Valutare il ruolo della funzione mitocondriale in affaticamento legato al cancro

Cancer Research

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Summary

Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un protocollo pratico per valutare la disfunzione mitocondriale è associata con affaticamento nei pazienti oncologici. Questo innovativo protocollo è ottimizzato per uso clinico che coinvolge phlebotomy solo standard e procedure di laboratorio di base.

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Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

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Abstract

L'affaticamento è un comune e debilitante che colpisce la maggior parte dei malati di cancro. Fin qui, resti di affaticamento scarsamente caratterizzati con nessuna diagnostica di test per misurare obiettivamente la gravità di questa condizione. Qui descriviamo un metodo ottimizzato per la valutazione della funzione mitocondriale di PBMCs raccolti dai malati di cancro affaticato. Usando un sistema compatto flux extracellulare e iniezione sequenziale di inibitori respiratori, abbiamo esaminato lo stato funzionale mitocondriale di PBMC misurando la respirazione mitocondriale basale, ricambio capacità respiratoria ed il fenotipo di energia, che descrive la via di energia preferita di rispondere allo stress. PBMCs fresco sono prontamente disponibili in ambito clinico utilizzando standard flebotomia. L'intera analisi descritto nel presente protocollo può essere completato in meno di 4 ore senza il coinvolgimento di tecniche biochimiche complesse. Inoltre, descriviamo un metodo di normalizzazione che è necessario per ottenere dati riproducibili. La semplice procedura e normalizzazione metodi presentati consentono per raccolta di campioni ripetuti dallo stesso paziente e generazione di dati riproducibili che possono essere confrontati tra intervalli di tempo per valutare i potenziali effetti del trattamento.

Introduction

La fatica è una condizione prevalente e angosciante che ha un impatto negativo sulla qualità della vita dei pazienti di cancro1. A questa data, la fatica di cancro rimane definita male e si basa solo su segnalazione soggettiva da pazienti2. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di identificare un test di laboratorio diagnostico facilmente adattabile per caratterizzare obiettivamente fatica in ambiente clinico3,4.

I meccanismi sottostanti multipli, compreso disfunzione di mitocondri, sono state proposte per causare affaticamento5. I mitocondri sono gli organelli di centrale elettrica, fornendo il 95% del fabbisogno energetico cellulare tramite fosforilazione ossidativa e svolgono un ruolo importante nella segnalazione del calcio, apoptosi, segnalazione immuni e regolamento di altri di eventi di segnalazione intracellulare6 . Di conseguenza, bioenergetica mitocondriale alterata e difetti nella produzione di energia possono contribuire alla fatica. Supporto di questa ipotesi, gli studi precedenti hanno osservato le mutazioni nel DNA mitocondriale in pazienti con la sindrome di stanchezza cronica7. Mentre rimane poco chiaro se l'origine patofisiologica della fatica si trova all'interno del sistema nervoso centrale o i tessuti periferici, come i muscoli scheletrici8,9, attualmente non esiste un metodo diretto per valutare con precisione disfunzione mitocondriale legata alla stanchezza in live, contenenti cellule.

Usando cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) per studiare la funzione mitocondriale offre diversi vantaggi. In primo luogo, PBMC sono prontamente disponibili in ambito clinico utilizzando flebotomia standard e possono essere isolati rapidamente utilizzando tecniche di laboratorio di base. In secondo luogo, la raccolta del sangue è meno dilagante che raccogliendo altri tessuti quali una biopsia del muscolo. Così, i campioni di sangue possono essere raccolti dallo stesso paziente ripetutamente nel corso del tempo, che facilita la valutazione longitudinale degli effetti del trattamento. Interessante, la funzione mitocondriale in PBMCs ha sembrato essere ben correlato con Rene stato mitocondriale in un modello animale10. Inoltre, i mitocondri delle cellule immuni sono stati utilizzati come proxy per la rilevazione di cambiamenti sistemici sotto condizioni differenti di malattia11,12. I mitocondri in cellule immuni circolanti sono particolarmente sensibile ai cambiamenti nelle funzioni immuni e immuni segnalando le molecole quali le citochine13,14,15. Ad esempio, si è osservato che PBMCs da pazienti con malattie infiammatorie reumatiche acute presentano basale elevato consumo dell'ossigeno,14. Al contrario, il consumo di ossigeno è stato ridotto in PBMC isolati dai pazienti con le circostanze infiammatorie sistemiche comprese sepsi16. Nelle circostanze infiammatorie, radicali liberi prodotti dai mitocondri disfunzionali possono contribuire ulteriormente ad elevati stress ossidativo e infiammazione prolungata17. Il ruolo centrale dei mitocondri nella produzione di energia anche come stress ossidativo suggerisce l'utilità potenziale di usando la funzione mitocondriale come un proxy per lo studio della fatica in cancro pazienti 13.

Precedenti studi hanno esaminato la funzione mitocondriale utilizzate tecniche biochimiche, misura del potenziale di membrana mitocondriale o l'isolamento di popolazioni di cellule specifiche che non possono essere facilmente adattabile nella regolazione clinica5, 14,18. Negli ultimi anni, lo sviluppo di analisi di flusso extracellulare ha permesso ai ricercatori di facilmente e accuratamente esaminare i cambiamenti nel tasso di consumo di ossigeno (OCR) in risposta alle iniezioni automatizzate di inibitori respiratori19,20 , 21 , 22. Tuttavia, la maggior parte di questi studi sono progettata per tipi cellulari specifici e il grande formato di alto-rendimento potrebbe non essere applicabile in una regolazione clinica. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo ottimizzato per esaminare la funzione mitocondriale per uso clinico.

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Protocol

Lo studio corrente (NCT00852111) è stato approvato da Institutional Review Board (IRB) di istituti nazionali di salute (NIH), Bethesda, Maryland. I partecipanti arruolati in questo studio erano uomini euthymic, 18 anni di età o più anziani, che sono state diagnosticate con cancro alla prostata non-metastatico con o senza prostatectomia priore e sono stati programmati per ricevere la radioterapia esterna del fascio (EBRT). Potenziali partecipanti sono stati esclusi se avevano una malattia progressiva che potrebbe causare notevole affaticamento, hanno avuti malattia psichiatrica negli ultimi cinque anni, ha avuto non riveduta ipotiroidismo o anemia, o ha avuto una seconda malignità. Gli individui che sedativi, steroidi o agenti anti-infiammatori non steroidei utilizzati anche sono stati esclusi. I campioni di sangue di controllo in buona salute sono stati ottenuti presso la medicina NIH dipartimento di trasfusione da donatori sani sotto un protocollo approvato IRB (NCT00001846). Tutti i partecipanti sono reclutati al Magnuson Clinical Research Center al NIH. Prima della partecipazione allo studio sono stati ottenuti consensi scritti firmati.

1. mitocondriale funzione misurazione preparazione (giorno 1 dell'esperimento)

  1. Idratare la cartuccia sensore (Vedi Tabella materiali; durata approssimativa: 5 min).
    1. Rimuovere la cartuccia sensore dal pacchetto. Aggiungere 200 μL di soluzione di calibratore in ciascun pozzetto della piastra utilità, quindi riempire ogni fossato con 400 μL di soluzione di calibratore.
    2. Piatto di sensore ritorno alla piastra di utilità, che ora ha calibratore soluzione in esso. Idratare la cartuccia in un incubatore a 37 ° C non-CO2 durante la notte.
      Nota: Cartuccia sensore deve essere idratata per un minimo di 4 ore e un massimo di 72 ore.

2. preparazione del campione clinica (giorno 2 dell'esperimento)

  1. Affaticamento di misura utilizzando il 13-elemento funzionale valutazione di malattia la terapia cronica - affaticamento (FACIT-F)2,23,24 al basale (prima di iniziare la radioterapia esterna), punto medio e completamento della radioterapia esterna e 1 anno post-radioterapia esterna.
    1. Utilizzare un 0 - 4 scala per ogni elemento risposta, dove 0 rappresenta "non è affatto" e un 4 indica che il convenuto si riferisce all'istruzione del corrispondente "molto." Punteggi totali dovrebbero variare da 16-53, con punteggi più bassi che riflette intensità alte di affaticamento.
    2. Definire fatica come un punteggio FACIT-F inferiore a 43, con un punteggio di FACIT-F di ≥43 che indica assenza di o non clinicamente significativo affaticamento2.
      Nota: Un punteggio FACIT-F di 43 migliori divide fatica decine di malati di cancro e la popolazione generale2.
    3. Includono i seguenti 13 elementi della scala di affaticamento FACIT: 1) mi sento affaticato; 2) mi sento debole tutto; 3) mi sento svogliata ("lavato fuori"); 4) mi sento stanco; 5) ho problemi con l'avvio di cose perché sono stanco; 6) ho difficoltà a finire le cose perché sono stanco; 7) ho energia; 8) sono in grado di fare le mie solite attività; 9) ho bisogno di dormire durante il giorno; 10) sono troppo stanco per mangiare; 11) ho bisogno di aiuto facendo la mia solita attività; 12) sono frustrato di essere troppo stanchi per fare le cose che voglio fare; e 13) devo limitare la mia attività sociali perché sono stanco.
  2. Isolare i PBMC dai campioni di sangue appena prelevato (durata approssimativa: 1 h).
    1. Raccogliere 8 mL di sangue in una provetta di preparazione di cellule mononucleari (Vedi Tabella materiali).
      Nota: I campioni di sangue devono essere elaborati entro 2 h dalla raccolta. La qualità di PBMCs può essere compromessa se i campioni di sangue vengono elaborati più di 2 ore dal prelievo.
    2. Centrifugare a 1.750 x g per 30 min a temperatura ambiente (18-25 ° C). Trasferire lo strato nuvoloso per un tubo conico da 15 mL. Aggiungere fino a 15 mL di PBS e capovolgere 5 volte.
    3. Centrifugare a 300 x g per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere con cautela e scartare il supernatante senza pellet inquietante. Risospendere il pellet con l'aggiunta di fino a 10 mL di PBS e capovolgere 5 volte.
    4. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il liquido surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di PBS. Trasferire i PBMCs in una provetta di microfuge 1,5 mL.
    5. Centrifugare a 610 x g per 10 minuti. Con attenzione rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in completo RPMI-1640 (RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 10mm penicillina/streptomicina).
  3. Cappotto cella piastre per cellule non aderenti (durata approssimativa: 30 min).
    1. Preparare la soluzione di adesivo di cellule e tessuti (Vedi Tabella materiali) diluendo la soluzione di riserva in bicarbonato di sodio 0,1 M a pH 8.0. La soluzione di lavoro dovrebbe essere a 3,5 µ g/cm2 di superficie.
      Nota: Questa soluzione contiene polifenolici proteine estratte dal mitilo marino, Mytilus edulis. Queste proteine sono componenti chiave della colla secernuta dalla cozza per ancorarsi alle superfici. Troviamo che la cella-Tak funziona meglio con PBMCs.
    2. Aggiungere 100 μL della soluzione adesiva diluita in ciascun pozzetto e incubare per almeno 20 min a temperatura ambiente. Lavare tre volte con acqua deionizzata e aria secca.

3. mitocondriale funzione misurazione

  1. Preparazione di analisi Media (durata approssimativa: 10 min).
    Nota: La media di analisi dovrà essere preparate il giorno dell'esperimento.
    1. Aggiungere L-glutamina, piruvato e glucosio alla base media (i costituenti stessi come per volta Eagle di Dulbecco Medium (DMEM), ma senza bicarbonato di sodio, glucosio, glutamina o sodio piruvato) per realizzare un supporto di analisi. Riscaldare la media di 37 ° C, quindi regolare il pH a 7,4.
      Nota: Le concentrazioni di L-Glutammina, piruvato ed il glucosio sono solitamente le stesse concentrazioni nei media di crescita normale, ma possono essere regolate in base il dosaggio.
  2. PBMCs di preparare per il test di Stress di Mito (durata approssimativa: 2 h).
    1. In ogni pozzetto per raggiungere confluency di 80-90% del piatto abbastanza PBMCs dal passaggio 2. Nella nostra esperienza, 1.5 x 105 cellule/pozzetto ha prodotto i risultati più coerenti.
      Nota: Wells A e H sono pozzi di sfondo e deve contenere solo analisi media con nessuna cellula. In pozzi da B a G, si consiglia di almeno 3-6 pozzetti per paziente campione di placcatura per tenere conto di valori anomali.
    2. Rallentare piastre a 200 x g per 2 minuti per permettere che le cellule di aderire al fondo dei pozzetti. Lavare le cellule una volta con media di dosaggio. Questo passaggio rimuove il bicarbonato di sodio e del siero dal supporto di crescita.
      Nota: Nella nostra esperienza, la fase di lavaggio rimuove in genere 20-30% delle cellule.
    3. Aggiungi media di dosaggio 180 μL in ogni pozzetto, tra cui sfondo pozzi A e H. Incubare in un incubatore a 37 ° C non-CO2 per 45-60 min.
  3. Esecuzione del Test di Stress di Mito
    1. Ricostituire i farmaci nel Mito Stress Kit con media di test come segue:
      1. Oligomycin: Aggiungi 252 μL analisi media nel flaconcino per generare una soluzione di riserva a 50 μM.
      2. FCCP: Aggiungere 288 μL di media di dosaggio nel flaconcino per generare una soluzione di riserva a 50 μM.
      3. Antimycin A / Rotenone: aggiungere 216 μL di media di dosaggio nel flaconcino per generare una soluzione di riserva a 25 μM.
    2. Vortice ricostituito farmaci per circa 1 minuto. Diluire in soluzioni di lavoro.
      Nota: Le concentrazioni delle soluzioni di lavoro dovrebbero essere titolate e pre-determinate prima dell'esperimento a seconda del tipo di cella. Per PBMCs, troviamo quel 1 μM di Oligomycin, 1 μM FCCP e 0,5 μM antimycin A / Rotenone funzionare al meglio.
    3. Dispensare i farmaci in ogni porta nella cartuccia sensore in sequenza:
      1. R: Porta pipetta 20 μL 10 μm Oligomycin, per una concentrazione finale in ciascun pozzetto di 1 μM.
      2. Porta b: pipetta 22 μL 10 μm FCCP, per una concentrazione finale in ciascun pozzetto di 1 μM.
      3. C: Porta pipetta 25 μL di 5 μM antimycin A / rotenone per una concentrazione finale in ciascun pozzetto di 0,5 μM.
  4. Selezionare "Test di Stress di Mito" su uno strumento di cambiamento continuo extracellulare. Seguire il prompt dei comandi dello strumento e inserire la cartuccia sensore. Lo strumento eseguirà automaticamente la calibrazione del sensore. Inserire la piastra di cella dopo calibrazione del sensore e lo strumento si concluderà il resto del saggio. Dinamica dell'ossigeno è misurata a 530 nm (eccitazione) / 650nm (emissione), e concentrazione di protoni viene misurata a 470 nm (eccitazione) / 530 nm (emissione).

4. normalizzazione dei dati la funzione mitocondriale

  1. Preparare la soluzione di saggio di proliferazione cellulare (durata approssimativa: 5 min).
    1. Aggiungere 48 μL acido nucleico macchia (500 x) e soppressore di sfondo 240 µ l a 11,7 mL di PBS (2x). La macchia di acido nucleico è un colorante di legame al DNA cellulare-permeante e il soppressore di sfondo è un colorante di mascheramento che blocca le cellule morte o cellule con l'integrità della membrana cellulare compromessa da essere macchiato. La combinazione del colorante DNA-legantesi e il soppressore di sfondo assicura che solo dal vivo cellule sono macchiate.
    2. Una volta completata la prova di sforzo di Mito, aggiungere uguale volume di soluzione di lavoro (180 μL): 2x direttamente nel mezzo in ciascun pozzetto.
  2. Incubare le cellule in presenza di soluzione di saggio di proliferazione delle cellule in un incubatore a 37 ° C per 45-60 min. quantificare il numero di cellule vive (fluorescenti) su un lettore alla 508 nm (eccitazione) / 527 nm (emissione) e normalizzare i dati OCR (durata approssimativa: 10 min) .
    Nota: oltre a numero cellule vive, gli utenti possono anche scegliere normalizzare i dati con il numero totale delle cellule, la quantità di acido nucleico, concentrazioni di proteine, ecc.

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Representative Results

Il Test di Stress di Mito si basa sul tasso di consumo di ossigeno (OCR) di misura dopo iniezione sequenziale di vari inibitori respiratori per mappare un profilo mitocondriale completo. Misurazioni di OCR dopo ogni iniezione di droga può essere utilizzato per calcolare i seguenti parametri relativi alla salute mitocondriale: OCR basale prima viene misurata prima di ogni iniezione di droga per valutare il consumo di ossigeno necessario per soddisfare la domanda di livello ATP a riposo. Respirazione basale viene calcolato sottraendo il tasso di respirazione non mitocondriale dal basale OCR prima dell'iniezione di oligomycin. Successivamente, oligomycin viene iniettato per inibire il canale del protone del trifosfato di adenosina synthase (complesso V). Il successivo calo di OCR dopo l'iniezione di oligomycin rappresenta il consumo di ossigeno legati alla produzione di ATP. FCCP (cianuro di carbonile 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), un ionoforo utilizzato per disturbare la pendenza del protone e del potenziale di membrana mitocondriale, viene quindi utilizzato per suscitare il massimo consumo di ossigeno. Massima respirazione viene calcolata sottraendo la respirazione mitocondriale-non dal massimo OCR dopo iniezione FCCP. Capacità di riserva respiratoria è la differenza tra respirazione basale e massima. Infine, antimycin un (inibitore del complesso III) e rotenone (complesso ho inibitore) vengono iniettati contemporaneamente per spegnere la catena di trasporto degli elettroni. Per definizione, la respirazione mitocondriale-non è indipendente dalla catena di trasporto dell'elettrone (ad es., non-mitocondriali NADPH ossidasi in macrofagi, ecc.) ed è rappresentata come valori di OCR dopo antimycin A / iniezione di rotenone. L'efficienza di accoppiamento descrive la frazione del consumo di ossigeno mitocondriale basale usato per la sintesi di ATP ed è calcolato come 100% x (OCR correlate alla produzione di ATP) /(basal respiration rate).

Densità di cella per ogni condizione di coltura deve essere ottimizzata prima di eseguire un test di stress di mito. Nella nostra esperienza, confluency di 80-90% avviene mediante placcatura 1.5 x 105 cellule/pozzetto di PBMCs appena isolate da sangue umano (Figura 1A). Questa densità di placcatura rappresenta la fase di lavaggio descritta al punto 3.2.3. Oltre a determinare la densità di placcatura ottimale, titolazione FCCP deve essere eseguita per determinare la concentrazione necessaria per generare la massima OCR. Presso il FCCP concentrazioni testate - μM 0.125, 0.25 μM, 0,5 μM, 1 μM e 2 μM - OCR aumentato con concentrazione FCCP raggiungendo un plateau 1 μm, ma è diminuito a 2 μM (Figura 1B). Questo indica che 1 μM è la concentrazione ottimale di FCCP che deve essere utilizzata per esaminare la funzione mitocondriale di PBMC.

Abbiamo testato la funzione mitocondriale dello stesso batch delle cellule dallo stesso campione di sangue raccolto da un donatore sano in vari momenti dopo l'isolamento di PBMC. Consumo di ossigeno basale, nonché massima OCR è diminuito come presto come 3h e ha continuato a diminuire a 5 e 8 h dopo l'isolamento di PBMC (Figura 2A). Dopo 3 h, massima respirazione suscitata da iniezione FCCP (tempo punti 7-9) non eccedevano basale OCR, suggerendo che anche in cellule vive, mitocondri ricambio capacità respiratoria diminuisce rapidamente nel corso del tempo. Tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) è stato misurato simultaneamente su uno strumento di cambiamento continuo extracellulare. Poiché oligomycin inibisce mitocondriale ATP sintasi, la glicolisi è reclutata pochi minuti per soddisfare la domanda di energia e per compensare la mancanza di produzione di ATP tramite fosforilazione ossidativa, come dimostrato dal rapido aumento in ECAR dopo oligomycin iniezione. Più presto 3 h dopo l'isolamento di PBMC, c'era una diminuzione in ECAR nonché OCR (Figura 2B). Anche se non abbiamo osservato alcun cambiamento notevole nell'attuabilità delle cellule a 1, 3, 5 e 8 h dopo l'isolamento di PBMC, funzione mitocondriale è diminuito velocemente, suggerendo che la sincronizzazione è chiave per catturare il profilo mitocondriale di PBMCs live, uccida.

Collezioni di campioni paziente tendono a verificarsi in tempi diversi in giorni diversi; Pertanto, è fondamentale normalizzare i dati per confrontare diversi campioni e intervalli di tempo. Mentre altri metodi di normalizzazione quali proteina analisi e quantificazione degli acidi nucleici può essere utilizzati, troviamo che la colorazione di cellule vive con una tintura DNA-legante e la quantificazione delle cellule verde fluorescente in ciascun pozzetto è la normalizzazione più efficiente e affidabile Metodo. Dati rappresentativi di PBMCs raccolti da due diversi donatori sani per due giorni separati sono mostrati nella Figura 3. Da incasso è un'immagine rappresentativa di una piastra cellulare mostrando ben celle totali (contrasto di fase) e cellule vive macchiata con la tintura di legame al DNA (verde fluorescente) dopo test di stress di mito. Tasso di consumo di ossigeno basale, come pure il consumo di ossigeno dopo ogni iniezione di droga normalizzato a cellule vive era simili in due differenti non affaticato donatori sani (Figura 3).

Dati della funzione mitocondriale rappresentativa di un soggetto affaticato (Punteggio FACIT-F < 43) con carcinoma della prostata (rosso) e un pari età/genere/gara non affaticato donatore sano (blu) sono mostrati in Figura 4. Anche se non abbiamo osservato alcuna differenza in OCR basale (Figura 4B), il soggetto affaticato ha esibito diminuito consumo di ossigeno massimo così come ricambio capacità respiratoria rispetto al controllo (Figura 4C, D). Fatica è sembrato essere collegato alla riduzione in ricambio capacità respiratoria, perché non c'erano differenze trovate nel consumo di ossigeno non mitocondriale (Figura 4E), consumo di ossigeno di ATP-correlati (Figura 4F), o accoppiamento di efficienza (Figura 4G). I dati di base (prima di ogni iniezione di droga) e massima respirazione dopo iniezione FCCP possa essere visualizzati utilizzando una trama di fenotipo di energia, che rivela il percorso preferito (OCR fosforilazione ossidativa contro glicolisi ECAR) in presenza di aumentato domanda di energia (Figura 4H). Caselle vuote indicano fenotipo energetico basale e quadrati pieni indicano il fenotipo di energia in risposta alla domanda massima di ATP. La distanza tra basale (quadrato vuoto) e massima (quadrato solido) indica la capacità di riserva, considerando che indica la pendenza cellulare preferenza verso fosforilazione ossidativa contro glicolisi. Come illustrato nella Figura 4H, capacità di riserva nel soggetto affaticamento in diminuzione rispetto al controllo sano non affaticato. Inoltre, il fenotipo di energia in risposta all'aumento della domanda di ATP sbilanciata verso la glicolisi nel soggetto affaticato rispetto al controllo sano (Figura 4H).

Figure 1
Figura 1 : PBMC placcatura densità e curva dose-risposta FCCP. (A) appena isolato PBMCs erano cromate a 1,5 x 105 cellule/pozzetto in cella rivestite con CellTak cultura miniplates. Dopo il lavaggio e supporto di modifica, le cellule sono stati equamente distribuite al confluency di 80-90%. Scala bar = 100 μm. (B) OCR aumentato con l'aumento delle concentrazioni di FCCP presso μM 0.125, 0.25 μM, 0,5 μM, raggiungendo OCR di picco a 1 μM. OCR è sceso a 2 μM, che indica che 1 μM è la dose ottimale per suscitare massima respirazione in PBMCs.Error barre indicano la deviazione standard di 3 misurazioni sequenziali dopo l'iniezione di droga iniziale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 2
Figura 2 : La respirazione mitocondriale diminuisce nel tempo in PBMCs appena isolate. OCR (A) come pure ECAR (B) è diminuito velocemente nel tempo dopo l'isolamento di PBMC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 3
Figura 3 : Dati rappresentativi respirazione mitocondriale con normalizzazione. Mito stress test è stato eseguito utilizzando freschi PBMCs isolato da due diversi volontari sani in giorni diversi e normalizzata utilizzando una macchia fluorescente dell'acido nucleico quantificata su un lettore di piastra fluorescente. Inserto: un'immagine rappresentativa delle celle in tensione (verde) e totale cellule (contrasto di fase) in un pozzo. Barra della scala = 1.000 μm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 4
Figura 4 : Analisi rappresentativa di un soggetto affaticato rispetto ad un controllo sano. (A) rappresentante Mito Stress test OCR grafico di un soggetto affaticato rispetto a un controllo sano di pari età/genere/gara non affaticato. Grafici a barre di basale OCR (B), massima respirazione (C), ricambio capacità respiratoria (D), consumo di ossigeno non mitocondriale (E), produzione di ATP (F)ed efficienza di accoppiamento (G) vengono visualizzati. La trama di fenotipo di energia del soggetto affaticato e sani di controllo è mostrata (H). Caselle vuote indicano fenotipo basale di energia, quadrati pieni rappresentano fenotipo stressato energia misurata dopo iniezione FCCP. Barre di errore indicano la deviazione standard di 3 pozzi diversi per ogni partecipante allo studio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

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Discussion

Affaticamento in malati di cancro è una condizione debilitante che non è ben definito o caratterizzato1. Diagnosi di affaticamento si basa interamente su una relazione soggettiva e non c'è nessuna corrente standard diagnostico o trattamento per questa circostanza, in gran parte a causa di una mancanza di comprensione nella sua pathobiology2. Dei meccanismi proposti affaticamento nei pazienti oncologici, danno nella funzione mitocondriale è una delle vie più terapeuticamente indirizzabile. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo pratico e veloce per misurare la funzione mitocondriale in campioni clinici che può essere utilizzato per identificare in modo proattivo i pazienti a rischio per lo sviluppo di tossicità correlata al trattamento di cancro tra cui fatica, così che presto gestione può essere istituito.

La tecnologia di flusso extracellulare in combinazione con iniezione sequenziale di inibitori respiratori consentire per la valutazione dello stato funzionale mitocondriale ed è stato usato per entrambi in vitro e in vivo modelli19, 20,21. Abbiamo ampliato il corpo esistente del lavoro e ha sviluppato un metodo ottimizzato per l'esame di disfunzione mitocondriale in campioni clinici. Un vantaggio dello studio è l'utilizzo dell'analizzatore compatto flusso extracellulare. Come abbiamo dimostrato, temporizzazione dell'esperimento è cruciale dopo l'isolamento di PBMCs fresco dal sangue umano. Mentre il formato più grande (formato 96 pozzetti o 24 pozzetti) è la scelta ideale per un esperimento di throughput elevato, il sistema compatto flusso extracellulare, che contiene 8 pozzetti, consente per la valutazione individuale di ogni paziente campione19. Questo metodo è più pratico e conveniente (sia per quanto riguarda lo strumento in sé e per i reagenti utilizzati per eseguire il test), perché la raccolta di campioni da pazienti diversi tendono a verificarsi in tempi diversi in giorni diversi.

L'utilizzo di PBMCs per valutare la funzione mitocondriale in malati di cancro affaticato ha diversi vantaggi: 1) biopsia di tessuti quali i muscoli scheletrici può essere poco pratica a volte; 2) PBMC sono prontamente disponibili e può facilmente essere isolato utilizzando tubi di preparazione delle cellule, che offre un vantaggio pratico in una regolazione clinica; e 3) abbiamo dimostrato che la funzione mitocondriale diminuisce dopo appena isolate cellule sono state in coltura per più di 3 ore e isolando tipi cellulari specifici in genere richiede diverse ore (più di 3 ore). PBMCs può essere preparato entro un'ora, garantendo così la precisione di misurazione in tempo reale funzione mitocondriale. Mentre si consiglia di utilizzare PBMCs per indagine clinica iniziale in popolazioni di pazienti precedentemente atipici, altri tipi di cellule come i linfociti T, piastrine, neutrofili e monociti utilizzabile anche con l'attuale protocollo dopo l'ottimizzazione di placcatura di densità e respiratorio inibitore concentrazioni15,25,26.

Prima della prova la funzione mitocondriale in un nuovo sistema, è importante determinare innanzitutto la densità cellulare ottimale e concentrazioni FCCP. Nella nostra esperienza, placcatura 1.5 x 105 cellule per pozzetto assicura che la densità delle cellule dopo la placcatura e l'80-90% confluenti di lavaggio passo resti. Inoltre, è fondamentale determinare le concentrazioni di FCCP ottimale per ogni tipo di cellula. Una concentrazioni di gamma di FCCP devono essere testati e la concentrazione di FCCP che produce OCR massima senza compromettere la salute di una cella deve essere utilizzata. Alle concentrazioni testate, 1 μM di FCCP provocato massima respirazione in PBMCs. Un altro passaggio fondamentale è la tempistica dell'esperimento, come gocce di respirazione mitocondriale precipitosamente 3 ore dopo l'isolamento di PBMC. Ciò significa che il test di stress del mito deve essere eseguito entro 3 ore dalla raccolta del campione per acquisire con precisione la funzione mitocondriale in un campione clinico. Vale la pena di sottolineare che molti ricercatori hanno solo accesso a campioni congelati. In precedenza abbiamo testato PBMCs dopo congelamento e scongelamento, e le funzioni mitocondriali di queste cellule sono fortemente compromessa. Si consiglia pertanto di uso fresco isolato PBMCs negli studi clinici, quando è fattibile.

Un altro aspetto importante della generazione di dati riproducibili è il metodo di normalizzazione dei dati. Mentre alcuni laboratori hanno avuto successo con quantificazione della proteina BCA per normalizzare i dati la respirazione mitocondriale, troviamo che non è sempre fattibile soprattutto ad una densità bassa delle cellule. Il metodo di normalizzazione descritto in questo protocollo si basa sulla correlazione lineare tra numeri di cellulare e l'emissione di fluorescenza dei complessi acidi nucleico tintura e possibile quantificare con precisione 10 a 50.000 cellule27. Inoltre, utilizzando una combinazione di acido nucleico fluorescente macchia e un lettore di piastra fluorescente di normalizzazione consente rapida quantificazione delle celle in tensione dopo il completamento dell'esperimento. Inoltre, questo metodo non richiede trypsinization di cellule aderenti o con un raschietto in cella.

Un avvertimento del protocollo è che non sono suddivisi in PBMCs in tipi cellulari specifici prima di eseguire l'analisi funzionale mitocondriale. Come abbiamo dimostrato, la respirazione mitocondriale diminuisce rapidamente nel tempo dopo l'isolamento di PBMC. Ciò suggerisce che le differenze fra pazienti possono essere imprecise se l'esperimento è stato effettuato dopo isolare popolazioni differenti delle cellule, che di solito ci vogliono un paio d'ore. Anche se lo studio di popolazioni miste come PBMCs non rivela informazioni specifiche del tipo di cellula importante, informazioni ottenute dagli esperimenti utilizzando PBMCs possono aiutare le indagini meccanicistiche future guida focalizzate su tipi cellulari specifici. PBMCs servire come un proxy per disfunzione mitocondriale sistemica, che è rilevante per i disordini sistematici quali cancro fatica10,28. Il protocollo descritto nel manoscritto attuale fornisce solo una misura grezza di disfunzione mitocondriale senza individuare la causa dell'osservazione. Di conseguenza, i risultati utilizzando questa tecnologia e la procedura devono essere interpretati con cautela e deve considerare la natura multifattoriale della fatica, come la sua co-occorrenza con altri comportamenti (ad es., depressione, sonno, danno conoscitivo) e condizioni (ad es., condizione cardiopolmonare, polypharmacy). Gli studi futuri dovrebbero esaminare le alterazioni nelle funzioni mitocondriali in tipi cellulari specifici (ad es., cellule natural killer, linfociti T e monociti) e in varie popolazioni cliniche (ad es., i malati di cancro affaticato/non-affaticato e controlli sani). Mentre è oltre la portata del manoscritto attuale, determineremo le associazioni tra gravità della fatica di cancro e la disfunzione mitocondriale, come pure la correlazione tra la funzione mitocondriale misurazioni e prove fisiche della fatica come un test di 6 minuti a piedi, in futuro le indagini. Inoltre, gli studi futuri esaminerà inoltre la disfunzione mitocondriale in altri tipi di cancro al fine di determinare se la fatica attraverso vari tipi di cancro è associato con disfunzione mitocondriale. In conclusione, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per una rapida valutazione delle disfunzioni mitocondriali generale utilizzando campioni clinici. Ulteriori indagini meccanicistiche possono essere eseguite per individuare il coinvolgimento di specifiche vie in questo stato debilitante.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è completamente supportato dalla divisione di ricerca intramurale dell'Istituto nazionale di ricerca infermieristica del NIH, Bethesda, Maryland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

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Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

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