Kartläggning Metabolism: Övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet direkt i vävnad

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver ett protokoll för att kartlägga den rumsliga fördelningen av enzymatisk aktivitet för enzymer som genererar nicotinatmide adenin-dinukleotidfosfat (NAD(P)H) + H + direkt i vävnadsprover.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jelinek, D., Flores, A., Uebelhoer, M., Pasque, V., Plath, K., Iruela-Arispe, M. L., Christofk, H. R., Lowry, W. E., Coller, H. A. Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue. J. Vis. Exp. (136), e57760, doi:10.3791/57760 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mappning av enzymaktivitet i tid och rum är avgörande för att förstå den molekylära basen för cell beteende i normal vävnad och sjukdom. In situ metabolisk aktivitet analyser kan ge information om den geografiska fördelningen av metabolisk aktivitet i en vävnad. Vi ger här ett detaljerat protokoll för att övervaka aktiviteten hos enzymet laktat dehydrogenas direkt i vävnadsprover. Laktatdehydrogenas är en viktig faktor för om förbrukade glukos omvandlas till energi via aerob eller anaerob glykolys. En lösning som innehåller laktat och NAD tillhandahålls ett fryst vävnad avsnitt. Celler med hög laktatdehydrogenas aktivitet kommer att konvertera den medföljande laktat till Pyruvat, medan samtidigt konvertera som nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) till NADH och en proton, vilket kan upptäckas baserat på minskning av nitrotetrazolium blå till formazan, som visualiseras som en blå fällning. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet i mus hud. Tillämpning av detta protokoll, hittade vi att laktatdehydrogenas aktivitet är hög i quiescent hårsäcken stamcellerna i huden. Tillämpa protokollet till odlade mus embryonala stamceller visade högre färgning i odlade embryonala stamceller än mus embryonala fibroblaster. Analysen av nymalen isolerade mus aorta visade färgning i glatta muskelceller vinkelrätt mot aorta. Den metod som kan användas till rumsligt karta aktiviteten av enzymer som genererar en proton i fryst eller färsk vävnad.

Introduction

Förstå platser inom vävnader där enzymer har hög eller låg aktivitet är viktigt för förståelse utveckling och fysiologi. Avskrift eller protein nivåer används ofta som substitut för enzymatisk aktivitet. Sådana studier kan vara informativ, ger de inte information som kan vara avgörande för att fastställa ett enzym aktivitet, till exempel post-translationella modifieringar, förekomsten av proteinkomplex eller enzymets subcellulär lokalisering. När enzymaktiviteten mäts direkt, är det ofta övervakas i homogeniserad protein lysates som inte längre innehåller information om enskilda celler inom blandningen eller rumslig distribution av cellerna med hög eller låg aktivitet i en vävnad.

Vi erbjuder här ett detaljerat protokoll för att kartlägga den rumsliga fördelningen av enzymatisk aktivitet inom ett vävnadsprov. Metodiken bygger på tidigare studier som visar att tetrazolium salter kan användas för att lokalisera verksamhet mellan östradiol och östron, reductases och oxidases i fryst vävnad1. Med dessa metoder bildas en olöslig formazan när protoner överförs till en tetrazolium salt2,3. Glukos-6-fosfatdehydrogenas genererar NADPH och en proton, och har upptäckts med tetrazolium aktivitet. Glukos-6-fosfatdehydrogenas har övervakats i Europeiska skrubbskädda hepatocyter4, i alveolära typ 2 celler av lungorna5 och nefron av njure5. Tetrazolium salter har också använts för att övervaka transketolase aktivitet i fryst vävnad6. Ett liknande tillvägagångssätt användes nyligen till att övervaka aktiviteten hos flera mellan östradiol och östron i samma vävnaden på intilliggande bilder7.

Här beskriver vi en metod för att använda tetrazolium salter för att övervaka den rumsliga fördelningen av laktatdehydrogenas aktivitet (figur 1). Laktatdehydrogenas kan konvertera pyruvat som genereras av glykolys till laktat och omvända reaktionen. Laktatdehydrogenas aktivitet är följaktligen en viktig determinant av pyruvats hänrycka in i cykelns tricarboxylic syra kontra dess utsöndring som laktat. Laktat nivåer i blodet är ofta används för att diagnostisera ett spektrum av sjukdomar, inklusive cancer8,9,10, eftersom det kan signalera att sjukdom eller skada har skadade celler och enzymet har släppts.

Det finns fyra laktatdehydrogenas gener: LDHA, LDHB, LDHC och LDHD11. LDHA och LDHB tros ha uppstått från dubblering av en tidig LDHA gen12. LDH är aktivet som en tetramer och LDHA och LDHB kan bilda homotetramers och heterotetramers med varandra. LDHA rapporteras ha högre affinitet för pyruvat, medan LDHB rapporteras ha högre affinitet för laktat, och prioriterat konvertera laktat till Pyruvat13. LDHA arrangören innehåller bindande platser för HIF1α, cMYC och FOXM1 transkription faktorer11. Dessutom, liksom många andra glycolytic enzymer14,15, kan LDH ändras av post-translationella modifieringar. Fibroblast tillväxtfaktor receptor 1 kan fosforylera LDHA på Y10, som främjar tetramer bildandet, eller Y83, som främjar NADH substrat bindande16. LDHA kan också vara acetylerade17. Av dessa anledningar kräver en fullständig förståelse av LDH aktivitet övervakning inte bara LDH proteinnivåer, men det enzymaktivitet samt.

Förutom den metod som vi presenterar här, har andra metoder använts för att övervaka laktatdehydrogenas aktivitet. Laktatdehydrogenas aktivitet kan övervakas spektrofotometriskt homogeniserad protein lysate. Generering av NADH som laktat omvandlas till Pyruvat kan mätas utifrån absorbansen vid 340 nm, medan försvinnandet av NADH kan övervakas eftersom pyruvat omvandlas till laktat18. Laktatdehydrogenas aktivitet har också följts med magnetisk resonanstomografi (MRT). 13 C-pyruvat kan administreras och omvandlingen av pyruvat till laktat kan övervakas som förhållandet mellan [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvat. Förhöjda nyckeltal [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvat har observerats i cancer vävnad19. Medan MRI-baserade metoder kan ge information om laktatdehydrogenas aktivitet i normal och sjukdom vävnader, har metoder som inte den upplösning som behövs för att avgöra aktivitetsnivån i specifika celler. Den metod som anges här kan ge information om laktatdehydrogenas aktivitet i vävnad områden och även i enstaka celler.

Med i situ aktivitet analyser upptäckte vi att aktiviteten av laktatdehydrogenas är hög i hårsäcken stamcellerna mus hud20. Vi har också använt metoden att övervaka aktiviteten av laktatdehydrogenas i odlade embryonala stamceller och hittade aktiviteten är högre i stamcellerna än feeder lagret. Slutligen, vi övervakas aktiviteten av laktatdehydrogenas i färska musen aorta och observerade färgning i glatta muskelceller. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet i frysta mus hud.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment beskrivs godkändes av djur hand kommitté vid University of California, Los Angeles.

1. generera diabilder av frysta mus hud

  1. Euthanize möss i enlighet med institutionens policy.
    Obs: Följ institutionella politiken för skyddskläder. Alla protokoll som involverar djur måste godkännas av djur hand utskottet för institutionella.
  2. Ta bort musens hår med en djurhår trimmer.
  3. Gör snitt i huden med hjälp av sax. Med pincett, lyfta huden från musen. Med sax, klippa avsnittet huden bort.
  4. Fyll i cryomold med frysning reagens sammansatt (se Tabell för material).
  5. Placera huden sektioner i fylld cryomolds med nål-nosed pincett. Orient huden så att vävnaden skivor kommer att generera ett tvärsnitt av huden från epidermis till dermis, hypodermis och muskel (figur 2).
    Obs: om möjligt, montera experimentella och kontrollera möss tillsammans i den samma cryomold så de kan sektioneras på samma bild och bearbetas tillsammans. Se till att inte skapa bubblor.
  6. Placera cryomold på den plana ytan av ett block av torr-is i en ishink och låt frysa. Fortsätta att observera orientering på huden. Justera vid behov.
    Obs: Använd kryogen handskar vid hantering av torr-is.
  7. Över cryomolds till-80 ° C frys för förvaring. Prover kan bibehållas i frysen i cirka 3 månader utan betydande förlust av enzymaktivitet. Låt inte frusna snitt torka ut.
  8. Använda en kryostat vid-20 ° C, bit vävnad att skapa sektioner 7-10 µm tjock för de bästa hud morfologi21.

2. förbereda bilder för färgning

  1. Fastställa de bilder som ska testas. Inkluderar en kontroll bild som NAD kommer att innehållas och en annan kontroll Skjut där underlaget, laktat, kommer att avbrytas. Inkludera en positiv kontroll bild från ett fryst vävnad block tidigare undersökt.
  2. Kort fixa bilder som innehåller hud sektioner med 4% formalin för 5 min antingen genom pipettering 1 mL 4% formalin in i bilden, eller vid bearbetning av flera bilder, genom att doppa glider in en behållare som innehåller 4% formalin.
    Fixering kommer att kontrollera huden inte lossnar från glasen vid följande procedurer och bevara hudens morfologi.
    Försiktighet: Formalin är ett cancerframkallande och farliga; Använd handskar, låt inte det kontakt med huden och utföra det här steget i kemiska dragskåp.
  3. Tvätta bilder med minst 1 mL fosfat buffrad koksaltlösning, pH 7,4, per bild antingen genom pipettering eller doppning.

3. Förbered färgningen lösning

  1. Vortex grupp reagenser för laktatdehydrogenas aktivitet färgning (50 mM Tris pH 7,4, 750 µM NADP, 80 µM phenazine metosulfat (PMS), 600 µM nitrotetrazolium blå klorid och 30 mM laktat) i en lämplig storlek rör beroende på mängden färgning lösningen som behövs.
    Obs: 1 mL är tillräckligt för att helt täcka en bild.
  2. Förbereda en andra lösning där alla reagenser är närvarande utom NAD. Bered en tredje där alla reagenser är närvarande utom laktat.

4. odling av objektglas i färgning lösning

  1. Försiktigt Pipettera färglösningen eller lösningar på de förberedda bilder som täcker avsnittet i sin helhet (1 mL räcker för en bild). Om flera bilder bearbetas tillsammans, doppa alla bilder i färglösningen samtidigt (kontrollera att behållaren har tillräckligt lösning att helt täcka avsnittet vävnad).
  2. Inkubera bilder i en fuktig miljö vid 37 ° C i mörker. Om färgning lösning ligger ovanpå bilden, placera bilden i en fuktig miljö för att förhindra avdunstning.

5. övervaka bilder

  1. Övervaka omvandlingen av färglösningen från klar till blå genom okulärbesiktning. När proven har nått önskad nivå av blåhet, stoppa reaktionen genom att ta bort färgningslösningen.
    Obs: För huden, 10 min räcker. Tiden beror på orgeln och den enzymatiska aktiviteten.
  2. Skölj bilder med fosfatbuffrad saltlösning genom pipettering (1 mL räcker för varje bild) eller doppning.
    Obs: Alla prover som kommer att jämföras med varandra måste upprätthållas i färglösningen för samma belopp av tid.

6. motfärg och montera

  1. Pipettera en motfärg på bilderna när bilderna har nått en lämplig nivå av blåhet.
    Obs: Counterstains som förvandla atomkärnor röd eller grön ger bra kontrast med blått skapad av formazan fällningsmedel.
  2. Montera med vatten eller vattenbaserade montering medium22. En till tre droppar (40-50 µL) av monteringsmedium räcker beroende på täckglaset storlek.

7. bild bilder och kvantifiera

  1. Bild glider under ett ljusmikroskop. Ta fotografier av experimentella och kontrollprover och alla negativa kontroller vid 10 X och 20 X 40 X förstoring.
  2. Bestämma intensiteten av blånad i olika regioner med bild analys programvara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidigare rapporterat resultat för i situ aktivitet analyser i mus hud20. I figur 3visas vi observerat höga nivåer av laktatdehydrogenas aktivitet i hårsäcken stamcellerna vid basen av hårsäcken när förfarandena ovan följdes. Dessa fynd var styrks av fluorescens aktiverad cell sortering av huden för hårsäcken stamceller och bekräftar högt laktatdehydrogenas aktivitet i stamceller kupén med aktivitet analyser på sorterade celler.

Baserat på våra resultat att hårsäcken stamcellerna har högt laktatdehydrogenas aktivitet, utökat vi våra studier av odlade embryonala stamceller. Mus embryonala fibroblaster som serverar som mataren lager analyserades enskilt eller i närvaro av embryonala stamceller. För att analysera odlade celler, medium var aspirerade, och cellerna var kort fast och inkuberas med laktatdehydrogenas färgning lösning som beskrivits ovan. Vi observerade högt laktatdehydrogenas aktivitet i de embryonala stamcellerna jämfört med musen embryonala fibroblaster (figur 4).

Vi har också tillämpat färgning protokollet nymalen isolerade vävnad. Mus artärer var dissekeras och skivade öppna. Fartygen var öppnade och orörlig så att insidan lumen av artärer var tillgänglig. Prover inkuberades med Hanks balanserad saltlösning som innehåller 0,5% Triton-X för 10 min, därefter med på laktat dehydrogenas färgning lösning för 10 min. laktatdehydrogenas färgning lösningen applicerades på frisk vävnad. Efter inkubation samlades bilder, visar färgning i glatta muskelceller (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Kemisk aktivitet av laktatdehydrogenas och upptäckt. Laktatdehydrogenas omvandlar laktat + NAD till Pyruvat + NADH + H+. Protonen som genereras kommer att minska nitroblue tetrazolium till formazan, som bildar en blå fällning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Schematisk av orientera mus hud i cryomolds. Mus hud bör vara orienterad inom cryomolds så att varje skär avsnitt innehåller ett tvärsnitt av hela huden från epidermis, dermis, hypodermis och muskel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Laktatdehydrogenas färgning av mus hud avslöjar hög aktivitet i hårsäcken stamceller. Mus hud var fryst i cryomolds och inkuberas med laktatdehydrogenas färgning lösning innehåller laktat. Laktatdehydrogenas aktivitet var framträdande i hårsäcken stamceller. (A, B) Två bilder av laktatdehydrogenas aktivitet haltbestämning av mus hud. (C, D) Två bilder av kontroll färgning med de substrat laktat undanhållas. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Högt laktatdehydrogenas aktivitet i odlade mus embryonala stamceller. Odlade mus embryonala stamceller som odlas på ett bestrålat mus embryonala fibroblast feeder lager analyserades för laktatdehydrogenas aktivitet. Hög aktivitet observerades i stamcellerna jämfört med fibroblaster. Mus embryonala fibroblaster visade liknande nivåer av färgning med och utan bestrålning. Bilder är tagna med ett 20 X-objektiv. Skalstapeln = 50 µm. (A, B, D, E) mus embryonala fibroblaster och stamceller. (C, F) Mus embryonala fibroblaster ensam. (A-C) Bilder togs efter 7 minuters inkubation med färgning lösning. (D-F) Bilder togs efter 20 minuters inkubation med färgning lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Högt laktatdehydrogenas aktivitet i glatta muskelceller kring mus aorta. Artärer isolerades från euthanized möss. Fartyg var fast i 2 minuter i 2% PARAFORMALDEHYD och tvättat 3 x 10 minuter i 1 x fosfatbuffrad saltlösning. Fartyg inkuberades med Hanks balanserad saltlösning med 0,5% Triton-X och tvättade 3 x 5 minuter i fosfatbuffrad saltlösning. Laktatdehydrogenas färgning lösning lades och prover inkuberades i 10 min vid 37° C och tvättade 3 x 5 min med 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning. Prover var sedan fast i 1 timme i 2% paraformaldehyd, tvättat 3 x 5 min med 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning och avbildas. (A) laktatdehydrogenas lösning innehållande laktat. (B) laktatdehydrogenas lösning utan laktat som en negativ kontroll. För varje avsnitt, det finns en lägre förstoring bild till vänster och ett utvalt område visas med högre förstoring till höger. (A, B) Komplett laktatdehydrogenas lösning innehållande laktat användes för färgning. B är en förstorad bild av det angivna området i bild A. (C, D) laktatdehydrogenas lösning utan laktat användes för färgning som en negativ kontroll. D är en förstorad bild av det angivna området i C. A och C togs med 20 X mål (skalstapeln = 50 µm) och B och D togs med ett 40 X-objektiv (skalstapeln = 20 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metod som beskrivs här kan användas för att övervaka aktiviteten av laktatdehydrogenas eller andra metabola enzymer som genererar NADH eller NADPH, i olika celltyper i en vävnad eller inom olika delar av en vävnad över tid. Laktat dehydrogenas är ett enzym som är viktigt för att förstå biologin av stamceller och tumörer, och förmågan att följa laktatdehydrogenas i enskilda celler är sannolikt att ge viktiga insikter i funktionen av detta enzym.

En viktig fördel med detta protokoll jämfört med andra metoder är att förmågan att övervaka enzymaktivitet, snarare än bara protein överflöd, kan resultera i mer avgörande information om inte bara var laktatdehydrogenas enzymer är närvarande, men där de är faktiskt funktionell. Den metod som beskrivs här kan kombineras med immunohistokemi så att nivån på ett utvalda protein, exempelvis en cell härstamning markör, bestäms i de samma vävnadsproverna som laktatdehydrogenas verksamhet. Jämfört med MRI-baserade metoder för övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet, har protokollet som den fördelen att det kan ge ökad rumslig upplösning och hjälpa till att bestämma de specifika celler i en vävnad som har hög enzymaktivitet . Jämfört med metoder för mappning metabolism baserat på fluorogenic substrat, begränsas upptäcka signal med protokollet beskrivs inte av autofluorescens1. Miller och medförfattare framförde en liknande analys av tid beroende och substrat beroende av fem olika enzymer övervakning konvertering till formazan7. Reaktionerna upptäcktes att följa stökiometriska principer av enzymkinetik. Miller och medförfattare framstående mitokondriella enzymer från icke-mitokondriella enzymer av samtidig lokalisering med mitokondriell färgning7. De använde 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium klorid (CTC) som upptäckt reagens följt av konfokalmikroskopi för subcellulär samtidig lokalisering analys7.

Den metod som beskrivs har nackdelar också. Medan Mr tillvägagångssätt kan användas i levande organismer, kräver det tillvägagångssätt som beskrivs fryst eller färsk vävnad. Frysta vävnader är endast lämpliga för ett par månader eftersom aktiviteten av enzymer försämras med tiden, även när fryst. Ytterligare, eftersom underlaget tillhandahålls i överskott, metoden ger information om ”aktivitet potential” förutsatt att substratet är närvarande. Om nivåerna av substratet är begränsande, kan sedan aktivitet distribution observerats med denna analys avvika från mängden aktivitet som uppstår fysiologiskt. Dessutom, om det finns olika isoformer av samma enzym som utför samma enzymatisk aktivitet, är den metod som presenteras här inte kunna skilja mellan dem. Metoden presenteras inte kan exempelvis skilja mellan aktiviteten av LDHA kontra LDHB. Ett sätt att adressen problemet skulle vara att använda genetiskt konstruerade möss där ett enda enzym isoform är genetiskt inaktiverade.

Vi har experimenterat med PMS, photochemically stabil elektron bärare som medierar elektronöverföring mellan NADH och tetrazolium färgämnen23. Medan vissa forskare har rapporterat att PMS hämmar glukos 6-fosfat dehydrogenas aktivitet och hittade PMS ohjälpsam5, hittade vi PMS att vara värdefullt för enzym lokalisering och inkludera det i våra protokoll. Några andra författare har rapporterat använder polyvinylalkohol för att begränsa spridningen av glukos 6-fosfat dehydrogenas enzym1. I vårt experiment, vi kunde inte hitta den polyvinyl alkoholen att vara hjälpsam och eliminerade.

Några steg är kritiska för att lyckas med färgningen. En viktig fråga är att säkerställa att vävnadsproverna placeras korrekt i cyromolds. Huden sektioner bör fastställas platt så att skivor skär över huden. Dessutom om flera avsnitt är att vara förberedd, är det perfekt om de är inbäddade i den samma cryomold så de kan vara skivad tillsammans med samma bild. Detta hjälper till att eliminera variation som beror på tjockleken av bilden som klipps med kryostaten. Det är också viktigt att se till att vävnaden fortfarande behåller enzymaktivitet.

Den bästa tiden att avsluta reaktionen bör bestämmas empiriskt. Det är nödvändigt att noga övervaka bilderna under inkubationstiden och bestämma lämpligt tillfälle att lägga till motfärg och montera bilder baserat på intensiteten av blånad. Om proverna färgas för lättvindigt, kommer det inte vara möjligt att avgöra var aktiviteten är. Om proverna är overstained, kan formazan fällningen spridas, vilket gör det svårt att fastställa de specifika områden som var ursprungligen hög aktivitet.

Vi räknar med detta protokoll kommer att vara värdefullt för forskare med ett brett spektrum av frågor om rollen av metabolism. Tillämpningar inkluderar Co färgning för metabolisk aktivitet och cell lineage markörer eller spridning markörer, bedömning av bidragen från olika enzymer med genetiska modeller, bedömning av subcellulär lokalisering av enzymaktivitet, övervakning enzymaktivitet i sjuk vävnad eller under utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen konkurrerande intressen att avslöja.

Acknowledgements

HAC var Milton E. Cassel lärd av Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Detta arbete finansierades genom bidrag till HAC från nationella institutet av allmänna medicinska vetenskaper R01 GM081686, R01 AR070245, nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper R01 GM0866465, Eli & Edythe breda Center för regenerativ medicin & forskning på stamceller ( Rose Hills och Hal Gaba awards), Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, föreningen leukemi lymfom, inverkan utmärkelser från Jonsson omfattande Cancer Center WEL och HAC. Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute av det nationella Institutes of Health under Award nummer P50CA092131. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet. HAC är medlem av Eli & Edythe breda Center för regenerativ medicin & forskning på stamceller, UCLA molekylärbiologi Institutet och UCLA bioinformatik enhetsövergripande programmet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical instruments For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm Fisher Scientific NC9511236 For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound Fisher Scientific NC9638938 For mounting cryomolds
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide Fisher Scientific 12-545-78
4% formalin Fisher Scientific 23-245-684 Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base Fisher Scientific 23-245-684
NAD Sigma-Aldrich N7004
Phenazine methosulfate Sigma-Aldrich P9625
Nitrotetrazolium blue chloride Sigma-Aldrich N6876
Lithium L-lactate Sigma-Aldrich L2250 Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain Anatech 861 Counter stain
Mounting medium Vector Laboratories H-5000 
Cover slips for slides Fisher Scientific 12-544D
Light microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
  2. Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
  3. Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. Bios. (1992).
  4. Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
  5. Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
  6. Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
  7. Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. (2017).
  8. Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
  9. Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
  10. Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
  11. Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
  12. Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
  13. Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
  14. Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
  15. Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
  16. Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
  17. Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
  18. Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
  19. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
  20. Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. (2017).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).
  22. Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
  23. Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics