Encellede transkriptom analyser af mus i bugspytkirtlen endokrine celler

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en metode til isolering af endokrine celler fra embryonale, neonatal og postnatal bugspytkirtel efterfulgt af encellede RNA sekventering. Denne metode giver mulighed for analyser af pancreas endokrine lineage udvikling, celle heterogenitet og transkriptom dynamik.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, L. C., Yu, X. X., Zhang, Y. W., Feng, Y., Qiu, W. L., Xu, C. R. Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells. J. Vis. Exp. (139), e58000, doi:10.3791/58000 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Pancreas endokrine celler, der er grupperet i Holme, regulere blod glucose stabilitet og energimetabolisme. De forskellige celletyper i Holme, herunder insulin-secernerende β celler, er adskilt fra fælles endokrine stamfaderen under fosterstadiet. Umodne endokrine celler udvide via celleproliferation og modne i en lang postnatal udviklingsmæssige periode. Mekanismerne bag disse processer er imidlertid ikke klart defineret. Encellede RNA-sekventering er en lovende tilgang til karakterisering af forskellige cellepopulationer og spore celle lineage differentiering veje. Her, beskriver vi en metode til enkelt celle RNA-sekventering af isolerede pancreas β celler fra embryonale, neonatal og postnatal bugspytkirtel.

Introduction

Bugspytkirtlen er en vitale metaboliske organ i pattedyr. Bugspytkirtlen er sammensat af endokrine og eksokrine rum. Pancreas endokrine celler, herunder insulin-producerende β celler og glukagon-producerende α celler, klynge sammen i Holme i Langerhanske og regulere coordinately systemisk glukose homøostase. Dysfunktion af endokrine celler resultater i diabetes mellitus, som er blevet et stort folkesundhedsproblem på verdensplan.

Pancreas endokrine celler er afledt af Ngn3+ progenitorceller under embryogenese1. Senere, i den perinatale periode, de endokrine celler formere sig til form umodne Holme. Disse umodne celler vedbliver med at udvikle og efterhånden modne Holme, som bliver rigt vaskulariserede for at regulere blod glukose homøostase i voksne2.

Selv om en gruppe af transcriptional faktorer er blevet identificeret som regulerer β Celledifferentiering, er præcise modning pathway af β-celler stadig uklart. Β celle modning processen indebærer endvidere også reguleringen af celle nummer ekspansion3,4 og generation af cellulære heterogenitet5,6. Dog har reguleringsmekanismer af disse processer ikke været godt undersøgt.

Encellede RNA-sekventering er en kraftfuld tilgang, der kan profilere celle delpopulationer og spore celle lineage udviklingsmæssige veje7. Drage fordel af denne teknologi, nøglen hændelser, der opstår under pancreas islet udvikling kan være tydet på én celle niveau8. Blandt de encellede RNA-sekventering protokoller, Smart-seq2 giver mulighed for generation af fuld længde cDNA med forbedret følsomhed og nøjagtighed, og brugen af referencereagenser på lavere omkostninger9. Smart-seq2 tager ca. to dage til at konstruere en cDNA bibliotek for sekventering10.

Her foreslår vi en metode til isolering af fluorescens-mærket β celler fra bugspytkirtel af føtal til voksen Ins1-RFP Transgene mus11, ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS), og udførelsen af transkriptom analyserer på den encellede niveau, ved hjælp af Smart-seq2 teknologi (figur 1). Denne protokol kan udvides til at analysere transcriptomes af alle i bugspytkirtlen endokrine celletyper i aging, normale og patologiske stater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Peking Universitet.

1. bugspytkirtlen Isolation

  1. For E17.5 (embryonale dag 17,5) embryoner:
    1. Anslå embryonale dag 0,5 baseret på tidspunkt, da skeden stikket vises.
    2. Ofre de gravide mus af CO2 administration. Spray den abdominale pels med 70% alkohol.
    3. Lave en V-formet snit med en saks fra den genitale område strækker sig til ribbenene. Denne proces vil helt åbne i bughulen.
    4. Dissekere livmoderen ud af bughulen og placere det i en 10 cm parabol der indeholder kold PBS.
    5. Dissekere embryoner fra livmoderen med tynd spids pincet under et stereomikroskop, fjerne andre væv, såsom moderkagen og navlestrengen. Placere alle embryoner i en 10 cm parabol der indeholder kold PBS.
    6. Rive åbne embryoner bughulen og grave ud af visceralt væv med albue pincet. Overføre den visceralt væv i en 6 cm sort-nederste skål indeholdende kolde PBS.
    7. Bugspytkirtlen er placeret i øverste venstre del af maven og tillægger den mave, milt og duodenum (gul punkteret linie i figur 2A)12. Frigøre bugspytkirtel fra visceralt væv ved hjælp af pincet og pool i bugspytkirtlen vævet sammen i en 20 mL hætteglas indeholdende 5 mL 0,5 mg/mL koldt collagenase løsning: 0,5 mg/mL collagenase Pedersen i isolation buffer (HBSS indeholdende 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2 5 mM Glucose, pH 7,4).
  2. For P0-P15 (postnatal dag 0-15) mus:
    1. Ofre og lave musen ved at tilslutte lemmer til et stykke af benchtop protector med tape. Spray den abdominale pels med 70% alkohol.
    2. Helt åbne i bughulen, som beskrevet i trin 1.1.3. Trække tarmen ud og til venstre side af musen. Denne procedure vil udsætte i sår på tolvfingertarmen, gastrisk og milt lapper i bugspytkirtlen. Omhyggeligt dissekere alle kamre af bugspytkirtlen (figur 2B)12 og pool i bugspytkirtlen vævet sammen i en 20 mL hætteglas indeholdende 5 mL 0,5 mg/mL koldt collagenase løsning.
  3. For P18-P60 (postnatal dag 18-60) mus:
    1. Forberede collagenase løsning. Holde på is indtil klar til brug.
    2. Ofre musen og åbne i bughulen, som nævnt ovenfor (trin 1.1.2 og 1.1.3).
      Bemærk: Ondt ikke leveren, eventuelle sår til leveren vil reducere flow presset ind i galdegang og reducere perfusion effektiviteten i de følgende trin.
    3. Fjerne formet som et sværd. Trække tarmen ud og på højre side af musen, og skubbe de venstre og højre mediale lapper af leveren til hver side for at udsætte galdeblæren (hvid pil i figur 2 c) og fælles galdegang.
    4. Klemme duodenum med et par små fartøj klemmer på den øvre og nedre holdning, flankerer webstedet hvor galdegang ind i duodenum (figur 2D).
      Bemærk: Ikke klemme gastrisk eller milt kamre i bugspytkirtlen. Collagenase løsning vil ikke flyde ind i den mave og milt lap af bugspytkirtlen i de næste skridt hvis fastspændt.
    5. Fyld en sprøjte med 5 mL 0,5 mg/mL koldt collagenase opløsning og indsætte en 30 G nål i galdeblæren. Omhyggeligt og jævnt, manipulere nål gennem fælles galdegang.
    6. Perfuse bugspytkirtlen ved at indsprøjte 1 – 5 mL 0,5 mg/mL koldt collagenase løsning, afhængigt af størrelsen af musen. Injektionen bør være langsom og konstant at forhindre nålen glider ud af kanalen og forhindre tarmen fra brister under flydende højtryk. Injektionen er færdig, når bugspytkirtlen er fuldt udvidet.
    7. Dissekere bugspytkirtlen (den gule stiplede linje i figur 2D) ud af bughulen bruger pincet umiddelbart efter perfusion. Sted væv i en 20 mL hætteglas indeholdende 5 mL 0,5 mg/mL koldt collagenase løsning. Hvis manipulere med mere end en mus på et tidspunkt, perfuse mus én efter én og pool væv i kolde collagenase løsning i en 20 mL hætteglas, indtil alle mus har været dissekeret.

2. collagenase fordøjelse og Holmen Isolation

  1. Placere 20 mL hætteglas indeholdende i bugspytkirtlen vævet ind i et 37 ° C vandbad og Inkuber i 3 min. til Reagensglasset temperaturen.
  2. Ryst forsigtigt rør til en anden 3-5 min. Hvis den pancreas væv er fuldt oppustet, vil det gradvist adskille i lille væv stykker, indtil det er endelig spredt ensartet. Fordøjelsestid varierer afhængigt af bugspytkirtlen størrelse og perfusion effektivitet.
  3. Filtrer fordøjet produktet gennem en 0,25 mm nylon si i en ny 50 mL-centrifugerør. Grundigt vaske sien ved hjælp af en 20 mL sprøjte indeholdende iskold PBS.
  4. For E17.5-P15 bugspytkirtel, spring til trin 3.1.
  5. For P18-P60 bugspytkirtel, centrifugeres ved 200 x g i 1 min og supernatanten. Genopslæmmes væv med kolde PBS.
  6. Hældes 5 mL af væv suspension i en 6 cm sort bund fad. Pancreas holmene er lille, kompakt, mælket hvidt strukturer og acinar væv er løs og gennemsigtig hvid. Vælge Holme med 200 μl pipette og overføre dem til en 1,5 mL tube, som indeholder en lille mængde koldt PBS.

3. trypsin fordøjelsen af pancreas væv eller Holme

  1. Der centrifugeres rør indeholdende pancreas væv eller Holme ved 200 x g i 1 min. ved 4 ° C, og supernatanten uden at forstyrre pelleten.
  2. Genopslæmmes pellet med 0,25% trypsin-EDTA og Inkuber i et 37 ° C vandbad. Efter 4 min inkubation, forsigtigt og lejlighedsvis Aspirér (pipette) for 1 min bruger 200 μl tips.
    Bemærk: For E17.5-P3 bugspytkirtel, tilsættes 1 mL trypsin-EDTA. P4-P15 bugspytkirtel, Tilføj 3 mL trypsin-EDTA. For 100-300 Holme, tilsættes 1 mL trypsin-EDTA. Justering af lydstyrken for trypsin-EDTA efter mængden af væv.
  3. Stopper fordøjelsen ved at tilføje 0,4 x mængden af kolde føtal bovint serum (FBS) og blandes ved blid vortex.
  4. Der centrifugeres ved 250 x g i 3 min. ved 4 ° C. Supernatanten uden at forstyrre pelleten.
  5. Genopslæmmes celler med 200 μl koldt FACS buffer (HBSS indeholdende 1% FBS, pH 7,4). Overfør celler til et 5 mL FACS rør.
  6. Hurtigt spin FACS røret for at tillade cellesuspension til at passere gennem filteret til at fjerne ufordøjet store væv snavs. Enkelt cellesuspension i røret er nu klar til FACS sortering.

4. enkelt-celle Lysis

  1. Forberede celle lysisbuffer.
    Bemærk: Udfør alle eksperimenter under en UV-steriliseret hætte med laminar flow. Alle rør, plader og pipette tips bør være RNase- / DNase-frit. Dekontaminering hood og pipetter med RNase lager løsning før brug.
    1. Tø reagenser på is: dNTP (10 mM), oligo-dT primer (10 μM) og ERCC bestand løsning (1:20).
    2. Fortynd ERCC 1:5 x 105 med nukleasen-gratis vand.
    3. Beregne omfanget af celle lysisbuffer behov. Der tilsættes 0,1 μL af RNase inhibitor (40 U/μL), 1.9 μL på 0,2% (vol/vol) Triton X-100, 1 μL af dNTP, 1 μL oligo-dT primer og 0,05 μL fortyndet ERCC til en endelige mængden af 4.05 μL for hver celle.
    4. Alikvot celle lysisbuffer til 0,2 mL tynd væg 8-stribe PCR rør eller 96-brønd plader. Der centrifugeres rør eller plader til 30 s ved 4 ° C.
      Bemærk: Centrifugeres 0,2 mL tynd væg 8-stribe PCR rør på 7500 x g og 96-brønd plader på 800 x g i følgende trin.
  2. Encellede plukning og lysering.
    1. Manuelt pick FACS sorteret Ins1-RFP+ enkelt celler i FACS buffer i 8-strip PCR rør ved hjælp af en 30-40 µm kapillær pipette, eller direkte sortere Ins1-RFP+ enkelt celler i 96-brønd plader. Den diskenhed, der indeholder en enkelt celle anses for at være mindre end 0,3 μl.
      Bemærk: Brug forward scatter højde (FSC-H) vs videresende scatter område (FSC-A) gating strategi for doublet forskelsbehandling, FSC-H vs side scatter område (SSC-A) for snavs og fluorescens gating til sortering af Ins1-RFP+ celle (figur 3A-3C). Metoden picking sortere target-cellerne i en 1,5 mL rør indeholdende 300 μL FACS buffer. Den passende endelige koncentration er 5 – 10 celler/μl. Juster lydstyrken på buffer i overensstemmelse hermed. Metoden plade samling sortere en enkelt celle i hvert hul i en 96-brønd plade efter manual instrument. 7 , 13
    2. Vortex rør eller plader til lyse celler og frigive RNA. Der centrifugeres rør eller plader til 30 s ved 4 ° C og straks placerer dem på is.
      Bemærk: Cellerne kan opbevares ved-80 ° C i en uge.

5. enkelt-celle cDNA forstærkning

  1. Reverse transkription (RT).
    1. Tø RT reagenser (tabel 1) på is.
    2. Inkuber prøver ved 72 ° C i 3 min og straks sætte de rør eller plader på køl i mindst 1 min. kort centrifugeres rør eller plader til 30 s ved 4 ° C.
      Bemærk: Brug en termisk cycler med 105 ° C opvarmet låg til alle inkubationer.
    3. Forberede RT mix for alle reaktioner, som beskrevet i tabel 1.
    4. Dispensere 5,7 μL af RT mix til hver prøve at bringe mængden til ialt 10 μL. Forsigtigt vortex mix og centrifugeres i 30 s ved 4 ° C.
    5. Placer prøverne i en termisk cycler og starte programmet RT som følger: 42 ° C til 90 min, 10 cyklusser (50 ° C i 2 min., 42 ° C i 2 min.), 70 ° C i 15 min og hold ved 4 ° C.
  2. PCR pre forstærkning.
    1. Tø PCR-reagenser (tabel 2) på is.
    2. Forberede PCR mix for alle reaktioner, som beskrevet i tabel 2.
    3. Dispensere 15 μl PCR mix til hver prøve, der indeholder de første-strand reaktioner. Forsigtigt vortex mix og centrifugeres i 30 s ved 4 ° C.
    4. Placer prøverne i en termisk cycler og starte programmet følgende PCR: 98 ° C i 3 min, 18 cykler (98 ° C i 20 s, 67 ° C i 15 s, 72 ° C i 6 min.), 72 ° C i 5 min og hold ved 4 ° C.
      Bemærk: PCR produktet kan opbevares ved 4 ° C for mindre end en uge eller ved-20 ° C/-80 ° C i op til 6 måneder.
  3. PCR rensning.
    1. Tilsættes 25 μL re suspenderede DNA oprensning perler (1 x) til hver prøve fra forrige trin og bland godt af vortex. Derefter hurtigt spin-tube eller plader ved stuetemperatur til at indsamle flydende men undgå bilæggelse af perler.
      Bemærk: Reagensglasset DNA oprensning perler til stuetemperatur for 15 min og vortex grundigt før brug.
    2. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
    3. Sted røret eller plade på en passende magnetiske stå indtil løsningen er klar, så forsigtigt fjerne og supernatanten.
    4. Tilføje 200 μl af frisklavede 80% ethanol til at vaske perlerne i den magnetiske stå, inkuberes i 30 s, derefter forsigtigt fjerne og kassere ethanol løsning.
      Bemærk: 80% (vol/vol) ethanol opløsning skal være frisk fremstillede hver gang.
    5. Gentag trin 5.3.4 i alt to skylninger.
    6. Forsigtigt fjerne og kassere de resterende ethanol løsning og luft tørre perler mens røret eller plade er på den magnetiske stand.
      Bemærk: Undgå over tørring perler for at sikre maksimal eluering effektivitet.
    7. Tilføje 11 μL nukleasen-gratis vand til elueres DNA målet fra glasperler og bland godt af vortex. Derefter hurtigt spin tube eller plade og placere den på en magnetisk stå indtil løsningen er klar. Overfør 10 μl af prøven til et nyt PCR rør.
      Bemærk: Hvis dimerer findes efter en enkelt runde af rensning, baseret på cDNA størrelse distribution påvisning, rense igen for at fjerne dimerer helt. Dimerer kan påvirke beregningen cDNA udbytte, hvis lov til at forblive i prøven.
  4. Kvalitetstjek af cDNA.
    1. Tilfældigt vælge prøver at opdage det cDNA samlede udbytte ved hjælp af en fluorometer.
    2. Evaluere markør gen expression niveauer af real-time PCR (qPCR) (figur 4E). Fjerne 1 μL af prøven fortyndes 40 gange og udføre qPCR ved hjælp af en 384-godt plade. Forberede qPCR mix, som beskrevet i tabel 3. Cykling betingelser: 95 ° C i 10 min, 45 cyklusser (95 ° C til 10 s, 60 ° C i 15 s, 72 ° C i 15 s).
    3. Tilfældigt vælge prøver at opdage størrelse distribution ved hjælp af en parallel kapillær elektroforese instrument.

6. cDNA bibliotek opbygning

  1. Tagmentation reaktion af Tn5 transposase.
    1. Opdage cDNA samlede udbytte af qPCR-udvalgte celler fra trin 5.4.2 ved hjælp af en fluorometer. Brug 2 ng af cDNA som råvaren.
    2. Optø tagmentation reaktion reagenser (tabel 4) på is.
    3. Forberede tagmentation reaktionen i en 0,2 mL tynd væg 8-stribe PCR rør, som beskrevet i tabel 4, og der blandes omhyggeligt ved vortex. Derefter hurtigt spin ned løsning ved stuetemperatur.
    4. Inkuber prøver ved 55 ° C i 10 min og holde ved 4 ° C.
    5. Straks tilføje 2 μl af 5 x TS til hver prøve, der indeholder tagmented DNA til at stoppe reaktionen. Bland omhyggeligt af vortex, og derefter hurtigt spin ned løsning ved stuetemperatur.
    6. Inkuber blandingen i 5 min ved stuetemperatur. DNA skal behandles til den endelige berigelse PCR straks.
  2. Forstærkning af adapter-forbundet fragmenter.
    1. Tø PCR-reagenser (tabel 5) på is.
    2. Forberede berigelse PCR mix, som beskrevet i tabel 5, og der blandes omhyggeligt ved vortex. Derefter hurtigt spin ned løsning ved stuetemperatur.
    3. Udføre PCR ved hjælp af følgende program: 72 ° C i 10 min, 98 ° C til 30 s, 8 cyklusser (98 ° C i 15 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 3 min), 72 ° C i 5 min og hold ved 4 ° C.
      Bemærk: Antallet af cyklusser afhænger af det forventede bibliotek DNA beløb.
  3. PCR rensning med valg af størrelse.
    1. Tilføje 14 μL af re suspenderede DNA oprensning perler (0,7 x) til hver prøve fra forrige trin og bland godt af vortex. Derefter, dreje hurtigt røret ved stuetemperatur til at indsamle flydende men undgå bilæggelse af perler.
      Bemærk: Reagensglasset DNA oprensning perler til stuetemperatur for 15 min og vortex grundigt før brug.
    2. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
    3. Røret anbringes på et passende magnetiske stå indtil løsningen er klare, omhyggeligt overføre supernatanten til en ny tube stribe og kassér den tidligere tube stribe.
    4. Tilsæt 3 μL af re suspenderede DNA oprensning perler (0,15 x) til hver prøve i tube stribe og bland godt af vortex. Derefter, dreje hurtigt røret ved stuetemperatur.
    5. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
    6. Sted røret eller plade på en passende magnetiske stå indtil løsningen er klar, så forsigtigt fjerne og supernatanten.
    7. Tilføje 200 μl af frisklavede 80% ethanol til at vaske perlerne i den magnetiske stå, inkuberes i 30 s, derefter forsigtigt fjerne og kassere ethanol løsning.
      Bemærk: 80% (vol/vol) ethanol opløsning skal være frisk fremstillede hver gang.
    8. Gentag trin 6.3.7 for i alt to skylninger.
    9. Forsigtigt fjerne og kassere de resterende ethanol løsning og luft tørre perler mens røret eller plade er på den magnetiske stand.
      Bemærk: Undgå over tørring perler for at sikre maksimal eluering effektivitet.
    10. Tilføje 11 μL nukleasen-gratis vand til elueres DNA målet fra glasperler og bland godt af vortex. Derefter hurtigt spin tube eller plade og placere den på en magnetisk stå indtil løsningen er klar. Overfør 10 μl af prøven til en ny tube stribe.
  4. Kvalitetstjek af endelige cDNA bibliotek.
    1. Måler koncentrationen af hver bibliotek ved hjælp af en fluorometer og kontrollere størrelse distribution ved hjælp af en parallel kapillær elektroforese instrument.
      Bemærk: DNA udbyttet er typisk mellem 15-25 ng for hvert bibliotek. Fragmenter spænder fra 250 bp til 450 bp vil observeres. Hvis dimerer forbliver efter rensning, hvilket bekræftes af den størrelse distribution kontrol, rense med 1 x DNA oprensning perler endnu en gang.
  5. Bibliotek-gruppering
    1. Baseret på den omtrentlige fragment størrelse, pool lige store mængder af DNA fra hver prøve, at sikre, at ingen af dem indeholder de samme kombinationer af N6XX og N8XX adaptere.

7. DNA-sekventering

  1. Emnet barcoded biblioteker til 51 bp single-ende sekventering ved hjælp af en høj overførselshastighed sekventering system. Udføre sekventering efter producentens protokol. Sekventering dybden af hver celle er omkring 1 million læser i gennemsnit8, mindst 0,5 millioner læser per celle14.

8. Bioinformatik analyser

  1. Sekventering kvalitetsevaluering og justering.
    1. Evaluere kvaliteten af sekventeret læsninger ved hjælp af FastQC (v0.11.3)15 med følgende parametre: "fastqc--uddrag -o output_dir input_fastq".
    2. Flette mus genom med de ERCC sekvenser benytter befale "kat mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
    3. Byg bowtie2 (v2.2.5)16 indeks med følgende parametre: "bowtie2-build mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
    4. Juster læsninger ved hjælp af tophat2 (v2.1.0)17 med følgende parametre: "tophat2 -o output_dir -G gene.gtf--transkriptom-index trans_index mm10_ERCC input_fastq".
  2. Kvantificere gen expression niveauer.
    1. Grev kortlagt læser for hvert gen ved hjælp af HTSeq (v 0.6.0)18 med følgende parametre: '' htseq-count - f bam - r pos -s ingen - et 30 accepted_hits.bam gene.gtf > read_count.txt''.
    2. Normalisere gen expression niveauer til udskrifter pr. million (TPM)19.
  3. Kvalitetskontrol af celler.
    1. Udelukke celler med mindre end 0,5 millioner tilknyttede læser eller færre end 4.000 gener (TPM > 1).
      Bemærk: kriteriet om udelukkelse afhænger celletyper og sekvens dybde.
    2. Bevare celler, der udtrykker endokrine markører (f.eks. Ins1 for β celler, Gcg for α celler), og udelukke celler, der udtrykker ikke-endokrine markører (f.eks. Spi1 for leukocytter).
  4. Principal komponent analyse (PCA)
    1. Identificere meget varierende gener efter ERCC spike-ins, som tidligere beskrevet20.
    2. Udføre PCA ved hjælp af funktionen "PCA" i R pakke FactoMineR (v1.31.4)21, med log2(TPM + 0.1) af meget varierende gener.
    3. Visualisere PCA resultater med ggplot2 (v2.0.0)22.
  5. Hierarkisk klyngedannelse.
    1. Identificere gener med de højeste vigtigste komponent (PC) belastninger ved hjælp af funktionen "dimdesc" FactoMineR (v1.31.4)21.
    2. Udføre hierarkisk klynger ved hjælp af funktionen "heatmap.2" i R pakke gplots (v3.0.1)23med log2 (TPM + 1) relative værdier af høj PC lastning gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bugspytkirtel var dissekeret fra embryonale, neonatal og postnatal mus (figur 2A og 2B). For mus ældre end postnatal dag 18 afhænger fordøjelsesfremmende effekt af graden af perfusion; injektionen er derfor det vigtigste skridt for Holmen isolation (figur 2 c-2E og tabel 6). Så meget collagenase blev sprøjtet som det var muligt at fylde bugspytkirtlen under dette trin. Fuldt oppustede bugspytkirtlen er vist i figur 2D. Hvis perfusion er ikke vellykket (figur 2E), men prøven er kostbar, kan bugspytkirtlen blive revet i små stykker for tilstrækkelig fordøjelsen senere.

Efter perfusion, blev pancreas væv fordøjet i små stykker til at frigive Holme (figur 2F). For at forkorte FACS sortering tid, beriget vi de endokrine celler ved at vælge holmene i forvejen. Størrelsen af holmene kan variere afhængigt af mus alder og fordøjelsen intensitet. Lejlighedsvis, er holmene ikke runde form. Holme bør vælges efter farve og kompakt tilstand (figur 2 g og tabel 6). Hvis den Transgene mus stamme har en reporter gen, som normal god landbrugspraksis eller RFP for endokrine celler, kunne holmene også være samlet under et fluorescens mikroskop.

Ins1-RFP+ celler blev renset af FACS sortering (figur 3A-3 C), og derefter enkelt celler blev samlet ved hjælp af en kapillær pipette til én celle RNA-seq (figur 3D). Med held forstærket cDNA bør have en fuld længde over 500 bp og blive beriget fra 1,5 kb til 2 kb. Desuden er der som regel en 500-600 bp berigelse af cDNA observeret i Ins1-RFP+ celler, som kan repræsentere insulin udskrifter (figur 4A). Der har dog været nogle unormale situationer observerede10 (tabel 6). For eksempel, cDNA fragmenter nær 100 bp er primer dimerer (figur 4B), som er normalt forårsaget af de overdrevne primere, der skal fjernes ved at gentage trinnet DNA oprensning. Eksistensen af primer dimerer kan påvirke beregninger af samlede cDNA udbytter, der anvendes til følgende bibliotek opbygning. CDNA fragmenter mellem 100 bp og 500 bp normalt repræsenterer forringet cDNA (figur 4 c), som er forårsaget af dårlig celle status eller reagens problemer, såsom RNase forurening. På denne betingelse, bør vi identificere årsagen til DNA nedbrydning og udelukke forstyrrelser. For eksempel, for at sikre god celle status, der skal fordøjes væv og celler skal sorteres hurtigt og forsigtigt, og operationer bør udføres forsigtigt for at undgå enhver form for forurenende stoffer.

Efter rensning af cDNA-biblioteker til sekvensering opnåede vi cDNA fragmenter af forskellig størrelse ved at følge instruktionerne for at føje forskellige nøgletal for DNA oprensning perler til prøven. For eksempel, vi kan opnå cDNA spænder fra 250 bp til 450 bp ved at tilføje 0,7 x og 0,15 x DNA oprensning perler til først og anden runder af rensning, henholdsvis (figur 4D). Dette skridt har en høj succesrate. Men hvis der er fragmenter af cirka 100 bp, foreslås det for at rense biblioteker igen med 1 x DNA oprensning perlerne til fjerne dimerer (tabel 6). Unremoved dimerer vil skråtstille DNA kvantificering og vil påvirke prøven pooling resultater, hvilket resulterer i en ujævn dataopsamling fra hver prøve.

Vi analyserede sequencing data med Bioinformatik tilgange (figur 5A). Sekventering kvalitetsresultater bør være større end 30 under sekventering kvalitetsevalueringen (figur 5B). Efter justering forventes 80-90% af læser skal knyttes til referencen genom. For at opnå høj kvalitet celler for downstream analyser, vi udelukket celler med mindre end 0,5 millioner tilknyttede læser eller med færre end 4.000 opdaget gener (figur 5 c og 5 D). Efter PCA og hierarkisk klyngedannelse, vi kendetegnet forskellige grupper af celler og identificeret de gener, der var uensartet udtrykt i forskellige grupper8.

Figure 1
Figur 1: skematisk oversigt for encellede RNA-FF. i mus i bugspytkirtlen endokrine celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: bugspytkirtlen dissektion, perfusion og Holmen picking. (A) dissektion af embryonale pancreas væv (lavere) fra et E17.5 Foster (øverste). Den gule stiplede linje afgrænser den pancreas væv. Skalalinjen = 1.000 µm. (B) dissektion af postnatal pancreas væv (til højre) fra P10 musen (venstre). Skalalinjen = 1.000 µm. (C-D) i bugspytkirtlen vævet P60 musen før (C) og efter (D) perfusion. Den gule stiplede linje afgrænser den pancreas væv. Hvid pil angiver galdeblæren. (E) den delvist perfused pancreas væv P60 musen. Rød pil angiver området godt perfused i bugspytkirtlen. Blå pile angiver de dårligt perfused områder i bugspytkirtlen. (F) de pancreas væv før (øverst) og efter (lavere) collagenase fordøjelsen. (G) pilene peger på de øer, der blev udgivet fra collagenase fordøjet pancreas væv. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: manuelt picking celler med 30 – 40 µm kapillær pipette under et mikroskop. (A-C) Trinvis FACS gating for sortering Ins1-RFP+ celler. (D) den lyse cirkler angive celler og røret er en kapillær pipette. Pick celler med bedre morfologi (pil) og ignorere de grupperede celler (pilespids). Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Kvalitet påvisning af cDNA og bibliotek størrelse distribution af Ins1-RFP+ celler af en parallel kapillær elektroforese instrument. (A) repræsentant resultat af vellykket pre forstærket cDNA. Normalt, cDNA profil skal være over 500 bp med en ~1.5–2 kb peak. (B) repræsentative resultatet af pre forstærket cDNA med en primer dimer peak. Primer dimer peak er ca 100 bp. (C) profil i Pre forstærker cDNA med fragmenter mellem 100 bp og 500 bp antyder muligheden af cDNA nedbrydning. (D) størrelsen fordelingen af cDNA bibliotek spænder mellem 250 bp og 450 bp efter rensning trinene nævnt i denne protokol. (E) udtrykket niveauer af Ins2 i cDNA-biblioteker af qPCR (venstre) og relativ sequencing data (til højre). X-axes repræsenterer forskellige 8 enkelt celle prøver. Y-aksen (venstre) repræsenterer normaliserede ΔCt i forhold til Gapdh (CtGapdh- CtIns2 + 6) og y-aksen (højre) repræsenterer normaliseret udtryk niveau af Ins2 i forhold til Gapdh (log2(TPM- Ins2 / TPMGapdh)). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Bioinformatik analyser af encellede transkriptom data. (A) rørledningen Bioinformatik analyser. (B) sekventering kvalitetsresultater på tværs af alle baser af læser. (C) Distribution af tilknyttede Læs count. (D) Distribution af detekterede gen tæller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Komponent Volumen (µL)
Reverse transkriptase (200 U/µL) 0,5
RNase hæmmer 0,25
First-strand buffer (5 x) 2
DTT (100 mM) 0,5
Betain (5 M) 2
MgCl2 (1 M) 0,06
TSO (100 ΜM) 0,1
Nukleasen-frit vand 0,29
I alt 5.7

Tabel 1: RT reagens blandes komponenter i en 5,7 µL reaktion for hver prøve.

Komponent Volumen (µL)
First-strand reaktion 10
DNA-Polymerase (2 x ReadyMix) 12.5
ER PCR-primere (10 µM) 0,25
Nukleasen-frit vand 2.25
I alt 25

Tabel 2: PCR pre forstærkning reagens blandes komponenter i en 25 µL reaktion for hver prøve

Komponent Volumen (µL)
SYBR Green Master Mix 5
Primere (5 µM) 0,5
Nukleasen-frit vand 2.5
cDNA 2
I alt 10

Tabel 3: qPCR reagens blandes komponenter i en 10 µL reaktion ved hjælp af en standard 384-godt plade.

Komponent Volumen (µL)
5 x TTBL 1,6
2 ng cDNA Variabel
Hedeselskabet2O Variabel
TTE Mix V5 2
I alt 8

Tabel 4: Tagmentation reagens blandes komponenter i en 8 µL reaktion for hver prøve.

Komponent Volumen (µL)
Hedeselskabet2O 1,6
Produkt af forrige trin 10
5 x TAB 4
N6XX 2
N8XX 2
TAE 0,4
I alt 20

Tabel 5: Berigelse PCR reagens mix komponenter i en 20 µL reaktion for hver prøve.

Trin Problem Mulighed for at Løsning
1.3.4 Glide af klemmerne Den ydre overflade af tarmen er våd skyldes eksistensen af den lille mængde af interstitiel væske og collegenase leakness Forsigtigt swap duodenum væg og andre orgel vægge i bughulen med bomuld svaberprøver
1.3.6 Tarmen burst Flydende trykket er for højt i tarmen Bremse injektion hastighed
2.6 Holme holde til eksokrine væv når picking Holme Ufuldstændig fordøjelse Forlænge fordøjelsen varighed og ryster styrke
5.3 CDNA udbyttet er lavt efter PCR-amplifikation Cellerne er i dårlig stand Hold celler, frisk og i god stand
5.4 eller 6.4 Primer dimerer kan ses Overdreven primere Rense cDNA endnu en gang med DNA oprensning perler (0.8:1 eller 1:1 ratio)
5.4 Forringede cDNA efter PCR-amplifikation Dårlig kvalitet af celler eller forurenet reagenser Holde celler i god stand eller ændre reagenser
6.3 Mængden af DNA er lav efter bibliotek opbygning For få PCR cykler eller kvaliteten af cDNA er ikke godt Øge antallet af cykler eller sikre cDNA kvalitet før bibliotek opbygning

Tabel 6: fejlfinding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol demonstrerede vi en effektiv og nem at bruge metode til at studere encellede udtrykket profiler af pancreas β celler. Denne metode kan bruges til at isolere endokrine celler fra embryonale, neonatal og postnatal bugspytkirtel og udføre encellede transkriptom analyser.

Den mest kritiske trin er isolering af enkelt β celler i god stand. Fuldt perfunderet bugspytkirtel reagerer bedre på efterfølgende fordøjelsen. Utilstrækkelig perfusion, som normalt opstår i den dorsale bugspytkirtlen, vil resultere i en lav islet udbytte. Efter perfusion kræver fordøjelsestid og ryster intensitet særlig opmærksomhed. Over fordøjelsen, som følge af lange inkuberingstider og kraftig kan rysten, bryde holmene i stykker. Utilstrækkelig fordøjelsen bliver ikke helt adskilte holmene fra tilstødende væv. Efter fordøjelsen af bugspytkirtlen, blev holmene renset af hånd pluk ikke af tæthed gradient centrifugering. Selv om tæthed gradient centrifugering kan berige Holme, er mange små Holme eller øer forbundet med acinar væv fejlagtigt kasseret. Prøv at undgå at plukke acinar væv, som kan medføre ineffektive trypsin fordøjelse og reducere renheden af β-celler.

Uafhængige biologiske replikater er nødvendige for at adskille biologisk variation og batch effekter. Hvis to biologiske replikater har et lignende mønster i PCA og omfatter lignende undergrupper i klyngedannelse resultater, disse prøver kan afsløre pålidelige biologiske variation. Ellers er yderligere biologisk replikater forpligtet til at bekræfte resultaterne. For en metabolisk orglet som bugspytkirtlen, kan tilstanden celle tilknyttet døgnrytmen ur24 tegner sig for batch forskelle. For at løse dette problem, anbefaler vi indsamle alle prøver på det samme tidspunkt på dagen.

Begrænsning af denne tilgang er lav overførselshastighed, fordi vi er nødt til at konstruere et bibliotek for hver celle. På grund af de overdrevne primere i reaktionen, cDNA før og efter bibliotek byggeri generelt skal renses to gange hen til helt ophæve primer dimerer. Disse processer er tidskrævende. For nylig, en modificeret protokol25 forlød det at kunne løse problemet til en vis grad. I denne protokol etiketter celle-specifikke stregkode cDNA fragmenter under trinnet til reverse transkription. Derfor, cDNA for hver celle kan samles sammen og derefter renses, efterfulgt af bibliotek konstruktion. Denne ændring øger gennemløb af bibliotek konstruktion. Men denne ændrede metode er mindre følsomme og registrerer færre gener pr. celle. Desuden, er denne metode en 3' tælle metode med reducerede Læs dækning. Smart-seq2 er derfor stadig den mest passende metode for pancreas udvikling.

Pancreas forberedelse fra andre arter kan være forskellige. For menneskets bugspytkirtel, kan holmene isoleres efter tidligere protokoller26,27. Derefter, de isolerede øer kan adskilles i enkelt celler28 og udføre encellede analyser ved hjælp af denne metode. Denne metode kan anvendes bredt til forskning af pattedyr i bugspytkirtlen udvikling, sygdomme og regenerering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgements

Vi takker det nationale Center for Protein videnskaber, Beijing (Peking University) og Peking-Tsinghua Center for Life Science Computing Platform. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for videnskab og teknologi i Kina (2015CB942800), National Natural Science Foundation of China (31521004, 31471358 og 31522036) og støtte fra Peking-Tsinghua Center for Life Sciences til C.-R.X.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase P Roche 11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200114
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30071.03
Dumont #4 Forceps Roboz RS-4904
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
Stereo Microscope Zeiss Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope Zeiss Stereo Lumar V12
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap BD-Falcon 352235
96-Well PCR Microplate Axygen PCR-96-C
Silicone Sealing Mat Axygen AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube Extragene P-02X8-CF
Cell sorter BD Biosciences BD FACSAria
Capillary pipette Sutter B100-58-10
RNaseZap Ambion AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix Life Technologies 4456740
Distilled water Gibco 10977
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
dNTP mix New England Biolabs N0447
Recombinant RNase Inhibitor Takara 2313
Superscript II reverse transcriptase Invitrogen 18064-014
First-strand buffer (5x) Invitrogen 18064-014
DTT Invitrogen 18064-014
Betaine Sigma-Aldrich 107-43-7
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Nuclease-free water Invitrogen AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) KAPA Biosystems KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads Vazyme N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix Vazyme Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina Vazyme TD502 Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina Vazyme TD203 Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit Advanced Analytical Technologies DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl
4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4
0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl Sigma-Aldrich S5886
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H4034
MgCl2 Sigma-Aldrich M2393
Oligo-dT30VN primer 5'-AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGTACT30VN-3'
TSO 5'-AAGCAGTGGTATCAAC
GCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers 5'-AAGCAGTGGTAT
CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer 5'-ATGGTGAAGGTC
GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer 5'-GCCTTGACT
GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer 5'-TGGCTTCTTC
TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer 5'-TCTAGTTGCA
GTAGTTCTCCA-3'

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, (10), 2447-2457 (2002).
  2. Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22, (15), 1998-2021 (1998).
  3. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429, (6987), 41-46 (2004).
  4. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, (3), 281-293 (2011).
  5. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  6. Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535, (7612), 430-434 (2016).
  7. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42, (14), 8845-8860 (2014).
  8. Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25, (5), 1194-1205 (2017).
  9. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, (11), 1096-1098 (2013).
  10. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9, (1), 171-181 (2014).
  11. Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63, (1), 203-215 (2014).
  12. Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
  13. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
  14. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9, (1), 75 (2017).
  15. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, (4), 357-359 (2012).
  17. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, (4), (2013).
  18. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31, (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
  19. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131, (4), 281-285 (2012).
  20. Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10, (11), 1093-1095 (2013).
  21. Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25, (1), (2008).
  22. Hadley, W. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Springer Science & Business Media. (2009).
  23. Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016).
  24. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466, (7306), 627-631 (2010).
  25. Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. (2017).
  26. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  27. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  28. Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4, (14), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics