マッピング代謝: 監視組織で直接乳酸脱水素酵素活性

Biochemistry

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Summary

Nicotinatmide アデニン酸 (NAD(P)H) + H + 組織サンプルで直接生成酵素の酵素活性の分布をマッピングするためのプロトコルについて述べます。

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Jelinek, D., Flores, A., Uebelhoer, M., Pasque, V., Plath, K., Iruela-Arispe, M. L., Christofk, H. R., Lowry, W. E., Coller, H. A. Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue. J. Vis. Exp. (136), e57760, doi:10.3791/57760 (2018).

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Abstract

空間と時間における酵素活性のマッピングは、正常組織と病気での細胞行動の分子基盤を理解することにとって重要です。その場で代謝活性アッセイは、組織内の代謝活動の空間分布に関する情報を提供できます。ここで組織サンプルに直接酵素乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルいたします。乳酸脱水素酵素は消費グルコースが好気性または嫌気性解糖系によるエネルギーに変換するかどうかの決定が重要です。液乳酸および NAD は、凍結するティッシュ セクションを提供しています。高乳酸脱水素酵素活性と細胞はニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD) NADH と検出することができるプロトンの減少に基づいて提供される同時変換中、提供乳酸をピルビン酸に変換されます。nitrotetrazolium 青青い沈殿物として可視化した塩。マウス皮膚における乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルについて述べる。このプロトコルを適用すると、乳酸脱水素酵素活性が皮膚内で静止の毛包幹細胞で高いことがわかった。マウス胚性線維芽細胞より培養胚性幹細胞の高い染色プロトコルを培養マウス胚性幹細胞に適用することを明らかにしました。新鮮単離マウス大動脈の解析では、大動脈に垂直平滑筋細胞における染色を明らかにしました。提供手法を使用して、新鮮なまたは冷凍の組織で陽子を生成する酵素の活性を空間的にマッピングすることができます。

Introduction

酵素が高または低活性を持つ、組織内の場所を理解する理解の開発および生理学のため不可欠です。謄本又はタンパク質レベルは、酵素活性の代理として使われます。このような研究は有益であることができます中、に、酵素の活動、翻訳後修飾、タンパク質複合体や酵素の細胞内局在性の存在などを決定するための重要なことができる情報は提供しません。酵素活性は直接計測するときにしばしばもはや組織内の高または低の活動と混合物または細胞の空間的分布内で個々 のセルについての情報が含まれて均質化タンパク質溶解液で監視されます。

ここで組織サンプル中の酵素活性の分布をマッピングするための詳しいプロトコルいたします。方法論は、テトラゾリウム塩を凍結するティッシュ1酸化酵素、還元酵素、脱水素酵素の活性のローカライズに使用できることを示す以前の研究に基づいています。これらのメソッドは、テトラゾリウム塩2,3に陽子が転送されるときに水不溶性ホルマザンが形成されます。グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、NADPH と、陽子を生成し、テトラゾリウム アクティビティが検出されました。グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、欧州ヒラメ肝45の 2 型肺胞細胞と5腎臓のネフロンに監視されています。テトラゾリウム塩は、凍結するティッシュ6の細胞の活動を監視する使用されています。同様のアプローチは、隣接するスライド7で同じ組織の複数の脱水素酵素の活動を監視する最近使用されました。

乳酸脱水素酵素活性 (図 1) の空間分布を監視するテトラゾリウム塩を利用する方法をご紹介します。乳酸脱水素酵素、乳酸を解糖系と逆の反応で生成されたピルビン酸に変換できます。乳酸脱水素酵素活性はその結果ピルビン酸の乳酸とその分泌対トリカルボン酸入学の決定が重要であります。血液中の乳酸濃度は、それことを知らせた病気やけがが損傷した細胞、酵素がリリースされているので癌8,9,10, を含む病気の範囲の診断に使われます。

4 つの乳酸脱水素酵素の遺伝子がある: 発現、LDHB、LDHC、LDHD11。発現と LDHB は、早期発現遺伝子12の重複から生じていると考えられています。LDH は 4 量体として活躍、発現と LDHB は、homotetramers と heterotetramers の相互を形成できます。発現は、乳酸、高い親和性を持っていると優先的に乳酸をピルビン酸13に変換する LDHB が報告される間、ピルビン酸、高い親和性を有するとされています。発現プロモーターには、HIF1α、cMYC FOXM1 のトランスクリプション要因11結合部位が含まれています。さらに、ように多く他解糖系酵素14,15LDH が翻訳後修飾によって変更できます。線維芽細胞増殖因子受容体 1 は Y10、4 量体形成を促進する、または NADH 基板結合16を促進する Y83 発現に対することができます。発現にアセチル化17することができます。これらの理由から LDH タンパク質レベルだけでなく、同様の酵素の活性を監視する必要の LDH 活性を完全に理解します。

ここでは提示方式に加え乳酸脱水素酵素の活動を監視する他のアプローチは使用されました。乳酸脱水素酵素活性は、均質化蛋白ライセートの吸収スペクトルの測定監視できます。NADH の生成、乳酸、ピルビン酸に変換されます測定可能 340 吸光度に基づいて nm, ピルビン酸は乳酸18に変換されます NADH の消失を監視できます。乳酸脱水素酵素活性は、磁気共鳴画像 (MRI) に監視されています。13C ピルビン酸を投与することができの比としてピルビン酸から乳酸の変換を監視できる [1-13] 乳酸/[1-13C] ピルビン酸。比率を上昇 [1-13C] 乳酸/[1-13] ピルビン酸は、癌組織19で観察されています。MRI ベースのアプローチは、通常の乳酸脱水素酵素活性と疾患組織に関する情報を提供できますが、方法論は特定の細胞の活動レベルを決定するために必要な解像度を持っていません。ここで提供されている方法論は、組織の地域とも単一細胞における乳酸脱水素酵素活動の情報を提供できます。

その場で活性測定法を使用して、乳酸脱水素酵素の活性が高い20マウス皮膚の毛包幹細胞のことがわかった。また培養胚性幹細胞の乳酸脱水素酵素の活動を監視し、活動は幹細胞に送り装置の層よりも高いメソッドを使いました。最後に、新鮮なマウス大動脈における乳酸脱水素酵素の活動を監視し、平滑筋細胞内染色を観察しました。我々 はここで冷凍マウス皮膚における乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルについて説明します。

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Protocol

記載されているすべての実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校で動物ケア委員会によって承認されました。

1. 冷凍マウス皮膚のスライドを生成します。

  1. 機関のポリシーに従ってマウスを安楽死させます。
    注: 防護服の制度のポリシーに従ってください。動物を含むすべてのプロトコルは、機関動物ケア委員会によって承認される必要があります。
  2. 動物の毛トリマーとマウスの髪を削除します。
  3. はさみを使用して皮膚の切開を行います。鉗子を使用すると、マウスから皮膚を持ち上げます。皮膚セクションを切り取るはさみを使用しています。
  4. 凍結試薬をコンパウンドで、cryomold を埋める (材料の表を参照してください)。
  5. 皮膚針鼻セクションを使用して塗りつぶされた cryomolds に鉗子を配置します。組織スライスは真皮、皮下・筋 (図 2) に表皮から皮膚の断面図を生成することは、肌を合わせます。
    注意: 可能であれば、マウント実験と同じスライド上に切断し、一緒に処理できるので、同じ cryomold で一緒にマウスを制御します。泡を作成しないように注意してください。
  6. 氷バケットにドライアイスのブロックの平らな面に cryomold を配置し、凍結させます。スキンの向きを観察し続けます。必要に応じて調整します。
    注: は、ドライアイスを取り扱う際に低温手袋を着用します。
  7. ストレージの-80 ° C のフリーザーに cryomolds を転送します。サンプルは、冷凍庫で約 3ヶ月酵素活性の重要な損失なしで維持できます。凍結切片の乾燥をさせてください。
  8. -20 ° c、7-10 μ m の最高の皮膚形態21の厚いセクションを作成するスライス組織クライオスタットを用いた。

2. 染色スライドの準備

  1. テストするスライドのセットを確立します。NAD は源泉徴収されるコントロール スライドを含めるし、別のコントロールをスライド基板、乳酸、源泉徴収されます。以前調査した凍結するティッシュのブロックからの肯定的な制御スライドが含まれます。
  2. 簡単にスライドを固定 5 分 4% ホルマリンで皮膚セクションを含む 4% ホルマリンをスライド、またはピペット 1 mL、4% ホルマリン入り容器にスライドを浸すことによって複数のスライドを処理するとき。
    注: 固定、皮膚がスライドから次の手順と保存皮膚の形態の中にむいていないを確認します。
    注意: ホルマリンは発がん性物質と危険だもの手袋を着用する、それはあなたの肌に触れるし、化学の発煙のフードでこの手順を実行させてはいけない。
  3. 少なくとも 1 mL リン酸洗浄スライドによって緩衝される塩、pH 7.4、スライドごとピペッティングまたは浸漬で。

3. 染色液の準備

  1. 乳酸脱水素酵素活性染色用渦一緒に試薬 (50 mM Tris pH 7.4 では、750 μ M NADP、80 μ M フェナジン methosulfate (PMS)、600 μ M nitrotetrazolium ブルーの塩化物および 30 mM 乳酸) 染色の量に応じて適切なサイズのチューブで必要なソリューションです。
    注: 1 mL は完全に 1 つのスライドをカバーするのに十分です。
  2. NAD を除くすべての試薬がある、2 番目のソリューションを準備します。すべての試薬は乳酸以外存在第 3 ソリューションを準備します。

4. 染色液でスライドを孵化させなさい。

  1. 優しくピペット染色液またはその全体のセクションをカバー スライド上に制御ソリューション (1 mL は、1 つのスライド十分です)。複数のスライドを一緒に処理されている場合は、同時に染色液にすべてのスライドをディップ (コンテナーが完全にティッシュ セクションをカバーする十分なソリューションを確認してください)。
  2. 暗闇の中で 37 ° C で加湿環境でスライドを孵化させなさい。染色液は、スライド上にある場合、は、蒸発を防ぐために加湿環境にスライドを配置します。

5. モニター スライド

  1. 目視による青クリアから染色液の変換を監視します。サンプルが青の所望のレベルに達したら、染色液を除去することによって反作用を停止します。
    注: 皮膚、10 分は十分です。時にオルガンと酵素の活性が異なります。
  2. ピペッティングでリン酸緩衝生理食塩水でスライドをリンス (1 mL はスライドごとに十分な) または浸漬します。
    注: 互いに比較されるサンプルは、時間の同じ量の染色液で維持する必要があります。

6. 対比染色とマウント

  1. スライド、スライドが青の適切なレベルに達したときに対比染色をピペットで移しなさい。
    注: 赤または緑の核を有効に Counterstains は沈殿ホルマザン結晶によって作成された青と良好なコントラストを提供します。
  2. 水または水溶液中22をマウントをマウントします。メディアをマウントのひとつ 〜 3 滴 (40-50 μ L) でカバー スリップのサイズによっては十分です。

7. スライドの画像し、定量化

  1. 画像は、光学顕微鏡下でスライドします。10 X、20 X、40 倍の倍率でのすべての否定的なコントロールとコントロールのサンプル実験の写真を取る。
  2. 画像解析ソフトウェアでさまざまな地域の青い汚れの強度を決定します。

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Representative Results

我々 は以前マウス皮膚20の活性測定法の場での結果を報告しました。図 3のように、上記の手順で説明したときの毛包の基部に毛包幹細胞の乳酸脱水素酵素活性の高いレベルが続いていたを見ました。これらの調査結果は、毛包幹細胞を皮膚の並べ替えと並べ替えられた細胞の活性測定法と幹細胞コンパートメント高乳酸脱水素酵素活性を確認する蛍光性によって作動セルによって確証されました。

毛包幹細胞が高乳酸脱水素酵素活性を持つという我々 の調査結果に基づいて、我々 は培養胚性幹細胞の研究を拡張しました。マウス萌芽期の繊維芽細胞はフィーダー層としては、単独で、または胚性幹細胞の存在下で解析しました。媒体の吸気、培養細胞を分析して細胞が簡単に固定し乳酸脱水素酵素染色液を上記のように培養します。胚性線維芽細胞 (図 4) マウスと比較して胚性幹細胞における高乳酸脱水素酵素活性を見ました。

新鮮単離組織染色プロトコルも適用しました。マウス大動脈は解剖され、スライス オープン。血管が開かれ、固定化、内部大動脈の内腔にアクセスでした。サンプル新鮮な組織に適用されたトリトン X 染色液 10 分乳酸脱水素酵素染色液の乳酸脱水素酵素とその後の 10 分の 0.5% を含むハンクの平衡塩溶液で培養。インキュベーション後、画像を集め、平滑筋細胞 (図 5) の染色を示します。

Figure 1
図 1: 化学活性乳酸脱水素酵素とその検出します。乳酸脱水素酵素はピルビン酸 + NADH + H+乳酸 + NAD を変換します。生成されるプロトン ニトロブルーテトラゾリウムを青色の沈殿物を形作る塩に減ります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: Cryomolds のマウス皮膚を定位のスケマティック。各断面は、表皮、真皮、皮下、筋肉から全身の皮膚の断面を含まれることマウス皮膚が cryomolds 内でする必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 乳酸脱水素酵素染色マウス皮膚の毛包幹細胞で高活性を明らかにします。マウス皮膚は cryomolds で凍結され、培養乳酸脱水素酵素とは、乳酸を含む染色液。乳酸脱水素酵素活性は、毛包幹細胞で顕著だった。(A, B)マウス皮膚の乳酸脱水素酵素活性測定法の 2 つの画像。(C, D)源泉徴収基板乳酸染色コントロールの 2 つの画像。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 培養マウス胚性幹細胞における高乳酸デヒドロゲナーゼ活性します。照射マウス胚性線維芽細胞の送り装置の層上に成長した培養マウス胚性幹細胞は、乳酸脱水素酵素活性の解析しました。繊維芽細胞と比較して幹細胞の高い活性を示した。マウス胚性線維芽細胞は、染色と照射なしの同じようなレベルを示した。画像は、20 × 対物で撮影されました。スケールバー = 50 μ m. (B、D、E、) マウス胚性線維芽細胞と幹細胞。(C)マウス胚性線維芽細胞だけで。(A ~ C)染色液の孵化の 7 分後に撮影されました。(D-F)染色液の孵化の 20 分後に撮影されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: マウス大動脈を取り巻く平滑筋細胞における高乳酸脱水素酵素活性します。大動脈は、安楽死させたマウスから分離しました。船は 2% パラホルムアルデヒドで 2 分間修正され、1 x リン酸緩衝生理食塩水の 3 × 10 分を洗浄しました。0.5% トリトン X とリン酸緩衝生理食塩水で洗浄の 3 x 5 分ハンクの平衡塩溶液を添加して血管。サンプル 37 ° C で 10 分間培養し, および 3 x 5 分 x 1 リン酸緩衝生理食塩水での洗浄、乳酸脱水素酵素染色液が追加されました。サンプル 2% パラホルムアルデヒドで 1 時間固定し、リン酸緩衝生理食塩水 x 1 と 3 x 5 分を洗浄およびイメージします。(A) 乳酸脱水素酵素液乳酸。(ネガティブ コントロールとして乳酸なし乳酸脱水素酵素 B) ソリューションです。各セクションの左下の拡大画像があるし、右側に高倍率で指定された領域を示します。(A, B)乳酸を含む完全な乳酸脱水素酵素溶液は、染色に使われました。B はネガティブ コントロールとしての汚損のため使用されたイメージ (C, D) A. 乳酸脱水素酵素ソリューション乳酸なしで示された領域の拡大画像です。D は C で示された領域の拡大画像です。A と C は 20 X の目的で撮影された (スケールバー = 50 μ m) と B と D は、40 X 目的で撮影された (スケール バー = 20 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

ここで説明する方法は、乳酸脱水素酵素や他の代謝酵素生成 NADH または NADPH 依存性の異なる種類の細胞、組織内または時間の経過とともに組織のさまざまな部分の活動を監視する使用できます。乳酸脱水素酵素は幹細胞と腫瘍の生物学を理解するための重要な酵素を個々 の細胞における乳酸脱水素酵素の活動を監視する機能はこの酵素の機能に重要な洞察を提供する可能性が高い。

他の方法論と比較してこのプロトコルの重要な利点の 1 つはタンパク質豊富なだけではなく、モニター酵素活性能力はより決定的なについてだけではなく、乳酸脱水素酵素の酵素が結果することができます。現在、実際には機能しているが。ここで説明している方法は、選択した蛋白質、例えば、細胞の系統マーカーのレベルは、乳酸脱水素酵素活性として同じ組織サンプルで決定されますので、免疫組織化学と結合できます。乳酸脱水素酵素の活動を監視するため、MRI を用いたアプローチと比較して提供されるプロトコルがそれがより高い空間解像度を提供し、高い酵素活性を持つ、組織内の特定のセルを決定するのに役立つことができます利点.蛍光基板に基づくマッピング代謝へのアプローチと比較しては、蛍光1によって説明されたプロトコルと信号の検出は制限はありません。ミラーと共著、塩7への変換を監視することによって同様の時間依存性と 5 つの異なる酵素の基板依存性の分析を実行しました。反応は、酵素反応の化学量論的原則に従うこと発見されました。ミラーとの共著者識別ミトコンドリア酵素非ミトコンドリア ミトコンドリア染色7との共局在酵素から。5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium 塩化 (CTC) は、共焦点顕微鏡を用いた共局在解析7続いて検出試薬としても使用。

記載されているメソッドは、同様な欠点です。MRI ベースのアプローチは、生きている有機体で使用できますが、記述されているアプローチは、凍結や新鮮な組織を必要があります。凍結するティッシュの数ヶ月、時間をかけて、酵素の活性が低下するので場合でも適している冷凍します。さらに、基板が過剰にあるので、アプローチは「活動電位」基板あると仮定すると情報を提供します。基板のレベルを制限している場合、このアッセイの活動分布は生理学的に発生するアクティビティの量から逸脱可能性があります。さらに、同じ酵素の活動を実行する同じ酵素の異なるアイソ フォームが存在する場合に、ここで紹介した方法がそれらを区別することができるは。例えば、紹介した方法は、LDHB 対発現の活動と区別できません。遺伝子を使用することこの問題に対処する 1 つ方法は、単一の酵素のアイソ フォームが遺伝子活性化するマウスを設計されています。

PMS の実験を行ったが、NADH とテトラゾリウム間電子伝達を仲介する光化学安定な電子キャリア染料、23。一方、PMS がグルコース 6-リン酸脱水素酵素活性を阻害する、PMS 役に立たない5を発見したいくつかの科学者を報告している、酵素の局在化の価値があるし、我々 のプロトコルに含めることに PMS がわかったポリビニル アルコールを使用してグルコース 6-リン酸脱水素酵素1の拡散を制限するいくつかの他の著者が報告しています。実験では、有用であるポリビニル アルコールを見つけられませんでした、それを排除しました。

いくつかの手順は、染色の成功のために重要です。1 つの重要な問題は、組織のサンプルを cyromolds に正しく配置することです。皮膚のセクションは、フラット、スライス カット、肌全体にレイアウトするか。さらに、複数のセクションを準備する場合は、それは理想的な同じスライド上一緒にスライスできますので同じ cryomold 内に埋め込まれている場合。これはクリオスタットでカットはスライドの厚さによる変動を排除するのに役立ちます。また、組織がまだ酵素活性を保持することを確認することが重要です。

反応を終了する最もよい時期は経験的に決定する必要があります。潜伏期間中にスライドを密接に監視し、青い汚れの強度に基づいてスライド マウントを対比染色を追加して適切な時間を決定する必要は。サンプルがあまりにも軽く染色、それは活動の場所を特定することが可能なります。サンプルが overstained される場合は、活動で高値、もともと特定の領域を確認するために困難に塩の沈殿物が広がることができます。

このプロトコルは代謝の役割についての質問の広い範囲で科学者のために貴重になります期待しています。代謝活性と細胞系統マーカーや増殖マーカー、遺伝的モデルで、酵素活性の細胞内の局在化を評価する別の酵素の貢献を評価する共同染色用途の監視病気の組織や開発中の酵素活性は。

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Disclosures

著者は開示する競合する興味を持ってないです。

Acknowledgements

HAC リタ アレン財団 (http://www.ritaallenfoundation.org) のミルトン E. カッセル学者でもあった。この作業によって賄われていた補助金拍する国立研究所の一般的な医療科学 R01 GM081686、R01 AR070245、国立の研究所一般医療科学 R01 GM0866465、イーライ ・ エディス広い再生医療センター ・幹細胞研究 (からローズの丘と Hal Gaba 賞)、WEL および HAC にジョンソン総合がんセンターからアイリス カントール女性の健康センター/カリフォルニア大学ロサンゼルス校 CTSI NIH グラント UL1TR000124、白血病リンパ腫協会の影響賞を受賞します。この出版物で報告された研究は、賞を受賞番号 P50CA092131 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所によって支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。HAC は、Eli およびエディス広い再生医療センター ・幹細胞研究、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の分子生物学研究所と UCLA バイオインフォマティクス部門間プログラムのメンバーです。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical instruments For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm Fisher Scientific NC9511236 For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound Fisher Scientific NC9638938 For mounting cryomolds
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide Fisher Scientific 12-545-78
4% formalin Fisher Scientific 23-245-684 Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base Fisher Scientific 23-245-684
NAD Sigma-Aldrich N7004
Phenazine methosulfate Sigma-Aldrich P9625
Nitrotetrazolium blue chloride Sigma-Aldrich N6876
Lithium L-lactate Sigma-Aldrich L2250 Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain Anatech 861 Counter stain
Mounting medium Vector Laboratories H-5000 
Cover slips for slides Fisher Scientific 12-544D
Light microscope

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References

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