Spectral Reflectometric mikroskopi på myelinerede axoner In Situ

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi præsenterer her, en trinvis protokol for imaging myelinerede axoner i en fast hjernen skive ved hjælp af en etiket-fri nanoskala imaging teknik baseret på spektral reflectometry.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kwon, J., Choi, M. Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ. J. Vis. Exp. (137), e57965, doi:10.3791/57965 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I et pattedyr nervesystemet giver myelin en elektrisk isolering af enwrapping axon fibre i en flerlaget spiral. Inspireret af sin meget organiseret subcellulært arkitektur, vi for nylig udviklet en ny imaging modalitet, opkaldt spektral reflectometry (SpeRe), som giver mulighed for hidtil uset etiket-fri nanoskala billeddannelse af levende myelinerede axoner in situ. Det underliggende princip er at opnå nanostructural oplysninger ved at analysere Reflektionsgraden spektrum af flerlaget subcellulært struktur. I denne artikel vil beskrive vi en detaljeret trin for trin-protokol til at udføre en grundlæggende SpeRe billeddannelse af nervøs væv ved hjælp af en kommerciel Konfokal mikroskopiske system, udstyret med en hvid-lys laser og en afstemmelige filter. Vi dækker procedurer for prøveforberedelse, erhvervelse af spektrale data og billedbehandling for at opnå nanostructural oplysninger.

Introduction

I pattedyr nervesystemet giver myelin hurtig nerve varmeledning og cytoskeletale integritet af enwrapping axon fibre med flerlaget hindeagtige skeder. Dens lag struktur er sammensat af skiftevis nanoskala tynd-film sammensat af plasma membraner (~ 5 nm), cytosol (~ 3 nm), og ekstracellulære rum (~ 7 nm)1,2. Optisk mikroskopi, herunder den seneste Super-resolution mikroskopi, er ikke egnet til observere nanoskala myelin dynamikken på grund af deres utilstrækkelige opløsning på grund af optisk diffraktion3,4,5. Selvom elektronmikroskopi kan give fine detaljer af myelin nanostrukturer, er den ikke kompatibel med de levende biologiske systemer på grund af stærkt invasive prøve forberedelserne involverer kemiske fiksering og ultrasectioning6,7 . Indtil for nylig, er der ingen teknik gældende at observere nanoskala dynamics af myelinerede axoner in situ.

Schain et al. rapporterede tidligere, at myelinerede axoner udviser farverige lys Reflektionsgraden8. Ved at vedtage spektroskopisk analyse på det reflekterede lys, har vi udarbejdet en ny imaging modalitet for nanoskala billeddannelse af myelinerede axoner, opkaldt spektral reflectometry (SpeRe)9. SpeRe er baseret på de tynd-hinde interferens forekommer i den multi-lag struktur af myelinskeden (figur 1). Af fiberoptiske simulering på forskellige axoner, vi har afsløret at Reflektionsgraden spektrum er en periodisk funktion af wavenumber og dens hyppighed (Equation 1) er omvendt proportional med axon diameter (d). Denne simple relation (Equation 2) tilbyder facile kvantificering af axon diameter fra SpeRe data. Udnytte dette, afslørede vi den fremherskende axon svulmende under mild traumatisk hjerneskade i vores tidligere rapport.

SpeRe systemet er baseret på Konfokal mikroskopi og består af en specialiseret Laserkilde og filtre (figur 2). Input-kilde er en hvid-lys laser, leverer bredbånd spektrale output synlige infrarøde regioner. For den spektrale scanning, systemet er udstyret med to akustisk-optiske enheder: en akustisk-optisk afstemmelige filter (AOTF) for at levere en valgte bølgelængde fra bredbånd indgangskilden og en akustisk-optisk stråledeler (AOBS) til vejlede den valgte afspejles bølgelængde til detektoren. Software til hyperspectral Konfokal mikroskopi giver (Se Tabel af materialer) en tilpasselig spektrale scan valgmulighed sekventielt erhverve Reflektionsgraden billeder på forskellige input bølgelængder. Derudover kromatisk aberration kritisk kan blande sig i den spektrale måling; Derfor anbefales brug af en apochromat mål linse.

Bemærk, hvid-lys lasere producere en ujævn spektrale output og de optiske komponenter også påvirke den spektrale profil. De erhvervede spectra skal derfor være kalibreret til den efterfølgende kvantitativ analyse. En beskyttet Sølv spejl bruges typisk som en reference, der giver en næsten konstant Reflektionsgraden (> 97%) over regionen fuldt synlige. De erhvervede spectra er derefter divideret med reference spektre fra spejlet.

Den spektrale trin størrelse for den spektrale scan bestemmer erhvervelse hastighed; Det skal således være optimeret. Som en større axon har en højere spektrale periode, kræver det finere spektrale prøveudtagning. For eksempel, en axon med en diameter på 10 µm, en af de største fysiologisk axoner, har en spektral periode af ~ 8 nm. Ved at anvende Nyquist prøveudtagning kriterier, vi ansat den spektrale prøveudtagning interval af 4 nm til at dække alle de fysiologiske axoner i mus nervøs væv. Denne tilgang tager typisk over flere sekunder for en fuld spektrale scanning og er således ikke egnet til i vivo applikationer, hvor fysiologisk bevægelse (f.eks. åndedræt og hjerterytme) griber stabil spektrale erhvervelse. Vi tidligere løst problemet ved instrumentering tilpassede opretstående mikroskop, designet til at erhverve den fulde spektrum for hver punkt ved hjælp af en array spectrometer (erhvervelse hastighed ≈ 30 ms per pixel).

I denne betænkning beskriver vi en detaljeret protokol på SpeRe imaging på en fast hjernen skive, som kan udføres i en kommerciel hyperspectral mikroskop (Se Tabel af materialer). Protokollen kan således udføres af eksperimentatorer uden ekspertise i optisk instrumentation. Vi dækker også de potentielle problemer og fejlfinding i forbindelse med erhvervelse og analyse af SpeRe data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle kirurgiske procedurer blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Sungkyunkwan Universitet.

1. Prøvetilberedning

Bemærk: Autoklave alle kirurgiske instrumenter inden deres dyr behandling. Gennemføre alle kirurgiske ydeevne i et rum dedikeret til kirurgiske procedurer. Steril kirurgiske kjoler og handsker skal bæres af alle medarbejdere i den kirurgiske værelse på alle tidspunkter.

  1. Væv fiksation
    1. Forbered to 10 mL sprøjter hver fyldt med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS.
    2. Bedøver en 7-12 uge gammel mus, (C57BL/6J eller mus linjer med begge køn) ved at administrere en blanding af zoletil og xylazin (1:1, 20 mg/kg hver) eller en alternativ egnet anæstesi regime (fx, blanding af 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin) med en intraperitoneal injektion.
    3. Når musen har nået et kirurgisk fly af anæstesi (Brug metoden tå knivspids-reaktion), udsætte hjertet ved at afskære huden og brystkassen med en saks.
    4. Snip højre atrium med en lille saks til at dræne blodet og perfuse opløsningen PBS og PFA sekventielt gennem venstre hjertekammer med en nål (perfusion sats = 4 mL/min, volumen = 10 mL for hver løsning).
      Bemærk: Musen bliver stiv, hvis proceduren er fuldført. Brug af øjet salve eller Sterilisation er ikke nødvendigt, da proceduren er terminal. Fiksering procedure må være hoppet. Dette trin anbefales dog at minimere strukturelle deformationer herunder mekaniske vævsskader og iskæmisk cytoskeletale hævelse. Yderligere oplysninger om væv fiksering, henvise til artiklen af Gage, G. J. et al. 10
  2. Forberedelse af hjernen skive
    1. Halshugge musen med kirurgisk saks gennem den ventrale thorax og abdomen.
    2. Fjerne hovedbunden og periosteum ved hjælp af en passende lille saks indtil fuldt udsætte kraniet.
    3. Bryde frontal knoglen og skære kranium langs den sagittal sutur fra nakkeknude ved hjælp af lille saks med omhu ikke for at skade hjernen.
    4. Forsigtigt fjerne kraniet og dura mater sekventielt ved hjælp af fine pincet.
    5. Uddrag den hjerne ved hjælp af en blød plast skeen, pas på ikke for at beskadige vævet.
    6. Skyl og Nyd den udpakkede hjerne i en 4% PFA løsning i 30 min. ved 4 ° C.
    7. Skær fast hjernen i 100-150 µm sektioner ved hjælp af en vibratome.
      Bemærk: Yderligere oplysninger om væv forberedelse, henvise til artiklen ved Segev et al. 11. for efterfølgende procedurer, vævet skal være skåret i sektioner tyndere end tykkelsen af spacer.
  3. Montering af hjernen skive
    1. Forberede 1 glas dias og 2 firkantede dække briller (22 × 22 × 0,17 mm) for hver væv skive.
    2. Skær en firkantet dæksel briller i halvdelen (to rektangulære stykker) ved hjælp af et glas cutter.
    3. Fastgør to halveret dække briller ved hjælp af en super lim på dias glas.
      Bemærk: Mellemrummet mellem de to halveret briller skal være lidt større end størrelsen af væv skive.
    4. Høste hjernen skive ved hjælp af en pensel eller en pipette og lå vævet på dias glas mellem spacer. Passe på ikke for at folde væv.
    5. Der afpipetteres 100 μl af PBS på væv overflade.
    6. Placere den andre firkantede cover glas på toppen af vævet. Undgå optagelse af luftbobler i denne fase.
    7. Seal omkring cover glas ved hjælp af en neglelak (eller alternativt egnet klæbemidler) for at forhindre fordampning af PBS og kontaminering af støv under den efterfølgende imaging-session.
      Bemærk: Eksperimentatoren kan pause på dette tidspunkt.

2. kalibrering

  1. Tænde mikroskopet mindst 1 time før imaging at give termisk stabilisering af laser kilde (Se Tabel af materialer). Derefter tænde software til spektrale scanning (Se Tabel af materialer) og klik på knappen erhverve øverst på GUI (figur 3a).
  2. Drej på software udløseren for hvid-lys laser (WLL) og photomultiplier tube (PMT) (figur 3a).
  3. Vælg den xyΛ tilstand på drop-down listen i Erhvervelse Mode, så laser indtastningsmodus ændres automatisk fra konstant procent til Konstant strømforsyning. Fjern markeringen i afkrydsningsfeltet automatisk SPbevægelighed. Og angiv derefter vinduet spektrale af input laser til 470-670 nm og den spektrale trin størrelse til 4 nm på Λ-Excitation Lambda Skan Indstillinger (figur 3b).
  4. Angiv den spektrale vifte ydelse til 450-690 ved at dobbeltklikke på eller flytte justering baren for spektrale rækkevidde (figur 3 c).
    Bemærk: Denne spektrale rækkevidde bør omfatte komplet båndbredde af input-kilden.
  5. Vælg en vand-fordybelse mål linse, passende med en høj numerisk blænde (NA > 0,7) og give nogen værdi til ydelse og laser magt til at aktivere AOBS konfiguration og Live Scan knap. Skifte det optiske sti ved at kontrollere refleksion i AOBS konfiguration (figur 3d).
  6. Montere en reference spejl (Se Tabel af materialer) på stadiet mikroskop. Spejlet overflade bør stå over mod mål linse. Hvis det ikke er let at sætte spejlet på stadiet mikroskop, bond et spejl på den flade tallerken (f.eks. dias glas).
  7. Kontrol mikroskop scenen for at justere brændplanet at spejlet overflade.
  8. Justere ydelse gevinst og laser power overvejer det dynamiske område af detektoren og derefter ændre laser indtastningsmodus fra konstant procent til Konstant strømforsyning.
    Bemærk: Som det er typisk, en ydelse få 500 (V) og en relativ laser power på 0,1% anvendes på 570 nm.
  9. Bekræfte i en pseudo-farve mode til at kontrollere, at der er ingen mætning hele bølgelængdeområdet. Hvis mætning er observeret, sænke laser power (figur 3a).
  10. Køre Lambda Skan erhvervelse.
  11. Fjerne spejlet fra scenen og gentage den samme erhvervelse uden en prøve for at opnå den mørke reference (dvs., mørke forskydning).
  12. Gemme data i en Multistacked TIF format.

3. SpeRe billede erhvervelse

  1. Placer den monterede væv på stadiet mikroskop. Du kan groft justere væv til brændplanet af formålet objektivet, hjælp wide-felt fluorescens mode gennem en lup.
  2. Med den Live Skan på kontrol mikroskop fase at justere brændplanet at det pågældende område i vævet. For at undgå baggrundsstøj fra cover slip, Vælg målområde for mindst 15 μm dybde fra grænsefladen glas-væv.
  3. Erhverve den spektrale billedstak for regionen mål ved hjælp af den samme procedure som beskrevet i trin 2.1-2.10.
  4. Gemme data for væv og den mørke forskydning i Multistacked TIF format.
    Bemærk: Eksperimentatoren kan pause på dette tidspunkt.

4. billede behandling og analyse

  1. Åbn den spektrale data (multistacked TIF) for reference spejl og hjernevæv i ImageJ.
  2. Vælg ROIs (regioner af interesse) for de åbnede billedstakke — det centrale område for reference spejl og segment af et axon fiber til hjernevæv.
  3. Erhverve rå spektrene for de valgte ROIs af løbende billedstakkePlot z-aksen profil i menuen ImageJ.
  4. Åbn den mørke offset data, en taget for reference spejl og de andre taget for hjernevæv.
  5. Erhverve spektre for de mørke forskydninger af løbende billedstakkePlot z-aksen profil i menuen ImageJ.
  6. Gemme alle de erhvervede spektre ved hjælp af indstillingerne til Kopier og sæt ind .
    Bemærk: For SpeRe billeddannelse, brug af den centrale imaging felt at minimere off-axis optiske aberrationer er anbefalet. Axon fibre kan være strukturelt heterogen langs deres længde. Dermed, at vælge ROI på en lille axon segment, typisk < 5 µm, at minimere delvis-volumen artefakt anbefales.

5. baseline korrektion og SpeRe Signal analyse

  1. Fratræk de offset spektre fra spektrene reference spejl og hjernen væv.
  2. Normalisere hvert spektrum ved at dividere den maksimale intensitet af spektret.
  3. Opdele axon normaliseret spektrum af de normaliserede spektrum af reference spejl og fratræk DC offset fra den normaliserede spektrum.
  4. Måle wavenumber frekvens ved at montere de erhvervede spektrum til en sinusformet kurve (Se Tabel af materialer), og derefter konvertere den erhvervede wavenumber hyppigheden af at tage gensidige.
  5. Konvertere wavenumber hyppighed til axon diameter ved hjælp af ligningen i figur 4 c.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I henhold til protokollen, en fast hjernen skive var parat med eksogene farvning, en målretning af myelin fluorophore (Se Tabel af materialer). SpeRe imaging blev udført på hjernen skive ved hjælp af en kommerciel hyperspectral Konfokal mikroskop sammenholdt med Konfokal fluorescens imaging (figur 4a). For SpeRe, input optisk intensitet blev sat til 5 µW/µm2 med en pixel hviletiden ~ 1 µs. Dette lys dosis er over en rækkefølge af størrelsesorden lavere end konventionelle fluorescens konfokalmikroskopi12. Det tager ~ 17 s til spektrale scanning over 470-670 nm med et interval på 4 nm (51 billeder).

SpeRe signal blev lokaliseret langs midten af myelinerede axoner, som forventet af geometrien af optiske refleksion. Fra Reflektionsgraden spektrum af et axon segment, blev der opnået wavenumber hyppighed, som blev efterfølgende omdannet til axon diameter (figur 4b, c). Den diameter, målt ved SpeRe fandtes for at være i god aftale med fluorescens-baseret måling (figur 4 d). Den resterende mindre fejl kunne have stammer enten fra den diffraktion-begrænset opløsning af fluorescens-baseret metode eller den ufuldstændige geometriske model for SpeRe.

SpeRe imaging er baseret på optiske refleksion, dermed en silica-baseret coverslip kan indføre en betydelig baggrundsstøj. I vores optik setup var baggrundsstøjen betydelig, da imaging dybden fra coverslip er mindre end 5 µm men undgik når imaging dybden er større end 15 µm (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Princippet om SpeRe. Myelinerede axon har et lag tynde film struktur. Det indfaldende lys er delvist reflekteres fra på grænseflader, som beskrevet af Fresnels lov. Disse reflekteres lyset bølger forstyrrer hinanden; Derfor, den resulterende reflekterede lys koder nanostructural oplysninger. Spectral Reflectometry (SpeRe) henter den nanostructural ved afkodning det reflekterede lys fra myelinerede axon. Dette tal er blevet genoptrykt fra Kwon, J. et al. 9 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Layout af ordningen SpeRe. SpeRe systemet er baseret på en Konfokal Reflektionsgraden mikroskop. For spektrale scanning, tre ekstra komponenter er nødvendige langs stien excitation: (1) en supercontinuum laser, (2) akustisk-optisk afstemmelige filter (AOTF) og (3) akustisk-optisk beam splitter (AOBS). Bredbånd Laserkilde er spektralt filtreret af AOTF til at overføre en valgt bølgelængde med en smal båndbredde. AOBS fungerer som en stråledeler for den valgte bølgelængde til at guide excitations lys til prøven. Lyset er så hændelse på prøven gennem en galvanometric scanner og en mål linse. Det reflekterede lys fra prøven er descanned, rumligt filtreret af en Konfokal pinhole og indsamlet af photomultiplier tube (PMT). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Software setup. (en) den grafiske brugergrænseflade (GUI). I hovedvinduet, der er hovedsagelig fem sub paneler: imaging setup, laser setup, fiberoptiske setup, detektor setup og Billedfremviser. (b) den henlægge-nede menu hen til sluttet imaging-tilstand. SpeRe vælges xyλ. (c) panelet for at justere vinduet spektrale til detektoren. (d) i panelet for at oprette acousto-optisk stråledeler (AOBS). 'Reflektionsgrad' er valgt til at lede det reflekterede lys til detektoren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : SpeRe på en hjernevæv. (en) et SpeRe billede af en murine hjernevæv farvet med et fluorescerende counterstaining af myelin (fluoromyelin). (b) en repræsentativ Reflektionsgraden spektret opnået fra de hvide stiplet boks i litra a. (c) en simuleret reference kurve til at anslå axon diameteren fra spektrale hyppighed. Blå stjerne er det datapunkt, der er fremstillet af (b). (d) tværgående profil af fluorescens intensitet fra boxed regionen i litra a. Den myelin udvendig diameter anslået ved hjælp af fluorescens signal er ~ 760 nm, som er enig godt med SpeRe måling. De resterende fejl er tænkes fra diffraktion fejl af fluorescens-baseret måling. Scalebar, 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Effekt af et dække slip. (en, b) Reflektionsgraden billeder af en hjernevæv ved den samme lateral position er erhvervet på forskellige dybder fra grænsefladen væv-coverslip: på 3 µm (a) og 15 µm (b). Scalebar, 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SpeRe er en ny label-fri imaging modalitet baseret på spektrale interferometri, som for første gang tilbyder nanoskala oplysninger i live myelinerede axoner. I den nuværende protokol, erhvervelse, den rumlige opløsning for axon diameter er ca. 10 nm. Desuden udnytter SpeRe ordrer af størrelsesorden lavere lys dosis i forhold til andre super-opløsning microscopies; Det er således fri for fototoksicitet og photobleaching. SpeRe vil give en ny avenue for at studere nanoskala dynamics af myelinerede axoner.

Protokollen beskrevet heri er baseret på spektrale scanning medieret af akustisk-optik og punkt detektor (dvs.ydelse). Denne tilgang er fordelagtige for at erhverve spektrale billeder af fuld synsfeltet. Dog er tidsopløsning begrænset af den spektrale scanning, som er typisk > 15 s i vores nuværende konfiguration. Som alternativ, kan en højhastigheds spektroskopet indarbejdes for at aktivere real-time overvågning af en lille field-of-view9. Dette system kan konstrueres blot fra en konventionel Konfokal system ved at skifte ydelse af en spektroskopet og ved at tilføje en hvid-lys laser. For erhvervelse software skal Drejespoleinstrument synkroniseres med en afvikling af spektroskopet. I tilfælde af en enkelt måling bestemmes de tidsmæssige opløsning af frame rate af spektroskopet, som kan være > 10 kHz for nylig ultrahurtig spectroscopes. Denne sub millisekund tidsmæssige opløsning bør være nok for observerer størstedelen af den fysiologiske dynamics af myelinerede axoner in vivo. SpeRe er baseret på lysrefleksion; den fundne lys har derfor samme bølgelængde som input lyset. Tværtimod indebærer fluorescens spektrale Skift (dvs., Stokes Skift); den fundne lys er således spektralt kan adskilles fra det indgående lys. Denne funktion er nyttig for samtidige erhvervelse af SpeRe og fluorescens på den samme model (som vist i figur 4). Optagelsen af de input lys ved en fluorophore kan påvirke SpeRe måling, men absorption fra typiske fluorescerende farvning er negligibly lavt (< 1%).

Bemærk har SpeRe en begrænset kantede opdagelse rækkevidde-kun axoner næsten parallelt med billedbehandling kan påvises. Denne kantede grænsen for SpeRe er omkring ± 13.5° 9. For at erhverve specifikke orientering af interesse, kan prøven vippes. I tilfælde af gennemsigtige prøver såsom zebrafisk embryo, kan fuld volumetriske erhvervelse være muligt ved at dreje modellen. En yderligere praktisk begrænsning er, at en coverslip monteret på en stikprøve producerer stærke back-refleksion fører til generation af høj baggrund signal som vist i figur 5; Det anbefales, at denne overfladiske region bør undgås. SpeRe baseret på synligt lys har 1/e dæmpning længde af ~ 20 µm i hjerne-væv. Typiske væv indtrængningsdybde kan erhverve pålidelige spektrale oplysninger er begrænset til ~ 100 µm. dybere imaging være muligt, hvis en længere indgangskilde bruges. I sidste ende, er validering af SpeRe vist ved at sammenligne det med diffraktion-begrænset Fluorescens mikroskopi. Dette har tilsyneladende været utilstrækkeligt til at vurdere nanoskala præcisionen (figur 4). De seneste teknikker, såsom korrelationsmaalinger lys-Elektron Mikroskopi og ekspansion mikroskopi, ville tilbyde en måde til at validere SpeRe på nanoskala regime13,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer konkurrerende finansielle interesser: J. Kwon og M. Choi er opfinderne af patentanmeldte teknologi beskrevet i denne artikel.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Institute for grundlæggende videnskab (IBS-R015-D1) og grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (2017R1A6A1A03015642).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass cutter - - Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Nail polish - - Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Apochromat objective 40×, NA 1.1 Leica Microsystems 15506357 Water-immersion type
Fluoromyelin Green Thermo Fisher F34651 Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.
Leica SP8 TCS microscope Leica Microsystems SP8 Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details.
Imaging software Leica Microsystems LAS-X -
Matlab MathWorks - -
Mirror Thorlabs PF10-03-P01 Coated with protected silver.
Phosphate-buffered saline (PBS) Life technologies 14190-136 -
Paraformaldehyde Biosolution BP031a 4% v/v in PBS
Cover slip Thermo Fisher 3306 Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)
Slide glass Muto Pure Chemicals 5116-20F Thickness: ~1 mm
Super glue Henkel Loctite 406 Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.
Syringe pump Brainetree Scientific BS-8000 DUAL -
Vibratome Leica Biosystems VT1200S -
White-light laser NKT photonics EXB-6 EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
  2. Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction. Brain Research. 210, 383-387 (1981).
  3. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 13978-13983 (2012).
  4. Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices. Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).
  5. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5, 155-157 (2008).
  6. Peters, A., Sethares, C. Is there remyelination during aging of the primate central nervous system? Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).
  7. De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. Anisotropic properties of the myelin sheath. Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).
  8. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
  9. Kwon, J., et al. Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo. Nature Communication. 8, 1832 (2017).
  10. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
  11. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. JoVE. (112), e54024 (2016).
  12. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  13. Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14, 593-599 (2017).
  14. Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics