単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Immunology and Infection

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Summary

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

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Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

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Abstract

Efferocytosis の規制を勉強してアポトーシス細胞の取り込みを正確に定量化する efferocytosis を制御するシグナル伝達と細胞プロセスをプローブすることができる方法が必要です。この数量は、アポトーシス細胞は efferocytosed、断片的、呼び出しと残留 unengulfed 細胞に対するアポトーシス ターゲットの efferocytosed 部分の間正確に記述することができます。 メソッドを実行することは困難することができます。フラグメント。記載方法は、正確にマクロファージなどの efferocytes の efferocytosis と efferocytic の容量のダイナ ミックスを定量化するためのアプローチのデュアル ラベルを利用しています。アポトーシス細胞の細胞質がアポトーシス細胞の表面ビオチン化可能ですが差別化と非内面内面の間すべてのアポトーシス細胞由来物質の監視を有効にするための細胞追跡染料にラベル付けされてアポトーシス細胞画分。Efferocytes の efferocytic 容量は、ライブまたは固定細胞の蛍光画像を撮影し、ストレプトアビジンの汚損によって差別化、内面化されたターゲット対連結の量を定量化によって決定されます。このアプローチは、フローサイトメトリー、すなわち efferocytosed アポトーシス細胞画分、生細胞顕微鏡による efferocytic のダイナミクスを測定する能力と非 efferocytosed の正確な描写などの方法と比べていくつかの利点を提供していますと、蛍光標識した遺伝子を発現する細胞の細胞内シグナル伝達の研究を実行する能力。組み合わせることで、このプロトコルで説明する方法は、正確に efferocytic 活動を定量化し、efferocytosis 中細胞のシグナル伝達経路を調査するために使用することができます柔軟な実験的アプローチのための基礎として機能します。

Introduction

アポトーシスまたはプログラム細胞死は、ほとんどの多細胞生物の発生、発達と恒常性1の重要な非常に調整される生理学的プロセスです。正常細胞の代謝回転と萌芽期の開発に関与している、に加えてアポトーシス組織から感染したり、損傷した細胞の除去を有効にし、感染、炎症、癌とも医療介入による応答で引き起こされることができます。放射線療法やステロイド1。アポトーシス細胞を公開"を食べる-私"専門家と非専門家の食細胞の範囲の受容体によって認識される表面に信号をまとめて"efferocytes"と呼びます。これらの受容体の関与は、efferocytosis2,3として知られているプロセスによって efferocyte によって吸収とアポトーシス細胞の劣化を誘導します。ホスファチジルセリンは最高の特徴を食べる-運転 efferocytosis シグナルします。それは通常アポトーシス細胞表面4ホスファチジルセリンを公開するので、この膜非対称を乱す脂質 scramblase をアクティブにすると、血しょう膜の内部のリーフレットに限定されます。ホスファチジルセリンは、成熟マクロファージなどのいくつかの非アポトーシス細胞の細胞表面にあるし、血小板を活性化します。しかし、これらの細胞は、その細胞表面5,6,7CD47 などの「私を食べていない」の信号の存在のために efferocytosed ではありません。露出ホスファチジルセリンは、efferocytes で表される efferocytic 受容体の配列によって認識されます。ホスファチジルセリンにこれらの受容器のバインディング、直接または、オプソニンの援助は efferosome8,と呼ばれる膜結合液胞にアポトーシス細胞の貪食を促進するシグナル伝達経路をアクティブに9,10,11,12.、efferosome は順番にエンドソームと融合し、貨物13,14細胞のリソソームは、分子機械、efferosome を酸性化して、アポトーシスを低下する必要を提供します。リサイクルのエンドソーム アポトーシス細胞由来材料劣化、一度入稿-アポトーシス細胞由来の抗原に対する免疫応答を制限して、可能性がありますによりアポトーシス細胞13から栄養素の回復プロセス 15。Efferocytosis で故障した場合、アポトーシス細胞の障害クリアランスこれらの未確認の細胞は最終的に二次壊死を受けます。壊死細胞は、感染、炎症、自己免疫疾患16,17の範囲を駆動、細胞外の環境に賛成して炎症性のゾル性細胞質の内容、病原体・自己抗原をリリースします。一緒に、アポトーシスと efferocytosis 死んで、死んだ細胞の除去を容易にするため、組織の恒常性の維持を可能にします。

Efferocytosis の基礎となる分子機構を解明、アポトーシス細胞取り込みの明確な数量を提供するメソッドが必要です。他の吸収とは異なりエンドサイトーシスと貪食18,19、efferocytosis などのメカニズムがない結果は断片的な吸収の結果そのままターゲット細胞の貪食で、この数量は複雑します。efferocyte20によるアポトーシス細胞。記載プロトコルの in vitro efferocytosis 試金を記述、内面の正確な描写を提供する個々 のアポトーシス細胞の非内面部分とさまざまな固定セルと組み合わせることができますと生細胞の顕微鏡に近づきます。伝統的な食作用の試金の抗体を追加手法として内在化している非ターゲットをラベル付けするために実験の終わりに貪食のターゲットに固有の共有リンク ビオチン21アポトーシス ターゲットのラベルによって異なります,22. ビオチン化アプローチに分類されるべき任意のタンパク質含有ターゲットを可能にし免疫染色を行った場合、二次抗体の交差反応性の潜在的な問題を回避アポトーシス細胞特異的抗体は、この試金で使用できますが、.具体的には、我々 は、アポトーシス Jurkat 細胞追跡の染料とビオチンの両方でデュアル染色されているの準備を概説します。追跡色素細胞はアポトーシス細胞由来材料 efferocytosis 中に追跡する表面ビオチン化可能の差別に対し efferocytosed アポトーシス細胞の非内面部分から内面のことができます。文化とマウスと人間の efferocytes として使用、M2 マクロファージの J774.2 と THP 1 細胞の efferocytic ターゲットとして一次電池 efferocytosis および Jurkat 細胞の例として準備について述べる。これらのメソッドは、他の細胞や細胞、脂質コーティングを介してアポトーシスをシミュレートするミクロン サイズの模倣し、標的細胞の細胞死 (アポトーシスなど壊死とネクロトーシス) の任意のフォームを受けているに簡単に適用できるか特定の関心の efferocytic 受容体にリガンドでコーティングします。

このプロトコルで説明したメソッドには、フィールド23,24でよく使用される流れ cytometry による方法に比べていくつかの利点があります。両方の合計と内在化している非アポトーシス細胞材料の明確なラベリングと組み合わせる食細胞アポトーシス細胞の相互作用を直接イメージングによる efferocytosis の定量的な対策が可能です。また、pH に依存しない fluorophores の使用は、いくつかの代替方法25を混同するライソゾームの pH で FITC と GFP の蛍光性の抑制などの交絡因子を制限します。最後に、詳細に記述されていませんが、これらのメソッド使用できる蛍光標識遺伝子を表現する efferocytes を使用してまたはポスト固定免疫染色、シグナリング分子の活動との監視の定量化を可能にするのにはefferocytosis 中細胞プロセスは。

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Protocol

健康なボランティアから血液は健康科学研究倫理委員会のウェスタン オンタリオ大学によって承認されました。人間研究にトライ理事会方針のガイドラインに従って採血を行った。

1. 文化と THP 1 単球細胞株の作製

  1. 37 ° C + 5% CO2T25 フラスコ浮遊培養として文化 THP 1 球。細胞は、ウシ胎児血清 (FBS) ロズウェル パーク記念研究所 1640 (RPMI 1640) + 10 %5 mL で栽培する必要があります。
  2. 優しく、フラスコを振ることによって成長媒体全体に均等に各日の中断細胞は、細胞診断をすぐにカウントします。細胞密度 1 x 106セル/mL に達すると、細胞を継代する必要があります。
    1. あらかじめ暖かい RPMI 1640 + 10% FBS 37 ° C の水浴中。
    2. 5 分間室温で 500 × g で遠心分離によって 1.5 mL 遠心チューブに 15 mL の円錐管 2 x 10 の5セルとペレットのセルを転送します。
    3. 細胞ペレットを乱すことがなく上澄みを除去し、(1.5 mL 容マイクロ チューブ) 1 mL または 5 mL (15 mL コニカル チューブ) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のペレットを再懸濁します。
    4. 5 分間遠心する常温 500 x g でチューブは、細胞ペレットを乱すことがなく、PBS を削除します。
    5. 新鮮な RPMI 1640 + 10 %1 mL にペレットを再懸濁します FBS。
    6. 新しい T25 フラスコ場所これに温めたメディアの 4 mL に 1.2.5 から再懸濁細胞を追加します。細胞継 (通常 3 日) を必要とするまで、または細胞が実験に必要な 37 ° C + 5% CO2インキュベーターで培養します。
  3. THP-1 マクロファージでの実験用フラスコから通過前に皿に必要な細胞数を削除します。
    1. 12 ウェル プレートのウェルに 18 ミリメートル円形ガラス coverslips (#1.5 厚) の必要な数を配置-条件および/または timepoint あたり通常 1 coverslip。それぞれに分注 5 × 104 THP 1 球をよきます。セルの数は、必要に応じて各井戸を変更ことができますを追加しました。
    2. それぞれの総容積をもたらす RPMI + 10 %1 mL によくセル含む FBS 37 ° C に温めて
    3. 各ウェルに 100 nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) を追加し、THP 1 単球のマクロファージ様細胞への分化を誘導するために 3 日間の文化します。

2. 文化と J774.2 マクロファージ細胞株の作製

  1. 37 ° C + 5% CO2T25 フラスコで培養 J774.2 細胞。セルはダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) + 10 %5 mL で育つべきである FBS 文化が 80-90% の confluency に達すれば継代と。通路のセル。
    1. フラスコと 5 mL の PBS で 1 回上昇からすべてのメディアを削除します。
    2. フラスコから PBS を削除し、新鮮な DMEM + 10 %5 mL に置き換える FBS。
    3. 細胞スクレーパーを使用して、メディアのセルを中断するフラスコの底を擦る。積極的に任意のセルの集計を分割するセル数回のピペットします。
    4. セル 1:5 を希釈すると、細胞懸濁液 4 mL をフラスコから取り外して 4 ml の新鮮なメディアの交換します。残りの細胞懸濁液は、破棄、新鮮な T25 フラスコで新しい細胞培養を開始するために使用または実験に使用できます。
  2. J774.2 細胞を用いた efferocytosis の試金のためのセットアップ。
    1. 1 日、実験の開始前に、手順 2.1.1–2.1.3 に従って、新鮮なメディアの 5 mL に J774.2 細胞を中断します。診断を使用してセルをカウントし、5 × 104セル/mL の濃度で細胞に必要な量を準備します。
    2. 12 ウェル プレートのウェルに 18 ミリメートル円形ガラス coverslips (#1.5 厚) の必要な数を配置します。それぞれに 5 × 104セル/mL 細胞懸濁液の分注 1 mL をよきます。
    3. 文化は一晩、coverslip に準拠し、継から回復する細胞を許可します。

3. 主な人間 M2 マクロファージの文化

  1. 必要な M2 マクロファージのすべて 12 ウェル プレートのヘパリンの血中の 10 mL を収集します。
  2. 15 mL 遠心管 5 mL 5 mL に予め温めておいた Lympholyte ポリ細胞分離培地の上に人間の血の層します。処理している場合、複数の管を準備 > 大きいボリュームのチューブを使用してよりもむしろ血の 5 mL。
  3. 媒体の加速と中断することがなく使用して、35 分間 300 × g で遠心分離機します。
  4. プラスチック pipettor と 50 mL の遠心管に転送を使用して上の単核細胞豊富なバンドを慎重に取り外します。3.2 の手順で複数のチューブを作製、バンドが単一の 50 mL チューブにプールできます。チューブのボリュームをもたらす PBS で 50 mL まで。
  5. 8 分間 300 × g で遠心し、上清を削除します。このステップの間に、12 ウェル プレートの各ウェルにオートクレーブ 18 mm 径円形 coverslips (#1.5 厚) を配置します。
  6. 井の数で目的の無血清 RPMI 1640 の 300 μ L で細胞ペレットを再懸濁します例えば、 10 mL の血液が完全 12 ウェル プレートを準備する処理された場合メディアの 3.6 mL の細胞ペレットを中断します。
  7. 各 coverslip を含む 12 ウェル プレートでよくに細胞懸濁液の 300 μ L を追加します。37 ° C + 5% CO2で 1 時間インキュベートします。
  8. 水洗いして coverslip 3 x と任意の非付着性細胞を除去する温めの PBS の 1 mL。
  9. RPMI 1640 + 10 の 1 つの mL を追加 %fbs + 10 ng/mL 組換えヒトの CSF M + 細胞文化抗生物質/抗真菌薬。37 ° C + 5% CO2で 5 日間インキュベートします。
  10. メディアを置き換えて RPMI 1640 + 10 %fbs + 10 ng/mL 組換えひと M CSF + 10 ng/mL 組換えひと IL-4 + 細胞文化抗生物質/抗真菌薬。37 ° C + 5% CO2 m 2 偏波を完了する 2 日間で孵化させなさい。
  11. 偏光マクロファージは今後 3 日以内に使わなければなりません。

4. アポトーシス Jurkat 細胞の調製

  1. RPMI 1640 + 10 %5 ml Jurkat 細胞の培養 37 ° C + 5% CO2で政府短期証券。Jurkats 懸濁液の細胞ライン、3-5 日ごとに予め温めておいた、新鮮なメディアに 1:5 を継によって維持することができます。
  2. アポトーシス細胞を準備するには、高密度 (通過後 4-5 日) に成長する Jurkat 文化を許可します。5 分 500 × g で遠心分離によって 1.5 mL 遠心チューブ、ペレット セルに分注 1.5 mL。
  3. 上澄みを廃棄し、再 1 μ M スタウロスポリンを含む無血清 RPMI 1640 培地 1 mL の細胞ペレットを中断します。
  4. 37 ° C + 5% CO2細胞アポトーシスをレンダリングするために 16 時間孵化させなさい。
  5. 必要な場合は、アネキシン v: の染色によるアポトーシスの誘導を確認します。
    1. 1.5 mL 遠心チューブにスタウロスポリン扱わ Jurkat 細胞培養分注 100 μ。5 分 500 × g で遠心分離によって細胞のペレット、培養上清を破棄および再 RPMI 1640 の無血清培地を 100 μ l 添加の細胞ペレットを中断します。
    2. かに (FITC) の 1 μ L を追加-Annexin V を共役し、暗闇の中で室温で 10 分間インキュベートします。
    3. 900 μ L の PBS を追加し、18 mm 円形ガラス基板 (#1.5 厚) を含む 12 ウェル プレートのよく、単一ボリューム全体を転送します。遠心分離機、coverslip に準拠するために細胞を強制する 1 分 200 x g でプレート アダプター装備でスピンダウンします。また、細胞は、イメージングのための腔症スライドに配置できます。
    4. 蛍光顕微鏡を使用してイメージ。

5. Efferocytic 吸収および固定セル Efferocytosis アッセイとインサイド アウトの染色を使ってのダイナ ミックスを定量化

  1. それぞれのセクション 1-3で説明した M2 や J774.2 THP 1 ヒトのマクロファージを準備します。
  2. 実験開始前に夜準備アポトーシス Jurkat 細胞のセクション 4で説明されているようです。
  3. 実験の前にすぐに診断を用いたアポトーシス細胞をカウントします。アポトーシス細胞の十分な数を 1.5 mL 遠心チューブに移す-私たちは通常、5 x 10 の5細胞/ウェル、ターゲット: efferocyte 比が 10:1 を提供する追加します。
  4. 5 分 500 × g で遠心分離によって Jurkat 細胞のペレットし、500 μ L の PBS に再懸濁します。
  5. 中に遠心分離、新しい 1.5 mL 遠心チューブに DMSO の 10 μ L 分注。N hydroxysuccinimidobiotin (NHS-ビオチン) の最小限の量を DMSO に溶解します。5-10 結晶 (~0.005 mg) で十分です。
  6. チューブを含む DMSO/NHS-ビオチンに懸濁液 500 μ L のアポトーシス細胞/PBS を転送します。細胞のアポトーシス細胞懸濁液に染料を追跡する製造元の推奨濃度を希釈しています。追跡色素 FITC ストレプトアビジン (例えば赤や遠細胞トラッキング色素) とスペクトルと重複しないセルを選択することを確認します。
  7. 暗闇の中で室温で 20 分間懸濁液を孵化させなさい。RPMI 1640 + 10% の等量を追加 FBS と任意の未反応の染料を癒やすため暗闇の中での室温で 5 分間インキュベートします。
  8. 5 分 500 × g で遠心分離によって細胞のペレット、培養上清を破棄および再 RPMI 1640 + 10% の 100 μ L でステンド グラスのアポトーシス細胞を中断 FBS もマクロファージのあたり。
  9. マクロファージの各ウェルに滴下のステンド グラス アポトーシス細胞懸濁液 100 μ L を追加します。大食細胞とアポトーシス細胞間の接触を強制するプレート アダプターを装備、遠心分離機で 1 分 200 x g を遠心します。
  10. プレートを 37 ° C + 5% CO2組織文化のインキュベーターで時の希望期間にインキュベートします。マクロファージ、efferocytosed 材料は通常、最初 20-30 分後に検出可能な 120-180 分後に完成。
  11. 希望の時間にポイントはインキュベーターからセルを削除します。部屋の温度 efferocytosis を停止し efferocytosed 非アポトーシス細胞を削除する PBS の 1 mL で 2 回細胞を洗浄します。
  12. 各ウェルに縮尺希釈で FITC 結合ストレプトアビジンを追加し、暗闇の中で 20 分間インキュベートします。これはすべての非 efferocytosed アポトーシス細胞の材料にさらされるビオチンにラベルを付けます。
    注: 必要な場合、細胞核汚すことができるこの段階のヘキスト 33342 1:20,000 希釈添加によるまたは 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole、塩酸 (DAPI)。
  13. 3 回 1 mL の PBS、優しく揺れやリンスあたり 5 分のサンプルを揺動で血球を洗浄します。室温で 20 分間 4% パラホルムアルデヒド (PFA) と PBS のセルを修正します。一度余分な PFA を削除する PBS のセルをすすいでください。
  14. イメージングと蛍光顕微鏡への転送のためのスライド マウント coverslips。正確な定量化のための細胞の十分な数の z スタックをキャプチャ-通常 10-30 セル 1 つの条件。細胞を色素標識 efferocytosed 素材フォーム個別細胞を色素涙点、ストレプトアビジンの無料を追跡中に FITC ストレプトアビジンが染色に包まれて物質の追跡として結果の画像で明らかであろう非内面アポトーシス細胞材料染色。
  15. さまざまな施策によって得られた画像で efferocytosis を定量化します。
    1. 離散 efferosomes (細胞色素+/streptavidin-点) の数の平均値を決定することによってマクロファージあたり efferocytic インデックスを計算します。アポトーシス細胞にバインドまたは ≥ 1 表示 efferosomes を含むマクロファージのみを定量化します。レコード大食細胞はアポトーシス細胞が 0 の efferocytic インデックスを持つものとして、欠けている離散 efferosomes にバインドされています。
    2. ≥ 1 efferosome を含むマクロファージの割合を測定することによって efferocytic の効率を計算します。
    3. Efferocytosis イメージング細胞固定し、複数時点でステンド グラスのレートを計算します。唯一イメージ マクロファージがアポトーシス細胞にバインドまたは各セルのキャプチャ z スタックの表示 efferosomes を含みます。このイメージを作成すると、一度、efferocytosis の速度を決定します。
      1. ガイドとフィジー/ImageJ26 (またはその他の画像解析ソフトウェア パッケージ)、フリーハンドまたは多角形選択ツールをすべて追跡色素+/streptavidin- (例えば内面) セルの円としてストレプトアビジン染色を使用z スタックの 1 つの平面の原料。この地域に追跡色素細胞の統合された強度を測定します。各 efferosome (例えば直径、セルの枠線または核等の位置)15,27の個別対策簡単に取得できる同時にこれらの測定値を大きく分析中に収集されたデータの増加します。
      2. 同じ z セクション上色素+/streptavidin+ (例えば非内面) を追跡するセルのすべてをサークル ガイドとフリーハンドまたは多角形選択ツールとして染色ストレプトアビジンを使用して z スタックの 1 つの平面の材料.食細胞と接触してアポトーシス細胞から染色のみ含まれます。この地域の統合の強度を測定します。
      3. イメージの z 以降の 4.2.3.1 に 4.2.3.2 の手順を繰り返します。Efferocytosed (Σeff) および非 efferocytosed (Σne) 材料の強度を合計します。Efferocytosed をされているアポトーシス細胞の割合は、としてセルに計算することができます。
        Equation
      4. すべての時点ですべてのセルの割合 efferocytosed を定量化します。個々 のアポトーシス細胞が色素を追跡するセルの吸収の違いと露光時間などイメージ集録パラメーターの変化による画像間アポトーシス細胞/efferosomes の蛍光強度が変化する場合に注意してください。など、唯一比較正規化分数 Efferocytosed などの値または efferocytic インデックスなど efferocytic 効率、画像間、実験条件間および強度に依存しない値が実験を繰り返します。
    4. 結果のデータセットは、セル間の efferocytosis の変化を正確に反映するには、各実験でのセルの最大数のこれらの分析を行います。
      注: Efferocytic の効率性と efferocytic のインデックスは、急速に (いくつか秒/セル) 計算できます、通常めざします実験あたり少なくとも 100 セルを分析する実験ごとに少なくとも 3 回の繰り返し。Efferocytosed の割合を計算する材料、および efferosome 固有の対策より面倒ですが、通常 2-3 分を取っている/経験豊富なアナリストのセルします。これらの計算の 1 つの実験につき条件 15 セルの最小値を定量化します。
    5. レコードの efferocytic 指数、分数 efferocytosed ・ セル単位上の個々 の efferosome データ。
      注: これにより、インターセルのばらつきを定量化することができます、単一セルのアプローチを使用してデータ分析のため。人口レベル分析をまだこれらのデータセットの個々 の実験で取得した単一セルのデータを平均することによって実行できます。アンサンブル (例えばそれらを含んでいるセルの独立した efferosomes の人口として)、単一細胞レベルで、人口レベルで Efferosome 固有の測定を分析することができます15

6. ライブ アポトーシス細胞を用いた細胞 Efferocytosis の試金

  1. それぞれ 1-3 の手順で説明するように、THP 1、J774.2 または M2 マクロファージを準備します。細胞を遺伝子と transfected 必要があります必要な場合、または他の遺伝の実験を実行する前に、少なくとも 18 h を構築します。
  2. 実験の開始前日の夕方は、アポトーシス Jurkat 細胞のセクション 4 および 5 以下の変更で説明するようを準備します。
    1. 細胞を希釈し 4.1-4.3 に従ってアポトーシスを誘導して 5.3-5.4 に従ってアポトーシス細胞の必要な数を収集します。
    2. アポトーシス細胞懸濁液に製造元の推奨濃度で染料を追跡セルを追加します。暗闇の中で室温で 20 分間懸濁液を孵化させなさい。RPMI 1640 + 10% の等量を追加 FBS と任意の未反応の染料を癒やすため暗闇の中での室温で 5 分間インキュベートします。これらの実験は、NHS ビオチンを追加しないでください。
    3. 5 分 500 × g で遠心分離によって細胞のペレット、培養上清を破棄および再 RPMI 1640 + 10% の 100 μ L でステンド グラスのアポトーシス細胞を中断 FBS もマクロファージのあたり。
  3. アポトーシス細胞または任意に各ウェルから文化メディアを削除してから追加 500 μ L の PBS メーカーを含むマクロファージが追跡追跡色素細胞とスペクトル重複しない色素細胞の希釈を推奨ラベルが追加され、必要な場合蛍光遺伝子の大食細胞によって表現されます。暗闇の中室温で 20 分間インキュベートし、DMEM + 10% の等量を追加 FBS と任意の未反応の染料を癒やすため暗闇の中での室温で 5 分間インキュベートします。
  4. マクロファージを含む coverslip をライデンの商工会議所に転送します。追加 400 μ L DMEM + 10% の FBS、続いてラベル アポトーシス細胞懸濁液を 100 μ l 添加します。ミックスを軽くピペッティング メディア 2-3 回。
  5. ライデン チャンバーを温水と CO2に転送-生細胞蛍光顕微鏡の灌流チャンバー。
    注: CO2血流機能を欠いている組織を使用して、顕微鏡のセットアップのため培バッファー 1 mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) 中の生理的な pH を維持するために重炭酸ナトリウムではなく、文化は、空気にさらされます。
  6. 白色光 (位相コントラストまたは DIC) イメージとすべての蛍光ラベルのイメージを含むコマ撮りシリーズをキャプチャします。
    1. 実験場所は良い細部を解決する必要な (食細胞アポトーシス細胞の相互作用例えば膜ダイナミクス) 100 X 対物レンズを使用します。一方より一般的な措置 (アポトーシス細胞取り込み、マクロファージとアポトーシス細胞間の相互作用時間のレート) 60 X または X の 63 の目的を使用して最もよく描出されます。
    2. 可能な場合、単一の実験でキャプチャされた efferocytic イベントの数が増えて、1 回の取込み時に複数のフィールドの表示を画像にポイント訪問を使用します。
    3. Efferocytes が多くの場合そのままなセルではなく、アポトーシス細胞の小片を巻き込むので、z スタックをキャプチャすることをお勧めします。光毒性を最小限に抑えるため、キャプチャする顕微鏡対物の焦点深度で区切られた z セクション (通常 0.5-1.0 μ m)、細胞 (マクロファージ、例えば8-20 スライス/セルの通常 8-10 μ) 貫通。これは、すべての貪食・人身売買イベントが少なくとも 1 つが z 面で表示されることを保証します。また、大規模な使用 (1-5 μ m 径) アポトーシス細胞模倣または efferocytosis 中に最小限の断片を受ける細胞のアポトーシス (例えば熱ショックを受けた好中球) 代わりにせず z 積み重ね。模倣やアポトーシス好中球の準備について以前28
    4. 退色を最小限に取得の設定を使用してイメージ退色を最小限に抑えるため、明るい蛍光物質とキャプチャを使用する-例えば強度の低い励起高カメラのゲインと短い露光時間29。高感度電磁電荷結合素子 (EM CCD) カメラまたは回転のディスク共焦点、および高速圧電メカニカル ステージである、画像のこの形を搭載した顕微鏡の使用を強くお勧めします。
  7. これらの時間経過のビデオに適用することができます可能な解析のメソッドの数が豊富なとここを確認する我々 の能力を超えて。いくつかの例としてには、手動または自動トラッキング ソフトウェアを使用して融合・分裂・細胞15内の efferosomes の動きを追跡、endolysosomes と efferosome 融合ダイナミクスを表現するマクロファージの共局在解析による定量化コンパートメント固有蛍光 transgenes13、プロービングとカップ形成30など吸収プロセスの監視確認信号と efferosome13に蛋白質を人身売買の募集のダイナミクスおよび/またはph や酸化に敏感なプロテアーゼ活性化 fluorophores31ラベルの付いたアポトーシス細胞を用いた efferosomes の分解活動を定量化します。

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Representative Results

Jurkat 細胞のアポトーシスに 1 μ M スタウロスポリン結果の文化を一晩 > アネキシン V (図 1) を染色で確認することができます細胞の 95%。スタウロスポリンの濃度とスタウロスポリン処置の持続期間は各セル行の最適化が必要であるが、これらの実験のため他の細胞型を使用できます。信頼性の高い検知及び efferocytosis、定量化の > 細胞の 80% は、efferocytes にそれらを追加する前にアポトーシスをする必要があります。他誘導アポトーシス (例えば熱ショック、エトポシド、紫外線光) も使用できます、しかし、私たちの経験ではこれらはより異種誘導アポトーシスとアポトーシス、二次壊死を含む混合細胞数の結果を生成し、非アポトーシス ターゲット セルです。

インサイド アウト染色固定細胞イメージングのために密接にタンブレロ efferocyte アポトーシス細胞の相互作用は、明確に線引きの非 efferocytosed (ストレプトアビジン+/cell 追跡色素+) で、すべての時間ポイントで観測されるべきとefferocytosed (-ストレプトアビジン/cell 追跡+) 材料表示されます (図 2)。Efferocyte とアポトーシス細胞と形成するシナプスは、ストレプトアビジンを除外するタイトな十分な多くの場合、オブジェクトの円周上の任意の時点でストレプトアビジンを軸受を染色色素を追跡する任意のセルの考えに注意することが重要だ、バインドされたセルは、efferosome ではないです。ほとんどの実験で efferocytosed は、アポトーシス細胞の割合が増加時間依存型ファッション内面非アポトーシス細胞材料がなくなるまで、または食細胞に達すると、最大 efferocytic 容量 (図3). 個々 の実験と従来の分析実験の複数の繰り返しから平均値内のセル全体のデータの平均、しかし、分析は通常実行し個々 の細胞 (図 3 a) の記録統計的アプローチ (図 3 b)。含まれる追加の汚損のため一次電池型、代替 efferocytic ターゲットの使用許可はこの標準化されたプロトコルの変更が可能です。たとえば、図 4に示します efferocytosed アポトーシス細胞模倣で構成されています 3 μ m 径シリカビーズ ホスファチジルセリンの混合物でコーティングとホスファチジルコリン28、続いては、プライマリ M2 偏光人間マクロファージその後固定、透過、リサイクル エンドソーム マーカー Rab17 の免疫染色。

生細胞中に efferocytic プロの食をイメージング観測される拡張およびプロセスに小さなプロセスを撤回する「プローブ」30と呼ばれる (図 5、t = 0);これらのプロセスが発生するターゲット彼らはしっかりとターゲットに付着し、食細胞にそれを描画します。この調査活動は、上皮細胞などの非専門家食が観測されないことが。Efferocyte、タイトな形成自体とアポトーシス細胞は、多くの場合アポトーシス細胞の大部分を包み込むこのシナプスをもつ「efferocytic シナプス」32 (図 5、t = 10)。Efferocyte の細胞質 (図 510-30 分) にこのシナプスからアポトーシス細胞の部分を描画します。その形成後すぐにシナプスからと周囲核エリア、Rab7/RILP/ダイニン-ダイナクチンを介したトランスポート33の結果へのこれらの初期の efferosomes が人身売買します。Efferosomes 時間の経過とともに縮小し、可能性があるセル全体に再配布結果劣化材料吸収または13,15をリサイクルします。これらのプロセスを検出する機能、フレーム レートと実験の期間に大きく依存。プロービングなど急速なプロセス観測されないことがフレーム レートが低い、遅いイベント (efferosome が人身売買と吸収) 長時間イメージングを必要としながら、両方のケースでこれらの大きいイメージの買収は、しばしば低輝度画像のキャプチャを必要と退色、光毒性 (図 5) を制限します。固定セルの試金と同様、研究者のニーズに合わせてこのアッセイの生きているセルのバージョンを変更できます。J774.2 マクロファージを蛍光膜 (午後 GFP) をデンマークし、シグナル伝達脂質 PI (3) P (FYVE RFP) を選択的に結合する遺伝子を表現する生きているセル買収の単一のフレームを図 6に示します。Efferosome 膜における PI (3) P の生成は、FYVE RFP の午後 GFP+ efferosome 膜との共局在として検出できます。PI (3) P、efferosome のシグナル伝達のダイナミクス、efferosome に FYVE RFP の強さを定量化することで示すことができる (図 6)。

Figure 1
図 1: アネキシン V アポトーシス ・非アポトーシス Jurkat 細胞染色します。アネキシン V、ホスファチジルセリンをラベル"を食べる-私"アポトーシスによって公開される信号。(Top)未処理の (UT) Jurkat 細胞健康 (滑らかで丸みを帯びた) 形態 (DIC) を表示およびアネキシン (下) (動) Jurkat 細胞 1 μ M スタウロスポリン (STS) と一晩 (不規則と blebbed)、アポトーシスの形態を取るし、で染色では染色されません。Annexin v. スケール バー = 10 μ m、画像の輝度、カラー マップとして表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: J774.2 マクロファージによる細胞のアポトーシス Jurkat の初期と後期の貪食します。画像は、初期 (60 分) と efferocytosis (120 分) 後期でマクロファージです。白色光 (DIC) イメージは、マクロファージ (動脈) とアポトーシス細胞 (AC) のタイトなインターフェイスを示しています。細胞を色素 (CTD、赤) を追跡では、アポトーシス細胞由来材料のすべての場所を明らかにします。FITC ストレプトアビジン染色 (Str、緑)、マクロファージにまだ包まれていないアポトーシス細胞の部分を識別します。大食細胞核が DAPI (青) と事前にステンド グラス。Efferosomes (赤) (緑/黄) アポトーシス細胞の非内面部分対は Streptavidin および細胞色素画像のオーバーレイで容易に識別されます。しっかりと形成 efferocytic シナプス (*) からストレプトアビジンの除外によって作成された初期の timepoint でマクロファージのアポトーシス細胞界面染色ストレプトアビジンの不在に注意してください。大食細胞の核は、ヘキスト染色 (青) によって識別されます。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: J774.2 マクロファージによるアポトーシス細胞 Efferocytosed の分画の経時的.Efferocytosis アッセイを行ったため指定された時刻、およびアポトーシス細胞を色素/Streptavadin 染色を追跡を使用して各時点で決定物質の細胞の割合。(A) 個々 のマクロファージ内 efferocytosed 材料の割合、個々 のセルからデータの表示、水平のバーは、平均を示します。12-17 セル 1 つの条件、1 を 5 の独立実験からのデータです。5 独立した実験では, 少なくとも 10 のセル/条件/リピート全体 efferocytosed 材料の (B) の割合の平均です。p < 30 分、ダン補正クラスカル-ウォリス検定に比べて 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: プライマリ ヒトマクロファージで Efferosomes に Rab17 募集分析します。M2 偏光マクロファージはアポトーシス細胞模倣 (矢印) を巻き込んだし、貪食を次 60 分 Rab17 (緑) の immunostained であった。スケール バー = 5 μ m の細胞核はヘキスト染色、DIC イメージ細胞の形態を示し、アポトーシス細胞模倣を識別するために使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 生きているセル efferocytosis アッセイ。細胞の色素 labeledJ774.2 マクロファージ (動脈、緑) をトラッキング追跡色素 (AC、赤い) 別の色セルの付いたアポトーシス Jurkat 細胞が包まれている記録されました。アポトーシス細胞は内面化過程で断片的な吸収および複数 efferosomes (矢印) の形成に終って複数のフラグメントに分割されます。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: Efferocytic 信号を調査する蛍光遺伝子を使用しています。J774.2 マクロファージは細胞膜の GFP タグ マーカー (緑日) をトランスフェクトした、FYVE RFP 作成シグナル伝達脂質を結合する PI (3) P (赤)。Efferocytosis は、FYVE RFP 募集 (矢印) によって検出された PI (3) P, を含む初期膜由来の efferosome を形作る。Efferosome 閉鎖時点で現在 FYVE RFP 信号を基準にして強さを折ると PI (3) P シグナリングのダイナミクスの定量化を行った (t = 0、グラフ)。この実験は、アポトーシスではなくのアポトーシス細胞模倣ビーズ (矢印、DIC) を使用します。スケール バー = 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

このプロトコルで説明する方法では、イメージング、固定細胞と生細胞の両方の方法を使用して、動的な efferocytic プロセスの定量化を有効にします。これらのアプローチは、一般的に使用される流れ cytometry 法23,24上のいくつかの利点を提供しています。インサイド アウト染色固定サンプルの使用率のより堅牢で正確な定量化と efferocytosis の範囲を提供しています-確かに、多く流れの cytometry ベースのメソッドは単にアポトーシス細胞とマクロファージ、異なった fluorophores が付いているラベル、内面化されたアポトーシス物質細胞とマクロファージのアポトーシス細胞のマーカーは、こうして区別する能力が欠けて染色の一部としてスコア efferocytosis がバインドされています。PHrodo アポトーシス細胞24のラベルを使用して代替フロー フローサイトメトリーのアプローチがあります。pHrodo は、酸性 pH で明るさが増加する pH に敏感な蛍光体です。結果この fluorophore は非-内面内面化された材料と特に次のアポトーシス細胞の内部化と酸性化、efferosome の蛍光が増加するとの間でよりよい解決を提供することができます。efferosome 酸性化34,35, を損なう病気プロセスによって混乱し、このメソッドは、efferocytosis36, の酸性化貧しい地域である (前の酸性化) 初期の efferosomes を欠場すること27細胞または細胞のリソソーム37を弱酸性化します。このプロトコルで説明されているメソッドの 2 番目の利点は、生細胞イメージング プローブ、efferocytic シナプスの形成などのプロセスとして、efferocytosis のダイナミクスを測定するための使用とすることはできません efferosomes の細胞内輸送流れの cytometry ベースのアプローチを使用して検出。

このメソッドでは、多くの利点を提供しています、一方実験細胞の多くの何百もの数量を必要とする-珍しいイベントを検出または高い変数プロセスの定量化実験などできないことが、これらの大規模なデータセットの解析時間の法外な金額を取っています。高スループット フロー イメージングなどのアプローチをイメージング フローサイトメトリー38できる従来の顕微鏡よりも高いスループットを実現私たちの経験現在自動化された画像の解析プログラムはありませんが常に正確に分割できます。内面素材と内面は化。具体的には、バインドされたアポトーシス細胞がしばしば部分的で包まれている色素チャネルを追跡携帯の固体固まりとして表示されますよう、アポトーシス細胞と efferocyte の間を形成するタイトな efferocytic シナプスは、ストレプトアビジンの染色を除外できます。ストレプトアビジン染色 (図 2)。したがって、efferosomes が容易に識別されたアルゴリズムによって、一方アポトーシス細胞の連結部分は誤認しやすい会計部分ストレプトアビジンの汚損のための難しさのため efferosome として。我々 は正確に識別でき、人間の力添えなしアポトーシス細胞の断片的な摂取量を定量化することができますプログラムを見つけるには至っていない、我々 は発見したその仕込むことができる半自動システム39分析を加速することが大きく割合を削減2-3 分から efferocytosed 測定 < 60 秒・ セル。また、非消化性アポトーシス細胞を模倣し、アポトーシス、時に最小フラグメント セルタイプを代わりに使用することができます。これは単一より大きい構造に自動化されたアプローチに従う義務があるかもしれないし、z 積み重ねの必要性を排除する可能性があります検出を簡素化します。これらの進歩といってもこのメソッドの取得と解析速度の制限、ままし、フローサイトメトリー大細胞数の解析が必要な23の最も現実的な方法のままなど。

ターゲットとして Jurkat 細胞 (T 細胞線) を efferocytes とアポトーシスと細胞ラインと主要なヒトのマクロファージを使用してこのメソッドを説明しましたが、このメソッドは、efferocytic 細胞型またはアポトーシス細胞ターゲットに適用できます。確かに、同様のアプローチは、肝細胞と上皮細胞9,40,41, efferocytosis と efferocytosis 腫瘍細胞42など臨床的に関連性の高いターゲットの調査に使用されています。免疫のない efferocytes を使用する場合、または特定の efferocytic イベントをモデル化するときにこのプロトコルを変更する必要があります。たとえば、Jurkat 細胞は非付着性、したがってはおそらく完全に機械的な力を要約し、空間の制限 efferocytes 付着性アポトーシス細胞または固体組織内アポトーシス細胞と対話するときに発生します。多くの細胞のタイプはアポトーシス中に接着を維持、したがって、付着性のターゲットとして使用できます。一例として HeLa 細胞は再現性をもって細胞体43の接着力を維持しながら 4-6 時間の期間にわたってスタウロスポリン誘発アポトーシス、ホスファチジルセリンがスクランブル、ブレブを受けます。細胞コラーゲン マトリックスまたは幹細胞オルガノイド44懸は、私たち、これらのアプローチを使用している任意の研究を認識が固体ティッシュで efferocytosis を研究するための潜在的なモデルにあります。いくつかのモデル Jurkat 細胞など免疫細胞およびこれらの細胞は、サイトカイン ベースを解放できると、好中球をアポトーシス ターゲットとして使用しないでください」を見つける-私「炎症や渡り鳥がモデルに交絡因子となる CX3CL1 などの信号プロセスは、調査45です。したがって、このアッセイの汎用性細胞タイプおよびモデル システムの範囲を渡る efferocytosis を探索するために使用するために可能ですが、注意が必要適切な efferocytes、標的細胞生理学の最もよいモデルに培養条件を選択するには調査の下で処理します。

このプロトコルで説明する分析方法は、広範な分析を有効にするこれらの実験のイメージングに基づく自然との開始点としてのみものです。Efferosome 位置決め・直径測定の分数 efferocytosed 測定を実行するときに収集方法や生細胞内測定などの経過などの細胞内輸送のプロセスを調査するためにefferosomes とアポトーシス率低下13,15 をセルします。免疫染色 (図 4) を使用してこのようなバインド効果と貪食30の料金住セルイメージ投射の形態学的分析と組み合わせるプロセスを定量化するために使用できます。 が efferosomes、タンパク質の募集を調査することができます。,46. efferocytosis (図 6) の中に信号分子の活性化または携帯電話イベントの活動報告蛍光遺伝子を表現するマクロファージのこれらのアッセイを行い頻繁。これらのレポーター efferocytosis; 中にプロセスを信号の監視を有効にします。たとえば、efferosome 処理とアポトーシス細胞由来抗原13,15の後続の人身売買を媒介に Rab5、Rab7 と Rab17 の役割を探検する Rab Gtpase の蛍光タグを使いました。Efferosomes31 の劣化を仲介するプロセスを調査する細胞死、efferosome pH、活性酸素種の生産、および生きているセル実験に他の細胞プロセスの記者団の定款を使用ことができます同様に、 ,47。これらの実験で共通の課題です。 互換性のある fluorophores が付いている遺伝子や記者を識別します。多くの場合、染料および/または他の同時イメージングのためのチャネルを解放するストレプトアビジンをトラッキング細胞を排除します。いくつかの実験のため非断片化の模倣とアポトーシス細胞を置き換えるに有益です。シグナル伝達のダイナミクスと単一アポトーシス細胞から派生した複数の efferosomes 追跡の複雑さを伴わない細胞プロセスの定量化が可能になります。・ エヴァンスを参照してください28を模倣する細胞アポトーシスの準備について。

これらの実験を設計するときの最も一般的な難易度は、退色、光毒性の29を最小限に抑えながら、イメージを作成する目的のプロセスでは、蛍光物質の組み合わせを見つけることです。Fluorophore の選択は、主 dichroics/キューブ/レーザー励起フィルターによって決まります、排ガス浄化装置、顕微鏡のしたがって fluorophores の選択しばしば個々 の顕微鏡に固有です。一般に、長い波長の蛍光物質 (遠、例えば排出マキシマにオレンジ > 580 nm) にくく退色するが、これらの波長は細胞への悪影響が少ない。緑フルオロ (発光極大 ~ 525 nm) を使用できますが、注意が必要、細胞への毒性を制限するべきであります。480 未満の波長で励起フルオロ nm (バイオレット ・ ブルー) はその高い毒性と漂白剤を他のフルオロ29これらの励起波長のための傾向のため避ける必要があります。可能であれば、高輝度で安定した蛍光物質を選択してください。画像集録パラメーターを調整して、退色と光毒性を最小限にする同様に、-高い励起強度48より低い励起強度で長い露光などが優先されます。いくつかのメディア コンポーネントのルチンなど抗酸化物質の追加と削除は、両方の光安定性を向上させるし、光毒性49を削減できます。フルオロおよび撮影条件の慎重な選択も、退色を頻繁に制限する必要低信号対雑音比 (例については図 5を参照) の画像のキャプチャが必要です。蛍光強度の定量化、偉大な注意が必要; 工芸品画像処理を制限するべきであります。理想的には、処理の任意の形式なしの raw 画像を分析する必要があります。定量化の前に画像を deconvolving、蛍光強度を保持・ デコンボリューション アルゴリズムは使用される50,51をある必要があります。

セル買収が特に困難になる、励起強度、露光時間、フレーム レート、および実験期間の間、慎重にバランスを必要とする実験に成功とのライブします。励起強度と露出時間を調整してより長い露光時間が細胞運動による動きの工芸品は、または買収のフレーム レートを制限、注意点が、上記のように毒性を最小限に抑えるください。フレーム レートは、実験の要件によって異なります。低いフレーム レート (フレーム間の 5-30 分) 時間 (12 時間以上) の長期間にわたってイメージングを可能にするが、生体膜ダイナミクスと efferosomes の人身売買の記事 efferocytosis などの現象に最小限のデータを提供します。高フレーム レート (1 秒あたり 1 フレームほど高速) efferocytic イベントや efferosome が人身売買の優れた時間分解能を提供-fluorophores が付いて、励起強度と露光時間の慎重な選択と、退色または光毒性通常これらの実験期間で 1 時間以内に制限されます。我々 の経験で 1-2 分毎に画像取得 2-6 時間の実験期間にわたって、妥協点は合理的な時間分解能 efferocytic イベントの十分な数の定量化が可能なイメージを提供します。

変更と失敗した efferocytosis はがん、動脈硬化、複数の自己免疫疾患の病態に関与すると知られている、efferocytosis を対象とした治療法を示す偉大な臨床約束7,52, 53,,5455。これらのフィールドの発展細胞プロセス、受容体と efferocytosis を調節するシグナル伝達経路の同定と解析が必要になります。このプロトコルで説明アッセイは、これらの研究のための強力なツールを表し、多くの efferocytosis を調節する細胞およびシグナリング プロセスを定量化する変更することができます。

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Disclosures

著者は利益相反を宣言しません。

Acknowledgements

この研究は、健康研究 (機構) 営業許可モップ-123419、自然科学と工学研究会のカナダ発見グラント 418194 とオンタリオ州省の研究、BH に初期研究賞のカナダの協会によって賄われていた。DGW はいくつかの画像を提示、プロトコルの最適化と; 原稿の執筆に貢献してください。彼はリヴァプールの大学からエコカー補助金で賄われていた。CY はヴァニエ大学院奨学金とされて MD/思い立ったによって資金を供給します。資金提供機関は、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備で役割をなかった。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

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