Tek hücreli Nefelometri mRNA ve yüzey Protein Simian virüs, immün yetmezlik enfekte CD4 ifadede+ T hücreleri izole Rhesus makak üzerinden

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Açıklanan 96 genlerin ifade quantitate için bir metodoloji olduğunu ve 18 yüzey proteinler tarafından tek hücreleri ex vivodifferentially tanımlanması için izin, genler ve proteinler kandan hücrelere göre virüs enfeksiyonlu hücrelerdeki dile getirdi. Yaklaşım+ T çalışma SIV-enfekte CD4 için uyguladığımız rhesus makak izole hücreler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tokarev, A., Creegan, M., Eller, M. A., Roederer, M., Bolton, D. L. Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques. J. Vis. Exp. (139), e57776, doi:10.3791/57776 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tek hücre Analizi hücre türdeş olmayan nüfus dissekan için önemli bir araçtır. Kimlik ve yalıtım nadir hücre-ebilmek var olmak zor. Bu zorluğu aşmak için bir metodoloji birleştirerek akış sitometresi dizine ve yüksek üretilen iş çoğaltılmış nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) geliştirilmiştir. Amaç tanımlamak ve maymun immün yetmezlik virüsü (SIV) karakterize oldu-enfekte hücreleri rhesus makak içinde mevcut. Nefelometri floresans aktif hücre (FACS) sıralama tarafından yüzey protein ve mRNA qPCR tarafından virüs bulaşan hücreleri çok boyutlu bir profil oluşturmak için ana bilgisayar gen ve protein ölçümleri ile kombine viral gen ekspresyonu tanımlanır . Biz yaklaşım, hedeflenen tek hücreli proteolitik-transkripsiyon değerlendirme veya tSCEPTRE vadeli. Yöntemi gerçekleştirmek için hücrelerin floresan antikor ile belirli bir hücre alt ve/veya aşağı akım fenotipik analiz FACS yalıtımı için kullanılan yüzey işaretleri lekeli. Tek hücreleri hemen lizis, multiplex ters Transkripsiyon (RT), PCR öncesi amplifikasyon ve yüksek işlem hacmi qPCR 96 tutanaklar, ardından sıralanır. FACS ölçümleri sıralama sırasında kaydedilir ve daha sonra gen ifadesi verileri bir kombine protein ve transkripsiyon profil oluşturmak için iyi konuma göre bağlı. SIV-enfekte çalışmaya doğrudan ex vivohücre, hücre birden çok viral RNA türler qPCR tespiti tarafından tespit edilmiştir. Viral transkript kombinasyonu ve miktar her sağlamak bir çerçeve içine viral ömrünün (Örneğin, karşı verimli verimli) farklı aşamalarında hücreleri sınıflandırma. Ayrıca, SIV+ hücre tSCEPTRE göre hastalık bulaşmamış tek hücreleri differentially ifade ana bilgisayar genler ve proteinler değerlendirmek için aynı örnek izole edildi. Analiz daha önce hesaba katılmayan viral RNA ifade heterojenite yanı sıra vivo SIV-aracılı çoğu gen düzenlemesi tek hücreli çözünürlük ile enfekte hücreleri arasında ortaya koydu. TSCEPTRE yöntemi herhangi bir hücre popülasyon yüzey protein marker(s), ana bilgisayar veya patojen gene(s) veya bunların kombinasyonları ifade tarafından kimliği için mükellef analizi için uygundur.

Introduction

Çok sayıda hücre içi patojenlerin çoğaltmak için konak hücre makine kez konak hücre biyolojisi değiştirme veya ana hücrelerinin yayılma şanslarını en üst düzeye çıkarmak için çok özel altgrupları hedefleme güveniyor. Sonuç olarak, hücre biyolojik süreçlerin yaygın olarak, ana bilgisayarın genel sağlık için zararlı sonuçları ile kesintiye. Virüsler ve içinde çoğalıyorlar konak hücreleri arasındaki etkileşimler anlama bulaşmayı önlemek amacıyla gelişmiş tedaviler ve stratejileri geliştirmede yardımcı olabilir hastalığı mekanizmaları aydınlatmak. Ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma sağlayan doğrudan analitik araçlar bu amaçla doğru gereklidir. Tek hücreli analiz tek belirsizliğe yer bırakmadan bir hücresel fenotip özniteliği bir belirli genotip ya da enfeksiyon durumu1için bulunmasını sağlar. Örneğin, patojenik enfeksiyonları sık konak hücreleri doğrudan ve dolaylı değişimler neden. Bu nedenle, ayrım bulaşmamış karşılıklarından enfekte hücreleri doğrudan enfeksiyon veya ikincil etkileri, öznitelik ana hücre değişiklikleri için gerekli gibi Genelleştirilmiş iltihabı. Ayrıca, SIV ve insan immün yetmezlik virüsler (HIV), gibi birçok patojenler için konak hücre enfeksiyon birden çok aşamalardan gibi gelirleri erken, geç, ya da gizli, her biri farklı gen ve protein ifade profilleri2 tarafından karakterize edilebilir , 3 , 4 , 5. hücre karışımları toplu analizleri bu heterojenlik6yakalamak başarısız olur. Aksine, son derece multiplexed tek hücreli analizleri viral her iki ifade ölçmek mümkün ve ana bilgisayar genler enfeksiyon etap üzerinden türevleriyle birlikte enfeksiyon özgü hücresel tedirginlikler gidermek için bir yol sunar. Ayrıca, ana bilgisayar-patojen etkileşimlerde fizyolojik açıdan analiz ilgili ayarları virüslü canlılar arasında meydana gelen olayları tanımlaması için kritik. Böylece, ex vivo çoğu doğrudan olasılığı en iyi yakalama vivo içinde uygulanacak yöntemleri işler.

SIV ve HIV hedef CD4+ T hücreleri, ana bilgisayar antiviral "kısıtlama" faktörler ve tümleyici antijen sunan molekül immün gözetim7,8, önlemek ve üretken enfeksiyon kurmak için hangi onlar karşı koymak 9,10,11. Tedavi olmadan, enfeksiyon sonuçları büyük CD4 kaybına+ T hücreleri, sonuçta sonuçlanan kazanılmış bağışıklık yetmezliği sendromu (AIDS)12. Antiretroviral tedavi ayarında gizlice enfekte hücre rezervuarlar iyileştirici stratejiler için zorlu bir engel poz yıllardır devam ediyor. Vivo HIV/SIV-enfekte hücre özellikleri'ni anlama ana bilgisayar ökaryotlar arasındaki farklılıklar patogenez ve sebat enstrümantal ortaya çıkarmak için potansiyele sahiptir. Ancak, bu son derece, öncelikle enfekte hücreleri low frequency ve onları kolayca tespit edebilmek reaktifler eksikliği nedeniyle zor oldu. Viral RNA, uyarlamak hücreleri 0,01-1'de bulunması için tahmin edilmektedir CD4%+ T hücreleri kan ve lenf dokusu13,14,15. Süpresif tedavi altında gizlice enfekte hücreleri 10-3–10-7 16,17,18, daha az sıktır. Viral protein boyama deneyleri içinde vitro enfeksiyonlar, tür hücre içi Gag, eğitim için iyi iş 0,01 – 0.1 arka plan boyama nedeniyle suboptimal %, benzer veya daha fazla enfekte hücreleri13, frekans 14. Yüzey boyama için iyi karakterize SIV/HIV Env özgü monoklonal antikorları kullanarak Env protein de büyük olasılıkla benzer nedenlerden dolayı zor olabilir kanıtlanmıştır. Son zamanlarda, Gag tarafından ifade hücre algılama geliştirmek için yeni araçlar amaç birleşmeyle deneyleri belirli gag RNA veya alternatif görüntüleme teknolojileri14,15,19. Ancak, bu tür yaklaşımlar sınırlı kalır nicel ölçümler sayısı içinde gerçekleştirilen her cep telefonundan.

Burada, biz (1) 18'e kadar yüzey proteinleri ve 96 genlerin ifadesi her bulaştırmak için ex vivo duyarlı ve spesifik viral gen nicel qPCR ve (2) tarafından quantifies doğrudan tek virüs bulaşan hücreleri tanımlayan yöntembilim tanımlamak (ve virüs bulaşmamış) hücre. Tek hücre yüzey proteini ölçüm hemen hücre lizis tarafından takip FACS tarafından Bu metodoloji birleştirir ve gen ifade analizi ile hedeflenen qPCR Biomark sistemdeki multiplexed. Entegre sıvı devre (IFC) teknoloji 96 örneklerinden 96 genlerin çoğaltılmış Nefelometri aynı anda, 9,216 odaları tek tek qPCR reaksiyonlar gerçekleştirildiği bir matris tarafından başarılı izin verir. Analiz için tüm transcriptome koruyarak hemen gerçekleştirilen iken canlı hücre FACS sıralama yüksek içerikli protein bereket ölçümleri kaydeder aşağı akım. Virüs bulaşan hücreleri tanımlamak için alternatif olarak spliced ve unspliced viral RNA'ların (vRNA) ilişkin deneyleri özel dahildir 96 genler, şu anda içinde ağırladı deneyleri sayısının Toplam Kullanıcı tanımlı deneyleri bir panel ile birlikte qPCR Analizi IFC. Gen ekspresyonu ve protein her hücre için toplanan bilgilerin iyi konuma göre bağlantılıdır. Biz daha önce başka bir yerde bu analiz sonuçları20bildirdi. Burada, daha ayrıntılı metodolojik yönergeleri yanı sıra daha da açıklayıcı fenotipleme SIV-enfekte CD4 sağlamak+ T hücreleri.

TSCEPTRE dönem, bu yaklaşım herhangi bir geçerli hücre popülasyon fluorescently etiketli antikorlar ve transcriptome temin qPCR deneyleri ile uyumlu ifade için reaktif süspansiyonlar uygulanabilir. Örneğin, farklı gen ve protein ifadede nadir hücreleri veya hücre yüzey proteini işaretleri tarafından kolayca ayırt karakterize için kullanılabilir. Numune hazırlama bir standart iletişim kuralı'nı piyasada bulunan antikor boyama dayanır. Cytometers tek hücreli sıralama yeteneği ile de ticari olarak kullanılabilir, ancak ek Biyogüvenlik önlemleri bulaşıcı canlı hücreleri işlemek için gereklidir. Tek - hücre protein ifade profil burada başvurulan her hücre iyi konuma göre kayıt sıralama, dizine gibi piyasada bulunan FACS yazılım sıralama ortak bir özelliği var. Sayısal Analiz differentially ifade ana bilgisayar genlerin hücre popülasyonlarının ilgi arasında burada açıklanmayan ancak başvurular için daha önce yayımlanmış yöntemleri sağlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Protokolü iş akışı şeması Şekil 1' de gösterilen. Üç temel adımdan oluşur: FACS, RT ve cDNA öncesi amplifikasyon ve qPCR 96 genler için aynı anda. Hücreleri dilutions sınırlama ve tek hücre, sıralama sıralama iletişim kuralı, iki sürümü daha ayrıntılı olarak adım 5 ve adım 6, sırasıyla açıklanmıştır. Bu stratejileri farklı araştırma soruları adresi ama benzer yordamları izleyin.

1. ön koşul veya önceki analizleri

  1. Yukarıda açıklanan6kullanılmak üzere tüm gen ifade deneyleri doğrulayın.
    Not: Bu adım de deney tarihi öncesinde yapılıyor. Tüm deneyleri doğrulamak, ticari ve özel, tek hücreli düzeyine kadar ilgili RNA'ın verimli ve doğrusal amplifikasyon emin olmak için gerekli. Birçok ticari olarak kullanılabilir ve özel deneyleri bu özellikleri karşılamak için başarısız. İşleme ve otomatik eğri uydurma ifade deneyleri 96 genlerinin eşzamanlı yeterlilik için Ek kodlama dosyaları 1 – 5içinde sağlanır, ancak bireysel deneyleri R2 ve doğrusal Sığdır yamaç kullanarak nitelikli. Temsilcisi başarılı ve başarısız olan tahlil niteliği araziler Şekil 2' de gösterilmiştir.
  2. Bir akış sitometrik panel hücre yüzey işaretleyicileri ilgi leke antikorların geliştirmek.
    1. Antikorlar ilgili bir örnek örneğin, al yanaklı periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs), boyama ile her antikor titre. Başlamak ile antikor başına 100 µL testinde 20 µL tepki boyama ve sekiz iki kat seri dilutions oluşturun. En fazla yoğunluk süre paraca desteklemek belgili tanımlık negatif ve pozitif nüfus arasında net bir ayrım boyama sergileyen en iyi konsantrasyon tanımlayın.
    2. 1.2.1. adımda belirlenen en yüksek konsantrasyonu, tüm antikorlar karışımı kullanarak ek hücre sample(s) üzerinde kombine boyama değerlendirin. Boyama için bireysel antikor lekeleri gözlemlenen benzer olduğundan emin olun. Boyama ne zaman herhangi bir antikor yalıtım modunda kullanılan görülmektedir az ise, böyle antikorlar yerine alternatif fluorochrome conjugates göz önünde bulundurun.

2. gen ifade tahlil hazırlık

  1. Birleştirme 96 gen ekspresyonu deneyleri bir RNase/DNaz-Alerjik 1-15 mL tüp (boyut sıralama plaka numarası ile farklı olabilir). Bu çalışmada kullanılan deneyleri paneli Tablo 1 ve Tablo 2belirtilir. Elde edilen malzeme "Tahlil Mix" adlandırılır. Her tahlil 180 son bir konsantrasyon için eklemek ileriye ve geriye doğru astar nM. DNA süspansiyon tahlil Mix uygun seyreltme ulaşmak için arabellek ekleyin.
    Not: pratik amaçlar için özel tahlil (Kullanıcı tarafından oluşturulan) hisse senetleri 18 µM piyasada bulunan "20 x" gen ifade qPCR deneyleri (Tablo reçetesi) konsantrasyon ile tutarlı olacak şekilde hazır olun. 18 µM karışımları özel ileriye ve geriye doğru astar her gen DNA süspansiyon arabellek hisse senedi çözümlerinde yapılır. Ticari olarak mevcut deneyleri (Tablo reçetesi) Ayrıca probları, bunlarla probları değildir RT veya cDNA öncesi amplifikasyon ve olabilir için gerekli böylece özel deneyleri için ihmal. Bu bir dahil etmek için tavsiye edilir veya sıralama, hücre kurtarma ve cDNA sentez verimliliğini değerlendirmek için kalite kontrol için daha fazla oda temizliği gen kullanın. CDNA oluşturmak için rasgele astar kullanımı değil belirledi ama gene özgü astar verimli olacağı tahmin edilmektedir.
  2. 2 adet tahlil plaka adım 7.1 (çok katmanlı qPCR) kullanmak için hazır olun. Her içine de bir 96-şey PCR tabak belirlenmiş beklenen her 96 x 96 çip dizi için her testin 6 µL pipet. Örneğin, 5 chips için her testin 30 µL 96-şey plaka tek bir kuyuda yer alacak. 96 deneyleri kullanılıyorsa, her şey 96-şey plaka bir tahlil içerir. Plaka ile yapıştırıcı seal kilitleyin.
    Not: İdeal olarak, adımlar 2,1 ve 2,2 aynı anda birden çok donma-çözülme çevrimleri gen ifade deneyleri için önlemek için gerçekleştirilir. Tahlil plaka tüm genlerde de tahlil Mix (adım 2.1) mevcut olmalı. Tahlil mix ve tahlil plaka-20 ° C veya uzun veya kısa vadeli kullanım için 4 ° C, sırasıyla depolanabilir.

3. yüzey leke hücrelerin

Not: RNA uzlaşma gibi hücre içi boyama, permeabilization ve fiksasyon bu yöntem ile uyumlu değildir.

  1. Tazminat örnekleri Malzemeler tablo hücre boyama için kullanılan daha 2.5-fold daha yüksek konsantrasyon, tazminat boncuk 40 µL için listelenen her antikor ekleyerek hazırlayın. Işıktan korunan 25 ° C'de 20 dk için kuluçkaya. Boncuk ve 500 x g , santrifüj 25 ° C'de 3 min için PBS 3 mL ekleyin PBS Aspire edin ve boncuk PBS ~ 300 µL içinde resuspend.
  2. Akış sitometrik hücre sıralayıcısı için örnek işleme hazırlamak: tazminat tüpler elde etmek, tazminat matris oluşturmak ve matris için deneysel numune alma dosyalar için geçerlidir.
  3. Floresan antikor kokteyl ana karışımı her antikor Malzemeler tablo, lekeli tüm örnekleri için 1,5 mL sarı tüp belirtildiği gibi uygun hacmi birleştirerek hazırlar. Girdap ve santrifüj kokteyl 21.000 x g 2 dk antikor cips için 25 ° c de toplar.
    Not: burada kullanılan antikor Malzemeler tablolistelenir.
  4. 2 dk. Ekle 0,5-2 mL PBS 12 ml 15 mL Tüp, 500 x g , santrifüj 25 ° C'de 3 dk içinde hücre süspansiyon için 37 ° C su banyosu cryopreserved hücrelerde çözülme ve PBS Aspire edin. PBS ve transfer 5 mL polistren Tüp 3 ml resuspend. Yukarıdaki gibi santrifüj kapasitesi ve ~ 20 µL kalan PBS bırakarak PBS, Aspire edin.
    Not: Boyama sıcaklık için daha sıcak veya soğuk sıcaklık koşulları buna göre (bkz. Adım 1.2) boyama antikor titrasyonu değiştirerek özel uygulamalar için gerektiği gibi adapte.
  5. 2 x 107 antikor 80 µL hücrelerde kokteyl yıkanmış resuspend ve ışıktan korunan 25 ° C'de 20 dk için kuluçkaya. 2 x 107 hücreleri, aşan örnekleri artırmak için boyama tepki birim buna göre korumak için < 2 x 107 hücreler/100 µL.
  6. PBS, 3 mL ekleyerek hücreleri yıkama 500 x g 3 min için de centrifuging ve süpernatant aspirating.
  7. İyice 300-500 µL PBS ve filtre hücrelerinde bir 35 µm naylon hücre süzgeç kap ile pipetting tarafından resuspend. Hücreler buz tutmak ve ışıktan sıralama kadar korumalı.

4. hücre toplama plakaları, FACS sıralama gerçekleştirmek ve Generate cDNA hazırlamak

  1. RT-preamp tepki Mix parçaları (Tablo 3) bir tek RNAse/DNaz-Alerjik steril tüp pipetting tarafından birleştirmek.
    Not: Bu adım önce veya 3. adımda boyama sırasında gerçekleştirilebilir. RT enzim burada qPCR sinyal DNA şablona katkısını belirlemek için atlanabilir.
  2. RT-preamp tepki Mix 10 µL 96-şey PCR sıralama koleksiyon tabakları istenen dizi halinde dağıtmak için bir çok kanallı pipet kullanın. Yapıştırıcı film ile plakalarının ve tabakları önceden soğutulmuş 96-şey Alüminyum blok üzerinde yer.
  3. Akış Sitometresi gating düzeni lekeli örnek yaklaşık 20.000 hücrelerden veri kazanılması by sıralama hücre kurmak. Tazminat matris için toplanan veriler geçerli emin olun. Gates çizmek ve gen ifade analizi için izole olmak cep population(s) ilgi tanımlar gating ağacı tanımlayın.
    Not: potansiyel SIV vRNA+ hücreler topluluğu için kullanılan gating ağacı Şekil 3' te gösterilmiştir.
  4. Her kuyuya sıralanması için numarası ve hücre alt grubunu belirtmek için uygun araç ayarlarını girin. Ya sıralama için ek ayrıntılı talimat sınırlayan bir hücre seyreltme serisi veya tek hücre adım 5 ve 6, sırasıyla sağlanır.
  5. FACS hazırlanan 96-şey PCR koleksiyonu kalıplara hücreleri sıralamak. Sıralama önce yapışkan mühür kaldırın ve sıralama takip taze bir mühür ile değiştirin.
    Not: Önceden soğutulmuş Alüminyum blok tabaklarda her zaman belirleyin, sıralama sırasında da dahil olmak üzere.
  6. Hemen sıralama, girdap ve santrifüj sonra koleksiyon plaka 2000 x g 4 ° C'de 1 dk de
  7. Thermocycle bir PCR makinesi aşağıdaki koşullar kullanarak önceden ısıtılmış bir kapak ile plaka: 50 ° C 15 dakika (RT), 95 ° C için 2 dk, ardından 95 ° C 18 döngüsü tarafından 15 s ve 60 ° C 4 dk (öncesi amplifikasyon) için.
  8. DNA süspansiyon arabelleği yeni bir 96-şey PCR plaka 20 µL içine cDNA 5 μL aktararak cDNA 1:5 oranında seyreltin. Seyreltilmiş cDNA 4 ° C veya -20 ° C süresiz olarak bu noktada depolanabilir. CDNA şimdi qPCR (adım 5.2, 7,4) için bir şablon olarak kullanılmak üzere hazırdır.
    Not: Bu seyreltme RT-preamp tepki olarak mevcut astar için aşağı akım qPCR katılmazlar sağlar.

5. varyasyon A: FACS sıralama hücreleri vRNA+ sıklığını belirlemek için bir sınırlama seyreltme dizisine hücreleri veya deneysel kalite kontrol gerçekleştirin

Not: tek hücreli sıralama gerçekleştirmeden önce Bu çoğaltma içinde seri dilutions içine hücreleri sıralayarak ilgi, hücrelerin frekansını belirlemek için kullanım olabilir. Bu adımı da değerli kalite kontrol için sıralama verimliliği, hücre lizis, RNA kurtarma ve cDNA sentezi, 5.3 adımda anlatıldığı gibi sağlar. VRNA+ hücre frekans önceden belirlenmesi uygun şekilde güçlendirilmiş vRNA+ hücre gen ifade analizi için yeterli örnek boyutu elde etmek için sıralanması gerekir tek hücre sayısı daha doğru tahmin sağlar.

  1. FACS adımları 4.1-4.2, olduğu gibi hazırlanan 96-şey tabak içine hücreleri sıralamak ve birden çok çoğaltır kuyuda başına 1-1000 hücreleri toplamak.
    Not: Her hücre seyreltme, Çoğalt kuyu sayısı genellikle ters hücre konsantrasyon iyi ücret ile ilişkilidir. Enfekte hücre frekans de %1 altında olduğunda, hücre dilutions iyi başına 100 – 1000 hücre üzerinde odaklanmalıdır. Bir örnek sıralama plaka harita Şekil 1' de, sol üst sağlanır. İyi başına 1.000 hücre aşan nedeniyle sonuçta ortaya çıkan artışlar kaçınılmalıdır tepki birim ve aşağı akım cDNA sentez ve miktar ile müdahale.
  2. QPCR reaktifler Tablo 4ana mix çözümde birleştirir. 25 µL tepki birim için ana Mix 22.5 µL 2.5 µL seyreltilmiş cDNA şablonunun adım 3.9 ile birleştirilmiştir. Standart Bisiklet koşullarını kullanarak qPCR gerçekleştirmek (Örneğin, 94 ° C 5 min için 94 ° C 40 döngüsü tarafından takip 15 s ve 60 ° C için 1 dakika için).
    Not: Singleplex qPCR reaksiyonlar geleneksel gerçek zamanlı qPCR enstrüman kullanarak verimli hücre sıralama, RNA kurtarma ve cDNA sentez göstermek için bir ya da birkaç deneyleri bir ekonomik ön analiz olarak tavsiye edilir. VRNA+ hücre frekansını hesaplamak için de kullanılabilir. Biomark kullanarak çok katmanlı qPCR reaksiyonlar genellikle büyük ölçekli tek hücreli analizleri için daha uygundur.
  3. Kalite kontrol için Et arsa değerleri (Et Ctmax − Ct =) karşı hücre sayıları göre iyi bir günlük10 ölçekte başına ve doğrusal regresyon analizi uygulayın.
    Not: Tutarlı çoğaltır, doğrusal regresyon yamaç 3.3 (± 0,3) ve R2 > 0,9 verimli bir deney göstergesi. En iyi ve suboptimal sıralama örnekleri, RT-preamp deneyler Şekil 4' te gösterilmiştir.
  4. VRNA+ hücreleri sıklığını belirlemek için hücre sayıları x ekseni (günlük10 ölçek) ve kısmını iyi başına göre Arsa vRNA, y ekseni üzerinde her hücre seyreltme için olumlu kuyuları. Örneğin, Şekil 1 (alt sol, Poisson dağılımı) bakın. Bir doğrusal regresyon modeli verileri bir pozitif hücre ortalama, kuyu pozitif (y ekseni üzerinde 0.632)%2163,2 karşılık gelen liman hücreleri belirlemek için uygulanır. Bu hücre seyreltme sayı (x ekseni kesişim noktası) yüzde ifade edilen frekans dönüştürün. Örneğin, bir vRNA+ hücre başına 48 hücreleri % 2.1 bir frekans için eşdeğerdir.

6. varyasyon B: FACS sıralama hücreleri tek hücre analizi için

  1. 4.1-4.8, adımları izleyin ve iyi konuma göre eşlenen bir hücre de akış sitometresi'nın Dizin sıralama özellik sıralanmış, her hücre için bireysel FCS dosyaları oluşturmak için kullanarak başına göre belirtin.
    Not: sıralama koleksiyon tabakları kullanılabilir thermocyclers sayısını aşıyor, ters transkriptaz inactivation adım (95 ° C için 2 dk) sonra Bisiklete binme durdurulabilir ve thermocyclers mevcuttur kadar cDNA 4 ° C'de depolanabilir. Bu durumda, 95 ° C ilk döngüsü 15 öncesi amplifikasyon başlamak s.
  2. İsteğe bağlı: cDNA "havuzları arta kalan su katılmamış cDNA kullanarak ilgi nadir hücreler için ekrana gelen Kullanıcı tanımlı toplu işlemleri tek hücre cDNA oluşan" oluşturun. Su katılmamış tek hücreli önceden güçlendirilmiş cDNA 2 µL çok kanallı pipet tarafından yeni bir 96-şey plaka aktarın. CDNA belirlenen havuzundan tüm ek tek hücrelerden pipetting 2 µL tarafından aynı de yineleyin. CDNA havuzları gene(s) ilgi pozitif hücrelerinin geleneksel qPCR kullanarak içeren belirlemek için (Örneğin, vRNA) için ekran. Havuzu cDNA her hücreden, sadece küçük bir aliquot gerektirdiğinden cDNA kalan ~ 8 µL tek hücreli analizleri için bulunmaya devam eder.
    Not: Kaynak-yoğun katlı qPCR tarafından sorguya tek hücre sayısını azaltmak için bir çaba tek hücreli gen ifade analizleri gerçekleştirmeden önce havuzu oluşturma stratejileri tavsiye edilir. Hangi faiz (Örneğin, SIV mRNA +) hücrelerinin bir ön tek-plex qPCR tahlil tarafından tanımlanan durumlar için uygundur. CDNA havuzları oluşturmak üzere basit yüksek üretilen iş stratejileri bir koleksiyon sıralama tabağın (tüm 12 satır A hücreleriyani ) satırları veya sütunları (sütun 1 tüm 8 hücreleriyani ), su katılmamış cDNA 2 µL birleştirerek yeni bir tabak içinde tek bir kuyuya içerir. En iyi strateji havuzu belirlemek için adım 5.4 faiz hücrelerinin beklenen sıklığını göz önünde bulundurun. Örneğin, hücrelerin % 10'u olumlu olacağı tahmin ediliyor, altı tek hücreli cDNA örnekleri oluşan havuzları sık eksi olacak ve o havuzda temsil hücreleri böylece aşağı akım tek hücreli analizleri dışlanabilir.

7. qPCR Biomark platformda multiplex

Not: Bu bölümde sürüm A veya B yukarıda açıklanan takip edebilir. Burada açıklanan çalışmada, sadece tek hücre Analizi uygulandı.

  1. Testin her iyi reaktif yükleme 4 µL içeren yeni bir 96-şey PCR tabak içine qPCR tahlil plaka her testin tahlil plaka (adım 2.2 hazır) x 2 pipetting 4 µL hazırlayın. 4 ° C'de tahlil plaka korumak
    Not: Tahlil plaka 4 ° c ilâ bir hafta ve bir ay için-20 ° C'de stabil. Böylece, birden çok patates kızartması için yeterli malzeme hazırlamak ve uygun şekilde depolamak yararlı olabilir.
  2. Denetim satır sıvıları astar şırınga dan çip iki alımı valfleri dağıtmak. Koruyucu plastik plaka altından kaldırın. Çip A1 konumundaki çentikli tarafı ile bir IFC denetleyicisi yerleştirin. Ana menüden "Prime" komut dosyası seçin. Komut dosyasını çalıştırın.
  3. Gerçek zamanlı tepki Mix 50 µL PCR Master Mix (Tablo reçetesi) 500 µL her mikrosıvısal çip ile reaktif yükleme örneği karıştırarak hazırlayın. 4.4 µL PCR plaka, bundan böyle "örnek plaka" belirlenmiş yeni 96-şey her kuyuya pipet.
  4. 1:5 seyreltilmiş cDNA gerçek zamanlı tepki karışımı içeren örnek plaka içine adım 4,8 3,6 µL pipet.
    Not: Eğer bir PCR aşağı-seçimi gerçekleştirildi nadir (Örneğiniçin vRNA+) hücreleri aşağı akım analizi için 6.2. adımda anlatıldığı gibi ekran, sadece olumlu havuzlarında temsil hücreleri ekleyin.
  5. Çip astar tamamlanmasını takiben, çip alıcılar dağıtım 5 µL de çip çentikli (tahlil) tarafında karşılık gelen içine tahlil plaka ve 5 µL örnek plaka de (örnek) öbür çip üzerinde karşılık gelen içine yükleyin. Çip IFC denetleyicisi olarak yerleştirin ve "mix yük" komut dosyasını çalıştırın.
  6. Çip çoğaltılmış qPCR gerçekleştirmek için Biomark platformu aktarın. Araç kurulum ve gerçek zamanlı PCR analiz yazılımı tarafından sağlanan ve PCR ile 40 devir gen ifade (GE) 96.96 Standart V.1 protokolünü kullanarak adım adım talimat takip qPCR programlama ile devam edin. ChipRun dosya belirtilen bir klasöre kaydedin.
    Not: Birden fazla cips günlük ve birden fazla gün içinde çalışabilir.
  7. QPCR veri analiz.
    1. Gerçek zamanlı PCR analiz yazılımı açın. "ChipRun.bml" Dosyadan Aç "dosya | Açık"menü.
    2. "Çip Explorer" ve "Çip Run Özeti" LightBox penceresinin sol üst köşesinde bulun. Chip Run Özeti üç bileşenlerini belirlemek: analiz görünümleri, örnek kurulum ve dedektör Kur.
    3. "Dedektör yapısı üzerinde"'nı tıklatın. "Görev" altında "Yeni" tıklatın ve kapsayıcı türü "SBS plaka" ve konteyner biçimi "SBS96" seçin. "Eşleştirme" yanında tıkırtı üstünde... düğmesini tıklatın ve "M96-tahlil-SBS96.dsp" seçin.
      1. İsteğe bağlı: her bulmak (tahlil) bir sayı ya da adı her şey "adı" bölümünde dest 1 çift tıklatarak atayın. De "F2" tuşuna basarak geçmek.
    4. "Örnek yapısı üzerinde"'nı tıklatın. "Görevi altında" "Eşleştirme" yanında, tıklatın... düğmesini tıklatın ve "M96-örnek-SBS96.dsp" seçin.
    5. "Analiz görünümleri" seçeneğini tıklatın. "Temel düzeltme Lineer (türev) için", "Görev altında", "qPCR" sekmesini seçin ve "Ct eşik yöntemi Kullanıcı (dedektörleri) için". "Ct eşikleri" sekmesinde, "Başlatma" otomatik kutusunu kontrol edin. Yukarıdaki "Analiz" düğmesini tıklatın.
    6. 'Analiz görünümlerini"üst sağ çeyreği'ikinci sekmesinde"Sonuçları tablo "'ı tıklatın. Açılan menüde "Isı harita görünümü". Isı haritası verilerle görüntülenir.
      1. İsteğe bağlı: Tekdüzen ROX floresans karşıdan karşıya belgili tanımlık küçük parça sağlamak için "Görüntü görünüm" yerine "Isı harita görünümü" aynı menüden seçin. İkinci ısı haritası üzerinde doğru penceresinden "ROX" seçin. İlkinden sağdaki pencereye 1-40 döngüleri birini seçin. Dördüncü doğru penceresinden ROX floresan siyah beyaz görüntüye geçiş yapmak için tıklatın. Görüntüyü splatters, parçacıklar, bildirir veya yonga üzerinde kusurları görünür. ROX tekdüzelik fena halde gizlenmiş çip yeniden çalıştırın.
    7. Isı haritası altında "Eşik" ve "Günlük grafik"'ı tıklatın. Ct eşikler el ile her dedektör deneyleri (ısı haritası sütunlarından) tıklatıp sürükleyerek eşik amplifikasyon eğrileri veya üssel faz kesiştiği gerektiği gibi ayarlayın. İşiniz bittiğinde, "Analiz"'ı tıklatın.
  8. QPCR verileri bir .csv dosyası olarak verin. Verileri bir elektronik tablo veya istatistiksel analiz yazılımı (Örneğin, JMP) içine alın ve sonuçlarına göre çip örnek ve tahlil pozisyonlar eşleyin. Hücreler viral genlerin ifade üzerinde temel alan yeni bir sütun oluşturup koşullu bir formül kullanarak gruplar halinde düzenleyin. Altında "Analiz", "Y X tarafından uygun" seçin ve grup karşı gen ekspresyonu arsa. İstatistiksel analiz için geçerli.
    Not: Temsilcisi tek hücreli nicel ifade dört SIV RNA türlerin Şekil 5Abivariate parsellerde tasvir edilir. Nicel ana bilgisayar gen ekspresyonu SIV RNA+ hücrelerdeki Şekil 5Biçinde gösterilir.
  9. Nicel protein ifade değerleri tek hücreli FACS verileri ayıklayın.
    1. .fcs açın FACS dosyaları sıralamak için 96-şey plaka FlowJo sürüm 9 kullanarak (adım 6.1) karşılık gelen. Vurgulanan dosya adıyla seçin "platformu | Olay numarası kapı | Dizin oluşturulmuş sıralama gates oluşturmak". Tek tek hücreler satır tarafından görüntülenen görünür.
    2. Tüm 96 hücreleri (değil satır) vurgulayıp seçiniz "çalışma alanı | İhracat | «««Seçin"tüm telafi fluors. "Veri türü" altında "FCS Dosya" seçin, "Ver"'i tıklatın ve belirlenen bir klasör seçin.
    3. Yeni .fcs dosyaları tek tek hücreler için yeni bir FlowJo çalışma alanına sürükleyin. Tüm hücreleri vurgulayın, "İstatistik" ("Σ" düğmesini sol üst köşede) eklemek tıklatın "| Demek | Tüm fluor parametreleri".
    4. "Tablo Düzenleyicisi" sol üst köşede soldan dördüncü düğmesini tıklatarak açın. İlk hücrenin tüm fluores vurgulayın ve tablo Düzenleyicisi penceresine sürükleyin. Tablo Düzenleyicisi penceresinde üst "Oluşturmak ve görünüm tablosu" aynı düğmeye tıklayın. Bu 96 hücreleri ve her fluor için sayısal bir parametre bir tablo oluşturur.
    5. Çıkış bir veritabanı yazılımı (Örneğin, MS Excel, JMP), ya da kopyalama/yapıştırma veya "Uygulaması kaydetmek ve denize indirmek" tıklayarak (dördüncü tablosunun üstünde belgili tanımlık sol düğme) kopyalayın.
      Not: Bu yordam FlowJo sürüm 9 için özeldir. FlowJo yorum 10 farklı bir yordam dizini oluşturulmuş veri almak için kullanır. Dizin oluşturulmuş akış veri kopyalanan/kopyaladım içine JMP doğrudan hücre sıralayıcısı tarafından oluşturulan .csv dosyalarından da olabilir.
  10. Tek hücreli FACS veri ve plaka numarasına göre qPCR veri birleştirme ve de getirin. Birleştirilmiş tek hücreli gen (qPCR) grafik ve istatistiksel analizleri gerçekleştirmek ve protein ifadesi (FACS) verileri.
    Not: Tek hücreli örnekleri qPCR kombine ve FACS veri Şekil 6 ' da gösterilen (yüzey proteini ifade profilleri SIV-enfekte, spliced vRNA+ rhesus makak hücreler için ev sahibi), Şekil 7 (CD4 gen ekspresyonu yüzey karşı CD4 protein ifade spliced vRNA+ rhesus makak hücreleri) ve daha önce20yayınlandı. Hücre population(s) ilgi genlerinde differentially tanımlamak için ifade, tek hücreli analiz yöntemleri daha önce açıklanan önerilen20,22,23,24, için hangi hesabı hücreleri bir gen için hem de sürekli gen ifade değeri pozitif oranı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tüm iletişim kuralı için iş akışı Şekil 1' de tasvir edilir. İki varyasyon göre hücre sayısı tarafından tanımlanan oluşur: her iki sınırlayıcı seyreltme ya da metinde açıklandığı gibi hücreleri, tek. Logosuna 2 kat seri RNA dilutions astar-sonda yeterlilik analizlere örnekleri Şekil 2' de gösterilmiştir. Potansiyel SIV+ hücreleri tanımlamak için gating strateji Şekil 3' te gösterilmiştir. Temizlik gen GAPDH seyreltme sınırlama FACS sıralanmış hücreler üzerinde suboptimal başarılı ve başarısız olan kalite kontrol qPCR Şekil 4' te gösterilmiştir. Tek hücreli nicel ifade genlerin Bu differentially enfekte hücrelerde ifade edildi dört SIV RNA çeşitleri ve rhesus makak Şekil 5' te gösterilmektedir. Temsilcisi bivariate, çubuk grafik ve scatterplots tasvir yüzey proteini ifade profil+ T SIV RNA+ CD4 hücreleri ölçülen tarafından akış sitometresi Şekil6. Trivariate kabarcık Arsa (Şekil 7) yüzey CD3 veya CD4 protein, CD3 veya CD4 mRNA ve nicel viral gen arasındaki ilişkiyi görüntüler (tat/rev) ifade tek kişilik hücrelerde.

Figure 1
Resim 1 : Deneysel iş akışı şeması gösterir üç ana bileşenleri: akış sitometrik sıralama, Ters transkripsiyon artı PCR tabanlı cDNA öncesi amplifikasyon (RT, ön amp) ve qPCR. Sıralama ya da sınırlayan bir seyreltme (A, yeşil zemin) veya tek hücre (B, turuncu zemin) olarak yapılabilir. Hemen ardından FACS sıralama hücreleri lysed ve RNA olduğunu ters kopya etmek cDNA ve (qPCR şablon hazırlamak için önceden güçlendirilmiş RT, ön amp PCR). Sınırlayıcı seyreltme sıralar için viral RNA yanı sıra deneysel verimliliği Poisson dağılım istatistiklerini kullanarak hücreleri olumlu sıklığını belirlemek ve kurtarma örnek. Yeşil ok başından bir hücre frekansına dönüştürülür de içeren bir hücre için bir viral gen (gen olumlu olmak böyle wells %63,2 olasılığı için karşılık gelen), pozitif başına hücre sayısı tahmini sıralı gösterir. Frekans tahminleri tek hücreleri bir sonraki sıralama (B) toplanan bilgilendirmek için kullanılır. Dizin oluşturulmuş tek hücreli FACS sıralama mevduat bir şey hücre ve 96-şey plaka içinde iyi konuma göre açıklamalı her hücre için veri dosyaları oluşturur. Tek hücreli qPCR multiplex 96 genler için içinde aynı anda gerçekleştirilir. Yüzey proteini (FACS) ve mRNA ifade birleştirme bireysel hücrelerin (sağ sütun) profil oluşturma için sağlar. Viral bir gen için isteğe bağlı bir qPCR yapılabilir öncesi amplifikasyon PCR ve çoğaltılmış qPCR (B, orta) ekran tek hücrelere veya tek hücre cDNA aşağı seçim viral RNA+ hücrelere takımlık veya multiplex qPCR analiz için havuzları arasında. Isı haritası gen ekspresyonu (Ct değer) için 96 deneyleri (sütunlar) ve 96 tek hücreleri (satırlar) gösterilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Astar yeterlilik deneyleri verilerden temsilcisi qPCR are göstermek için başarılı (soldaki ve ortadaki) ve (sağda) ticari olarak mevcut deneyleri başarısız oldu (CD6, SIV tat/rev, ve TLR3, sırasıyla). CD6 ve TLR3, RNA 106 FACS sıralanmış rhesus makak PBMC CD4 ayıklandı için+ T-hücreleri ticari bir seti kullanarak. Sekiz on iki nokta RNA iki kat seyreltme dizi çoğaltır (0.023-48 ng 1.2-2400 hücre eşdeğerlerine CD4 başına 20 pg RNA varsayarak karşılık gelen RNA,+ T hücreli) RT-preamp ve qPCR tabi tutuldu. SIV tat/reviçin rhesus makak SIVmac239 ile enfekte PBMCs vitro RNA çıkarılan. RNA dilutions 6-12.000 hücreleri kapsayan RNA karşılıkları hazırlanmıştır. Et gen ekspresyonu ile artırmak, (40-Ct) değerlere karşı tahmin edilen hücre sayıları çizilen. R2 sergilenmesi seyreltme serisi > 0.97 ve 3.32 ±0.3 eğimini gösterir başarılı astar yeterlilik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Bivariate FACS araziler için yalıtım potansiyel SIV tarafından enfekte rhesus makak hücre şeması geçişi ile. Bellek (CD95 +) seçmek için sıralı gates CD4+ T hücreleri her nüfus adı belirtilen alt sağa üst soldan gösterilir. Her kapı içinde düşüyor üst Arsa yüzde belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : QPCR temsilcisi deneysel doğrulamanın yapılacağı dilüsyonu kullanılarak sınırlama FACS sıralanmış hücreler üzerinde GAPDH Temizlik Hizmetleri gen üç bağımsız deneyler için: başarılı (sol), suboptimal (orta) ve (sağda) başarısız oldu. Çoğaltır iyi başına 10-100 hücrelerinin span fazla 2 Ets ve 300-1000 hücre kuyu 1 içinde Et. Doğrusal regresyon yamaç 3.32 ± 0,3, R2 olmalıdır > 0,95. Başarısızlık bu özellikleri elde etmek için adımlar 1, 2, 3 veya diğer birleşimlere teknik zorluklar gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Tek hücreli nicel viral ve ana bilgisayar gen ifadesinde FACS sıralanmış rhesus makak CD4+ T hücrelerinin mezenterik lenf nodu 10 gün sonrası-SIVmac251 enfeksiyon. (A)Viral gen ekspresyonu bivariate arsalar çarpma-spliced in (tat/rev) ve tek başına spliced (env) SIV mRNA tek tarafından hücreleri (solda). Tat/rev+env- hücreleri (açık yeşil hücrelerin x ekseni boyunca) ifade tatdaha az kopyaları /rev RNA env+ hücreleri (koyu yeşil), erken bir ile tutarlı daha sahne enfeksiyon ve Rev protein aracılı istikrar ve nükleer ihracat envgibi kısmen spliced vRNAs önce. Spliced viral RNA ifade edemediği hücreler gri (hiçbir viral RNA), kahverengi (+ gagve soldan sağa+) veya tan (+ gagveya LTR+) tasvir edilmektedir. (Gag+) unspliced ve toplam (soldan sağa+) SIV mRNA ifade aynı hücreler için (doğru) gösterilir. Unspliced gag RNA tatiçinde yüksek bolluk /rev+env+ hücreleri ile geç sahne verimli enfeksiyon sırasında bol genomik RNA ifade edilen ambalaj içine tomurcuklanma için tutarlı virions. (B) keman differentially SIV-enfekte hücreler kandan hücrelere (gri) göre en az bir alt kümesini ifade rhesus makak genlerin çizer. İstatistiksel analiz daha önce açıklanan20,22,23,24gerçekleştirildi. Yıldız işareti yanlış bulma oranı < % 10'luk kombine olabilirlik oranı test karşılaştırmaları kandan hücrelere göre gösterir. Satır ortalama değerleri her gen için hücre grupları arasında bağlar. Bu rakam Bolton ve ark. değiştirildi 20 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Temsilcisi Ana yüzey proteini ifade profilleri rhesus makak mezenterik lenf nodu 10 gün sonrası-SIVmac251 enfeksiyon FACS sıralanmış hücrelerinin. (A)Scatterplot göstermek bulaşmamış (gri),+ gagtat/rev- (kahverengi) CD3, CD4 ve ICOS yüzey proteini ifadesinde vetat/rev+ hücreleri (yeşil)+ gag. Floresan yoğunluğu (nokta) her hücre için çizilir. Aykırı kutu araziler tasvir interquartile aralığı (IQR) ve ortanca (kutusunu), 1,5 içindeki en uzak noktaları kutusu (bıyık) ve potansiyel outliers (bağlantısı kesilmiş puan) üzerinden x IQR. Üst yatay çubuklar önemli farklılıklar gösterir (p < 0,05, nonparametrik Wilcoxon rank testi). (B) ekran (A) gösterilen hücre yüzey CD3 ve CD4 protein ifade regresyonda ve çubuk grafik. Nokta Arsa (solda) bir kadran içinde her hücre nüfusunun yüzde gösterir. CD3 ve CD4 çubuk grafikler (orta, sağ) yüzey proteini downregülasyon gag+tat/rev+ hücreleri göre zarar görmemiş ve+ gagtat/rev- hücreleri arasında tasvir. (A-B) (C) on iki temsilcisi tat/rev+ tek hücrelerin CD3/CD4 (solda), CD69/CD38 (orta) ve ICOS/HLA-DR (sağda) yüzey ifade için üç bivariate araziler üzerinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 : Trivariate Arsa tek hücreli viral gen (tat/rev), ana bilgisayar gen (CD3 veya CD4) ve ana bilgisayar yüzey proteini (CD3 veya CD4) ifade+ T bellek SIV-enfekte CD4 hücreleri mezenterik lenf düğümü 10 gün Post-SIVmac251 enfeksiyon. Her hücre tarafından ifade edilen tat/devir miktarı nokta boyutu tarafından yansıtılır iken CD4 protein ifade (floresan) CD4 mRNA (qPCR), karşı çizilir. Tatolarak /rev+ hücreleri (yeşil), sırasıyla sürekli CD4 ve CD3 dökümleri ile yüzey CD4 ve CD3 protein ifade azalmıştır, yüzey proteini ifade aşağı modülasyonlu belirtmek gen ifadesi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Astar ve SIV nükleik asitler tespiti için kullanılan problar. İki dizinin bir astar veya sonda için belirtilen zaman, her iki serilerini ekimolar miktarda kullanılmıştır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tablo 2: amplicons Biomark cihazda Nefelometri için kullanılan bir 96-gen panel. Dört SIV deneyleri mavi arka plan ile gösterilir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tablo 3: Ters transkripsiyon ve öncesi amplifikasyon için kullanılan tepki mix. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tablo 4: gerçek zamanlı PCR için kullanılan qPCR reaksiyon mix Quant Studio 6 araç üzerinde gerçekleştirilen. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek kodlama dosyası 1. Gen ifade deneyleri geçerli olan yönergeleri. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek kodlama dosya 2: örnek harita şablonunda JMP. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek kodlama dosya 3: yoklama Haritası şablonu JMP içinde. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek kodlama dosya 4: astar Analysis komut dosyası JMP için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek kodlama dosya 5. Piecewise analiz script JMP. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokol, burada açıklanan tSCEPTRE olarak adlandırdığı, multiparameter akış sitometresi ile nicel tek hücreli mRNA ifade son derece çoğaltılmış RT-qPCR tarafından tarafından tek hücre yüzey proteini Nefelometri bütünleştirir. Bu iki teknoloji Birliği yüksek içerikli anlık görüntülerini kombine transkripsiyon ve bir yüksek-den geçerek biçimde tek hücre proteini profili sağlar. Biz SIV vivo içindeile enfekte şimdiye kadar zor hücrelerini tanımlamak için yöntemini kullanın ve differentially ifade ana bilgisayar genler ve proteinler açıklayın. Protokol herhangi bir hücre popülasyonu ayırt ilgi çalışma için yüzey protein(s), mRNA veya bunların bir arada ifade tarafından adapte edilebilir. Tek hücreli doğru sıralama açıklanan yöntemleri itimat ve veri akış sitometresi tarafından kayıt piyasada bulunan qPCR reaktifleri ile eşleştirilmiş ve gerçek zamanlı PCR araçları multiplexed. Tek hücreli kombine protein ve gen ifadesi verileri hassas, kantitatif değerlendirilmesi çıktıdır.

Tek hücre proteini ve gen ifadesinde bağlama diğer yaklaşımlar olmuştur açıklanan1,25,26,27. Dizin oluşturulmuş FACS sıralama RNAseq başarıyla uygulanan hematopoetik kök hücre, karakterizasyonu, ardından özellikle umut verici bir yaklaşım28temsil eder. Ancak, süre RNAseq hedeflenen gen ifade analizleri, Yani tarafsız tam transcriptome analizi, birçok avantajı vardır bu daha yüksek bir tabi birden fazla karşılaştırmalar istatistiksel maliyet ve düşük kopya miktar için daha az duyarlı olabilir transkript. Ayrıca, şu anda hücreleri bulmak için nadir enfekte hücreleri frekanslarda mevcut binlerce RNAseq gerçekleştirmek için ekonomik olarak mümkün değildir < % 1 (Örneğin, HIV, SIV). Diğer gelişmekte olan tek hücreli teknolojileri tek bir okuma, Yani, FACS veya PCR, proteinler ve nükleik asitler aynı hücrede tespiti için oluşturmak hedefliyoruz. Bu proteinler tarafından floresan antikor ve floresan oligonükleotid probları FACS analiz (mRNA akışı balık)14,15,29,30tarafından takip tarafından mRNA tespiti içerir. Alternatif olarak, protein reversely kopya etmek mRNA31,32,33,34 ile paralel olarak qPCR tarafından algılanan antikor-oligonükleotid conjugates bir çift ile tespit edilebilir . Bu "karma" yaklaşımlar eşzamanlı nükleik asit ve protein ölçümleri ile tek hücreli kararlılık tSCEPTRE için benzer sağlar, ama onlar are mahdut nerede onlar da niceliksel değil (mRNA-akış-balık) veya gerektirebilir antikor veya mRNA özelleştirilmiş sondalar. Bizim tSCEPTRE yaklaşım için protein ve mRNA ölçümleri nicel ve tüm reaktifler piyasada bulunan patojen özgü deneyleri olası istisna ile.

Özel ilgi analiz deneysel örnekleri önce protokolünde çeşitli adımlar uygulanmalıdır. İlk, yüksek-parametresi akış sitometresi gerektirir dikkatli optimizasyon floresan antikor hassas algılaması ve çözümlemesi35emin olmak için bir panel. Her antikor tek tek tüm antikor conjugates birlikte kullanıldığında boyama değerlendirmesi ardından en iyi ayrılık ve minimal arka plan boyama, elde konsantrasyonu belirlemek için titre. Her gen ilgi ölçmek için uygun qPCR gen ifade tahlil ikinci, deneysel belirlenmesi esastır. Birden fazla ticari olarak mevcut deneyleri için her gen ulaşabileceğiniz önceden ama deneyim, birçok tek hücreli seviye6nicel değildir. Böylece, tüm önerilen deneyleri seri olarak seyreltilmiş RNA kantitatif gen ekspresyonu için kullanmadan önce üzerinde hak kazanmak önemlidir. Bu reaktifler duruma getirilmesi zaman alıcıdır ama ilgi tüm molekülleri hassas tespiti için sağlar antikor conjugates ve gen ifade deneyleri güvenilir panelleri değerini zaman yatırım haklı. Buna ek olarak, exon exon kavşak (alternatif genomik DNA (sonek "s1" veya "g1" algılama yeteneğine deneyleri rağmen "m1" soneki ile özgüllük mRNA için geliştirmek için belirlenmiş) yayılan probları içeren ticari olarak mevcut deneyleri için öncelik verilmelidir ) gen ifade sonucu her hücrede eşdeğer kromozom kopya nedeniyle etkilemek olası kabul edilir. RT, RNA akıntıya karşı korunması önemlidir ve soğutulmuş, örnekleri boyunca protokolünün belirtildiği gibi tutarak elde edilir. Benzer şekilde, FACS sıralama ve sıralama arasındaki aralığı süresi ve RT-preamp minimumda tutulması. Hem sınırlayıcı seyreltme ve tek hücreli sıralama için cDNA ilk RNA kurtarılması değerlendirmek için geleneksel qPCR tarafından son derece genler kat hizmetleri ifade çözümlenebilir. Gözlenen deyim çoğaltır cep numaraları gibi veya dilutions başarısız doğrulama sınırlamak için doğrusal Sığdır yamaç arasında Tekdüzen değilse, sorun giderme hücre sıralama ve aşağı akım işlemleri yapılmalıdır.

Burada açıklanan yaklaşımın potansiyel sınırlamaları (1) tespiti DNA RNA, ek olarak özgü olmayan mRNA splice kavşak ve yüzey proteinleri ve ölçülen genler (2) sınırlı sayıda deneyleri için özellikle içerir. Ancak, DNA algılama önemli ölçüde farklı ana bilgisayar gen ifade analizi için yukarıda belirtilen nedenle katkıda bulunmak mümkün değildir. Ayrıca, doğrudan için DNA katkıda qPCR sinyal bu iletişim kuralı için iki yaklaşım tarafından ölçüde ölçülen: a) transkriptaz hariç ve b) nükleer membran lizis geliştirmek için hücre lizis Protokolü değiştirme. Ters transkriptaz yokluğunda, her iki spliced ve unspliced viral genleri hala algılandı, ancak, önemli ölçüde transkriptaz varlığında daha frekansını düşür (~ 6-fold ve logosuna 2 kat indirimleri, sırasıyla)20. Bu nedenle, viral gen ifade deneyleri viral RNA viral DNA hücre ilişkili varlığı nedeniyle hücrede mevcut miktarı abartma. Bu bulgu SIV/HIV RNA spliced ve unspliced gelen virions36kaynaklanan için bilinen ana hücre enfeksiyon sırasında oluşturulan sitoplazmik RT ürünler için öznitelik. Böylece, bu koşulların transkriptaz DNA elde edilen şablon bazı uygulamalar için quantitate için eksik bir kısmını deneyler adamak için tavsiye olabilir. Ayrıca gelen virüs--dan türetilmiş unspliced SIV/HIV RNA sentez de novo viral RNA seçkin dikkat edilmelidir. İkinci olarak, bir nükleer lizis adım RT-preamp Protokolü dahil ve entegre SIV DNA (Alu-LTR) kopya bir üstel artış gözlendi (Şekil S3 Bolton vd.) 20. genomik DNA düşüktür bu nedenle burada kullanılan hücre lizis yönteminden çıkarılan nükleik asit şablon önemli ölçüde katkıda bulunmak. Not, bir nükleer lizis adım eklenmesi yararlı gelecekte tek hücreli çalışmalar SIV veya gizlice enfekte hücreleri de dahil olmak üzere diğer virüs DNA'sı pozitif hücreleri araştırmak isteyen olabilir.

Yüzey proteinleri analiz numarası akış sitometrik hücre sıralayıcısı yeteneği ile belirlenir. Şu anki piyasada bulunan aletleri 30 parametreleri fazla olamaz. Gelecekteki çalışmalar daha gelişmiş akış sitometresi istihdam daha fazla yetenek bu yaklaşımın profil oluşturma protein genişletecek. Transkript sayısı da 96, sağlanan destek reaktifler (Örneğin, astar daha yüksek konsantrasyon), ekipman ve araçları genişletilebilir. Sonuçta, Proteom (kütle spektrometresi) analizini birleştirmek tek hücreli teknolojiler ortaya çıkan, transcriptome (RNAseq) ve genom (DNAseq) bulma araştırma31,37, için hedeflenen yaklaşımlar'ın yerini 38 , 39. ancak, hedeflenen qPCR büyük olasılıkla böyle "omics" yaklaşımlar nicel ifade analizleri için altın standart olarak doğrulamak için değerli bir araç olmaya devam edecektir.

TSCEPTRE göre kombine protein ve transkripsiyon analiz nadir veya hücreleri bu patojenler barındıran, oncogenes içeren veya başka türlü bir anormal fenotip sergilenmesi gibi tespit etmek zordur soruşturma için güçlü bir araçtır. Transcriptionally etkin SIV/HIV enfekte hücreler için yeni işaretleri bu şekilde yanı sıra yeni mekanizmaları bu viral enfeksiyonlar patogenezinde dahil keşfi tespit. Gizlice enfekte hücreleri tanımlaması daha da geliştirilmesi, bir protokol ana bilgisayar genom viral DNA entegre eşek için gerektirir. Not, HIV/SIV enfekte hücreleri sıklığı bu ayarları elde edilen eğitim enfekte hücreleri pratik mücadelesine sunacak kronik viremic ya da tedavi hastalık içinde önemli ölçüde düşüktür. Yaklaşımımız daha önce zorlu bir mekanizma değerlendirmek için zemin bırakır: Bu tek hücre düzeyinde çoğu yönetmelik ve geniş uygulanabilirliği daha genel hücresel işlemlerin yanı sıra ev sahibi-patojen etkileşimleri vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu eser askeri tıp ilerleme, Inc, Henry M. Jackson Vakfı ve ABD Savunma Bakanlığı (DOD) arasında bir işbirliği anlaşması (W81XWH-07-2-0067) tarafından desteklenmiştir. Görüşler yazarlar vardır ve ABD Ordusu veya Savunma Bakanlığı'nın pozisyonlar temsil etmek üzere alınmamalıdır. Araştırma bir akredite AAALACi tesis hayvan refah Yasası ve diğer federal tüzük ve hayvanlara ilişkin düzenlemelere uygun olarak onaylanmış hayvan kullanım kuralında altında yapılmıştır ve içeren hayvan deneyleri ve politikalarına Bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının, NATO-Rusya Konseyi yayın, 2011 baskı için kılavuzdaki belirtti.

Acknowledgments

Yazarlar NIAID VRC akış sitometresi çekirdek ve MHRP akış sitometresi çekirdek tesisleri bakım ve işletme FACS aletleri ve sıralama ekipman için teşekkür etmek istiyorum; Maria Montero, Vishakha Sharma, uzman teknik destek için Kaimei şarkı; Michael Piatak, Jr. (SIV qPCR tahlil tasarım; hakkında yardım almak için öldü) ve Brandon Keele ve Matthew Scarlotta SIV için dizileri izole etmek. Görüşler yazarlar vardır ve ABD Ordusu veya Savunma Bakanlığı'nın pozisyonlar temsil etmek üzere alınmamalıdır. Araştırma bir akredite AAALAC tesis hayvan refah Yasası ve diğer federal tüzük ve hayvanlara ilişkin düzenlemelere uygun olarak onaylanmış hayvan kullanım kuralında altında yapılmıştır ve içeren hayvan deneyleri ve politikalarına Bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının, NATO-Rusya Konseyi yayın, 2011 baskı için kılavuzdaki belirtti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

RNA extraction and PCR reagents and consumables

Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate

BioExpress/VWR

T-3060-1

Adhesive PCR Plate Seals

ThermoFisher

AB0558

Armadillo 384-well PCR Plate

ThermoFisher

AB2384

MicroAmp Optical Adhesive Film

Applied Biosystems/ThermoFisher

4311971

DEPC Water

Quality Biological

351-068-101

Glass Distilled Water

Teknova

W3345

Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit

Invitrogen/ThermoFisher

11732088

SUPERase-In Rnase Inhibitor

Invitrogen/ThermoFisher

AM2696

Platinum Taq

Invitrogen/ThermoFisher

10966034

dNTP Mix

Invitrogen/ThermoFisher

18427088

ROX Reference Dye (if separate from kit)

Invitrogen/ThermoFisher

12223012

DNA Suspension Buffer

Teknova

T0223

RNAqueous kit

Invitrogen/ThermoFisher

AM1931

TaqMan gene expression assays not listed in Table 2

CD6

Applied Biosystems/ThermoFisher

Hs00198752_m1

TLR3

Applied Biosystems/ThermoFisher

Hs1551078_m1

Biomark reagents

Control Line Fluid Kit

Fluidigm

89000021

TaqMan Universal PCR Mix

Applied Biosystems/ThermoFisher

4304437

Assay Loading Reagent

Fluidigm

85000736

Sample Loading Reagent

Fluidigm

85000735

Dynamic Array 96.96 (chip)

Fluidigm

BMK-M-96.96

FACS reagents

SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)

Spherotech Inc.

CMIgP-30-5H

CompBeads Anti-Mouse Ig,k

BD Biosciences

51-90-9001229

5 ml Polystyrene tube with strainer cap

FALCON

352235

Aqua Live/Dead stain

Invitrogen/ThermoFisher

L34976

dilute 1:800

Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2

BD Biosciences

563916

dilute 1:40

Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200

BD Biosciences

563914

dilute 1:20

Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8

BD Biosciences

564804

dilute 1:10

Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2

Biolegend

302948

dilute 1:20

Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2

BD Biosciences

564710

dilute 1:10

Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2

Biolegend

301842

dilute 1:83

Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8

Biolegend

302048

dilute 1:167

Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7

Biolegend

302340

dilute 1:37

Anti-CD38-R PE clone OKT10

NHP reagent recource

N/A

dilute 1:100

Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50

BD Biosciences

564364

dilute 1:10

Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6

BD Biosciences

561358

dilute 1:20

Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A

Biolegend

313528

dilute 1:80

Instruments

BioPrptect Containment Enclosure

Baker

BD FACS Aria

BD Biosciences

ProtoFlex Dual 96-well PCR system

Applied Biosystems/ThermoFisher

4484076

Quant Studio 6 qPCR instrument

Applied Biosystems/ThermoFisher

4485694

IFC controller HX

Fluidigm

IFC-HX

Biomark HD

Fluidigm

BMKHD-BMKHD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33, (2), 155-168 (2017).
  2. Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41 (2013).
  3. Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8, (9), (2016).
  4. Varmus, H. Retroviruses. Science. 240, (4858), 1427-1435 (1988).
  5. Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
  6. Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, (1-2), 133-145 (2013).
  7. Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1, (3), 90-102 (2011).
  8. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (5), a006940 (2012).
  9. Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8, (3), 67 (2016).
  10. Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16, (6), 546-553 (2015).
  11. Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8, (1), 55-67 (2010).
  12. Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1, (6), 559-565 (1988).
  13. Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77, (11), 1059-1066 (2010).
  14. Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20, (3), 368-380 (2016).
  15. Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8, (4), (2017).
  16. Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9, (2), e1003174 (2013).
  17. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278, (5341), 1295-1300 (1997).
  18. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15, (8), 893-900 (2009).
  19. DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90, (5), 2165-2179 (2015).
  20. Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13, (6), e1006445 (2017).
  21. Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3, (7), 392-397 (1973).
  22. Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278 (2015).
  23. McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10, (7), e1003696 (2014).
  24. McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34, (6), 591-593 (2016).
  25. Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. (2017).
  26. Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
  27. Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34, (11), 1145-1160 (2016).
  28. Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128, (8), e20-e31 (2016).
  29. Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
  30. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, (4), 209-212 (2015).
  31. Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58, (12), 1682-1691 (2012).
  32. Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9, (4), e95192 (2014).
  33. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20, (5), 473-477 (2002).
  34. Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17, (1), 188 (2016).
  35. Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27, (3), 469-485 (2007).
  36. Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20, (2), 203-211 (2004).
  37. Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16, (3), 133-145 (2015).
  38. Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23, (1), 83-88 (2012).
  39. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9, (1), 75 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics