कैंसर से संबंधित थकान में Mitochondrial समारोह की भूमिका का मूल्यांकन

Cancer Research

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Summary

हमारा लक्ष्य कैंसर रोगियों में थकान से जुड़ी mitochondrial शिथिलता का मूल्यांकन करने के लिए एक व्यावहारिक प्रोटोकॉल विकसित करना था । इस अभिनव प्रोटोकॉल नैदानिक केवल मानक phlebotomy और बुनियादी प्रयोगशाला प्रक्रियाओं को शामिल उपयोग के लिए अनुकूलित है ।

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Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

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Abstract

थकान एक आम और दुर्बल हालत है कि सबसे अधिक कैंसर रोगियों को प्रभावित करता है । तारीख करने के लिए, थकान खराब नहीं नैदानिक परीक्षण के साथ विशेषता के लिए होना चाहए इस हालत की गंभीरता को मापने रहता है । यहां हम थका हुआ कैंसर रोगियों से एकत्र PBMCs के mitochondrial समारोह का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन । एक कॉंपैक्ट extracellular फ्लक्स प्रणाली और श्वसन अवरोधकों के अनुक्रमिक इंजेक्शन का उपयोग करना, हम बेसल mitochondrial श्वसन, अतिरिक्त श्वसन क्षमता को मापने के द्वारा PBMC mitochondrial कार्यात्मक स्थिति की जांच की, और ऊर्जा phenotype, जो वर्णन करता है पसंदीदा ऊर्जा मार्ग तनाव का जवाब । ताजा PBMCs मानक phlebotomy का उपयोग नैदानिक सेटिंग में आसानी से उपलब्ध हैं । पूरे इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख जटिल जैव रासायनिक तकनीकों की भागीदारी के बिना कम से 4 घंटे में पूरा किया जा सकता है । साथ ही, हम reproducible डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है एक सामान्यीकरण विधि का वर्णन करें । सरल प्रक्रिया और सामांयीकरण तरीके प्रस्तुत करने के लिए एक ही रोगी और reproducible डेटा है कि समय अंक के बीच की तुलना में संभावित उपचार प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है की पीढ़ी से दोहराया नमूना संग्रह के लिए अनुमति देते हैं ।

Introduction

थकान एक प्रचलित और चिंताजनक स्थिति है जिसका कैंसर रोगियों के जीवन की गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है1. इस तिथि करने के लिए, कैंसर थकान खराब परिभाषित रहता है और केवल रोगियों द्वारा व्यक्तिपरक रिपोर्टिंग पर निर्भर करता है2। इसलिए, नैदानिक सेटिंग3,4में थकान विशेषता के लिए एक आसानी से अनुकूलनीय नैदानिक प्रयोगशाला परीक्षण की पहचान करने के लिए एक तत्काल जरूरत है.

कई अंतर्निहित तंत्र, mitochondria शिथिलता सहित,5थकान पैदा करने के लिए प्रस्तावित किया गया है । Mitochondria बिजलीघर organelles, ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के माध्यम से सेलुलर ऊर्जा की जरूरत के ९५% प्रदान कर रहे हैं, और कैल्शियम सिग्नलिंग, apoptosis, प्रतिरक्षा संकेतन, और अन्य intracellular संकेतन घटनाओं के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा6 . तदनुसार, बिगड़ा mitochondrial ऊर्जा उत्पादन में ऊर्जावान और दोषों थकान में योगदान कर सकते हैं । इस परिकल्पना का समर्थन, पिछले अध्ययनों क्रोनिक थकान सिंड्रोम7के साथ रोगियों में mitochondrial डीएनए में उत्परिवर्तनों मनाया है । हालांकि यह स्पष्ट नहीं है कि क्या थकान के pathophysiological मूल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र या परिधीय ऊतकों, कंकाल की मांसपेशियों के रूप में8,9के भीतर निहित है, वहां वर्तमान में कोई सीधा तरीका सही आकलन है जी, respiring कोशिकाओं में थकान से संबंधित mitochondrial शिथिलता.

mitochondrial समारोह का अध्ययन करने के लिए परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) का उपयोग कई लाभ प्रदान करता है । सबसे पहले, PBMCs मानक phlebotomy का उपयोग कर नैदानिक सेटिंग में आसानी से उपलब्ध हैं और जल्दी से बुनियादी प्रयोगशाला तकनीकों का उपयोग कर अलग किया जा सकता है. दूसरा, रक्त संग्रह इस तरह के एक मांसपेशी बायोप्सी के रूप में अन्य ऊतकों को इकट्ठा करने से कम आक्रामक है । इस प्रकार, रक्त के नमूनों को समय के साथ एक ही रोगी के बार से एकत्र किया जा सकता है, जो उपचार प्रभाव के अनुदैर्ध्य आकलन की सुविधा । दिलचस्प है, PBMCs में mitochondrial समारोह में अच्छी तरह से एक पशु मॉडल में गुर्दे mitochondrial स्थिति के साथ संबंधित होना दिखाई दिया10. इसके अलावा, प्रतिरक्षा कोशिका mitochondria अलग रोग की स्थिति11,12के तहत प्रणालीगत परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया गया है । परिसंचारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं में Mitochondria विशेष रूप से प्रतिरक्षा कार्यों में परिवर्तन और प्रतिरक्षा संकेत अणुओं जैसे साइटोकिंस13,14,15के रूप में संवेदनशील होते हैं । उदाहरण के लिए, यह देखा गया है कि तीव्र आमवाती भड़काऊ रोगों के साथ रोगियों से PBMCs उच्च आधारभूत ऑक्सीजन खपत14प्रदर्शन. इसके विपरीत, ऑक्सीजन की खपत पूति16सहित प्रणालीगत भड़काऊ शर्तों के साथ रोगियों से अलग PBMCs में कम किया गया था । भड़काऊ शर्तों के तहत, बेकार mitochondria द्वारा उत्पादित मुक्त कण आगे ऑक्सीडेटिव तनाव और लंबे समय तक सूजन17में योगदान कर सकते हैं । ऊर्जा उत्पादन में mitochondria की केंद्रीय भूमिका के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में ऑक्सीडेटिव तनाव कैंसर रोगियों में थकान का अध्ययन करने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में mitochondrial समारोह का उपयोग कर के संभावित उपयोगिता पता चलता है 13

पिछले mitochondrial समारोह का परीक्षण अध्ययन जैव रासायनिक तकनीक का उपयोग किया, mitochondrial झिल्ली संभावित माप, या विशिष्ट कोशिका आबादी के अलगाव कि नैदानिक सेटिंग5में आसानी से अनुकूलनीय नहीं हो सकता है, 14,18. हाल के वर्षों में, extracellular फ्लक्स परख के विकास के शोधकर्ताओं ने अनुमति दी है आसानी से और सही ऑक्सीजन खपत दर में परिवर्तन की जांच (ओसीआर) श्वसन अवरोधकों के स्वचालित इंजेक्शन के लिए जवाब में,20 , 21 , 22. हालांकि, इनमें से अधिकांश अध्ययनों को विशिष्ट कक्ष प्रकारों के लिए डिज़ाइन किया गया है और बड़े उच्च-प्रवाह स्वरूप एक नैदानिक सेटिंग में लागू नहीं हो सकता है । इस पांडुलिपि में, हम नैदानिक उपयोग के लिए mitochondrial समारोह की जांच के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन ।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन (NCT00852111), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH), बेथेस्डा, मैरीलैंड के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया था । इस अध्ययन में नामांकित प्रतिभागियों euthymic पुरुषों, उंर के 18 साल या पुराने, जो गैर के साथ या पूर्व prostatectomy के बिना मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर के साथ का निदान किया गया और बाह्य बीम विकिरण चिकित्सा (EBRT) प्राप्त करने के लिए निर्धारित किया गया । संभावित प्रतिभागियों को बाहर रखा गया था अगर वे एक प्रगतिशील बीमारी है कि महत्वपूर्ण थकान पैदा कर सकता था, पिछले पांच वर्षों के भीतर मनोरोग रोग था, हाइपोथायरायडिज्म या एनीमिया, या एक दूसरे द्रोह था सुधारा था । शामक, स्टेरॉयड, या गैर-स्टेरॉयड विरोधी भड़काऊ एजेंटों का इस्तेमाल करने वाले व्यक्तियों को भी बाहर रखा गया । स्वस्थ नियंत्रण रक्त के नमूने एक आईआरबी-अनुमोदित प्रोटोकॉल (NCT00001846) के तहत स्वस्थ दाताओं से चढ़ाए गए दवा के NIH विभाग में प्राप्त किए गए । सभी प्रतिभागियों को NIH में Magnuson नैदानिक अनुसंधान केंद्र में भर्ती कर रहे हैं । हस्ताक्षरित लिखित सूचित सहमति अध्ययन की भागीदारी से पहले प्राप्त किया गया था ।

1. Mitochondrial समारोह माप तैयारी (प्रयोग के दिन 1)

  1. हाइड्रेट सेंसर कारतूस ( सामग्री की तालिकादेखें; अनुमानित अवधि: 5 min) ।
    1. पैकेज से सेंसर कारतूस निकालें । उपयोगिता थाली के प्रत्येक कुआं में २०० μL Calibrant समाधान जोड़ें, तो ४०० μL Calibrant समाधान के साथ प्रत्येक खाई भरें ।
    2. उपयोगिता थाली है, जो अब इसमें Calibrant समाधान है सेंसर प्लेट लौटें । एक गैर में कारतूस हाइड्रेट-सह2 ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन रातोंरात ।
      नोट: सेंसर कारतूस की जरूरत है 4 एच की एक ंयूनतम और ७२ एच की एक अधिकतम के लिए हाइड्रेटेड ।

2. नैदानिक नमूना तैयारी (प्रयोग के दिन 2)

  1. जीर्ण बीमारी चिकित्सा के 13-मद कार्यात्मक मूल्यांकन का उपयोग थकान उपाय-थकान (FACIT-F)2,23,24 बेसलाइन पर (EBRT दीक्षा से पहले), मध्यबिंदु और EBRT के पूरा होने, और 1 साल के बाद EBRT ।
    1. प्रत्येक आइटम प्रतिक्रिया के लिए एक 0-4 पैमाने का उपयोग करें, जहां एक 0 का प्रतिनिधित्व करता है "बिल्कुल नहीं" और एक 4 इंगित करता है कि प्रतिवादी इसी बयान "बहुत बहुत से संबंधित है." कुल स्कोर 16-53 से कम स्कोर उच्च थकान तीव्रता को प्रतिबिंबित के साथ, सीमा चाहिए ।
    2. एक FACIT-एफ ४३ से कम स्कोर के रूप में थकान को परिभाषित, ≥ ४३ के एक FACIT-f स्कोर के साथ या नहीं नैदानिक-सार्थक थकान2की अनुपस्थिति का संकेत ।
      नोट: एक FACIT-एफ ४३ का स्कोर सबसे अच्छा कैंसर रोगियों और आम जनता की आबादी की थकान स्कोर को विभाजित करता है2
    3. FACIT थकान स्केल में निम्नलिखित 13 आइटम शामिल करें: 1) मैं थका हुआ महसूस करता हूं; 2) मैं सब कुछ कमजोर लग रहा है; 3) मैं ("बाहर धोया") सूची में लग रहा है; 4) मैं थका हुआ महसूस करता हूं; 5) मैं मुसीबत शुरू बातें है क्योंकि मैं थक गया हूं; 6) मैं मुसीबत चीजें खत्म है क्योंकि मैं थक गया हूं; 7) मैं ऊर्जा है; 8) मैं अपने सामांय गतिविधियों करने में सक्षम हूं; 9) मैं दिन के दौरान सोने की जरूरत है; 10) मैं भी खाने के लिए थक गया हूं; 11) मैं अपने सामांय गतिविधियों कर रही मदद की जरूरत है; 12) मैं भी बातें मैं करना चाहता हूं थक जा रहा द्वारा निराश हूं; और 13) मैं अपने सामाजिक गतिविधि सीमा है क्योंकि मैं थक गया हूं ।
  2. हौसले से एकत्र रक्त नमूनों से PBMC को अलग (अनुमानित अवधि: 1 ज) ।
    1. एक Mononuclear कोशिकाओं तैयारी ट्यूब में रक्त की 8 मिलीलीटर लीजिए ( सामग्री की तालिकादेखें).
      नोट: रक्त के नमूनों को संग्रह के 2 ज के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए । PBMCs की गुणवत्ता से समझौता किया जा सकता है अगर रक्त के नमूने नमूना संग्रह के बाद 2 से अधिक एच संसाधित कर रहे हैं.
    2. (18-25 डिग्री सेल्सियस) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए १,७५० x g पर केंद्रापसारक । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए बादल परत स्थानांतरण । पंजाब के 15 मिलीलीटर और उलटा 5 बार जोड़ें ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । ध्यान से हटाने और परेशान गोली के बिना supernatant त्यागें । फिर से 10 मिलीलीटर पंजाबियों को जोड़कर गोली निलंबित, और 5 बार पलटना ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । 1 मिलीलीटर पंजाब में तरल supernatant और पुन: निलंबित कक्षों को छोड़ें । PBMCs को १.५ एमएल microfuge ट्यूब पर ट्रांसफर करें ।
    5. 10 मिनट के लिए ६१० x g पर केंद्रापसारक । ध्यान से निकालें supernatant और पूरा RPMI में गोली reसस्पेंड-१६४० (RPMI-१६४० 10% FBS के साथ पूरक, 10 mM पेनिसिलिन/Streptomycin) ।
  3. कोट गैर अनुयाई कोशिकाओं के लिए सेल प्लेटें (अनुमानित अवधि: 30 मिनट) ।
    1. सेल और ऊतक चिपकने वाला समाधान तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) ०.१ एम सोडियम बिकारबोनिट पीएच ८.० में शेयर समाधान कमजोर द्वारा. कार्य समाधान सतह क्षेत्र के ३.५ μg/2 पर होना चाहिए ।
      नोट: इस समाधान में समुद्री कौड़ी, Mytilus edulisसे निकाले गए polyphenolic प्रोटीन होते हैं । इन प्रोटीन कौड़ी द्वारा स्रावित गोंद के प्रमुख घटक खुद को लंगर सतहों के लिए कर रहे हैं । हम पाते है कि सेल-आजतक PBMCs के साथ सबसे अच्छा काम करता है ।
    2. एक अच्छी तरह से पतला चिपकने वाला समाधान के १०० μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर कम से 20 मिनट के लिए गर्मी । DI पानी और हवा सूखी के साथ तीन बार धो लें ।

3. Mitochondrial फ़ंक्शन माप

  1. परख मीडिया की तैयारी (अनुमानित अवधि: 10 मिनट) ।
    नोट: परख मीडिया प्रयोग के दिन पर नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए ।
    1. L-glutamine, पाइरूवेट, और ग्लूकोज बेस मीडिया (Dulbecco है संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के रूप में एक ही घटक है, लेकिन बिना किसी भी सोडियम बिकारबोनिट, ग्लूकोज, glutamine, या सोडियम पाइरूवेट) को परख मीडिया बनाने के लिए जोड़ें । गर्म ३७ डिग्री सेल्सियस तक मीडिया, तो ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें ।
      नोट: एल की सांद्रता-glutamine, पाइरूवेट, और ग्लूकोज आमतौर पर सामान्य विकास मीडिया में सांद्रता के रूप में ही कर रहे हैं, लेकिन परख के आधार पर समायोजित किया जा सकता है.
  2. मिळो तनाव परीक्षण के लिए PBMCs तैयार (अनुमानित अवधि: 2 ज) ।
    1. प्लेट पर्याप्त PBMCs चरण 2 में से एक अच्छी तरह से ८० तक पहुंचने के लिए-९०% प्रवाह । हमारे अनुभव में, १.५ x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से सबसे सुसंगत परिणाम झुकेंगे ।
      नोट: वेल्स एक और एच पृष्ठभूमि कुओं है और केवल कोई कोशिकाओं के साथ परख मीडिया शामिल होना चाहिए । कुओं में बी टू जी, हम outliers के लिए खाते में आदेश के अनुसार रोगी के नमूने प्रति कम से 3-6 कुओं चढ़ाना सलाह देते हैं ।
    2. स्पिन प्लेटें 2 मिनट के लिए २०० एक्स जी में नीचे की कोशिकाओं को कुओं के नीचे का पालन करने की अनुमति है । एक बार परख मीडिया के साथ कोशिकाओं को धो लें । इस चरण में ग्रोथ मीडिया से सीरम और सोडियम बिकारबोनिट निकलता है ।
      नोट: हमारे अनुभव में, वाशिंग चरण विशेष रूप से कक्षों की 20-30% निकालता है ।
    3. जोड़ें १८० μL परख एक अच्छी तरह से, एक गैर में पृष्ठभूमि वेल्स a और H. की मशीन सहित-CO2 ३७ ° c मशीन ४५-६० मिनट के लिए ।
  3. चल मिळो तनाव परीक्षण
    1. इस प्रकार के रूप में परख मीडिया के साथ मिळो तनाव किट में दवाओं का पुनर्गठन:
      1. Oligomycin: शीशी में २५२ μL परख मीडिया जोड़ें ५० माइक्रोन पर एक शेयर समाधान उत्पंन करने के लिए ।
      2. FCCP: शीशी में २८८ परख मीडिया के μL जोड़ें ५० माइक्रोन पर एक शेयर समाधान उत्पंन करने के लिए ।
      3. Antimycin/रोटेनोन: जोड़ें २१६ परख मीडिया के μL शीशी में 25 माइक्रोन पर एक शेयर समाधान उत्पंन करने के लिए ।
    2. भंवर लगभग 1 मिनट के लिए दवाओं का पुनर्गठन किया । काम के समाधान में पतला ।
      नोट: कार्य समाधान की सांद्रता कक्ष प्रकार के आधार पर प्रयोग करने से पूर्व titrated और पूर्व निर्धारित की जानी चाहिए । PBMCs के लिए, हम पाते है कि Oligomycin के 1 माइक्रोन, 1 माइक्रोन FCCP, और ०.५ माइक्रोन antimycin ए/रोटेनोन सबसे अच्छा काम करते हैं ।
    3. पिपेट सेंसर कारतूस में प्रत्येक बंदरगाह में दवाओं क्रमिक:
      1. बंदरगाह एक: पिपेट 10 माइक्रोन Oligomycin के 20 μL, 1 माइक्रोन के प्रत्येक कुआं में एक अंतिम एकाग्रता के लिए.
      2. पोर्ट बी: पिपेट 10 माइक्रोन FCCP के 22 μL, 1 माइक्रोन के प्रत्येक कुआं में एक अंतिम एकाग्रता के लिए.
      3. पोर्ट C: पिपेट 25 μL की 5 माइक्रोन antimycin a/रोटेनोन के प्रत्येक कुआं में एक अंतिम एकाग्रता के लिए ०.५ माइक्रोन.
  4. एक extracellular फ्लक्स उपकरण पर "मिळो तनाव परीक्षण" का चयन करें । उपकरण प्रॉम्प्ट का पालन करें और सेंसर कारतूस डालें. साधन स्वचालित रूप से सेंसर अंशांकन प्रदर्शन करेंगे । सेंसर अंशांकन के बाद सेल प्लेट डालें, और साधन परख के बाकी खत्म हो जाएगा । ऑक्सीजन गतिशीलता ५३० एनएम (उत्तेजना)/650nm (उत्सर्जन) पर मापा जाता है, और प्रोटॉन एकाग्रता ४७० एनएम (उत्तेजना)/५३० एनएम (उत्सर्जन) पर मापा जाता है ।

4. Mitochondrial फ़ंक्शन डेटा का सामान्यीकरण

  1. सेल प्रसार परख समाधान तैयार (अनुमानित अवधि: 5 मिनट) ।
    1. जोड़ें ४८ μL न्यूक्लिक एसिड दाग (500x) और २४० μL पृष्ठभूमि शमन करने के लिए ११.७ एमएल पंजाब (2x) । न्यूक्लिक एसिड दाग एक सेल permeant डीएनए बाध्यकारी डाई है, और पृष्ठभूमि दमन एक मास्किंग डाई जो मृत कोशिकाओं या कोशिकाओं के साथ समझौता सेल झिल्ली अखंडता दाग जा रहा से ब्लॉक है । डीएनए के संयोजन-बाध्यकारी डाई और पृष्ठभूमि शमन सुनिश्चित करता है कि केवल जीवित कोशिकाओं दाग रहे हैं ।
    2. 2x काम समाधान (१८० μL) के बराबर मात्रा में सीधे माध्यम में एक अच्छी तरह से एक के बाद मिळो तनाव परीक्षण पूरा हो गया है जोड़ें ।
  2. ४५-६० मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में सेल प्रसार परख समाधान की उपस्थिति में कोशिकाओं को मशीन । ५०८ एनएम (उत्तेजना) पर एक प्लेट रीडर पर जीवित कोशिकाओं (फ्लोरोसेंट) की संख्या यों तो बढ़ाता है/527 एनएम (उत्सर्जन) और मानक ओसीआर डेटा (अनुमानित अवधि: 10 मिनट) .
    नोट: संख्या लाइव कोशिकाओं के अलावा, उपयोगकर्ताओं को भी कोशिकाओं की कुल संख्या, न्यूक्लिक एसिड की मात्रा के साथ अपने डेटा को सामान्य करने के लिए चुन सकते हैं, प्रोटीन सांद्रता, आदि

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Representative Results

मिळो तनाव परीक्षण एक पूरा mitochondrial प्रोफ़ाइल नक्शा करने के लिए विभिंन श्वसन अवरोधकों के अनुक्रमिक इंजेक्शन के बाद ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) को मापने पर निर्भर करता है । प्रत्येक दवा इंजेक्शन के बाद ओसीआर माप mitochondrial स्वास्थ्य से संबंधित निम्नलिखित मापदंडों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: बेसल ओसीआर पहले किसी भी दवा इंजेक्शन से पहले मापा जाता है करने के लिए आराम स्तर एटीपी मांग को पूरा करने की जरूरत ऑक्सीजन की खपत का आकलन. बेसल श्वसन oligomycin इंजेक्शन से पहले आधारभूत ओसीआर से गैर mitochondrial श्वसन दर घटाई द्वारा गणना की जाती है । अगले, oligomycin के लिए एटीपी सिंथेस (जटिल वी) के प्रोटॉन चैनल को बाधित इंजेक्शन है । oligomycin इंजेक्शन के बाद ओसीआर में बाद ड्रॉप एटीपी उत्पादन से संबंधित ऑक्सीजन की खपतका प्रतिनिधित्व करता है । FCCP (Carbonyl साइनाइड 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), एक ionophore प्रोटॉन ढाल और mitochondrial झिल्ली की क्षमता को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया, तो अधिक से अधिक ऑक्सीजन की खपत को बटोरने के लिए प्रयोग किया जाता है । अधिक से अधिक श्वसन FCCP इंजेक्शन के बाद अधिकतम ओसीआर से गैर mitochondrial श्वसन घटाया द्वारा गणना की है । स्पेयर श्वसन क्षमता अधिक से अधिक और बेसल श्वसन के बीच का अंतर है । अंत में, antimycin एक (परिसर III अवरोध करनेवाला) और रोटेनोन (जटिल मैं अवरोध करनेवाला) एक ही समय में इंजेक्शन के लिए बंद इलेक्ट्रॉन परिवहन चेन बंद कर रहे हैं । परिभाषा के अनुसार, गैर mitochondrial श्वसन इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला से स्वतंत्र है (जैसे, मैक्रोफेज में गैर mitochondrial NADPH oxidase, आदि) और antimycin ए/रोटेनोन इंजेक्शन के बाद ओसीआर मूल्यों के रूप में प्रतिनिधित्व किया है । युग्मन दक्षता एटीपी संश्लेषण के लिए प्रयुक्त बेसल mitochondrial ऑक्सीजन की खपत के अंश का वर्णन करता है, और १००% x (एटीपी उत्पादन से संबंधित ओसीआर)/(बेसल श्वसन दर) के रूप में गणना की जाती है ।

प्रत्येक संवर्धन हालत के लिए सेल घनत्व एक मिळो तनाव परीक्षण प्रदर्शन करने से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए । हमारे अनुभव में, ८०-९०% के प्रवाह को चढ़ाना द्वारा प्राप्त की है १.५ x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से अलग PBMCs के मानव रक्त से (चित्रा 1एक) । चरण 3.2.3 में वर्णित धुलाई चरण के लिए यह चढ़ाना घनत्व खातों । इष्टतम चढ़ाना घनत्व का निर्धारण करने के अलावा, FCCP अनुमापन को अधिक से अधिक ओसीआर उत्पंन करने की आवश्यकता एकाग्रता निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए । FCCP सांद्रता का परीक्षण किया-०.१२५ माइक्रोन, ०.२५ माइक्रोन, ०.५ माइक्रोन, 1 माइक्रोन, और 2 माइक्रोन-ओसीआर FCCP एकाग्रता के साथ वृद्धि हुई 1 माइक्रोन पर एक पठार तक पहुँचने, लेकिन 2 माइक्रोन पर कम (चित्रा 1बी). यह इंगित करता है कि 1 माइक्रोन इष्टतम FCCP एकाग्रता है कि PBMC mitochondrial समारोह की जांच के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

हम एक ही रक्त PBMC अलगाव के बाद विभिंन समय अंक पर एक स्वस्थ दाता से एकत्र नमूना से कोशिकाओं के एक ही बैच के mitochondrial समारोह का परीक्षण किया । बेसल ऑक्सीजन खपत के रूप में अच्छी तरह के रूप में अधिक से अधिक के रूप में अधिक से अधिक के रूप में 3 एच और PBMC अलगाव के बाद 5 और 8 एच में कमी जारी रखा ओसीआर (चित्रा 2) । 3 एच के बाद, अधिक FCCP इंजेक्शन (समय अंक 7-9) द्वारा बटोरा श्वसन बेसल ओसीआर से अधिक नहीं था, सुझाव है कि जीवित कोशिकाओं में भी, mitochondria अतिरिक्त श्वसन क्षमता समय के साथ तेजी से कम हो जाती है. Extracellular अंलीकरण दर (ीकार) एक साथ एक Extracellular फ्लक्स साधन पर मापा गया था । चूंकि oligomycin mitochondrial एटीपी सिंथेस को रोकता है, glycolysis मिनट के भीतर भर्ती है ऊर्जा की मांग को पूरा करने के लिए और ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के माध्यम से एटीपी उत्पादन की कमी के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, के रूप में ीकार में तेजी से वृद्धि के द्वारा प्रदर्शन के बाद oligomycin इंजेक्शन. PBMC अलगाव के बाद के रूप में 3 एच के रूप में जल्दी, वहां ीकार में कमी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ओसीआर (चित्रा 2बी) था । यद्यपि हम सेल व्यवहार्यता में 1, 3, 5 पर किसी भी उल्लेखनीय परिवर्तन का पालन नहीं किया, और 8 PBMC अलगाव के बाद एच, mitochondrial समारोह में तेजी से कमी आई, सुझाव है कि समय के लिए जीना, respiring PBMCs के mitochondrial प्रोफ़ाइल पर कब्जा कुंजी है ।

रोगी नमूना संग्रह अलग दिनों पर विभिन्न समय पर होने के लिए करते हैं; इस प्रकार, यह विभिंन नमूनों और समय अंक की तुलना करने के लिए डेटा को सामान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि ऐसे प्रोटीन परख और न्यूक्लिक एसिड ठहराव के रूप में अंय सामांय तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है, हम पाते है कि एक डीएनए बाध्यकारी डाई और प्रत्येक अच्छी तरह से हरी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के ठहराव के साथ धुंधला रहने कोशिकाओं को सबसे कुशल और विश्वसनीय सामांय है विधि. दो अलग दिनों पर दो अलग स्वस्थ दाताओं से एकत्र PBMCs के प्रतिनिधि डेटा चित्रा 3में दिखाया गया है । इनसेट एक सेल प्लेट की एक प्रतिनिधि छवि अच्छी तरह से कुल कोशिकाओं (चरण इसके विपरीत) और जीने के डीएनए के साथ दाग कोशिकाओं को दिखा रहा है (हरी फ्लोरोसेंट) के बाद मिळो तनाव परीक्षण । बेसल ऑक्सीजन की खपत दर, साथ ही ऑक्सीजन की खपत प्रत्येक दवा इंजेक्शन के बाद जीवित कोशिकाओं को दो अलग स्वस्थ गैर में समान थे-थका दाताओं (चित्रा 3).

प्रतिनिधि mitochondrial एक थका विषय के समारोह डेटा (FACIT-F स्कोर < 43) प्रोस्टेट कैंसर के साथ (लाल) और एक उंर/लिंग/जाति-मिलान गैर थका हुआ स्वस्थ दाता (नीला) चित्रा 4में दिखाए जाते हैं । हालांकि हम बेसल ओसीआर (चित्रा 4बी) में किसी भी अंतर का पालन नहीं किया, थका हुआ विषय नियंत्रण की तुलना में अधिक से अधिक ऑक्सीजन की खपत में कमी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अतिरिक्त श्वसन क्षमता (चित्रा 4सी, डी) । थकान स्पेयर श्वसन क्षमता में कमी से संबंधित होने के लिए दिखाई दिया, क्योंकि वहां गैर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत (चित्रा 4), एटीपी से संबंधित ऑक्सीजन की खपत (चित्रा 4एफ) में पाया मतभेद थे, या युग्मन दक्षता (चित्रा 4जी) । आधारभूत डेटा (किसी भी दवा इंजेक्शन से पहले) और FCCP इंजेक्शन के बाद अधिक से अधिक श्वसन एक ऊर्जा phenotype साजिश है, जो पसंदीदा मार्ग (ओसीआर ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण बनाम ीकार glycolysis) से पता चलता है का उपयोग कर visualized किया जा सकता है वृद्धि की उपस्थिति में ऊर्जा की मांग (चित्रा 4एच) । खाली चौकों बेसल ऊर्जा phenotype संकेत और ठोस चौकों अधिक से अधिक एटीपी मांग के जवाब में ऊर्जा phenotype संकेत मिलता है । बेसल (खाली वर्ग) और अधिक से अधिक (ठोस वर्ग) के बीच की दूरी स्पेयर क्षमता इंगित करता है, जबकि ढलान ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण बनाम glycolysis के प्रति सेलुलर वरीयता इंगित करता है । के रूप में चित्रा 4एचमें दिखाया गया है, थकान विषय में अतिरिक्त क्षमता गैर थकान स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में कमी हुई । इसके अलावा, ऊर्जा phenotype के जवाब में वृद्धि की एटीपी मांग स्वस्थ नियंत्रण (चित्रा 4एच) की तुलना में थकाने वाले विषय में glycolysis की ओर विषम ।

Figure 1
चित्र 1 : PBMC चढ़ाना घनत्व और FCCP खुराक-प्रतिक्रिया वक्र(क) हौसले से पृथक PBMCs पर चढ़ाया गया १.५ x 105 कोशिकाओं CellTak-लेपित कोशिका संस्कृति miniplates में/ धोने और मीडिया बदलने के बाद, कोशिकाओं को समान रूप से ८०-९०% प्रवाह में वितरित किया गया । स्केल बार = १०० माइक्रोन । (ख) ओसीआर ०.१२५ माइक्रोन, ०.२५ माइक्रोन, ०.५ माइक्रोन पर FCCP की सांद्रता बढ़ाने के साथ वृद्धि हुई, 1 माइक्रोन पर चोटी ओसीआर तक पहुँचने. ओसीआर 2 माइक्रोन पर गिरा, यह दर्शाता है कि 1 माइक्रोन इष्टतम खुराक के लिए PBMCs में अधिक से अधिक श्वसन में लाना है. त्रुटि पट्टियों प्रारंभिक दवा इंजेक्शन के बाद 3 अनुक्रमिक माप के मानक विचलन इंगित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्र 2 : Mitochondrial श्वसन समय के साथ हौसले से अलग PBMCs में कम हो जातीहै । ओसीआर (क) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ीकार (ख) PBMC अलगाव के बाद समय के साथ तेजी से कमी आई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्र 3 : प्रतिनिधि सामांय के साथ श्वसन डेटा mitochondrial । मिळो तनाव परीक्षण विभिंन दिनों पर दो अलग स्वस्थ स्वयंसेवकों से अलग ताजा PBMCs और एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर पर एक फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग quantified का उपयोग कर सामान्यीकृत प्रयोग किया गया । इनसेट: एक कुआं में जीवित कोशिकाओं (हरा) और कुल कोशिकाओं (चरण कंट्रास्ट) की एक प्रतिनिधि छवि । स्केल बार = १,००० माइक्रोन कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 4
चित्र 4 : एक थकान विषय के प्रतिनिधि विश्लेषण एक स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में(क) प्रतिनिधि मिळो तनाव परीक्षण एक थका हुआ विषय के ओसीआर ग्राफ एक उंर की तुलना में/लिंग/दौड़-गैर थकान स्वस्थ नियंत्रण मिलान । बेसल ओसीआर के बार रेखांकन (ख), अधिक से अधिक श्वसन (ग), स्पेयर सांस की क्षमता (डी), गैर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत (ई), एटीपी उत्पादन (एफ), और युग्मन दक्षता (जी) दिखाया गया है । थकाने वाले विषय और स्वस्थ नियंत्रण के ऊर्जा phenotype प्लाट को दिखाया गया है (H). खाली चौकों आधारभूत ऊर्जा phenotype संकेत, ठोस चौकों बल दिया ऊर्जा का प्रतिनिधित्व phenotype FCCP इंजेक्शन के बाद मापा । त्रुटि पट्टियां प्रत्येक अध्ययन भागीदार के लिए 3 विभिंन कुओं के मानक विचलन को इंगित करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

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Discussion

कैंसर के रोगियों में थकान एक दुर्बल हालत है कि अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है या1विशेषता है । थकान का निदान पूरी तरह से व्यक्तिपरक रिपोर्टिंग पर निर्भर करता है और इस हालत के लिए कोई वर्तमान नैदानिक मानक या उपचार है, काफी हद तक इसके pathobiology में समझ की कमी के कारण2. प्रस्तावित कैंसर रोगियों में थकान अंतर्निहित तंत्र की, mitochondrial समारोह में हानि सबसे चिकित्सकीय लक्षित रास्ते में से एक है । इसलिए, हम नैदानिक नमूनों में mitochondrial समारोह को मापने के लिए एक त्वरित और व्यावहारिक विधि विकसित की है कि लगातार रोगियों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-थकान सहित कैंसर के उपचार से संबंधित विषाक्तता के विकास के लिए जोखिम, ताकि जल्दी प्रबंधन की स्थापना की जा सकती है ।

श्वसन अवरोधकों के अनुक्रमिक इंजेक्शन के साथ संयोजन में extracellular फ्लक्स प्रौद्योगिकी mitochondrial कार्यात्मक स्थिति के आकलन के लिए अनुमति देते हैं और दोनों में इन विट्रो के लिए इस्तेमाल किया गया है और vivo मॉडल19 में , 20,21. हम काम के मौजूदा शरीर का विस्तार किया और नैदानिक नमूनों में mitochondrial शिथिलता की परीक्षा के लिए अनुकूलित विधि विकसित की है । अध्ययन का एक लाभ कॉंपैक्ट extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग है । जैसा कि हम प्रदर्शन किया है, प्रयोग के समय मानव रक्त से ताजा PBMCs के अलगाव के बाद महत्वपूर्ण है । जबकि बड़ा प्रारूप (९६-अच्छी तरह से या 24-अच्छी तरह से प्रारूप) एक उच्च प्रवाह प्रयोग के लिए आदर्श विकल्प है, कॉंपैक्ट extracellular फ्लक्स प्रणाली है, जो 8 कुओं शामिल हैं, प्रत्येक रोगी नमूना19के व्यक्तिगत मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । इस विधि और अधिक व्यावहारिक और लागत प्रभावी है (दोनों साधन के संबंध में ही और एजेंट को परख प्रदर्शन करते थे), क्योंकि विभिंन रोगियों से नमूना संग्रह के लिए विभिंन दिनों में विभिंन समय पर होते हैं ।

PBMCs का उपयोग थका हुआ कैंसर रोगियों में mitochondrial समारोह का आकलन करने के लिए कई फायदे हैं: 1) ऐसे कंकाल की मांसपेशियों के रूप में ऊतकों की बायोप्सी समय पर अव्यावहारिक हो सकता है; 2) PBMCs आसानी से उपलब्ध हैं और आसान सेल तैयारी ट्यूबों, जो एक नैदानिक सेटिंग में एक व्यावहारिक लाभ प्रदान करता है का उपयोग कर अलग किया जा सकता है; और 3) हम प्रदर्शन किया है कि mitochondrial समारोह के बाद कम हो जाती है हौसले से पृथक कोशिकाओं से अधिक 3 घंटे के लिए संस्कृति में किया गया है और अलग विशिष्ट सेल प्रकार आमतौर पर कई घंटे लगते है (अधिक से अधिक 3 घंटे) । PBMCs एक घंटे के भीतर तैयार किया जा सकता है, इस प्रकार वास्तविक समय mitochondrial समारोह को मापने की सटीकता सुनिश्चित करने के । जब तक हम पहले से विलक्षण रोगी आबादी में प्रारंभिक नैदानिक जांच के लिए PBMCs का उपयोग करने की सलाह देते हैं, जैसे टी लिम्फोसाइटों, प्लेटलेट्स, न्यूट्रोफिल, और monocytes के रूप में अन्य कोशिका प्रकार भी अनुकूलन के बाद वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ इस्तेमाल किया जा सकता चढ़ाना घनत्व और श्वसन अवरोध करनेवाला सांद्रता15,25,26

एक नई प्रणाली में mitochondrial समारोह परीक्षण करने से पहले, यह सबसे पहले इष्टतम सेल घनत्व और FCCP सांद्रता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । हमारे अनुभव में, चढ़ाना १.५ x 105 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से सुनिश्चित करता है कि चढ़ाना के बाद सेल घनत्व और धुलाई कदम ८०-९०% धाराप्रवाह रहता है । इसके अलावा, यह हर कोशिका प्रकार के लिए इष्टतम FCCP सांद्रता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । FCCP सांद्रता की एक सीमा का परीक्षण किया जाना चाहिए और FCCP एकाग्रता है कि एक सेल के स्वास्थ्य समझौता किए बिना अधिक से अधिक ओसीआर पैदा करता है इस्तेमाल किया जाना चाहिए । सांद्रता का परीक्षण किया, FCCP के 1 माइक्रोन PBMCs में अधिक से अधिक श्वसन के परिणामस्वरूप । एक और महत्वपूर्ण कदम के प्रयोग के समय है, के रूप में mitochondrial श्वसन बूंदें precipitously 3 घंटे PBMC अलगाव के बाद । इसका मतलब यह है कि एक नैदानिक नमूना में mitochondrial समारोह सही कब्जा करने के लिए नमूना संग्रह के बाद 3 घंटे के भीतर मिळो तनाव परीक्षण किया जाना चाहिए । यह संकेत है कि कई शोधकर्ताओं ने केवल जमे हुए नमूनों तक पहुंच है लायक है । हम पहले ठंड और गल के बाद PBMCs परीक्षण किया है, और इन कोशिकाओं के mitochondrial कार्य बहुत समझौता कर रहे हैं । इसलिए, हम सिफारिश नैदानिक अध्ययन में ताजा पृथक PBMCs का उपयोग कर, जब यह संभव है ।

reproducible डेटा जनरेट करने का एक अंय महत्वपूर्ण पहलू है डेटा सामांयीकरण करने की विधि । जबकि कुछ प्रयोगशालाओं mitochondrial श्वसन डेटा को सामान्य करने के लिए बीसीए प्रोटीन ठहराव का उपयोग सफलता मिली है, हम पाते हैं कि यह हमेशा एक कम सेल घनत्व पर विशेष रूप से संभव नहीं है. सामान्यीकरण विधि इस प्रोटोकॉल में वर्णित कक्ष संख्याओं और डाई-न्यूक्लिक अम्ल परिसरों के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के बीच रेखीय सहसंबंध पर निर्भर करता है, और सही ढंग से 10 करने के लिए ५०,००० कक्ष27कर सकते हैं । इसके अलावा, सामांय फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग और एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का एक संयोजन का उपयोग करते हुए प्रयोग के पूरा होने के बाद जीवित कोशिकाओं के तेजी से ठहराव के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, इस विधि अनुयाई कोशिकाओं के trypsinization या एक सेल खुरचनी का उपयोग की आवश्यकता नहीं है ।

प्रोटोकॉल का एक चेतावनी है कि हम mitochondrial कार्यात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने से पहले विशिष्ट कोशिका प्रकार में PBMCs अलग नहीं है । जैसा कि हम प्रदर्शन किया है, mitochondrial श्वसन PBMC अलगाव के बाद समय के साथ तेजी से कम हो जाती है । यह पता चलता है कि रोगियों के बीच मतभेद गलत हो सकता है अगर प्रयोग अलग सेल आबादी है, जो आम तौर पर कुछ घंटे लगते अलग करने के बाद प्रदर्शन किया गया । हालांकि PBMCs जैसे मिश्रित आबादी का अध्ययन महत्वपूर्ण सेल प्रकार-विशिष्ट जानकारी, PBMCs का उपयोग करके प्रयोगों से प्राप्त जानकारी के विशिष्ट कोशिका प्रकार पर ध्यान केंद्रित भविष्य यंत्रवत जांच गाइड मदद कर सकते है प्रकट नहीं होता है । PBMCs प्रणालीगत mitochondrial रोग है, जो इस तरह के कैंसर थकान के रूप में प्रणालीगत विकारों के लिए प्रासंगिक है के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा10,28। वर्तमान पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल केवल अवलोकन के कारण को इंगित किए बिना mitochondrial शिथिलता की एक कच्चे माप प्रदान करता है । इसलिए, इस प्रौद्योगिकी और प्रक्रिया का उपयोग कर निष्कर्षों सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए और थकान के multifactorial प्रकृति पर विचार करना चाहिए, जैसे अपने सह अन्य व्यवहार के साथ घटना के रूप में (जैसे, अवसाद, नींद, संज्ञानात्मक हानि) और अटी (उदा., कार्डियोपल्मोनरी स्टेटस, polypharmacy). भविष्य के अध्ययनों में mitochondrial कार्यों में परिवर्तन की जांच विशिष्ट कोशिका प्रकार (जैसे, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, टी लिम्फोसाइटों, और monocytes) और विभिंन नैदानिक आबादी में (जैसे, थका हुआ है/ स्वस्थ नियंत्रण) । हालांकि यह वर्तमान पांडुलिपि के दायरे से परे है, हम कैंसर थकान गंभीरता और mitochondrial रोग के बीच संघों का निर्धारण करेगा, साथ ही साथ mitochondrial समारोह माप और थकान के शारीरिक परीक्षणों के बीच सहसंबंध जैसे एक 6 मिनट की पैदल परीक्षा, भविष्य की जांच में । इसके अलावा, भविष्य के अध्ययन भी अंय कैंसर के प्रकार में mitochondrial शिथिलता की जांच के लिए निर्धारित करने के लिए कि क्या विभिंन प्रकार के कैंसर के पार थकान mitochondrial रोग के साथ जुड़ा हुआ है । अंत में, हम एक सामांय mitochondrial नैदानिक नमूनों का उपयोग कर रोग के एक त्वरित आकलन के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित की है । इसके अलावा यंत्रवत जांच के लिए इस दुर्बल हालत में विशिष्ट रास्ते की भागीदारी तुच्छ प्रदर्शन किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के NIH, बेथेस्डा, मैरीलैंड के राष्ट्रीय नर्सिंग अनुसंधान संस्थान के अंदर अनुसंधान के विभाजन द्वारा पूरी तरह से समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

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Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

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