준선, 중간점, EBRT, 1 년제 포스트 EBRT의 완성 피로 (FACIT-F)2,23,24 를 사용 하 여 피로 측정 합니다.
    1. 0-사용 하 여 각 항목 응답, 어디 0 "전혀" 나타내고 4는 응답자에 관한 해당 문이 "대단히." 나타냅니다 4 규모 총 점수는 높은 피로 강도 반영 하는 낮은 점수와 16-53에서 범위 해야 합니다.
    2. FACIT F 점수 43, 보다 낮은 점수로 FACIT F ≥43의의 부재 또는 하지 임상-의미 있는 피로2나타내는으로 피로 정의 합니다.
      참고: 43 최고의 FACIT F 점수는 환자와 일반 인구2의 피로 점수 나눕니다.
    3. FACIT 피로 규모에 다음 13 항목을 포함: 1) 기분이 피로; 2) 나 온통; 약한 느낌 3) 기분이 무관심 ("세척 밖 으로"); 4) 나는 피곤해; 5) 나는 문제가 시작 하는 것 들 때문에 피곤; 6) 나는 문제가 피곤; 이기 때문에 일을 마무리 7) 나는 에너지; 8) 내가 내 평소 활동을 할 수 9) 나 낮; 자 필요 10) 내가 너무 피곤해 서 먹는; 11) 내가 내 평소 활동을 하 고 도움이 필요 12) 나; 하려는 일을 너무 피곤 되 고에 의해 좌절 해요 그리고 13) 나 난 피곤 때문에 내 사회 활동을 제한 하는.
  2. 갓 수집 된 혈액 샘플에서 PBMC를 분리 (대략적인 소요 시간: 1 시간).
    1. 단 세포 준비 관으로 8 mL의 혈액을 수집 ( 재료의 표참조).
      참고: 혈액 샘플 컬렉션의 2 시간 이내 처리 한다. 혈액 샘플 샘플 수집 후 2 시간 이상 처리 하는 경우 PBMCs의 품질을 손상 될 수 있습니다.
    2. 실 온 (18-25 ° C)에서 30 분 동안 1750 x g에서 원심. 15 mL 원뿔 튜브에 흐림 레이어를 전송. PBS의 15 mL를 추가 하 고 5 번 반전.
    3. 4 ° c.에 15 분 동안 300 x g에서 원심 조심 스럽게 제거 하 고 방해 펠 릿 없이 상쾌한 삭제. 다시 10 mL PBS, 추가 하 여 펠 릿을 일시 중단 하 고 5 번 반전.
    4. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기 액체 표면에 뜨는 삭제 하 고 다시 1 mL PBS에에서 셀을 일시 중단. 1.5 mL microfuge 관에는 PBMCs를 전송 합니다.
    5. 610 x g에서 10 분간 원심. 신중 하 게 상쾌한을 제거 하 고 완전 한 RPMI-1640 년에 펠 릿을 resuspend (RPMI-1640 보충 10 %FBS, 10mm 페니실린/스).
  3. 비 부착 한 세포에 대 한 셀 번호판 코트 (대략적인 소요 시간: 30 분).
    1. 세포 및 조직 접착제 솔루션을 준비 ( 재료의 표참조) 0.1 M 나트륨 중 탄산염 pH 8.0에서에서 재고 솔루션을 diluting 하 여. 작업 솔루션 3.5 μ g/c m2 의 영역에 있어야 합니다.
      참고:이 솔루션에는 해양 홍합 Mytilus 새싹에서 추출한 polyphenolic 단백질을 포함 되어 있습니다. 이 단백질은 표면에 자체를 홍합에서 분 비 하는 접착제의 주요 구성 요소. 우리는 세포 탁 PBMCs와 함께 최고의 작품을 찾을.
    2. 각 잘을 희석된 접착제 솔루션의 100 μ를 추가 하 고 실내 온도에 적어도 20 분 동안 품 어. 씻어 세 번 디 물과 공기 건조.

3. 미토 콘 드리 아 기능 측정

  1. 분석 결과 미디어의 준비 (대략적인 소요 시간: 10 분).
    참고: 분석 결과 미디어 준비 되어야 한다 갓 실험의 날에.
    1. L-글루타민, pyruvate, 및 포도 당 미디어 (동일한 성분 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 하지 않고 탄산, 포도 당, 글루타민, 또는 나트륨 pyruvate) 기반 분석 결과 미디어를 추가 합니다. 미디어를 따뜻하게 37 ° c, pH 7.4에 조정.
      참고: L-글루타민, pyruvate, 및 포도 당 농도 일반적으로 정상적인 성장 미디어, 농도와 동일 하지만 분석 결과에 따라 조정 될 수 있다.
  2. PBMCs 미토 스트레스 테스트에 대 한 준비 (대략적인 소요 시간: 2 시간).
    1. 각 잘 80-90 %confluency 도달에 2 단계에서에서 충분 한 PBMCs를 접시. 우리의 경험에서 1.5 x 105 셀/잘 가장 일관 된 결과 얻지 못했다.
      참고: 웰 스 A와 H 배경 우물 이며, 분석 결과 미디어 셀 포함. 스 B g, outliers를 담당 하기 위해 환자 샘플 당 적어도 3-6 우물을 도금 하는 것이 좋습니다.
    2. 우물의 바닥에 셀 수 있도록 2 분 200 x g에서 내려 접시를 회전 합니다. 한 번 분석 결과 미디어와 세포를 씻어. 이 단계는 성장 매체에서 혈 청 및 나트륨 중 탄산염을 제거합니다.
      참고: 우리의 경험에서 세척 단계 일반적으로 제거 됩니다 셀의 20-30%.
    3. 45-60 분에 대 한 비 CO2 37 ° C 배양 기에서 배경 웰 스 A와 헤 품을 포함 하 여 각 음에 180 μ 분석 결과 미디어를 추가 합니다.
  3. 미토 스트레스 테스트 실행
    1. 마약 분석 결과 미디어와 미토 스트레스 키트에 다음과 같이 다시 구성:
      1. Oligomycin: 50 μ M에서 재고 솔루션을 생성 하기 위해 유리병에 252 μ 분석 결과 미디어를 추가 합니다.
      2. FCCP: 50 μ M에서 재고 솔루션을 생성 하기 위해 유리병에 분석 결과 미디어의 288 μ를 추가 합니다.
      3. Antimycin A /로 테 논: 25 μ M에서 재고 솔루션을 생성 하기 위해 유리병에 분석 결과 미디어의 추가 216 μ.
    2. 소용돌이 약 1 분간 약을 재구성 된다. 작업 솔루션으로 희석.
      참고: 작업 솔루션의 농도 적정 및 셀 유형에 따라 실험 전에 미리 결정 되어야 한다. PBMCs, 우리 찾을 Oligomycin의 그 1 μ M, 1 μ M FCCP, 그리고 0.5 μ M antimycin A로 테 논 최고 작동 /.
    3. 약 플라스틱 센서 카트리지에서 각 포트에 순차적으로:
      1. 포트 a: 10 μ M의 피 펫 20 μ Oligomycin, 1 μ M의 각 음에 최종 농도 대 한.
      2. 포트 b: 피 펫 22 μ 1 μ M의 각 음에 최종 농도 10 μ M FCCP의.
      3. 포트 c: 5 μ M antimycin A의 피 펫 25 μ / 0.5 μ M의 각 음에 최종 농도 대 한로 테 논.
  4. 세포 외 유출 악기에 "미토 스트레스 테스트"를 선택 합니다. 악기 프롬프트를 따라을 센서 카트리지를 삽입 합니다. 악기는 자동으로 센서 캘리브레이션을 수행 합니다. 센서 교정 및 악기 분석 결과의 나머지를 완료 것입니다 셀 플레이트를 삽입 합니다. 530에서 산소 역학 측정 nm (여기) / 650nm (방출), 470에 양성자 농도 측정은 nm (여기) / 530 nm (방출).

4입니다. 미토 콘 드리 아 기능 데이터의 정규화

  1. 셀 확산 분석 결과 솔루션 준비 (대략적인 소요 시간: 5 분).
    1. 48 μ 핵 산 얼룩 (500 x)와 240 μ 배경 억압 11.7 mL PBS 추가 (2 배). 핵 산 얼룩 셀 permeant DNA 바인딩 염료 이며 배경 억압은 죽은 셀 또는 셀에서 얼룩이 되 고 손상 된 세포 막 무결성을 차단 마스크 염료. DNA 묶는 염료와 배경 억압의 조합은 라이브 셀은 스테인드 보장 합니다.
    2. 미토 스트레스 테스트 완료 된 후에 각 잘 매체에 직접 작업 솔루션 (180 μ) x 2의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
  2. 45-60 분 계량 508에서 플레이트 리더에 라이브 셀 (형광)의 수에 대 한 37 ° C 배양 기에서 세포 확산 분석 결과 솔루션의 셀을 품 어 nm (여기) / 527 nm (방출) OCR 데이터를 정규화 (대략적인 소요 시간: 10 분) .
    참고: 숫자 라이브 셀 이외에 선택할 수 있습니다 또한 셀의 총 수, 핵 산, 단백질 농도, 등등의 그들의 데이터를 정상화.

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Representative Results

미토 스트레스 테스트는 완전 한 미토 콘 드리 아 프로 파일을 매핑하는 데 다양 한 호흡 억제제의 순차 주사 후 산소 소비 속도 (OCR) 측정에 의존 합니다. 미토 콘 드리 아 건강에 관련 된 OCR 측정 후 각 약물 주입 다음 매개 변수를 계산 하는 데 사용 수: 기저 OCR 은 먼저 쉬고 레벨 ATP 수요를 충족 하는 데 필요한 산소 소비를 평가 하기 위해 어떤 약물 주입 하기 전에 측정. 기초 호흡 oligomycin 주입 전에 OCR 기준선에서 비-미토 콘 드리 아 호흡 속도 빼서 계산 됩니다. 다음, oligomycin ATP synthase (복잡 한 V)의 양성자 채널을 억제 하기 위해 주입 됩니다. Oligomycin 주입 후 OCR에 후속 드롭 ATP 생산 관련 산소 소비를 나타냅니다. FCCP (Carbonyl 시안 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), 양성자 기온 변화도 및 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 방해 하는 데 사용 되는 ionophore은 극대 산소 소비를 유도 하는 데 사용. 최대한 호흡 FCCP 주사 후 최대 OCR에서 비-미토 콘 드리 아 호흡을 빼서 계산 됩니다. 예비 호흡기 용량 최대한 및 기초 호흡의 차이입니다. 마지막으로, antimycin (복잡 한 III 억제제)와 테 논 (복잡 한 나 억제제) 전자 전송 체인을 동시에 주사 된다. 정의 함으로써, 비-미토 콘 드리 아 호흡 전자 수송 체인 (예를 들어, 비-미토 콘 드 리아 NADPH 산화 효소 세포, .) 독립적 이며 antimycin A 후 OCR 값으로 표시 됩니다 /로 테 논 주입. 커플링 효율 ATP 합성에 사용 되는 기저 미토 콘 드 리아 산소 소비량의 일부분을 설명 하 고 (ATP 생산 관련 OCR) x 100%로 계산 됩니다 /(basal respiration rate).

각 자란 상태에 대 한 셀 밀도 미토 스트레스 테스트를 수행 하기 전에 최적화 되어야 합니다. 우리의 경험에서는, 80-90% confluency 1.5 x 105 셀/잘 인간의 혈액 (그림 1A)에서 갓 격리 된 PBMCs의 도금에 의해 이루어집니다. 이 도금 밀도 단계 3.2.3에서에서 설명 된 세척 단계에 대 한 계정. 최적의 도금 밀도 결정, 이외 FCCP 적정 최대한 OCR을 생성 하는 데 필요한 농도 결정 하기 위해 수행 되어야 합니다. FCCP에 농도 테스트-0.125 μ M, 0.25 μ M, 0.5 μ M, 1 μ M, 고 2 μ M-OCR FCCP 농도에서 1 μ M, 고원 도달 증가 하지만 2 μ M (그림 1B)에서 감소. 이 1 μ M은 PBMC 미토 콘 드리 아 기능을 검토를 위해 사용 해야 하는 최적의 FCCP 농도 나타냅니다.

PBMC 격리 후 여러 시간 지점에서 건강 한 기증자 로부터 수집 된 동일한 혈액 샘플에서 세포의 동일한 배치의 미토 콘 드리 아 기능 테스트. 기저 산소 소비로 최대한 OCR로 3 h로 하 고 PBMC 절연 (그림 2A) 후 5와 8 h 감소 계속 감소. 3 h 후 최대한 호흡 FCCP 주입 (시간 점 7-9) 하 여 elicited 라이브 세포 에서도 미토 콘 드리 아 여분의 시간이 지남에 따라 빠르게 호흡 용량이 감소 하는 것을 건의 하는 기저 OCR을 초과 하지 않았다. 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 동시에 세포 외 유출 악기에 측정 했다. 에너지 수요를 충족 하 고 산화 인 산화를 통해 ATP 생산의 부족에 대 일 분 이내 분해 모집 oligomycin 억제 미토 콘 드리 아 ATP synthase, 이후 oligomycin 후 ECAR의 급속 한 증가 의해 표시 된 대로 사출입니다. 3 h PBMC 격리 후 일찍 ECAR로 OCR (그림 2B) 감소가 했다. 비록 우리가 PBMC 격리 후 1, 3, 5, 및 8 h 세포 생존 능력에 있는 어떤 주목할 만한 변화를 관찰 하지 않았다, 미토 콘 드 리아 기능 감소, 타이밍 열쇠 라이브, 다 PBMCs의 미토 콘 드리 아 프로필 캡처를 제안.

다양 한 시간에 별도 일;에서 발생 하는 경향이 환자 샘플 모음 따라서, 다른 샘플 및 시간 포인트 비교 데이터를 정상화 하는 것이 결정적 이다. 단백질 같은 다른 정규화 방법 분석 결과 및 핵 산의 정량화를 사용할 수 있습니다, 하는 동안 우리는 라이브 셀에 각 잘 녹색 형광 세포의 정량화와 DNA 바인딩 염료 착 색 하는 것이 가장 효율적이 고 신뢰할 수 있는 정규화는 찾을 방법입니다. 두 개의 별도 일 두 명의 다른 건강 한 기증자 로부터 수집 하는 PBMCs의 대표적인 데이터는 그림 3에 나와 있습니다. 삽입은 잘 보여주는 총 셀 (단계 대비)과 라이브 셀 셀 플레이트의 대표 이미지 스테인드 DNA 바인딩 염료 (형광 그린)와 미토 스트레스 테스트 후. 각 약물 주입 라이브 셀으로 정규화 후 산소 소비 뿐 아니라 기저 산소 소비 속도, 2 명의 다른 건강 한 피로 비 기증자 (그림 3)에서 유사 했다.

피로 주제의 대표적인 미토 콘 드 리아 기능 데이터 (FACIT F 점수 < 43) 전립선 암 (빨간색)와 나 이/성별/인종-일치 비 피로 건강 한 기증자 (블루) 그림 4에 나와 있습니다. 비록 우리가 기저 OCR (그림 4B)에 어떤 차이 관찰 하지 않았다, 전시 피로 주제 컨트롤 (그림 4C, D)에 비해 예비 호흡기 용량으로 최대 산소 소비량 감소. 비-미토 콘 드 리아 산소 소비 (그림 4E), ATP 관련 산소 소비 (그림 4F)에 차이가 있기 때문에 피로 예비 호흡기 용량에서 감소에 관련 된 출연 또는 커플링 효율 (그림 4G). (이전 어떤 약물 주입)의 초기 계획 데이터와 FCCP 주입의 존재에 선호 통로 (OCR 산화 인 산화 ECAR 분해 대)를 계시 하는 에너지 형 플롯을 사용 하 여 구상 될 수 있다 후 최대한 호흡 증가 에너지 수요 (그림 4H). 빈 사각형 표시 기저 에너지 형 이며 고체 사각형 최대한 ATP 수요에 대응에 에너지 표현 형. 기저 (빈 사각형)와 최대 (단색 정사각형) 사이의 거리 반면 기울기 나타냅니다 산화 인 산화 분해 대 향해 셀룰러 환경 예비 용량을 나타냅니다. 그림 4H같이 예비 용량 감소 피로 주제에 비 피로 건강 한 제어에 비해. 또한, 에너지 표현 형에 대 한 응답에서 건강 한 컨트롤 (그림 4H)에 비해 피로 주제에 분해 쪽으로 기울어진 ATP 수요 증가.

Figure 1
그림 1 : PBMC 도금 밀도 및 FCCP 복용량 응답 곡선. (A) 갓 절연 PBMCs CellTak 코팅 셀 문화 miniplates에서 105 셀/잘 x 1.5에서 도금 했다. 세척 후 미디어 변경, 셀 80-90 %confluency 균등 하 게 배포 했다. 눈금 막대 100 μ m =. (B) OCR 0.125 μ M, 0.25 μ M, 0.5 μ M, 1 μ M에 도달 피크 OCR FCCP의 농도 증가 함께 증가. OCR는 1 μ M는 PBMCs.Error 바에서 최대한 호흡을 유도 하는 최적의 복용량 초기 약물 주입 후 3 연속 측정의 표준 편차를 나타내는 나타내는 2 μ M에 떨어졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 2
그림 2 : 미토 콘 드리 아 호흡은 갓 격리 된 PBMCs에 시간이 지나면서 감소합니다. OCR (A) 뿐만 아니라 ECAR (B) PBMC 격리 후 시간이 지남에 따라 빠르게 감소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 3
그림 3 : 대표 미토 콘 드리 아 호흡 데이터 정규화. 미토 스트레스 테스트는 다른 일에 두 명의 다른 건강 한 지원자에서 고립 되 고 형광 플레이트 리더에 계량 형광 핵 산 얼룩을 사용 하 여 정규화 신선한 PBMCs를 사용 하 여 수행 되었다. 삽입: 라이브 셀 (녹색)의 대표 이미지와 잘에서 셀 (단계 대비) 총. 눈금 막대 1000 μ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 4
그림 4 : 건강 한 통제에 비해 피로 주제의 대표 분석. (A) 대표 미토 스트레스 테스트 OCR 그래프는 나 이/성별/인종-일치 비 피로 건강 한 제어에 비해 피로 주제. 막대 그래프의 기저 OCR (B), 최대한 호흡 (C), 예비 호흡기 용량 (D), 미토 콘 드 리아 비 산소 소비 (E), ATP에 생산 (F), 그리고 커플링 효율 (G) 에 표시 됩니다. 피로 주제와 건강 한 컨트롤의 에너지 형 플롯 (H)표시 됩니다. 빈 사각형 표시 기준 에너지 표현 형, 고체 사각형 스트레스 에너지 형 FCCP 주입 후 측정을 나타냅니다. 오차 막대는 각 연구 참가자에 대 한 3 다른 우물의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

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Discussion

암 환자의 피로 잘 정의 되지 않은 또는 특징1쇠 약 조건입니다. 피로의 진단은 전적으로 주관적인 보고에 의존 하며 현재 진단 표준 또는 그것의 pathobiology2에 대 한 이해의 부족 때문에 주로이 조건에 대 한 치료. 암 환자에서 피로 기본 제안 된 메커니즘의 미토 콘 드 리아 기능에서 장애는 가장 치료 대상 경로 중 하나입니다. 따라서, 우리 임상 샘플 사전 개발을 일찍 피로를 포함 하 여 암 치료 관련 독성 위험 환자를 식별 하는 데 사용할 수 있는 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하기 위한 신속 하 고 실용적인 방법을 개발 관리는 제정 될 수 있다.

호흡 억제제의 순차 주사와 함께에서 세포 외 유출 기술 미토 콘 드 리아 기능 상태 평가 대 한 허용 사용 되었습니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo 모델19, 20,21. 우리 작업의 기존 본문 확장 하 고 임상 샘플에 미토 콘 드 리아 기능 장애의 검사를 위해 최적화 된 방법을 개발. 연구의 장점은 소형 세포 외 유출 분석기의 활용입니다. 와 같이 우리는, 실험의 타이밍은 중요 한 신선한 PBMCs의 격리 후 인간의 혈액에서. 큰 체재 (96-잘 또는 24-잘 형식)은 높은 처리량 실험에 대 한 이상적인 선택 이다, 하는 동안 8 웰 스를 포함, 소형 세포 외 유출 시스템 각 환자 샘플19의 개별 평가 대 한 수 있습니다. 이 메서드는 더 실용적이 고 (악기 자체에 관한와 분석 결과 수행 하는 데 사용 하는 시 약), 비용 효율적인 샘플 수집 다른 환자에서 다양 한 시간에 다른 일에서 발생 하는 경향이 있기 때문에.

피로 암 환자에서 미토 콘 드리 아 기능을 평가 하는 PBMCs의 이용에는 여러 이점이 있다: 1) 골격 근육 같이 직물의 생 검 수 있습니다 실제 시간에; 2) PBMCs 쉽게 사용할 수 있으며 쉽게 격리 될 수 있습니다 셀 준비 튜브를 사용 하 여 임상 설정;에 실질적인 이점을 제공 하 그리고 3) 우리는 미토 콘 드리 아 기능 감소 갓 고립 된 세포에서 문화 3 시간 이상이 고 몇 시간 (3 시간 이상)은 일반적으로 특정 세포 유형 분리 후 증명 하고있다. 따라서 실시간 미토 콘 드 리아 기능 측정의 정확성을 보장 한 시간 PBMCs는 준비 될 수 있습니다. 그러나 이전 새롭거나 환자 집단에서 초기 임상 조사에 대 한 PBMCs를 사용 하는 것이 좋습니다, T 세포, 혈소판, 호 중구, 및 monocytes 등 다른 세포 유형 또한 사용할 수 있습니다 현재 프로토콜 최적화 후 밀도 호흡 억제제 농도15,,2526도금.

새로운 시스템에서 미토 콘 드리 아 기능을 테스트 하기 전에 먼저 최적의 셀 밀도 FCCP 농도 결정 하는 것이 중요입니다. 우리의 경험에서 잘 당 105 셀 x 1.5 도금 사용 셀 밀도 도금 및 세척 단계 남아 80-90% 합칠 후. 또한, 그것은 모든 세포 유형에 대 한 최적의 FCCP 농도 결정 하는 중요 한입니다. FCCP 범위 농도 테스트 해야 하 고 셀의 상태를 손상 없이 최대한 OCR 생산 FCCP 농도 사용 해야 합니다. 테스트 하는 농도에서 FCCP의 1 μ M PBMCs에서 최대한 호흡 결과. 또 다른 중요 한 단계는 미토 콘 드리 아 호흡 방울으로 실험의 타이밍 가파르게 PBMC 격리 후 3 시간. 이 임상 샘플에서 미토 콘 드리 아 기능을 정확 하 게 잡으려고 샘플 수집 후 3 시간 이내 미토 스트레스 테스트를 수행 해야 함을 의미 합니다. 그것은 많은 연구자만 냉동된 샘플에 대 한 액세스는 지적 가치가 있다입니다. 우리는 이전 중지 및 재개, 후 PBMCs을 테스트 하 고 이러한 세포의 미토 콘 드리 아 기능 크게 손상 됩니다. 따라서, 가능 하면 임상 연구에서 PBMCs 절연 갓을 사용 하 여 하는 것이 좋습니다.

재현할 수 데이터 생성의 또 다른 중요 한 측면은 데이터 정규화 방법입니다. 일부 실험실 BCA 단백질 정량화 미토 콘 드리 아 호흡 데이터 정규화를 사용 하 여 성공 했다, 그러나 우리는 아니에요 항상 낮은 세포 밀도에 특히 적합 찾으십시오. 이 프로토콜에서 설명 하는 정규화 방법을 핸드폰 번호와 염료-핵 산 단지의 형광 방출 사이의 선형 상관 관계에 의존 하며 정확 하 게 10 ~ 50, 000 셀27을 정할 수 있습니다. 또한, 형광 핵 산 얼룩 및 형광 플레이트 리더의 조합을 사용 하 여 정규화는 실험의 완료 후에 살아있는 세포의 급속 한 정량화에 대 한 수 있습니다. 또한,이 방법은 trypsinization 부착 셀 또는 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 필요 하지 않습니다.

프로토콜의 경고는 우리가 분리가 되지 않아 PBMCs 특정 세포 유형으로 미토 콘 드 리아 기능 분석을 수행 하기 전에. 살펴본 바와 같이 있다 미토 콘 드리 아 호흡 PBMC 격리 후 시간이 지남에 따라 빠르게 감소 합니다. 이 환자 간의 차이 실험 다른 세포 인구를 분리 후 수행한 경우 정확한 수는 일반적으로 몇 시간 소요 제안 합니다. PBMCs 같은 혼합된 인구를 공부 하 고 중요 한 셀 형식 관련 정보를 공개 하지 않습니다, 비록 PBMCs를 사용 하 여 실험에서 얻은 정보 가이드 미래 기계 조사 특정 세포 유형에 초점을 도울 수 있다. PBMCs는 암 피로10,28등 전신 질환에 관련 된 조직의 미토 콘 드 리아 기능 장애에 대 한 프록시 역할. 현재 원고에 설명 된 프로토콜만 관측의 원인을 정확히 파악 하지 않고 원유 미토 콘 드 리아 기능 장애 측정을 제공 합니다. 따라서, 발견이 기술 및 절차를 사용 하 여 주의 하 여 해석 해야 하 고 같은 다른 동작 (예를 들어, 우울증, 수 면, 인지 장애)의 동시 발생 피로의 multifactorial 특성을 고려해 야 하 고 조건 (예: 심폐 상태, polypharmacy). 미래 연구는 미토 콘 드리 아 기능 특정 세포 유형 (예: 자연 킬러 세포, T 림프 톨, monocytes) 및 다양 한 임상 인구에 있는 변경 검토 해야 (예: 피로/비-피로 암 환자와 건강 한 컨트롤)입니다. 그것은 현재 원고의 범위를 넘어, 우리 암 피로 심각도 및 미토 콘 드리 아 역 기능, 뿐만 아니라 미토 콘 드리 아 기능 측정 및 피로 같은 물리적 테스트 간의 상관 관계 사이 연결을 결정할 것입니다. 6 분 도보 시험, 미래에 조사. 또한, 미래 연구 또한 다양 한 암 종류에 걸쳐 피로 미토 콘 드 리아 기능 장애에 연관 인지 결정 하기 위하여 다른 암 종류에 있는 미토 콘 드리 아 역 기능을 검사 합니다. 결론적으로, 우리는 임상 샘플을 사용 하 여 일반 미토 콘 드 리아 장애의 빠른 평가 위해 최적화 된 프로토콜을 개발 했습니다. 더 기계 조사가 쇠 약 상태에 있는 특정 경로의 참여를 정확 하 게 수행할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 연구는 완전히 사단 교내 연구의 국립 연구소의 간호 연구 NIH, 베 데스 다, 메릴랜드의에 의해 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

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Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

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