बैक्टीरियल विकार आवृत्तियों की उच्च संकल्प तुलना

Genetics

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Summary

विभिंन स्थितियों के तहत विभिंन बैक्टीरियल conjugative डीएनए तत्वों के व्यवहार को समझने के लिए एक उद्देश्य के साथ, हम विकार आवृत्ति में मतभेदों का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, उच्च संकल्प के साथ, अनुमान लगाने के लिए कैसे कुशलतापूर्वक दाता जीवाणु आरंभ विकार ।

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Shintani, M., Ohkuma, M., Kimbara, K. High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies. J. Vis. Exp. (143), e57812, doi:10.3791/57812 (2019).

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Abstract

बैक्टीरियल विकार एक conjugative डीएनए तत्व के माध्यम से एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के क्षैतिज हस्तांतरण में एक महत्वपूर्ण कदम है । विभिंन स्थितियों के तहत विकार आवृत्ति की गहराई में तुलना समझ में कैसे conjugative तत्व प्रकृति में फैलता है की आवश्यकता है । हालांकि, विकार आवृत्ति की तुलना के लिए पारंपरिक तरीकों में गहराई से तुलना के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि उच्च पृष्ठभूमि के चयनात्मक प्लेट पर अतिरिक्त विकार घटनाओं की घटना की वजह से । हम सफलतापूर्वक एक सबसे संभावित संख्या (सीपीसीबी) विधि शुरू करने और एंटीबायोटिक दवाओं के एक उच्च एकाग्रता के लिए चयनात्मक तरल माध्यम में आगे विकार को रोकने के द्वारा पृष्ठभूमि कम । इसके अलावा, हम कितनी बार दाता कोशिकाओं प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा प्राप्तकर्ता पूल में एकल दाता कोशिकाओं छंटाई द्वारा विकार आरंभ की संभावना का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है । दो plasmids, pBP136 और pCAR1 का प्रयोग, Pseudomonas putida कोशिकाओं में विकार आवृत्ति में अंतर अलग सरगर्मी दरों पर तरल माध्यम में पाया जा सकता है । विकार दीक्षा की आवृत्तियों pCAR1 के लिए की तुलना में pBP136 के लिए उच्च थे । इन नतीजों का इस्तेमाल करके हम इन दोनों plasmids में विकार फीचर्स को बेहतर तरीके से समझ सकते हैं ।

Introduction

बैक्टीरियल विकार के मोबाइल आनुवंशिक तत्वों, conjugative plasmids, और एकीकृत और conjugative तत्वों (ICEs) आनुवंशिक जानकारी के क्षैतिज प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है । यह तेजी से जीवाणु विकास और अनुकूलन को बढ़ावा देने और बहुऔषध प्रतिरोध जीन1,2संचारित कर सकते हैं । विकार आवृत्ति डीएनए (भीड़) और संभोग युग्म गठन (MPF), सेक्स पिली, जो भीड़ और MPF प्रकार3,4के अनुसार वर्गीकृत कर रहे है सहित के लिए conjugative तत्वों पर इनकोडिंग प्रोटीन से प्रभावित किया जा सकता है, 5. यह भी दाता और प्राप्तकर्ता जोड़ी6 और कोशिकाओं की वृद्धि की स्थिति से प्रभावित कर सकते है7,8,9,10,11,12 ( विकास दर, कोशिका घनत्व, ठोस सतह या तरल मध्यम, तापमान, पोषक तत्वों की उपलब्धता, और cations की उपस्थिति) । कैसे बैक्टीरिया के बीच फैले conjugative तत्वों को समझने के लिए, यह विस्तार से विकार आवृत्ति की तुलना करने के लिए आवश्यक है ।

दाता और संभोग के बाद प्राप्तकर्ता जोड़े के बीच विकार आवृत्ति आमतौर पर इस प्रकार के रूप में पारंपरिक तरीकों से अनुमानित हैं । (i) सबसे पहले, दाता और प्राप्तकर्ता की कालोनियों की संख्या गिनी जाती है; (ii) फिर, प्राप्तकर्ता कालोनियों, जो conjugative तत्व प्राप्त (= transconjugants) गिना जाता है; (iii) और अंत में, विकार आवृत्ति की गणना कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) द्वारा transconjugants के दाता और/या13प्राप्तकर्ता के द्वारा की जाती है । हालांकि, जब इस विधि का उपयोग करते हुए, पृष्ठभूमि उच्च है के कारण अतिरिक्त विकार घटनाओं पर भी हो सकता है कि चुनिंदा प्लेटों transconjugants प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जब कोशिका घनत्व उच्च10है । इसलिए, यह आवृत्ति (एक 10-गुना अंतर के नीचे) में छोटे मतभेदों का पता लगाने के लिए मुश्किल है । हम हाल ही में एक सबसे संभावित संख्या (सीपीसीबी) तरल एंटीबायोटिक दवाओं की एक उच्च एकाग्रता युक्त माध्यम का उपयोग कर विधि शुरू की । इस विधि चयनात्मक माध्यम में आगे विकार बाधा द्वारा पृष्ठभूमि कम; इस प्रकार, विकार आवृत्ति उच्च संकल्प के साथ अनुमान लगाया जा सकता है ।

विकार को तीन चरणों में बाँटा जा सकता है: (१) दाता की आसक्ति-प्राप्तकर्ता की जोड़ी (२) conjugative अंतरण की दीक्षा, और (३) पृथक्करण की जोड़ी१४. कदम के दौरान (1) और (3), वहां दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच शारीरिक संपर्क है; इस प्रकार, कोशिका घनत्व और पर्यावरणीय स्थितियाँ इन कदमों को प्रभावित कर सकती हैं, हालाँकि सेक्स पिली की विशेषताएँ भी महत्वपूर्ण हैं. कदम (2) की संभावना कई बाहरी परिवर्तन है, जो प्लाज्मिड, दाता, और प्राप्तकर्ता की विभिंन सुविधाओं से प्रभावित हो सकता है के जवाब में विकार में शामिल जीन की अभिव्यक्ति द्वारा विनियमित है । हालांकि शारीरिक लगाव या दाता-प्राप्तकर्ता जोड़े की टुकड़ी गणितीय रूप से कणों के रूप में कोशिकाओं का एक आकलन का उपयोग कर अनुकरण किया जा सकता है, कदम (2) की आवृत्ति प्रयोग मापा जाना चाहिए । वहां कितनी बार दाताओं विकार शुरू कर सकते है [कदम (2)] प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी15,16का उपयोग कर के प्रत्यक्ष टिप्पणियों पर कुछ रिपोर्टों गया है; बड़ी संख्या में कक्षों की निगरानी की जानी चाहिए, क्योंकि हालांकि, इन विधियों उच्च प्रवाह नहीं हैं । इसलिए, हम प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग करके चरण (2) की आवृत्ति की प्रायिकता का अनुमान लगाने के लिए एक नई विधि विकसित की है । हमारी विधि किसी भी प्लाज्मिड के लिए लागू किया जा सकता है, विकार के लिए आवश्यक जीन की पहचान के बिना ।

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Protocol

1. ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक दाता की तैयारी (GFP)-और कनमीसिन प्रतिरोध जीन-टैग Plasmids

  1. लक्ष्य प्लाज्मिड pBP136 में मार्कर जीन का परिचय
    नोट: इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य pBP136 उत्पंन करने के लिए है::gfp। इस अध्ययन में प्रयुक्त जीवाणु उपभेदों और plasmids तालिका 1में सूचीबद्ध हैं ।
    1. ई कोलाई DH10B की संस्कृतियों बढ़ने pBP13617 में बाँझ Luria शोरबा (पौंड) और ई. कोलाई S17 के 5 मिलीलीटर-1λपीर18 बंदरगाह pJBA2819 [एक कनमीसिन युक्त (किमी)-प्रतिरोध जीन और gfp mut3 * एक मिनी में अपने प्रवर्तक और टर्मिनेटर के साथ जीन-तमिलनाडु5] बाँझ पौंड की 5 मिलीलीटर में ५० μg/एमएल किमी प्रति मिनट ३७ डिग्री सेल्सियस (O/N, 16-24 एच) में मिलाते हुए के साथ २०० क्रांतियों पर प्रती मिनिट (rpm) ।
    2. कटाई और धुलाई
      1. फसल प्रत्येक संस्कृति के 1 मिलीलीटर, यह एक 2 मिलीलीटर microtube में जगह है, और केंद्रापसारक (१०,००० × जी, कमरे के तापमान, 2 मिनट) । फिर, supernatant को त्यागें और बाँझ फॉस्फेट के 2 मिलीलीटर में सेल गोली फिर से स्थगित खारा (पंजाब) बफर ।
      2. फिर से केंद्रापसारक (१०,००० × जी, कमरे का तापमान, 2 मिनट), और बाँझ पंजाबियों के ५०० μL में resuspend ।
    3. फ़िल्टर संभोग
      1. (१.६% आगार के साथ) बाँझ पौंड प्लेटें तैयार है, और उस पर एक बाँझ ०.२२ माइक्रोन ताकना आकार झिल्ली फिल्टर जगह है । मिश्रण ५०० ई. कोलाई S17 के μL-1λपीर बंदरगाह pJBA28 ई. कोलाई DH10B के साथ बंदरगाह pBP136 और पौंड प्लेट पर फिल्टर पर मिश्रण हाजिर । 30 डिग्री सेल्सियस पर थाली ओ/ पौंड प्लेट से फिल्टर निकालें, यह एक बाँझ ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में जगह है, और बाँझ पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
        नोट: pJBA28 Π प्रोटीन की उपस्थिति में नकल कर सकते हैं, पीर जीन18द्वारा इनकोडिंग, और S17-1λपीर से DH10B को हस्तांतरित किया जा सकता है । pBP136 कोई मार्कर जीन17 वहन करती है और DH10B से S17-1λपीरको हस्तांतरित किया जा सकता है । इसलिए, हम S17-1λपीर हार्बर pBP136 और pJBA28 से DH10B बंदरगाह pBP136 और मिनी-तमिलनाडु5 (गुणसूत्र या pBP136 में स्थानांतरित) इस स्तर पर भेद नहीं कर सका । तब, हम बाद के चरणों में दाताओं के रूप में उनमें से मिश्रण का इस्तेमाल किया (1.1.4. – 1.1.5.) ।
    4. एक ओ/N संस्कृति के ऊपर से बाँझ पौंड में ऊपर संभोग मिश्रण की बढ़ती ५० μg/एमएल किमी में ३७ ° c पर मिलाते हुए के साथ २०० rpm और Pseudomonas putida KT2440 की एक संस्कृति [किलोमीटर संवेदनशील (किमीएस), रिफैंपिसिन-संवेदी (मोरोक्कनएस), gentamicin-संवेदी (जीएमएस), और टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोधी (टीसीआर)] २०० rpm पर मिलाते के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर १२.५ μg/एमएल टीसी युक्त माध्यम में ।
    5. कटाई के बाद और कदम 1.1.2 में के रूप में कोशिकाओं को धोने, उंहें (संभोग मिश्रण और KT2440) फिल्टर संभोग के लिए (O/N, 30 डिग्री सेल्सियस) के रूप में कदम 1.1.3 में उपयोग करें ।
    6. तैयार बाँझ पौंड प्लेटें युक्त ५० μg/एमएल किमी और १२.५ μg/एमएल टीसी (पौंड + किमी + टीसी प्लेटें) ।
    7. बाँझ पंजाबियों के साथ झिल्ली फिल्टर पर resuspend मिश्रण पतला (101-105गुना), और फिर पौंड पर प्रत्येक कमजोर पड़ने फैला + किमी + टीसी प्लेटें और 2 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें-3 डी की मशीन ।
    8. प्लेटों से कालोनियों उठाओ, बाँझ पौंड युक्त किमी और टीसी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पीमें एक ओ/ resinovorans CA10dm4RG (मोरोक्कनआर और जीएमआर)6 बाँझ में पौंड युक्त मोरोक्कन (25 μg/एमएल) और 30 डिग्री सेल्सियस पर जीएम (30 μg/एमएल) और २०० rpm ।
      नोट: के रूप में पिछले नोट में वर्णित है, पौंड पर कालोनियों + किमी + टीसी प्लेटें (1.1.7 से.) एक मिनी-तमिलनाडु 5 और KT2440 एक मिनी के साथ ले pBP136 बंदरगाह KT2440 जा सकता है-तमिलनाडु5, क्योंकि pJBA28 सीधे S17 से स्थानांतरित किया जा सकता है-1λपीर हार्बर pBP136 आणि pJBA28 ते KT2440. यही कारण है कि पी resinovorans CA10RG के साथ एक और संभोग निंनलिखित चरणों में एक मिनी-तमिलनाडु5 के साथ लक्ष्य pBP136 प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
    9. कटाई और चरण 1.1.2 में के रूप में कोशिकाओं को धोने के बाद, उन्हें फिल्टर संभोग के लिए उपयोग (O/N, 30 ° c) चरण 1.1.3 में के रूप में.
    10. मोरोक्कन, जीएम, और किमी युक्त बाँझ पौंड प्लेटें तैयार (पौंड + मोरोक्कन + किमी + जीएम प्लेट्स).
    11. फिल्टर पर मिश्रण resuspend और फिर इसे पतला 101– 105गुना, यह पौंड पर फैला + मोरोक्कन + किमी + जीएम प्लेटें, और 2 के लिए प्लेटें-3 डी 30 डिग्री सेल्सियस पर ।
    12. कालोनियों उठाओ और जांच अगर वे पीसीआर द्वारा pBP136 बंदरगाह प्लाज्मिड के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर ।
  2. लक्ष्य प्लाज्मिड pCAR1 में एक चयनात्मक मार्कर जीन का परिचय
    नोट: इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य pCAR1 उत्पंन करने के लिए है::gfp
    1. putida KT2440 बंदरगाह pCAR1 (किमीएस, जीएमएस, मोरोक्कनएस, टीसीआर)20 पर २०० rpm और 30 डिग्री सेल्सियस और ई. कोलाई S17-1λपीर18 बंदरगाह pJBA28 में 5 मिलीलीटर की एक ओ एन संस्कृति बढ़ती है बाँझ पौंड जिसमें २०० आरपीएम और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ५० μg/एमएल किमी है ।
    2. कटाई और चरण 1.1.2 में के रूप में कोशिकाओं को धोने के बाद, उन्हें फिल्टर संभोग के लिए उपयोग (O/N, 30 ° c) चरण 1.1.3 में के रूप में.
    3. पौंड प्लेट से फिल्टर निकालें, यह एक बाँझ ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में जगह है, और बाँझ पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. बाँझ पंजाबियों (101-105गुना) के साथ resuspend मिश्रण पतला, और बाँझ चयनात्मक पौंड + टीसी + किमी प्लेटों पर पतला मिश्रण फैल गया.
      नोट: pCAR1 ई. कोलाईमें दोहराने नहीं है; इस प्रकार, पी putida KT2440 एक मिनी के साथ pCAR1 बंदरगाह-तमिलनाडु5 पौंड + टीसी + किमी प्लेटों पर चुना जा सकता है ।
    5. थाली से एक कॉलोनी उठाओ, और एक O/N संस्कृति बढ़ती बाँझ में पौंड युक्त किमी और टीसी और पीकी एक संस्कृति resinovorans मोरोक्कन और जीएम (२०० आरपीएम, 30 डिग्री सेल्सियस) युक्त बाँझ पौंड में CA10dm4RG.
    6. बाद में 1.1.2 चरण में कटाई और धोने के बाद, फिल्टर संभोग के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें (O/N, 30 ° c) चरण 1.1.3 में के रूप में ।
    7. फिल्टर पर मिश्रण resuspend और फिर यह पतला, पौंड + मोरोक्कन + किमी + जीएम प्लेटों पर फैल गया है, और 2 के लिए प्लेटें-3 डी 30 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    8. कालोनियों उठाओ और अगर वे प्लाज्मिड के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर द्वारा pCAR1 बंदरगाह की जांच करें ।
  3. टैग-plasmids के हस्तांतरण की पुष्टि करें और अगले कदम के लिए दानदाताओं तैयार
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को ऊपर से निर्मित plasmids के हस्तांतरण की पुष्टि और अगले कदम के लिए दाताओं तैयार है ।
    1. बढ़ती एक O/N संस्कृति के पी resinovorans CA10dm4RG हार्बर pBP136::gfp या pCAR1::gfp बाँझ पौंड युक्त किमी और putida SMDBS की संस्कृति [kmएस, जीएमएस, मोरोक्कनआर, टीसीआर, lacI q, जिसमें PA1/O4/O3-gfpmut3* अपनी गुणसूत्र lacIq जीन की वजह से व्यक्त नहीं है]21 पौंड युक्त टीसी (२०० rpm, 30 डिग्री सेल्सियस) के 3 मिलीलीटर में ।
    2. कटाई और चरण 1.1.2 में के रूप में कोशिकाओं को धोने के बाद, उन्हें फिल्टर संभोग के लिए उपयोग (O/N, 30 ° c) चरण 1.1.3 में के रूप में.
    3. एक बाँझ ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में फिल्टर प्लेस, और बाँझ पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ resuspend । बाँझ पंजाबियों (101-105गुना) के साथ resuspend मिश्रण पतला, बाँझ चयनात्मक पौंड + टीसी + किमी प्लेटों पर पतला मिश्रण फैला.
    4. कालोनियों उठाओ और जांच अगर वे plasmids के विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर द्वारा प्रत्येक बंदरगाह ।
      नोट: मिनी के संमिलन की स्थिति की पुष्टि-तमिलनाडु5 प्रत्यक्ष अनुक्रमण द्वारा प्लाज्मिड निष्कर्षण के बाद वैकल्पिक है, यह पुष्टि करें कि संमिलन plasmids के स्थानांतरण फ़ंक्शन को प्रभावित नहीं करता है ।

2. सीपीसीबी विधि द्वारा विकार आवृत्ति की गणना

  1. तैयार बाँझ पौंड + किमी और पौंड + जीएम प्लेट्स.
  2. पी के एक ओ/ putida SMDBSे pBP136::gfp या pCAR1::gfp 3 मिलीलीटर बाँझ पौंड युक्त किमी और पी putida KT2440RGD (जीएमआर, मोरोक्कनआर) के 3 मिलीलीटर में £ जीएम (१४० rpm, 30 डिग्री सेल्सियस) से युक्त की संस्कृति ।
  3. कटाई के बाद और कदम 1.1.2 में के रूप में कोशिकाओं को धोने, उंहें फिल्टर संभोग के लिए 30 ° c में ४५ मिनट के रूप में 1.1.3 कदम के लिए उपयोग करें ।
  4. प्रश्नपत्र के ऊपर दाता और प्राप्तकर्ता संस्कृति पतला (101 -107) और यह पौंड पर फैल + किमी (दाता) या पौंड + जीएम (प्राप्तकर्ता) प्लेटें (तपसिल में प्रत्येक) के लिए कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) गिनती । 2 डी के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें मशीन
  5. बाँझ पौंड युक्त किमी और जीएम में फिल्टर पर मिश्रण resuspend, और प्रश्नपत्र पतला (21 से 224-10७.२) एक ९६-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट (quadruplicate में) का उपयोग कर ।
  6. उचित समय (30 डिग्री सेल्सियस पर 2 डी) के लिए ९६-अच्छी तरह से थाली मशीन ।
  7. प्लेटों (step २.४.) पर दाता और प्राप्तकर्ता के CFU की गणना करें और उन कुओं की संख्या की गणना करे जिनमें transconjugants बढ़ता है ।
  8. जार्विस एट अलद्वारा विकसित सीपीसीबी गणना कार्यक्रम का उपयोग करके सीपीसीबी और उसके विचलन की गणना. 22, जो http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls पर उपलब्ध है ।
    1. प्रयोग (उदा., ' परीक्षण '), प्रयोग की तिथि (उदा., 2018/4/9), परीक्षण श्रृंखला की संख्या, और अधिकतम का नाम दर्ज करें । नहीं. (' MPN_ver5. xls ') एक्सेल फ़ाइल के ' कार्यक्रम ' शीट की #7 पंक्ति में कमजोर पड़ने की (' 24 ' दर्ज करें) ।
    2. ' 2-1 (= ०.५) से 2-24 (= ५.९६ × 10-8) ' दर्ज करें ' कमजोर कारक डी' कॉलम में, ' ०.०१ ' में ' मात्रा एमएल या जी डब्ल्यू' कॉलम में, और ' 4 ' में ' नं. के ट्यूबों n ' के स्वतः उत्पादित तालिकाओं में ' इनपुट डेटा ' ।
    3. कुओं की संख्या दर्ज करें जिसमें transconjugants प्रत्येक नमूना कमजोर पड़ने पर बढ़ता है (0-4) ।
    4. पुश ऊपरी दाएँ ' परिणाम की गणना ' बटन, और उसके बाद परिणाम प्राप्त (सीपीसीबी/μL में) और उनके ९५% विश्वास सीमा (निचले और ऊपरी).
  9. दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं की संख्या (CFU/एमएल) द्वारा transconjugants (सीपीसीबी/एमएल) की संख् या को विभाजित करके plasmids की विकार आवृत्ति की गणना करें ।

3. दाता-शुरू विकार की संभाव्यता के आंकलन के लिए तैयारी

  1. बढ़ती एक O/N संस्कृति के पी putida SMDBS हार्बर pBP136::gfp या pCAR1::gfp में 3 मिलीलीटर बाँझ पौंड युक्त की एक संस्कृति और पी putida KT2440RGD (जीएमआर, मोरोक्कनआर) की 3 मिलीलीटर में बाँझ पौंड युक्त जीएम के प्रयोग से ३०० मिलीलीटर कुप्पी (१४० rpm, 30 डिग्री सेल्सियस) के रूप में संस्कृति ।
  2. २०० μL की संस्कृति के २०० मिलीलीटर में ताजा बाँझ पौंड युक्त या ५०० मिलीलीटर बोतल में जीएम और 30 डिग्री सेल्सियस पर १४० rpm पर मिलाते के साथ गर्मी में स्थानांतरण ।
  3. एक यूवी विज़ spectrophotometer का उपयोग संस्कृति के ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) पर turbidity उपाय और संस्कृति हाजिर, पौंड में पतला (101– 108-गुना कमजोर पड़ने), एक पौंड प्लेट पर किमी या जीएम युक्त । 30 डिग्री सेल्सियस पर इन पौंड प्लेट्स के लिए 1 – 2 d , और CFU निर्धारित करें ।
  4. आयुध डिपो६०० मूल्यों और विकास के समय के साथ CFU दाता और प्राप्तकर्ता के विकास घटता उत्पंन करने के लिए ।
  5. विकास की अवस्था के आधार पर दाता और प्राप्तकर्ता तनाव के मध्य लॉग चरण के लिए संस्कृतियों, बढ़ो ।
  6. कटाई करने और कोशिकाओं को धोने के बाद, 10 पौंड के १०० μL में प्राप्तकर्ता के 10 μL और 105-CFU के 107 CFU में दाता की 103 -1तैयार करें ।
  7. मिश्रण दाता के 10 μL और प्राप्तकर्ता संस्कृतियों के १०० μL में अलग घनत्व में ९६-well प्लेट्स (तपसिल में) । उदाहरण के लिए, मिश्रण 10 दाता के1 CFU और प्राप्तकर्ता के 105 CFU और यह ९६ कुओं में से प्रत्येक को जोड़ने के लिए, और मिश्रण दाता के 101 CFU और एक और ९६ में प्राप्तकर्ता के 106 CFU-अच्छी तरह से थाली, और इतने पर ।
  8. ४५ मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण की मशीन, और फिर एंटीबायोटिक दवाओं के उच्च सांद्रता (१०० μg/एमएल किलोमीटर और ६० μg/एमएल जीएम) जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से आगे विकार को बाधित ।
  9. 2 डी के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन
  10. कुओं की संख्या गिनने में जो transconjugants बढे.
  11. प्राप्तकर्ता घनत्व का चयन करें जो दाता की संभाव्यता के आकलन के लिए उपयुक्त है-शुरू विकार उपरोक्त डेटा के आधार पर (transconjugants में पाया जाना चाहिए कम से एक ९६-well प्लेट की अच्छी तरह से 1) ।
    नोट: Transconjugants सभी कुओं में बढ़ेगा जब दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के घनत्व अधिक होते हैं और एक से अधिक विकार एक कुआं में होता है. इसके विपरीत किसी भी कुएँ में जब कोशिका का घनत्व बहुत कम होगा तो कोई transconjugants नहीं मिल सकेगा. निंनलिखित अनुभाग में, एक दाता कक्ष में एक अच्छी तरह से हल है । इसलिए, प्राप्तकर्ता घनत्व अधिकतम होना चाहिए ।

4. दाता की संभाव्यता का अनुमान-प्रारम्भिक विकार

  1. दाता पी putida SMDBS के मध्य लॉग चरण संस्कृति के २०० मिलीलीटर तैयार pBP136::gfp या pCAR1::gfp और कि प्राप्तकर्ता पी putida KT2440RGD, के रूप में 3.6 – 3.7 में वर्णित है ।
  2. एक ९६-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में पौंड की १०० μL में प्राप्तकर्ता के 106 CFU प्लेस ।
  3. FACS प्रणाली (एक रोबोट बांह, एक ४८८ एनएम आर्गन लेजर, और एक ७० माइक्रोन नोजल छिद्र के साथ प्रवाह cytometry और सेल सॉर्टर) सेट करें । आगे तितर बितर (FSC) के लिए सेट, अधिग्रहण ट्रिगर के रूप में एक 1% दहलीज के साथ । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पंजाब का उपयोग कर, झूठी सकारात्मक संकेतों को बाहर कर सकते हैं जो अधिकतम संवेदनशीलता पर एच लाभ और FSC और साइड कैटर (एसएससी) के एक लाभ ट्यून. FSC और एसएससी और अधिक से अधिक प्रकार शुद्धता के लिए ०.५ ड्रॉप सॉर्ट मोड के आधार पर क्रमबद्ध गेट सेट करें ।
  4. एक पौंड प्लेट (३८४ विभिन्न स्थानों) पर FACS द्वारा एक एकल दाता कोशिका सॉर्ट, 2 डी के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन, और फिर कितनी कालोनियों क्रमबद्ध कोशिकाओं से थाली पर दिखाई देते हैं गिनती ।
    नोट: यह कार्यविधि सेट गेट की मांयता के लिए है । यदि प्लेट पर ३८४ कॉलोनियां हैं, तो इसका मतलब है कि सॉर्ट की गई कोशिकाओं का १००% कालोनियों को फार्म कर सकता है । छंटाई की औसत वैधता हमेशा 90-95% है ।
  5. प्राप्तकर्ता (४.२) के साथ एक ९६-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में FACS द्वारा एक एकल दाता सेल सॉर्ट करें ।
  6. 30 डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए थाली मशीन, और फिर एक अच्छी तरह से आगे विकार को रोकने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं (१०० μg/एमएल किलोमीटर और ६० μg/एमएल जीएम) के उच्च सांद्रता जोड़ें ।
  7. 2 डी के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन
  8. कुओं की संख्या गिनती जिसमें transconjugants के रूप में नग्न आंखों के साथ दृश्य निरीक्षण द्वारा निर्धारित वृद्धि हुई ।
  9. दाता की कुल संख्या के द्वारा transconjugants के साथ कुओं की संख्या को बांटकर दाता की विकार की संभाव्यता की गणना शुरू की, जिसमें दानदाता का हल था ।

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Representative Results

सीपीसीबी विधि द्वारा विकार आवृति की तुलना

हमारी पिछली रिपोर्ट में, हम pBP136 के विकार आवृत्तियों की तुलना में::gfp और pCAR1::gfp तीन गुना पतला पौंड (1/3 पौंड) तरल माध्यम के साथ अलग सरगर्मी दरों के बाद एक ४५ मिनट का उपयोग कर संभोग १२५ मिलीलीटर स्पिनर कुप्पी10। हम pBP136 के विकार आवृत्तियों की तुलना में::gfp और pCAR1::gfp के साथ 106 CFU/एमएल और प्राप्तकर्ता उपभेदों के विभिंन सरगर्मी शर्तों के तहत (0-600 rpm) । दोनों plasmids की विकार आवृत्ति उच्च सरगर्मी दर पर वृद्धि हुई है, और विकार आवृत्ति में अधिकतम अंतर pBP136 के लिए < 10 गुना था:: gfp (0 और ४०० rpm के बीच), जबकि pCAR1 की है कि:gfp था ~ 25 गुना (0 के बीच और २०० आरपीएम; अंजीर .1) ।

दाता-शुरू विकार की संभाव्यता का आंकलन

दाता शुरू विकार की पहले अनुमानित संभावना तालिका 2में दिखाया गया है । विकार की संभावना की तुलना करने के लिए आवश्यक प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के घनत्व का निर्धारण करने के लिए, संभोग परख दाता और प्राप्तकर्ता के विभिंन घनत्व के साथ प्रदर्शन किया गया । के रूप में 2 तालिकामें दिखाया गया है, pBP136::gfp transconjugants १००% (96/96) में पाए गए कुओं के 103 CFU और दाता के 105-10 प्राप्तकर्ता के7 CFU, और दाता और 106-10 7 के साथ उन 102 CFU के साथ उन प्राप्तकर्ता के CFU, यह दर्शाता है कि कोशिका घनत्व बहुत अधिक था । दाता के 101 CFU और प्राप्तकर्ता के 106 या 105 CFU के साथ परख संभोग transconjugant पॉजिटिव वेल्स (६६% और २.१%, क्रमशः, तालिका 2) की एक घटी हुई संख्या में हुई । इस प्रकार, > 10 प्राप्तकर्ता के5 CFU एक एकल दाता सेल के साथ सहवास के लिए आवश्यक होने की भविष्यवाणी की थी । इसी प्रकार, हम pCAR1 के साथ संभोग परख प्रदर्शन:: दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों के विभिंन घनत्व परgfp । transconjugant के प्रतिशत-सकारात्मक कुओं pBP136 की तुलना में बहुत कम थे::gfp (तालिका 2) । यह मानते हुए कि दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को एक दूसरे को इसी तरह संलग्न कर सकते हैं, pCAR1 दाता के लिए विकार दीक्षा की संभावना से कम था कि pBP136 दाता के लिए । इन परिणामों के आधार पर, हमने निर्धारित किया कि FACS द्वारा क्रमबद्ध एक दाता कक्ष के लिए प्राप्तकर्ता के 107 CFU की आवश्यकता थी ।

इसके बाद transconjugant-पॉजीटिव कुओं के नंबरों की गिनती की गई । pBP136 के लिए transconjugant-पॉजिटिव वेल्स का प्रतिशत::gfp pCAR1 के लिए उस से बड़ा (१.९%) था::gfp (< 0.052%; तालिका 2) । इस प्रकार, इन दो plasmids के बीच दाता-शुरू विकार की संभाव्यता में एक ३६-गुना से अधिक अंतर था ।

Figure 1
चित्र 1. pBP136 के विकार आवृत्तियों की तुलना::gfp और pCAR1::gfp के साथ 106 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) एमएल-1 के दाता (Pseudomonas putida SMDBS) और प्राप्तकर्ता (पी. putida KT2440RGD) के साथ अलग चमचे दर (0-600 आरपीएम). त्रुटि पट्टियों ९५% विश्वास सीमा के आधार पर सीपीसीबी विधि और दाता और प्राप्तकर्ता के CFU के मानक विचलन की गणना की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

बैक्टीरियल उपभेदों जीनोटाइप और प्रासंगिक phenotype संदर्भ या स्रोत
ई कोलाई DH10B F, mcrA, Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80dlacZΔM15, ΔlacX74, देओर, recA1, araD139, Δ (आरा लियू) ७६९७, गलू, galK , λ-, rpsL, endA1, nupG थर्मो
ई. कोलाई S17-1 (λपीर) Tmआर, एसएमआर, recA, थी, प्रो, hsdR-एम+, RP4:2-Tc: ंयू: Km तमिलनाडु7 λpir 18
Pseudomoans putida KT2440 मीएस, मोरोक्कनएस, जीएमएस, टीसीआर 25
Pseudomoans putida KT2440 (pCAR1) KT2440 हार्बर pCAR1 20
Pseudomoans putida KT2440RGD किमीएस, मोरोक्कनआर, जीएमआर, टीसीआर, miniTn7(जीएम) पीA1/O4/O3DsRedExpress-a गुणसूत्र में इनसेट है 10
Pseudomoans putida SMDBS पी putida KT2440 के व्युत्पंन तनाव, dapB-हटाए गए, किमीएस, जीएमएस, मोरोक्कनआर, टीसीआर, lacIक्ष गुणसूत्र में डाला जाता है 21
P. resinovorans CA10RG किमीएस, मोरोक्कनआर, जीएमआर, टीसीएस 6
Plasmids
pBP136 IncP-1, दूरध्वनी, MPFT प्लाज्मिड 17
pBP136::gfp pBP136 ले मीआर और पीA1/04/03- पैरा मेंgfp कैसेट (२६,१३७ nt) 21
pCAR1 IncP-7, दूरध्वनी, MPF, carbazole degradative प्लाज्मिड 26, 27
pCAR1::gfp pCAR1 ले मीआर और पीA1/04/03-gfp कैसेट ORF171 में (१८२,६२५ nt) 21
pJBA28 एपीआर, किमीआर, मिनी-तमिलनाडु के लिए डिलिवरीप्लाज्मिड 5-Km-PA1/04/03-RBSII-gfpmut3*-t0-t1 18

तालिका 1. बैक्टीरियल उपभेदों और plasmids ।

प्लाज्मिड दाता प्राप्तकर्ता ९६ कुओं के प्रति transconjugants के साथ कुओं की संख्या प्रतिशत
[CFUs या कक्ष] [CFUs] [%]
pBP136::gfp 103 107 96/96 १००
106 96/96 १००
105 96/96 १००
102 107 96/96 १००
106 96/96 १००
105 54/96 ५६
101 107 71/96 ७४
106 63/96 ६६
105 2/96 २.१
1 107 23/1212 १.९
pCAR1::gfp 103 107 6/96 ६.३
106 6/96 ६.३
105 0/96 0
102 107 1/96 1
106 1/96 1
105 0/96 0
101 107 0/96 0
106 0/96 0
105 0/96 0
1 107 1/1920 < ०.०५२

तालिका 2. कुओं की संख्या, विभिन्न कोशिका घनत्व के साथ, transconjugants युक्त दाता की संभाव्यता की तुलना करने के लिए शुरू की विकार के बीच pBP136::gfp और pCAR1::gfp.

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Discussion

यहाँ, हम transconjugants की संख्या का अनुमान लगाने के लिए एक सीपीसीबी विधि का उपयोग करते हुए विभिन्न स्थितियों के तहत विकार आवृत्ति में मतभेदों का पता लगाने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम कमजोर है दाता और प्राप्तकर्ता का मिश्रण संभोग के बाद जब तक कोई transconjugants हो जाना । एक और कदम एंटीबायोटिक दवाओं के उच्च सांद्रता चयनात्मक तरल माध्यम के लिए आगे विकार को रोकने के लिए जोड़ रहा है । इन कार्यविधियों को चयनात्मक माध्यम में आगे विकार के कारण पृष्ठभूमि को कम कर सकते हैं । हम सफलतापूर्वक दाता और प्राप्तकर्ता के बीच एक छोटी संभोग अवधि के बाद भी मतभेदों का पता लगा सकता है । इस प्रोटोकॉल द्वारा गणना conjugative आवृत्ति दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों की वृद्धि की स्थिति में छोटे मतभेदों से बदल सकता है । इस प्रकार, इन शर्तों को ध्यान से डिजाइन किया जाना चाहिए ।

इसके अलावा, हम एक दाता सेल छँटाई के लिए FACS का उपयोग करके विकार के दूसरे चरण का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम एक हल एक दाता कोशिका के लिए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के उचित घनत्व का निर्धारण है । जब एक दाता कोशिका के आसपास के प्राप्तकर्ता कोशिकाओं की संख्या काफी बड़ी है, दाता और प्राप्तकर्ता के बीच शारीरिक संपर्क निश्चित है । फिर, विकार आवृत्ति प्रभावित नहीं किया जा सकता है, कितनी बार की संभावना से दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को एक दूसरे से संपर्क करें, लेकिन दाता की संभावना द्वारा विकार शुरू की । FACS द्वारा एक एकल दाता कोशिका छंटाई मुश्किल नहीं है; हालांकि, ९६ कुओं हमेशा संभावना का अनुमान लगाने के लिए पर्याप्त नहीं हैं । इसलिए 10-100 प्लेट तैयार करनी चाहिए । प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक है कि यह दाता की संभावना को मापने के लिए उपयुक्त नहीं है-कम आवृत्ति transmissibility के साथ एक प्लाज्मिड के विकार शुरू की ।

इन तरीकों और उनके परिणाम के आधार पर, हम हाल ही में बताया कि दो plasmids तरल मीडिया में सरगर्मी दर, जो विकार, लगाव और की टुकड़ी के पहले और तीसरे कदम को प्रभावित कर सकते है बदल कर अलग विकार आवृत्तियों दिखाया दाता-प्राप्तकर्ता जोड़े । इसके अलावा, हम भी दूसरे चरण10की संभावना में मतभेद पाया । ये परिणाम प्रदर्शित करता है कि कैसे विकार आवृत्ति भिन्न स्थितियों के अंतर्गत बदलता है । इन प्रोटोकॉल एरोबिक या anaerobic शर्तों, विभिंन दाता-प्राप्तकर्ता जोड़े, विभिंन तापमान या पीएच, और उपस्थिति या विशिष्ट की अनुपस्थिति में शामिल है, विभिंन स्थितियों के तहत plasmids की विकार सुविधाओं की तुलना के लिए उपयोगी होते है रसायन, जैसे cations, पोषक तत्वों, और एंटीबायोटिक दवाओं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

pCAR1 प्रदान करने के लिए टोक्यो विश्वविद्यालय (जापान) के pBP136 और प्रो डॉ एच Nojiri प्रदान करने के लिए हम राष्ट्रीय संक्रामक रोग संस्थान (जापान) के कमाची डॉ. हम pJBA28 प्रदान करने के लिए डेनमार्क के तकनीकी विश्वविद्यालय के प्रोफेसर डॉ Molin Sølen के भी आभारी हैं. इस काम को JSPS KAKENHI (ग्रांट नंबर्स 15H05618 और 15KK0278) ने एमएस (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/) को सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoFlo XDP Beckman-Coulter ML99030 FACS
IsoFlow Beckman-Coulter 8599600 Sheath solution
Fluorospheres (10 μm) Beckman-Coulter 6605359 beads to set up the FACS
Incubator Yamato Scientific Co. Ltd 211197-IC802
UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 SIMADZU Corporation UV-1800
96-well plates NIPPON Genetics Co, Ltd TR5003
microplate type Petri dish AXEL 1-9668-01 for validation of sorting
membrane filter ADVANTEC C045A025A for filter mating
pippettes Nichiryo CO. Ltd 00-NPX2-20,
00-NPX2-200,
00-NPX2-1000
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL
multi-channel pippetes Nichiryo CO. Ltd 00-NPM-8VP,
00-NPM-8LP
0.5-10 μL, 20-200 μL
Tryptone BD Difco 211705
Yeast extract BD Difco 212750
NaCl Sigma S-5886
Agar Nakarai tesque 01162-15
rifampicin Wako 185-01003
gentamicin Wako 077-02974
kanamycin Wako 115-00342
Petri dish AXEL 3-1491-51 JPND90-15
microtubes Fukaekasei 131-815C
500 mL disposable spinner flask Corning CLS3578

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References

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