Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Efferocytosis, la suppression phagocytaire des cellules apoptotiques, est nécessaire pour maintenir l’homéostasie et est facilitée par les récepteurs et les voies de signalisation qui permettent la reconnaissance, d’une durée et l’internalisation des cellules apoptotiques. Ici, nous présentons un protocole de microscopie de fluorescence pour la quantification de l’efferocytosis et l’activité des voies de signalisation d’efferocytic.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Étudier la régulation de l’efferocytosis exige que les méthodes qui sont en mesure de quantifier avec précision la captation des cellules apoptotiques, d’étudier les processus cellulaires et signalisation contrôlant efferocytosis. Cette quantification peut être difficile à réaliser car les cellules apoptotiques sont souvent efferocytosed fragmentaire, d'où nécessité de méthodes qui peuvent délimiter avec précision entre la partie efferocytosed d’une cible apoptose versus résiduelle cellulaire unengulfed fragments. L’approche décrite ci-après utilise double-marquage des approches afin de quantifier avec précision la dynamique de capacité efferocytosis et efferocytic des efferocytes tels que les macrophages. Le cytosol de la cellule apoptotique est marqué par un agent de la cellule de suivi pour permettre un suivi de toutes les matières de culture cellulaire apoptotique, tandis que biotinylation surface de la cellule apoptotique permet la différenciation entre intériorisée et non-internalisés fractions de cellules apoptotiques. La capacité d’efferocytic d’efferocytes est déterminée en prenant des images fluorescentes des cellules vivantes ou fixes et quantifier la quantité de lié par rapport aux cibles intériorisées, comme dissociés par coloration de streptavidine. Cette approche offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes telles que de la cytométrie en flux, à savoir la délimitation exacte des non-efferocytosed versus efferocytosed fractions de cellules apoptotiques, la capacité de mesurer la dynamique efferocytic par microscopie des cellules vivantes et le capacité d’effectuer des études de signalisation cellulaire dans les cellules exprimant des transgènes fluorescent marqué. Les méthodes décrites dans le présent protocole combiné, servent de base pour une approche expérimentale flexible qui peut être utilisée pour quantifier avec précision l’activité efferocytic et interroger les voies de signalisation cellulaires actives au cours de l’efferocytosis.

Introduction

L’apoptose ou mort cellulaire programmée, est un processus physiologique fortement réglementé qui se produit dans la plupart des organismes pluricellulaires et est essentiel pour leur développement et l’homéostasie du1. En plus d’être impliqué dans le renouvellement cellulaire normale et le développement embryonnaire, l’apoptose permet l’élimination des cellules infectées ou endommagées, des tissus et peut être déclenchée en réponse à l’infection, inflammation, cancer et aussi par des interventions médicales comme la radiothérapie ou stéroïdes1. Exposent les cellules apoptotiques « manger-moi » sur leur surface des cellules, des signaux qui sont reconnues par les récepteurs sur un éventail de phagocytes professionnels et non professionnels, appelés « efferocytes ». L’engagement de ces récepteurs induit la captation et la dégradation de la cellule apoptotique de l’efferocyte par un processus appelé efferocytosis2,3. Phosphatidylsérine est le meilleur caractérisés manger-me signal conduite efferocytosis. Il se limite normalement au feuillet interne de la membrane plasmique, avec l’apoptose activant un scramblase de lipides qui perturbe cette asymétrie de la membrane, exposant ainsi la phosphatidylsérine à la surface cellulaire4. Phosphatidylsérine se trouve sur la surface extracellulaire de certaines cellules non-apoptotique, tels que les macrophages matures et activation des plaquettes. Cependant, ces cellules ne sont pas efferocytosed en raison de la présence de « ne me mangez pas » signaux comme CD47, sur leur cellule surface5,6,7. Phosphatidylsérine exposée est reconnu par un tableau d’efferocytic récepteurs exprimés par efferocytes. La liaison de ces récepteurs de phosphatidylsérine, soit directement, soit par le biais de l’aide des opsonines, active des voies de signalisation qui favorisent l’enlisement de la cellule apoptotique dans une vacuole de membrane-bondissent, nommée l’efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. l’efferosome fusibles séquentiellement avec les endosomes et les lysosomes, qui fournissent les mécanismes moléculaires nécessaires pour acidifier l’efferosome et de dégrader l’apoptose cellulaire fret13,14. Une fois dégradée, les matériaux de culture cellulaire apoptotique sont victimes de la traite à l’endosome recyclage — un processus qui limite la réponse immunitaire aux antigènes de culture cellulaire apoptotique, et qui peut permettre la récupération des éléments nutritifs de l’apoptose cellulaire13, 15. Un échec en efferocytosis résultats de la clairance réduite de cellules apoptotiques ; ces cellules désamorcées subissent finalement une nécrose secondaire. Les cellules nécrotiques libèrent pro-inflammatoires contenu cytosolique, des pathogènes et des antigènes dans le milieu extracellulaire, conduisant ainsi une gamme de maladies infectieuses, inflammatoires et autoimmunes16,17. Ensemble, l’apoptose et efferocytosis facilitent l’élimination des cellules mourantes et morts et permettent le maintien de l’homéostasie tissulaire.

Étudie les mécanismes moléculaires sous-jacents efferocytosis nécessite des méthodes qui fournissent une quantification claire de l’apport des cellules apoptotic. Cette quantification est compliquée par le fait que contrairement aux autre absorption des mécanismes tels que l’endocytose et phagocytose18,19, efferocytosis ne peuvent conduire à l’enlisement de la cellule cible intactes, ce qui entraîne l’absorption au coup par coup de la cellule apoptotique de la efferocyte20. Le protocole décrit ci-après décrit une analyse d’efferocytosis in vitro qui prévoit la délimitation précise de l’intériorisée par rapport à des portions non intériorisé de cellules apoptotiques individuels et peut être combiné avec une variété de cellules fixes et approches de la microscopie des cellules vivantes. Dosages traditionnels phagocytose ajouter des anticorps spécifiques à la cible phagocytaire à la fin de l’expérience afin d’étiqueter les cibles non-internalisés, alors que notre méthode se distingue par l’étiquetage la cible apoptotique avec biotine covalente21 , 22. alors que les anticorps spécifiques des cellules apoptotic peuvent être utilisés dans cet essai, l’approche biotinylation permet n’importe quelle cible portant des protéines doivent être étiquetées et évite les problèmes potentiels avec réaction croisée des anticorps secondaires si immunostaining est effectuée . Plus précisément, nous exposons la préparation de cellules Jurkat apoptotiques qui ont été à double marquage avec un colorant de repérage des cellules et la biotine. La cellule colorant de repérage permet pour les matériaux de culture cellulaire apoptotique devant être suivi lors du efferocytosis, tandis que la surface biotinylation permettant la discrimination des intériorisé à des parties non intériorisé d’efferocytosed les cellules apoptotiques. Nous décrivons également la culture et la préparation des lignées de cellules J774.2 et THP-1 pour utilisation comme efferocytes murins et humains, les macrophages dérivés de monocytes de M2 à titre d’exemple de cellules primaires efferocytosis et cellules Jurkat pour utilisation en tant que cibles efferocytic. Ces méthodes peuvent facilement être appliquées à d’autres lignées cellulaires ou de cellules primaires, pour cibler les cellules subissant toute forme de mort cellulaire (apoptosepar exemple , une nécrose et necroptosis) et imite taille micron qui simulent les cellules apoptotiques par les revêtements de lipides ou revêtement avec des ligands spécifiques à un récepteur d’efferocytic d’intérêt.

La méthode décrite dans le présent protocole présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes écoulement cytometry basé couramment utilisés dans le champ23,24. Par imagerie directement l’interaction cellule phagocyte-apoptotiques, combinée à un étiquetage clair des deux matériau à cellules apoptotic total et non intériorisé, mesures quantitatives des efferocytosis sont possibles. En outre, l’utilisation de fluorophores insensible à pH limite des facteurs confondants tels que la suppression de la fluorescence FITC et GFP à pH lysosomal qui confond certaines méthodes alternatives25. Enfin, ne pas décrite en détail, ces méthodes peuvent être employées à l’aide d’efferocytes exprimant des transgènes fluorescent marqué, ou avec l’immunomarquage après fixation, afin de permettre à la quantification de l’activité de la molécule de signalisation et de surveillance de la processus cellulaires au cours de l’efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Collecte de sang des volontaires sains a été approuvé par la Health Sciences Research Ethics Board de l’Université de Western Ontario. Ponction veineuse a été effectuée conformément aux directives de l’énoncé de politique des trois conseils sur la recherche humaine.

1. culture et préparation de la lignée Monocyte THP-1

  1. Monocytes THP-1 de la culture comme une culture en suspension dans des flacons de T25 à 37 ° C + 5 % de CO2. Les cellules doivent être cultivées dans 5 mL de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10 % de sérum fœtal (SVF).
  2. Chaque jour suspend des cellules uniformément partout dans les milieux de culture en le secouant doucement le flacon, puis compter immédiatement les cellules avec un hémocytomètre. Les cellules doivent être repiquées lorsque la densité cellulaire atteint 1 x 106 cellules/mL :
    1. Préchauffer le RPMI 1640 + 10 % FBS dans un bain-marie à 37 ° C.
    2. Transfert de 2 x 105 cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL ou un tube conique de 15 mL et les pellets par centrifugation à 500 g à température ambiante pendant 5 min.
    3. Retirez le surnageant sans déranger le culot et Resuspendre le culot dans 1 mL (tube de microtubes de 1,5 mL) ou 5 mL (tube conique de 15 mL) de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    4. Centrifuger le tube à 500 g à la température ambiante pendant 5 min. Retirez le PBS sans déranger le culot cellulaire.
    5. Remettre culot dans 1 mL de fresh RPMI 1640 + 10 % FBS.
    6. Dans un nouveau lieu de fiole T25 4 mL de médias réchauffé et pour cela ajouter les cellules resuspendues de 1.2.5. La culture dans un incubateur à 37 ° C + 5 % CO2 jusqu'à ce que les cellules nécessitent le passage (en général 3 jours), ou jusqu'à ce que les cellules sont nécessaires pour une expérience.
  3. Pour une expérience avec le THP-1-dérivés de monocytes, retirer le nombre nécessaire des cellules de la fiole et la plaque avant le passage :
    1. Placer le nombre requis de lamelles de verre circulaire de 18 mm (épaisseur 1.5) dans les puits d’une plaque de 12 puits — généralement 1 lamelle par condition et/ou validant. Dans chaque bien aliquote monocytes4 THP-1 de 5 x 10. Le nombre de cellules a ajouté à chaque puits peut être modifiée, si nécessaire.
    2. Faire apparaître le volume total de chaque cellule contenant bien à 1 mL à l’aide de RPMI + 10 % FBS chauffé à 37 ° C.
    3. Ajouter 100 nM phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) dans chaque puits et la culture pendant 3 jours induire la différenciation des monocytes THP-1 dans les cellules de type macrophages.

2. culture et préparation de la lignée de cellules macrophages J774.2

  1. Cellules J774.2 de culture dans des flacons de T25 à 37 ° C + 5 % de CO2. Les cellules doivent être cultivées dans 5 mL de Dulbecco Eagle modifié (DMEM) + 10 % FBS et subcultures lorsque la culture atteint 80 à 90 % confluence. Pour cellules de passage :
    1. Retirez tous les médias de la fiole et la hausse une fois avec 5 mL de PBS.
    2. Supprimez les PBS de la fiole et remplacez-les par 5 mL de fresh DMEM + 10 % FBS.
    3. À l’aide d’un grattoir de cellules, grattez le fond du flacon de suspendre les cellules dans les médias. Pipetter vigoureusement les cellules plusieurs fois pour casser vers le haut de n’importe quel agrégat de cellules.
    4. Diluer 1:5 de cellules en retirant 4 mL de la suspension cellulaire de la fiole et remplacez-le avec 4 mL de supports neufs. La suspension de cellules restantes peut être mis au rebut, utilisée pour démarrer une nouvelle culture de cellule dans une fiole de T25 frais ou utilisée pour une expérience.
  2. De mettre en place pour un test d’efferocytosis en utilisant des cellules J774.2 :
    1. Un jour avant le début de l’expérience, suspendre les cellules J774.2 dans 5 mL de supports neufs, selon les étapes 2.1.1–2.1.3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et préparer la quantité nécessaire de cellules à une concentration de 5 x 104 cellules/mL.
    2. Placer le nombre nécessaire de lamelles de verre circulaire de 18 mm (épaisseur 1.5) dans les puits d’une plaque de 12 puits. Dans chaque bien aliquote 1 mL de la suspension cellulaire de 5 x 104 cellules/mL.
    3. La culture du jour au lendemain pour permettre aux cellules d’adhérer à la lamelle et récupérer à partir de passage.

3. culture des Macrophages primaires humaines M2

  1. Collecter 10 mL de sang hépariné pour chaque plaque de 12 puits de macrophages M2 requis.
  2. Dans un tube à centrifuger 15 mL, couche 5 mL de sang humain sur le dessus de 5 mL de milieu de séparation préchauffé Lympholyte-poly cellule. Préparer les tubes multiples si traitement > 5 mL de sang plutôt que d’utiliser les plus grands tubes de volume.
  3. Centrifuger à 300 x g pendant 35 min, à l’aide de l’accélération moyenne et sans pause.
  4. Retirer délicatement la bande de riche-monocytaire supérieure à l’aide d’une pipette en plastique et le transfert dans un tube à centrifuger 50 mL. Si plusieurs tubes ont été préparées à l’étape 3.2, les bandes peuvent être regroupés dans un tube unique de 50 mL. Mettre le volume du tube à 50 mL avec du PBS.
  5. Centrifuger à 300 x g pendant 8 min et retirez le surnageant. Au cours de cette étape placer autoclavés 18 mm diamètre circulaire lamelles couvre-objet (épaisseur 1.5) dans chaque puits d’une plaque de 12 puits.
  6. Resuspendre le culot dans 300 µL de milieu sans sérum RPMI 1640 par le nombre désiré de puits ; par exemple, si 10 mL de sang a été traité pour préparer un plat bien complet 12, suspension culot cellulaire dans 3,6 mL de médias.
  7. Ajouter 300 µL de la suspension cellulaire à chaque lamelle contenant bien dans la plaque de 12 puits. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C + 5 % de CO2.
  8. Laver délicatement lamelle 3 x 1 ml de PBS chauffée pour enlever toutes les cellules non adhérentes.
  9. Ajouter 1 mL de milieu RPMI 1640 + 10 % BF + 10 recombinante ng/mL humain M-CSF + cell culture antibiotique/antimycosiques. Incuber à 37 ° C + 5 % CO2 pendant 5 jours.
  10. Remplacer le support avec RPMI 1640 + 10 % BF + 10 ng/mL recombinante humaine M-CSF + 10 ng/mL recombinante humaine IL-4 + cell culture antibiotique/antimycosiques. Incuber à 37 ° C + 5 % CO2 pendant 2 jours compléter la polarisation M2.
  11. Macrophages polarisées doivent être utilisés dans les 3 prochains jours.

4. préparation des cellules Apoptotic Jurkat

  1. La culture de cellules Jurkat dans 5 mL de milieu RPMI 1640 + 10 % FBS à 37 ° C + 5 % de CO2. Jurkats sont une lignée cellulaire de suspension et peut être maintenus par passage 1:5 dans les milieux frais, pré chauffées tous les 3 à 5 jours.
  2. Pour préparer les cellules apoptotiques, permettent la culture Jurkat à haute densité (4 – 5 jours après le passage). Aliquote 1,5 mL dans un 1,5 mL microcentrifugeuse tube granules des cellules et par centrifugation à 500 g pendant 5 min.
  3. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu RPMI 1640 sans sérum contenant 1 µM staurosporine.
  4. Incuber pendant 16 heures à 37 ° C + 5 % de CO2 pour rendre les cellules apoptotiques.
  5. Si vous le souhaitez, confirmer l’induction de l’apoptose par coloration avec l’annexine v :
    1. Aliquote 100µl de la staurosporine imprégnées de culture de cellules Jurkat dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Cellules de granule par centrifugation à 500 g pendant 5 min, jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 100 µL de milieu RPMI 1640 sans sérum.
    2. Ajouter 1 µL d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-conjugué annexine V et incuber pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
    3. Ajouter 900 µL de PBS et transférer la totalité du volume d’un seul puits d’une plaque de 12 puits contenant une lamelle de verre circulaire de 18 mm (épaisseur 1.5). Tournez en bas dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque à 200 x g pendant 1 min forcer les cellules à adhérer à la lamelle. Par ailleurs, les cellules peuvent être placés dans une diapositive chambrée pour l’imagerie.
    4. Image à l’aide d’un microscope à fluorescence.

5. quantification Efferocytic absorption et dynamique en utilisant une méthode de criblage cellulaire fixe Efferocytosis et coloration dedans-dehors

  1. Préparer des macrophages humains THP-1, J774.2 ou M2 tel que décrit dans les chapitres 1 à 3, respectivement.
  2. Le soir avant le début de l’expérience préparer apoptose des cellules Jurkat tel que décrit à la Section 4.
  3. Immédiatement avant l’expérience, compter les cellules apoptotiques utilisant un hémocytomètre. Transfert d’un nombre suffisant de cellules apoptotic dans un tube de microtubes de 1,5 mL – nous ajoutons généralement 5 x 105 cellules/puits, offrant un ratio cible : efferocyte de 10:1.
  4. Granules des cellules Jurkat par centrifugation à 500 g pendant 5 min et remettre en suspension dans 500 μl de PBS.
  5. Pendant la centrifugation, aliquote à 10 µL de DMSO dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL. Dissoudre dans du DMSO une quantité minimale de N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-biotine). 5-10 cristaux (~0.005 mg) est suffisante.
  6. Transférer la suspension de cellules/PBS 500 μL apoptotiques dans la DMSO/NHS-biotine contenant un tube. Diluer une cellule colorant de repérage à la concentration recommandée par le fabricant dans la suspension de cellules apoptotiques. Assurez-vous de sélectionner une cellule suivi colorant qui ne se chevauche pas spectralement avec streptavidine-FITC(par exemple rouge ou infra-rouge élément colorant de repérage).
  7. Incuber la suspension pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter un volume égal de RPMI 1640 + 10 % FBS et incuber pendant 5 min à température ambiante dans l’obscurité pour assouvir n’importe quel colorant n’a pas réagi.
  8. Cellules de granule par centrifugation à 500 g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules apoptotiques tachée dans 100 µL de milieu RPMI 1640 + 10 % FBS / puits des macrophages.
  9. Ajouter 100 µL de la suspension de cellules apoptotiques tachée goutte à chaque puits des macrophages. Centrifuger à 200 x g pendant 1 min dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque pour forcer le contact entre les macrophages et les cellules apoptotiques.
  10. Incuber les plaques pour la période souhaitée de temps à 37 ° C + 5 % de CO2 dans un incubateur de culture de tissus. Pour les macrophages, efferocytosed matériel est habituellement d’abord détectable après 20 à 30 min et se termine après 120 – 180 min.
  11. Point (s) au moment voulu déloger les cellules de l’incubateur. Laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS pour arrêter efferocytosis et supprimer les cellules apoptotiques non-efferocytosed de la température ambiante.
  12. Ajouter FITC conjugué streptavidine à une dilution de 1 : 1 000 à chaque puits et incuber pendant 20 min dans le noir. Cela étiquettera la biotine exposée sur tout matériel non-efferocytosed de cellules apoptotiques.
    Remarque : Si vous le souhaitez, noyaux des cellules peuvent être colorés au cours de cette étape par addition de dilution de 1/20 000 de Hoechst 33342 ou 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dichlorhydrate (DAPI).
  13. Laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS, secouant doucement ou de balancement les échantillons pendant 5 min par rinçage. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % (PFA) dans du PBS pendant 20 min à température ambiante. Rincer les cellules une fois avec du PBS pour enlever l’excès PFA.
  14. Monter les lamelles couvre-objet sur une diapositive pour l’imagerie et le transfert d’un microscope à fluorescence. Z-piles d’un nombre suffisant de cellules pour la quantification précise de capture — généralement 10 à 30 cellules / condition. Matériau à cellules apoptotic non-internalisé sera apparent dans l’image résultante comme cellule colorant étiqueté matériel enveloppé par la coloration de streptavidine-FITC, tandis qu’efferocytosed matériel forme discrète cellule suivi colorant examen gratuit de n’importe quel streptavidine de repérage la coloration.
  15. Quantifier les efferocytosis dans les images obtenues via une série de mesures :
    1. Calculer l’indice d’efferocytic en déterminant le nombre moyen de discrets efferosomes (cellule colorant+/streptavidin examen de suivi) par les macrophages. Quantifier les uniquement les macrophages lié à une cellule apoptotique ou contenant ≥ 1 efferosomes visibles. Macrophages Records lié à une apoptose cellulaire, mais manquent efferosomes discrets, comme ayant un indice d’efferocytic de 0.
    2. Calculer l’efficacité efferocytic par la mesure de la fraction des macrophages contenant ≥ 1 efferosome.
    3. Calculer le taux d’efferocytosis par les cellules d’imagerie fixe et tachée à plusieurs points de temps. Seuls les macrophages image lié à cellules apoptotiques, ou contenant des efferosomes visibles, avec z-piles capturé de chaque cellule. Une fois l’image, déterminer le taux d’efferocytosis :
      1. À l’aide de la coloration de la Streptavidine comme un guide et l’outil de sélection à main levée ou Polygone dans26 Fidji/ImageJ (ou autre progiciel d’analyse image), entourez tous de la cellule de suivi colorant+/streptavidin (p. ex. intériorisé) matériau en un seul plan de la z-pile. Mesurer l’intensité intégrée de la cellule de colorant de repérage de cette région. Des mesures individuelles pour chaque efferosome (par exemple diamètre, positionnement par rapport à la bordure de cellule ou de noyau, etc.)15,27 peuvent facilement être acquises en même temps avec ces mesures, grandement augmenter les données recueillies lors de l’analyse.
      2. Sur le même profilé en z, à l’aide de la Streptavidine coloration comme guide et l’outil de sélection à main levée ou Polygone, entourez tous de la cellule de suivi colorant+/streptavidin+ (p. ex. non intériorisé) matériel dans un seul plan de la z-pile . Inclure seulement la coloration des cellules apoptotiques au contact du phagocyte. Mesurer l’intensité intégrée de cette région.
      3. Répétez les étapes 4.2.3.1 à 4.2.3.2 pour profilés en z restants de l’image. Somme de l’intensité intégrée du efferocytosed (ΣFEP) et des matériaux non-efferocytosed (Σne). La fraction de la cellule apoptotique qui a été efferocytosed peut être calculée pour la cellule sous la forme :
        Equation
      4. Quantifier la fraction efferocytosed pour toutes les cellules à tous moments. Notez que l’intensité de fluorescence de l’apoptose des cellules/efferosomes peut varier entre les images, en raison des variations dans l’absorption de la cellule de suivi des colorants de cellules apoptotiques individuels et en raison de changements dans les paramètres d’acquisition image par exemple de temps d’exposition. À ce titre, seule comparaison normalisée valeurs telles que la Fraction Efferocytosed, ou valeurs d’intensité indépendante comme indice d’efferocytic et efferocytic efficacité, entre les images, entre les conditions expérimentales et entre répéter les expériences.
    4. Afin d’assurer que l’ensemble de données qui en résulte reflète fidèlement la variation d’efferocytosis entre les cellules, effectuer ces analyses sur le nombre maximal de cellules possibles dans chaque expérience.
      NOTE : Indice de l’efficacité et d’efferocytic Efferocytic on peut calculer rapidement (quelques secondes/cellule), et nous visent généralement à analyser au moins 100 cellules par expérience, répétant chaque expérience au moins 3 fois. Calcul de la fraction d’efferocytosed matériel et des mesures spécifiques efferosome sont plus laborieux, prenant généralement 2 à 3 min/cellule pour un analyste expérimenté. Pour ces calculs, Nous quantifions un minimum de 15 cellules par État, par l’expérience.
    5. Indice efferocytic record, fraction efferocytosed et efferosome des données sur une base par cellule.
      NOTE : Cela permet l’analyse des données en utilisant des approches de cellule unique, permettant ainsi des variations inter-cellules à quantifier. Des analyses de niveau de la population peuvent encore se dérouler sur ces ensembles de données en faisant la moyenne unicellulaires données acquises lors d’expériences individuelles. Efferosome spécifiques des mesures peuvent être analysées au niveau de la population, niveau unicellulaire et sous ensembles (par exemple sous forme de populations d’efferosomes indépendante des cellules qui les contiennent)15.

6. analyse de Efferocytosis des cellules à l’aide de cellules apoptotiques de vivre

  1. Préparer les macrophages THP-1, J774.2 ou M2 comme décrit aux étapes 1-3, respectivement. Si nécessaire, les cellules doivent être transfectées avec transgènes ou autres génétiques construit au moins 18 h avant d’effectuer toutes les expériences.
  2. Le soir avant le début de l’expérience, préparer apoptose des cellules Jurkat tel que décrit dans les Sections 4 et 5 avec les modifications suivantes :
    1. Diluer les cellules et induisent l’apoptose selon 4.1 à 4.3 et collecter le nombre requis de cellules apoptotiques selon 5.3 – 5,4.
    2. Ajouter une cellule à colorant à la concentration recommandée par le fabricant de repérage à la suspension de cellules apoptotiques. Incuber la suspension pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter un volume égal de RPMI 1640 + 10 % FBS et incuber pendant 5 min à température ambiante dans l’obscurité pour assouvir n’importe quel colorant n’a pas réagi. N’ajoutez pas de NHS-biotine pour ces expériences.
    3. Cellules de granule par centrifugation à 500 g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules apoptotiques tachée dans 100 µL de milieu RPMI 1640 + 10 % FBS / puits des macrophages.
  3. Si nécessaire, étiquette les macrophages en supprimant des milieux de culture dans chaque puits et ajouter 500 µL de PBS contenant les fabricants recommandés de dilution d’une cellule de suivi de colorant qui ne se chevauche pas spectralement par la cellule de colorant de repérage ajouté pour les cellules apoptotic ou toute transgènes fluorescentes exprimées par les macrophages. Incuber pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité, puis ajouter un volume égal de DMEM + 10 % FBS et incuber pendant 5 min à température ambiante dans l’obscurité pour assouvir n’importe quel colorant n’a pas réagi.
  4. Transférer la lamelle contenant des macrophages dans une chambre de Leyde. Ajouter 400 µL de DMEM + 10 % FBS, suivi par 100 µL de la suspension de cellules apoptotiques étiquetées. Mélanger doucement pipetage médias 2 à 3 fois.
  5. Transfert de la chambre de Leiden à une chauffée et CO2-perfusée chambre d’un microscope à fluorescence de cellules vivantes.
    Remarque : Pour les configurations de microscope qui n’ont pas de capacités de perfusion2 CO, utilisez des tissus milieu de culture mis en mémoire tampon avec 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES) plutôt que le bicarbonate de sodium pour maintenir un pH physiologique tout en le la culture est exposée à l’air.
  6. Capturer une série Time-lapse contenant une image de lumière blanche (contraste de phase ou DIC) et des images de toutes les étiquettes fluorescentes :
    1. Utiliser une lentille d’objectif X 100 pour les expériences où régler les détails fins est requis (par exemple dynamique de membrane des interactions cellulaires phagocyte-apoptotiques). Pendant ce temps, des mesures plus générales (taux d’apport des cellules apoptotiques, temps d’interaction entre les macrophages et les cellules apoptotiques, etc.) sont mieux imagés à l’aide d’un 60 X ou 63 X objectif.
    2. Le cas échéant, utiliser point-visite à l’image de plusieurs champs de vision au cours d’une seule acquisition, augmentant ainsi le nombre d’événements efferocytic, capturé dans une expérience simple
    3. Parce qu’efferocytes engloutir souvent de petits fragments de cellules apoptotiques, plutôt que des cellules intactes, il est préférable de capturer z-piles. Pour minimiser la phototoxicité, capturer z-sections séparées par la profondeur focale de votre objectif de microscopes (généralement de 0,5 à 1,0 µm), l’épaisseur de la cellule (en général 8 à 10 µm pour les macrophages, par exemple 8 – 20 tranches/cellule). Cela garantit que tous les engouffrement et traite des événements seront visibles dans au moins un plan z. Également utiliser gros imite de cellule apoptotique (1 à 5 µm de diamètre) ou les cellules apoptotiques qui subissent une fragmentation minime au cours de l’efferocytosis (p. ex. chaleur neutrophiles choqués) plutôt sans z empilement. Nous avons décrit la préparation de mimiques et de neutrophiles apoptotic précédemment28.
    4. Pour minimiser le photoblanchiment, utiliser des fluorophores lumineux et capture des images en utilisant des paramètres d’acquisition qui réduisent au minimum le photoblanchiment — par exemple les excitation de faible intensité combinée avec caméra haute gain et courte exposition fois29. Nous recommandons fortement d’utiliser un microscope équipé d’une caméra de haute sensibilité électromagnétique couplé dispositif de charge (EM-CCD) ou spinning-disque confocale et une platine mécanique piézoélectrique à grande vitesse, pour cette forme d’imagerie.
  7. Le nombre de méthodes d’analyse possibles qui peuvent s’appliquer à ces vidéos time-lapse est étendu et au-delà de notre capacité d’examiner ici. Comme exemples, utilisez manuel ou automatisé, logiciel de suivi pour suivre la fusion, la fission et la circulation des efferosomes dans les cellules15, quantifier efferosome dynamique de fusion avec endolysosomes par analyse de colocalisation dans les macrophages exprimant Compartiment spécifique fluorescente transgènes13, surveiller les processus de capture telles que sonder et coupe formation30, déterminer la dynamique de recrutement de la signalisation et le trafic des protéines à l’efferosome13, et/ou quantifier l’activité de dégradation des efferosomes à l’aide de cellules apoptotiques marquées avec des fluorophores sensibles au pH, oxydant sensibles ou activés par protéase31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Culture de cellules Jurkat avec résultats la staurosporine 1 µM dans l’apoptose de la nuit > 95 % des cellules, qui peuvent être confirmés avec l’annexine V, coloration (Figure 1). Autres types de cellules peuvent être utilisés pour ces expériences, même si la concentration de la staurosporine et la durée du traitement la staurosporine auront besoin d’être optimisé pour chaque lignée cellulaire. Pour une détection fiable et la quantification des efferocytosis, > 80 % des cellules devraient être apoptotic avant de les ajouter à l’efferocytes. Autres inducteurs de l’apoptose (p. ex. choc thermique, étoposide et lumière UV) peuvent également être utilisés, mais d’après notre expérience, celles-ci produisent une induction plus hétérogène de l’apoptose et aboutir à des populations de cellules mixtes contenant l’apoptose, nécrose secondaire et non-apoptotique des cellules cibles.

Pour l’imagerie de cellules fixe avec coloration dedans-dehors, interactions cellulaires apposées près efferocyte-apoptotiques doivent être observées en tous points dans le temps, avec clairement délimité non-efferocytosed (virus de streptavidine++de colorant de repérage) et efferocytosed (virus de streptavidinesuivi+) matériaux visibles (Figure 2). Il est important de noter que la synapse qui se forme entre l’efferocyte et la cellule apoptotique est souvent assez serrée pour exclure la Streptavidine et donc n’importe quelle cellule colorant teinté objet portant streptavidine à n’importe quel point sur sa circonférence de repérage doit être considérée comme une cellule liée et pas un efferosome. Dans la plupart des expériences de la fraction des cellules apoptotiques qui sont efferocytosed augmentera de façon dépendante du temps, jusqu'à ce qu’aucun matériau de cellules apoptotiques non intériorisé, ou jusqu'à ce que le phagocyte atteint sa capacité maximale d’efferocytic (Figure 3). analyse est généralement joué et enregistré pour les cellules individuelles (Figure 3 a), cependant, données peuvent être moyennées sur cellules d’expériences individuelles et les valeurs moyennes de multiples répétitions expérimentales analysées avec conventionnel approches statistiques (Figure 3 b). Modifications du présent protocole normalisé peuvent être effectuées pour permettre à utiliser des types de cellules primaires, efferocytic autres cibles et pour une coloration supplémentaire à inclure. Par exemple, la Figure 4 montre un macrophage humain polarisation M2 primaire qui a efferocytosed apoptotique cellulaire imite composé de 3 perles de silice de diamètre de µm enrobées dans un mélange de phosphatidylsérine et de phosphatidylcholine28, suivie la fixation ultérieure, perméabilisation et immunostaining pour le recyclage endosome marqueur Rab17.

Au cours de cellules vivantes imaging efferocytic phagocytes professionnels est observé pour étendre et rétracter petits processus dans un processus appelé « sonder »30 (Figure 5, t = 0) ; Lorsque ces processus rencontrent une cible qu’ils adhèrent à la cible fermement et tirez-le vers le phagocyte. Cette activité de détection n’est pas observables avec phagocytes non professionnels tels que les cellules épithéliales. L’efferocyte formeront ensuite un serré « efferocytic synapse »32 entre lui-même et la cellule apoptotique, avec cette synapse enveloppant souvent une grande partie de la cellule apoptotique (Figure 5, t = 10). L’efferocyte tirera ensuite des morceaux de la cellule apoptotique de cette synapse dans le cytosol (Figure 5, 10 et 30 min). Bientôt après leur formation, ces efferosomes naissants sont victimes de la traite de la synapse et vers la zone peri-nucléaire, un résultat de Rab7/RILP/dynéine-DCTN5 médié transport33. Au fil du temps, l’efferosomes va diminuer et les matériaux dégradés résultantes redistribués dans toute la cellule, où ils sont susceptibles absorbé ou recyclé13,15. La capacité à détecter ces processus est fortement tributaire de l’acquisition-cadence et durée de l’expérience. Processus rapides comme le sondage ne sont pas observables au plus faibles taux de trame, tandis que les événements lents (efferosome trafic et absorption) requièrent plus longues périodes d’imagerie — dans les deux cas, ces acquisitions image grand nécessitent souvent la capture d’images de faible intensité afin de limiter le photoblanchiment et phototoxicité (Figure 5). Comme pour l’essai de cellules fixes, la version de cellules vivantes de ce dosage peut être modifiée en fonction des besoins de l’enquêteur. La figure 6 montre un seul cadre d’une acquisition de cellules vivantes des macrophages J774.2 exprimant des transgènes qui demark fluorescent de la membrane plasmique (PM-GFP) et qui lie sélectivement la signalisation lipidique PI (3) P (FYVE-DP). Génération de PI (3P) sur la membrane d’efferosome peut être détectée comme la co-localisation de FYVE-DP avec la membrane d’efferosome PM-GFP+ . En quantifiant l’intensité de FYVE-DP sur l’efferosome, la dynamique de la PI (3) P signalisation sur l’efferosome peut être quantifiée (Figure 6).

Figure 1
Figure 1 : annexine V coloration apoptotique des cellules Jurkat Non - Apoptotic. Annexine V étiquettes la phosphatidylsérine « manger-me » signal exposé par les cellules apoptotiques. (En haut) Les cellules Jurkat (UT) non traitées affichent une morphologie (lisse et arrondie) saine (DIC) et tache pas avec l’annexine V. (en bas) Jurkat cellules cultivées pendant la nuit avec 1 µM staurosporine (STS) prennent une morphologie d’apoptose (irrégulière et blebbed) et tachent avec Annexin V. Echelle = 10 µm, intensité de l’image s’affiche comme une carte de couleur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : précoce et tardive d’une durée de Apoptotic Jurkat de cellules par les Macrophages J774.2. Les images sont des macrophages au début (60 min) et tardivement (120 min) d’efferocytosis. Lumière blanche (DIC) image illustre l’interface serré entre les macrophages (mφ) et les cellules apoptotiques (AC). Cellules à colorant (CTD, rouge) de repérage révèle l’emplacement de toutes les matières de culture cellulaire apoptotique. Coloration de streptavidine-FITC (Str, vert) identifie la partie de la cellule apoptotique qui n’a pas encore été engloutie par les macrophages. Les noyaux de macrophages sont préalablement colorés au DAPI (bleu). Efferosomes (rouges) par rapport à la partie non intériorisé de la cellule apoptotique (vert/jaune) sont facilement identifiables dans une superposition de la Streptavidine et la cellule de suivi des images de colorant. Notez l’absence de streptavidine coloration à l’interface de cellule de macrophage-apoptotique au début validant, créée par l’exclusion de streptavidine placés en aval de la synapse solidement formé efferocytic (*). Le noyau de macrophage est identifié par Hoechst coloration (bleu). Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : évolution temporelle de la Fraction des cellules Apoptotic Efferocytosed par les Macrophages J774.2. Efferocytosis analyses ont été effectuées pour la fois et la fraction de matériau à cellules phagocytées apoptotique déterminé à chaque point de temps à l’aide de la cellule suivi coloration teinture/Streptavadin. (A) Fraction des matières efferocytosed dans les macrophages, les données sont présentées de cellules individuelles, barre horizontale indique la moyenne. cellules de 12 à 17 ans par État, données de 1 de 5 expériences indépendantes. (B) Fraction des matériaux efferocytosed, moyennée sur 5 expériences indépendantes, au moins 10 cellules/condition/répétition. p < 0,05 comparée à 30 min, test de Kruskal-Wallis avec correction de Dunn. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : analyse du recrutement de Rab17 à Efferosomes dans les Macrophages humains primaires. Un macrophage M2 à polarisation englouti imite de cellules apoptotiques (flèches) et a été immunomarquées pour Rab17 (vert) 60 min après une durée. Echelle = 5 µm. noyau cellulaire est coloré avec Hoeschst, DIC image montre la morphologie des cellules et sert à identifier les imitateurs de cellules apoptotiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : dosage de cellules vivantes efferocytosis. Une cellule de suivi colorant labeledJ774.2 macrophage (mφ, vert) a été enregistrée comme il englouti une cellule de Jurkat apoptotic marquée avec une cellule de couleur différente (AC, rouge) de colorant de repérage. La cellule apoptotique est divisée en plusieurs fragments au cours du processus d’internalisation, absorption au coup par coup et de la formation de multiples efferosomes (flèches). Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : à l’aide de transgènes Fluorescent pour enquêter sur la signalisation Efferocytic. Un macrophage J774.2 a été transfecté avec un marqueur GFP-étiquetée de membrane plasmique (PM, vert) et construction de FYVE-DP, qui lie la signalisation lipidique PI (3) P (rouge). Efferocytosis forme une efferosome dérivée de la membrane plasmique naissante qui contient PI (3) P, tel que détecté par recrutement FYVE-DP (flèche). La dynamique de la PI (3) P signalisation a été quantifiée que pli d’intensité par rapport au signal FYVE-DP présent au moment de la fermeture d’efferosome (t = 0, graphique). Cette expérience a utilisé une perle d’imitant cellules apoptotiques (flèche, DIC) plutôt que les cellules apoptotiques. Echelle = 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Les méthodes décrites dans le présent protocole permettent l’imagerie et la quantification du processus dynamique d’efferocytic, en utilisant des approches tant fixe-cellules et cellules vivantes. Ces approches offrent plusieurs avantages par rapport aux flux couramment utilisés méthodes axées sur la cytométrie en flux23,24. L’utilisation de dedans-dehors la coloration avec des échantillons fixes permet une quantification plus robuste et plus précise du taux et l’étendue des efferocytosis — en effet, nombreuses méthodes axée sur la cytométrie de flux simplement étiquettent les cellules apoptotiques et macrophages avec des fluorophores différents, et efferocytosis note que la fraction des macrophages coloration conjointement avec le marqueur de cellules apoptotiques, manquant ainsi la capacité de différencier lié contre le matériau à cellules apoptotic intériorisée. Approches de cytométrie en flux alternatifs incluent ceux qui utilisent pHrodo étiqueté de cellules apoptotiques24. pHrodo est un fluorophore sensibles au pH qui augmente la luminosité à un pH acide. Bien que ce fluorophore ne fournisse une résolution supérieure entre non-internalisés par rapport aux matériaux intériorisées, comme les augmentations de fluorescence spécifiquement après internalisation de la cellule apoptotique et l’acidification de l’efferosome, les résultats peuvent être confondu par les processus morbides de nuire à l’acidification d’efferosome34,35, et cette méthode va manquer efferosomes dans les premiers stades (avant l’acidification) d’efferocytosis36, situées dans des régions pauvres en l’acidification de la cellule27, ou dans les cellules qui acidifient faiblement leurs lysosomes37. Un deuxième avantage de la méthode décrite dans le présent protocole est l’utilisation de cellules vivantes d’imagerie permettant de mesurer la dynamique de l’efferocytosis, comme processus tels que la détection, la formation de la synapse d’efferocytic, et le trafic intracellulaire d’efferosomes ne peut pas être détectés en utilisant des approches axées sur la cytométrie en flux.

Bien que cette méthode offre de nombreux avantages, les expériences nécessitant la quantification de plusieurs centaines de cellules — par exemple les expériences détecter des événements rares, ou de quantifier les processus hautement variables — peut s’avérer difficile, avec l’analyse de ces grands ensembles de données prendre énormément de temps. Imagerie des approches telles que l’imagerie de flux haut débit cytometry38 peut permettre pour des débits plus élevés que la microscopie conventionnelle, bien que dans notre expérience l’image courante automatisée des programmes d’analyse ne sont pas toujours capables de segmenter avec précision non-internalisés par rapport aux matériaux intériorisées. Plus précisément, la synapse efferocytic serré qui se forme entre les cellules apoptotiques et efferocyte pouvez exclure streptavidine coloration, et comme tel, une cellule de l’apoptose liée apparaît souvent comme une masse solide dans la cellule de suivi des canaux de colorant, qui est partiellement enveloppée par streptavidine coloration (Figure 2). Ainsi, tandis qu’efferosomes sont facilement identifiables par algorithme, la partie dépendante de la cellule apoptotique est souvent confondu avec une efferosome due à la difficulté de la comptabilité pour la coloration de la Streptavidine partielle. Alors que nous devons encore trouver un programme qui permet d’identifier avec précision et quantifier la captation au coup par coup des cellules apoptotiques sans assistance humaine, nous avons identifié que systèmes semi-automatisés trainable39 peut accélérer considérablement l’analyse, les réduisant la fraction efferocytosed mesures de 2 à 3 min à < 60 s par cellule. Alternativement, imite la cellule apoptotique non digestibles ou des types de cellules qui fragmentent minimalement à l’apoptose, peut être utilisé à la place. Cela simplifie la détection aux structures seule, plus grandes, ce qui peut être plus favorable aux approches automatisées et peut éliminer la nécessité d’un empilement z. Même avec ces avances, la vitesse d’acquisition et d’analyse de cette méthode reste limite et comme tel cytométrie reste la méthode plus viable lorsque les analyses du nombre de grandes cellules est nécessaire23.

Bien que nous avons décrit cette méthode à l’aide de lignée cellulaire et des macrophages humains primaires comme efferocytes et l’apoptose des cellules Jurkat (une lignée de cellules de T) comme cibles, cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle cible d’efferocytic cellule type ou l’apoptose cellulaire. En effet, des approches similaires ont été utilisés pour étudier les efferocytosis dans les hépatocytes et les cellules épithéliales9,40,41et l’efferocytosis des cibles cliniquement pertinentes telles que les cellules de tumeur42. Il peut être nécessaire de modifier le présent protocole lorsque vous utilisez efferocytes non immuns, ou que la modélisation des événements spécifiques efferocytic. Par exemple, les cellules Jurkat sont non adhérents et sont donc probablement pas entièrement récapituler les forces mécaniques et limites spatiales efferocytes rencontrer lorsqu’il interagit avec les cellules apoptotiques adhérentes ou les cellules apoptotiques au sein des tissus solides. Plusieurs types de cellules maintiendront l’adhérence au cours de l’apoptose et par conséquent peuvent être utilisés en tant que cibles adhérentes ; par exemple, les cellules HeLa reproductible subissent l’apoptose induite par la staurosporine, brouillage de phosphatidylsérine et blebbing sur une période de 4 à 6 h tout en conservant l’adhérence des corps cellulaire43. Les cellules en suspension dans une matrice de collagène ou de cellules souches dérivées organoïdes44 peuvent être des modèles potentiels pour l’étude des efferocytosis dans les tissus solides, bien que nous ne connaissons pas d’études qui ont utilisé ces approches. Pour certains modèles de cellules immunitaires comme les cellules Jurkat et neutrophiles ne devraient pas servir comme cibles d’apoptose, parce que ces cellules peuvent par les cytokines « trouver-me » signaux tels que CX3CL1 qui peut être un facteur de confusion dans les modèles où inflammatoire ou migrateurs les processus sont étudiés45. Ainsi, tandis que la polyvalence de ce dosage permet pour qu’il puisse être utilisé pour explorer efferocytosis dans un éventail de types de cellules et de modéliser des systèmes, il faut sélectionner efferocytes approprié, cellules cibles et les conditions de culture au meilleur modèle de la physiologique processus d’enquête.

Les méthodes d’analyse décrites dans le présent protocole visent uniquement comme point de départ, avec la nature axée sur l’imagerie de ces expériences, ce qui permet une large gamme d’analyses. Par exemple, efferosome les mesures de positionnement et de diamètre peuvent être recueillies lors de l’exécution des mesures d’efferocytosed fraction ou mesurées au sein de cellules vivantes temps-cours, afin d’étudier les processus tels que le trafic intracellulaire de efferosomes et le taux d’apoptose cellulaire dégradation13,15. Immunomarquage (Figure 4) peut être utilisé pour enquêter sur le recrutement des protéines à efferosomes, alors que l’imagerie de cellules vivantes combinée avec des analyses morphologiques peut être utilisé pour quantifier les processus telle efficacité de liaison et les taux d’une durée de30 , 46. nous effectuons fréquemment ces dosages dans les macrophages exprimant des transgènes fluorescents signalant l’activation de la molécule ou l’activité des événements cellulaires de signalisation au cours de l’efferocytosis (Figure 6). Ces journalistes activer l’analyse des processus de signalisation au cours de l’efferocytosis ; par exemple, nous avons utilisé fluorescent-étiquetées de Rab GTPases pour explorer le rôle du Rab5, Rab7 et Rab17 dans la médiation efferosome transformation et le trafic ultérieur d’apoptotic de cellules dérivées des antigènes13,15. De même, l’incorporation de reporters de la mort cellulaire, pH efferosome, production d’espèces réactives de l’oxygène et autres processus cellulaires dans les cellules vivantes des expériences peut être utilisée pour étudier les processus de médiation de la dégradation de l’efferosomes31 ,,47. Un défi commun dans ces expériences est identifier des transgènes ou journalistes avec des fluorophores compatibles ; souvent, nous n’éliminerons la cellule suivi colorant ou streptavidine placés en aval à des chaînes gratuites d’imagerie autres fluorophores. Pour certaines expériences, il est utile de remplacer les cellules apoptotiques par un imitateur non fragmentant. Cela permet à la quantification de la signalisation dynamique et des processus cellulaires sans la complexité du suivi de l’efferosomes multiples dérivés provenant d’une cellule unique apoptotic. Voir Evans et coll. pour obtenir des instructions sur la préparation d’apoptose cellulaire imite28.

La difficulté plus courante lors de la conception de ces expériences est de trouver une combinaison de fluorophores qui permettent les processus désirés d’être photographié, tout en minimisant le photoblanchiment et phototoxicité29. Sélection de fluorophore est largement dictée par les lasers/excitation filtres dichroiques/cubes et filtres d’émission du microscope et par conséquent le choix des fluorophores est souvent spécifique à des microscopes. En général, plus longue longueur d’onde fluorophores (orange à rouge sombre, maxima par exemple d’émission > 580 nm) sont moins sujettes au photoblanchiment et ces longueurs d’onde sont moins perturbatrices aux cellules. Fluorophores verts (émission maxima ~ 525 nm) peuvent être utilisés, mais les soins doivent être prises pour limiter la phototoxicité aux cellules. Fluorophores qui excitent à longueurs d’onde inférieure à 480 nm (violet et bleu) sont à proscrire en raison de leur haute phototoxicité et la propension à ces longueurs d’onde d’excitation blanchir les autres fluorophores29. Si possible, stables et de haut-éclat fluorophores doit être sélectionnés. De même, les paramètres d’acquisition image doivent être ajustées afin de minimiser le photoblanchiment et phototoxicité — par exemple des expositions plus longues à intensité faible excitation sont préférées aux intensités48de l’excitation plus élevé. L’ajout d’antioxydants tels que la rutine et suppression de certains composants de médias peuvent améliorer les deux photostabilité et réduire la phototoxicité49. Même avec une sélection rigoureuse des fluorophores et conditions d’imagerie, la nécessité de limiter le photoblanchiment souvent nécessite la capture d’images avec des rapports signal-bruit faibles (voir la Figure 5 pour obtenir un exemple). Si quantifier l’intensité de la fluorescence, grand soin doit être pris pour limiter les artefacts de traitement d’image ; Idéalement, il faudrait analyser sans aucune forme de traitement des images raw. Si déconvolution d’images avant quantification, un algorithme de déconvolution qui préserve l’intensité de fluorescence doit être utilisé50,51.

Cellule acquisitions peuvent être particulièrement difficile, avec des expériences réussies, qui exige un équilibre délicat entre l’intensité d’excitation, durée d’exposition, cadence et durée de l’expérience en direct. Temps exposition et intensité d’excitation doit être ajusté afin de minimiser la phototoxicité comme décrit ci-dessus, avec l’avertissement que les temps d’exposition peuvent entraîner des artéfacts de mouvement due au mouvement de la cellule ou limiter la cadence d’acquisition. La cadence peut varier selon les conditions expérimentales. Taux de trame inférieures (5 – 30 min entre les membrures) permettant l’imagerie au cours de longues périodes de temps (12 h ou plus), mais fournissent des données minimales sur des phénomènes tels que la dynamique de la membrane et la post-efferocytosis traite des efferosomes. Haute cadence (aussi rapide que 1 frame par seconde) fournit excellente résolution temporelle des événements efferocytic et efferosome trafic — mais même avec une sélection rigoureuse des fluorophores, intensité d’excitation et des temps d’exposition — photoblanchiment ou phototoxicité limitera généralement ces expériences à moins d’une heure dans la durée. Dans notre expérience, acquérir des images toutes les 1 à 2 min, sur une période expérimentale de 2 à 6 h, sont un compromis acceptable qui fournit des images quantifiables d’un nombre suffisant d’événements efferocytic, avec une résolution temporelle raisonnable.

Altéré et n’a pas efferocytosis est connu pour être impliqué dans la pathologie du cancer, l’athérosclérose et plusieurs maladies auto-immunes, avec les thérapies ciblant les efferocytosis grand affichage clinique promettre7,52, 53,,du5455. Poursuite du développement dans ces domaines exigera identification et caractérisation des processus cellulaires, récepteurs et voies de signalisation qui règlent l’efferocytosis. L’analyse présentée dans le présent protocole représente un outil puissant pour ces études et peut être modifié pour quantifier nombre des processus cellulaires et signalisation régulation efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par les instituts de la santé (IRSC) Operating Grant MOP-123419, Sciences naturelles et ingénierie recherche Conseil de Canada Discovery Grant 418194 et un Ontario Ministère de la recherche et Innovation recherche précoce des prix à la BH. DGW a contribué à certaines des images présentées, à l’optimisation des protocoles et à la rédaction du manuscrit ; Il a été financé par une subvention de l’amorçage de l’Université de Liverpool. CY est financé par une bourse d’études supérieures Vanier et la bourse de doctorat des IRSC. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32, (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148, (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122, (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7, (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118, (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25, (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450, (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198, (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7, (12), e2529 (2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10, (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0, (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584, (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15, (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358, (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169, (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192, (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71, (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342, (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74, (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212, (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191, (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, (DEC), 1863 (1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23, (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50, (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197, (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310, (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2, (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300, (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112, (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25, (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7, (12), e53004 (2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6, (2), e16964 (2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28, (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289, (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176, (12), 7657-7665 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics