Bedömningen av cellulär Stress och Inflammation i diskreta Oxytocin-utsöndrar hjärnan kärnor i Neonatal råtta, före och efter första råmjölk utfodring

JoVE Journal
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera hjärnan kärnor i neonatal råtta hjärnan i samband med första råmjölk utfodring. Denna teknik tillåter studier av näringsämnen insufficiens stress i hjärnan som moduleras av enterocyter signalering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Målet med detta protokoll är att isolera oxytocin-receptor rika hjärnan kärnor i neonatal hjärnan före och efter första råmjölk utfodring. Uttrycket av proteiner känt att bemöta metabol stress mättes i hjärnan-kärnor isolat med hjälp av Western blotting. Detta gjordes för att bedöma om metabola stressinducerade näringsämnen insufficiens i kroppen utlöste neuronala stress. Vi har tidigare visat att näringsämnen insufficiens hos nyfödda framkallar metabol stress i tarmen. Dessutom modulerar råmjölk oxytocin cellulär stress svar, inflammation och autofagi markörer i nyfödda råtta gut villi före och efter första matningen. Signalering protein markörer associerade med endoplasmatiska nätverket stress [ER förkläde bindande immunglobulin protein (BiP), eukaryota översättning inledande faktor 2A (eIF2a), och eIF2a kinase proteinkinas R (p-PKR)], samt två inflammation-signalering proteiner [nuclear factor-κB (NF-kB) och hämmare κB (IkB)], mättes i nyfödda hjärnan kärnor [kärnan i den ensliga tarmkanalen (NTS), paraventricular nucleus (PVN), supra-optic nucleus (SON), cortex (CX), striatum atomkärnor (STR), och mediala preoptic kärnan (MPO)] innan de första foder (ovaccinerade av råmjölk) och efter starten av omvårdnad (Primas av råmjölk). Uttryck för BiP/GRP78 och p-eIF2a var uppreglerad i ovaccinerade och nedreglerade i primade NTS vävnad. NF-kB behölls (hög) i CX, STR och MPO cytoplasman, medan NF-kB var lägre och oförändrad i NTS, PVN och SON i båda villkoren. Den kollektiva BiP och p-eIF2 resultaten överensstämmer med en stressreaktion. eIf2a var fosforyleras av dsRNA beroende kinase (p-PKR) i SON, CX, STR och MPO. Dock var i NTS (och i mindre utsträckning i PVN), eIf2a fosforyleras av ett annat kinase, allmän kontroll nonderepressible-2 tyrosinkinashämmare (GCN2). Stress-modulerande mekanismerna tidigare observerade hos nyfödda gut enterocyter verkar speglas i vissa regioner med OTR-rika i hjärnan. De NTS och PVN kan utnyttja en annan fosforylering mekanism (under näringsbrist) från andra regioner och vara refraktära mot effekterna av näringsämnen insufficiens. Sammantaget tyder denna data på att hjärnan Svaren till näringsämnen insufficiens stress uppvägs av signalering från råmjölk-primade enterocyter.

Introduction

I motsats till vår förståelse för tidig hjärnans utveckling sker under loppet av dagar-på-veckor postpartum, är relativt lite känt om myriaden av dynamiska ändringar som inträffar under de första timmarna av liv i råttor. En viktig utmaning har varit den lilla storleken på neonatal råtta hjärnan och ett krav för högteknologiska verktyg att isolera diskret hjärnregioner eller enstaka celler. Studier bedöma ofta gen transkription och inte translation1,2, som inte ger en fast förståelse för funktionella nivåer av aktiveras signalmolekyler. Andra undersöka uttryck med immunohistokemi till referens av hjärnan, som inte tillåter för kvantifiering av expression nivåer3. Ingen studie hittills har undersökt aktivering av signalering vägar som är associerad med råtta första råmjölk foder i diskreta hjärnregioner, som kräver snabb isolering och offer och mätning av proteiner och protein fosforylering via Western blotting. Medan hjärnan lokalt utförs på äldre och större hjärnor, har vi inte identifierat en referens som utför en icke-single-cell hjärnan punch i en P0 hjärna. Detta dokument presenterar ett protokoll för att isolera begränsade regioner i neonatal hjärnan med hjälp av en relativt lågteknologiska punch-teknik och en Western blotting förfarande för att mäta proteinuttryck i relativt små prover. Detta protokoll kan vara lämplig för forskningsfrågor som kräver bedömning av proteinuttryck och post-translationella modifieringar (t.ex., fosforylering) i relativt begränsade regioner av små hjärnor av alla arter, under förutsättning att de användaren kan visuellt identifiera hjärnregionen sevärdheter med en atlas och identifierbara landmärken.

Denna teknik utvecklades för att förstå förändringar som sker i hjärnan till följd av den neonatala råttor första råmjölk foder, som är rik på oxytocin (OT). OT har länge känt för dess förmåga att stimulera mjölk låt ned och livmoderns sammandragning. OT är dock nu känt att spela ett brett utbud av roller i regleringen av många kroppsliga funktioner och beteenden4. Till exempel OT motsätter sig stress och inflammation i samband med adaptiv affiliative beteenden5, fördröjer magtömningen och saktar intestinal transitering. OT-receptorer (OTR) har identifierats i enteriska nervceller och intestinala epitelet6,7,8. Gastrointestinala effekter av OT är särskilt viktiga för barnet under den tidiga postnatala perioden. Exempelvis amning är kopplade till leveransen av betydande mängder OT till neonatal gut9,10, och data visar att OTR är kraftigt ökad utsträckning hos duodenal villi under mjölken diande perioden8.

In vitro försök med en gut cellinje har visat på cellnivå att oxytocin modulerar viktiga molekyler i den stress som signalering utbildningsavsnitt11,12 och en reglerande roll i översättning av proteiner 12. dessa studier tyder på att komponenter av mjölk, inklusive exogena oxytocin från mamman, är viktiga i ovikta protein svaret hos nyfödda att minska cellulär stress13.

In vivo och ex vivo -studier har visat att råmjölk OT modulerar cellulär stress svar, inflammation och autofagi markörer i nyfödda råtta gut villi. Nyfödd enterocyter lida betydande cellulär stress på deras luminala sida när tarmen utsätts samtidigt för bakterieflora från mamman i råmjölk14,15 och många proteiner, inklusive hormoner såsom OT9 , 10 , 16.

Effekterna av OT på hjärnan har studerat17. OT signalering mekanismerna visat i tarmen under den tidiga postnatala perioden har dock inte studerats i hjärnan. I detta papper används en metod för att isolera diskret hjärnan kärnor i neonatal råtta hjärnstammen och hypotalamus med elektrofores att profilera isolerade hjärnregioner. Det övergripande målet med denna metod är att fånga delstaten cell signalering i hjärnområden så nära som möjligt till födelse, före och efter den första mjölk som diande, i hjärnvävnad med lägsta gliaceller/neuronala index. Grunden för utvecklingen av denna teknik är att det tillåter för snabb isolering av begränsade, mikroskopiska av hjärnan hos nyfödda ungar med en mer homogen samling av nervceller för ex vivo studier med hjälp av en automatiserad Western blotting metodik, erbjuder mycket konsekvent resultat på relativt små dissekerade prover. En brist av tidigare arbete innehåller fler brutto dissektion (hjärnan skivor eller hela hjärnan) och äldre djur18,19. Hjärnan hos unga valpar är otroligt dynamiska, med vågor av gliaceller differentiering efter födseln. För att studera förändringar i hjärnan påverkas av pups' första utfodring, är det nödvändigt att studera begränsade neuronala atomkärnor med reproducerbara dissektion.

Mjölk foder är vanligtvis analyseras för dess immunologiska och näringsmässiga inverkan på hälsa eller gen uttryck (till exempel i enterocyter20,21), medan dess inverkan på hjärnområden under hjärnans utveckling studeras sällan. Effekten av mjölk transit i tarmen på hjärnans funktion analyserades med hänvisning till gut cholecystokinin receptorer vagala relä till hjärnstammen kärnor, men inte till Intracellulär signalering vägar22. Det finns en omfattande litteratur på sårbarhet för hjärnans utveckling nyfödda undernäring av mödrar under graviditeten23, men stress och inflammation signalerna behandlas inte. Ännu viktigare, utnyttjar den nuvarande metoden ett fenomen i dag noll råtta nyfödda som isolerar de blod-född råmjölk stimuli från vagala relä av viscerala stimuli. Detta är den så kallade stress hypo-lyhördhet period kännetecknas av omogna kärnan tractus solitarius (NTS)-hypotalamus krets omedelbart efter födseln24,25 som begränsar NTS, paraventricular nucleus (PVN), och supraoptic kärnan (SON) signaler till blod-född stimuli.

Denna metod är användbar för analys av flera signalvägar och begränsade relativt till neuronala celler, förutsatt att hjärnvävnaden skördas vid postnatal dag-0 hos råttor, förutom om mödrar har ifrågasatts eller inte genom någon form av behandling under graviditet. Kullar kan analyseras effekterna av råmjölk foder jämfört med före utfodring signalering. När man jämför signaler mellan hjärnområden med fattiga mot rika protein avkastning, kan denna metod i-kapillär bestämning av totalt protein av kapillärer som löper parallellt med immun-kvantitering av proteinantigener polypeptid band. Denna metod möjliggör kvantitativa jämförelsen, med godtyckliga enheter, av resultat som erhållits av samma antikropp utan standard kvantitativa kurvor och med hänvisning till totalt protein per kapillär. Jämför resultaten av olika antikroppar är möjligt endast med hjälp av kvantitativa standard kurvor.

Denna metod tillåtet för bedömning av dubbelriktad signalering mellan tarmen och hjärnan och som kan påverka funktionen i båda organ26. Associationen mellan oxytocin och mat intag, som har studerats i senaste åren27, stöder ett samband mellan ökad oxytocin signalering och näringsämnen tillgänglighet. Dessa studier stöder också begreppet converse att energi underskott kopplas ihop med minskningar i hypotalamus oxytocin signalering.

Tidigare studier av effekten av OT på hjärnans aktivitet visade att inducerade tarm inflammation framkallas cFos transkription i hypotalamus PVN, amygdala och piriform cortex som var refraktära mot vagotomy28. Systemiska infusion av OT med sekretin minskade dock att hjärnan cFos bemöta den provocerade inflammatorisk reaktionen i tarmen28. Detta tyder på att effekten av exogena OT genomfördes av vägar än vagala reläer, eventuellt via blodburna signalmolekyler transporteras genom området postrema6,29.

I denna studie bedömdes de signalvägar som cellulär stress som har tidigare observerats i tarmen i hjärnan. Hypotesen var att mjölk komponenter kan skydda eller skjuta upp effekten av inflammation på gut permeabilitet mikrobiell och andra metaboliter, och i sin tur effekter på hjärnans funktion. De tydliga antagonistiska skillnaderna i IkB kontra BiP signalering Funna i villi, före och efter priming av råmjölk13, föreslog att hjärnan hos nyfödda, fortfarande håller på att utveckla, kan känna dessa råmjölk-inducerad gut signaler.

Signalering protein markörer som används i tidigare gut experiment som är associerade med endoplasmatiska nätverket stress mättes. De inkluderar ER förkläde BiP, översättning inledande faktor eIF2a (som fungerar som en stress reaktion integrator30), eIF2a kinase p-PKR, och två inflammation-signalering proteiner (NF-kB och dess hämmare, IkB).

Sex regioner i hjärnan utifrån deras förmåga hos vuxna att utsöndra eller svara på OT valdes. NTS, ligger på övre medulla, den första relän av visceral input och tar emot direkt signalering från vagala sensoriska nervceller i tarmen31 och eventuellt blod-född cytokiner, gifter och hormoner via den angränsande område-postrema32. PVN, supraoptic kärnan (SON), striatum atomkärnor (STR), cerebral cortex (CX) och mediala preoptic kärnan (MPO) får signalering från tarmen via NTS.

Resultaten visade att den cellulära stressreaktionen under omedelbara postnatala perioden före råmjölk priming och omedelbart efter första utfodring är olika i NTS jämfört med PVN och SON. Signalering i CX, STR och MPO skilde sig från PVN och SON, liksom. De distinkta skyddande funktionerna av OT visat tidigare att modulera cell stress och inflammation i tarmen är sannolikt kände av vissa områden i hjärnan. Data visar sammantaget att på cellnivå, under de första timmarna efter födseln, hjärnan svarar på metabola stress i samband med näringsämnen insufficiens. Data visar också att omfattning och riktning av råmjölk foder modulerande effekter är region-beroende och att i vissa regioner, de speglar OT effekter visas tidigare i tarmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna studie godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittéer vid Columbia University och New York State Psychiatric Institute.

1. vävnad förberedelse

  1. Beställa tidsinställda dräktiga råttor från leverantör.
  2. Följ tidsinställda dräktiga råttor genom att observera deras växande abdomens veckorna efter deras ankomst och därefter letar efter valpar på förväntat leveransdatum genom att inspektera buren varje 2 h tills leverans börjar.
  3. Ta bort pups med en behandskade hand genom stjärten innan deras första foder för ovaccinerade valpar (ingen vit mjölk mage är uppenbar när man tittar på buken) eller efter första matningen för primade valpar (varvid en vit mage kommer att synas på deras buken) som beskrivs i timeli Ne (Figur S1).
    Obs: Det första råmjölken fodret är kallas priming pup; Således är en pup ovaccinerade tills första matningen, efter som de är råmjölk-primade.
  4. Snabbt halshugga unanesthetized pup med skarp, ren kirurgisk sax.
  5. Ta bort hjärnan genom att skära huden ner mittlinjen och ovansidan av skallen till näsan. Sedan använder tången, försiktigt bända bort benet för att exponera hjärnan (figur 1A) och lokalisera den bregma, markera det med en penna som ben plattorna avlägsnas (figur 1B).
  6. Snabbt placera hela hjärnan i en polymethyl form hjärnan mögel i rumstemperatur i koronala skivning i rumstemperatur (figur 1 c).
  7. Utan dröjsmål göra 500 mm tjocka skivor med en färsk rakblad. Lägg skivor rostralt om stjärtfenan i en petriskål att bibehålla orienteringen av sektioner (figur 2).
  8. Snabbt lägga till konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF; 1,0 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 118,6 mM NaCl, 3,0 mM KCl, 203.3 mM MgCl2-6 H2O) utan glukos och inkubera skivor för 60 min vid 28-30 ° C, ständigt under omrörning på en roterande blandare metaboliskt och differentially utmana den ovaccinerade kontra råmjölk-primade vävnader.
  9. Identifiera hjärnan atomkärnor som krävs för att stämpla med en hjärna atlas33 och anatomiska landmärken på avsnittet vävnad. Placera denna skiva med atomkärnor av intresse i en petriskål och flytta den till mikroskopet dissekera.
  10. När visualiseras, snabbt stansa ut 4 av 6 olika kärnor med en coring verktyg, välja storlek till bästa punch kärnan i fråga och konsekvent mellan prover (figur 2).
    Obs: Återstående hjärnan segmentet har nu ett hål där hjärnvävnaden togs bort. I denna studie, censurerade vi följande atomkärnor med de nedanför koordinater. Alla anteriort/posteriort (A / P) koordinater är från Bregma (utom NTS, som är med hänvisning till den Calamus Scriptorius). Alla dorsala/ventrala (D/V) koordinater är från ytan av cortex (utom NTS, som är från ytan av medulla). Följande koordinater inkluderar A / P, medialt/lateralt (M/L) och D/V i mm: 1) ensam tarmkanalen nucleus (NTS, A / P, 0,4 till 0,8; L, ± 0,2; D/V, 0,3 (från ytan av medulla), 2) paraventricular nucleus (PVN, -0,8; ± 0,2; 0), 3) supra-optic nucleus (SON, -1,1; ± 1,4; 4.3), 4) cortex (CX, partiell cortex område 1, -2,8; ± 1,5; 0,6), 5) striatum atomkärnor (STR, -0,0; ± 1,6; 1,8), och 6) mediala preoptic Nucleus (MPO, -0,6; ± 0,2; 4.2).
  11. Snabbt doppa stansade atomkärnor i 0,06 mL iskallt, protein utvinning buffert innehållande proteashämmare och fosfatas-hämmare för 60 minuter (se steg 2.3).

2. protein utvinning

  1. Förbereda protein utvinning lösningen med hjälp av protein lysis kit (Tabell för material) dagen före förväntad pup leverans.
  2. Tina (på is) den frysta (-20 ° C) vattenlösningen av proteas och fosfatas hämmare av Lys buffert kit och placera lyseringsbuffert och DMSO lösning av de proteaser/fosfataser-hämmare på is.
  3. Lägg till 1,85 mL lyseringsbuffert i en ren, iskall 15 mL tub. Lägg sedan till 0.1 mL vattenlösning av hämmare och 0,05 mL av DMSO-upplöst-hämmare. Slutligen, cap och kort vortexa röret och hålla den vid-20 ° C fram till användning.
  4. Etikett 24 ren mikrocentrifugrör (0,5 mL) för Lys förfarandet. Designera 12 tuber per hjärnan för råmjölk-ovaccinerade gruppen (U) [6 vänster (L) och 6 rätt (R) hjärnan atomkärnor] och etikett enligt atomkärnor akronym, sida och villkor (t.ex., NTS-L-U, NTS-R-U, etc.). Märk den andra gruppen av 12 tuber för råmjölk-primade prover.
  5. Märk två ytterligare uppsättningar av rör som gjort steg 2,4 för lager protein extrakt (med 1,5 mL Eppendorf-stil rör) och för den första uppsättningen av Provberedning (med 0,5 mL rör). Hålla dessa rör i två separata, märkt frysning lådor (var och en utformade för 100 rör). En ruta kommer att användas för ovaccinerade proverna och den andra för de primade proverna.
  6. Tina lysis lösningen på is den dagen som valparna levereras, och medan ruvning hjärnan skivor i ACSF, alikvotens 0,06 mL lysis lösning in i Lys förfarande rören (från steg 2,4) och lägga atomkärnor slag och inkubera i ice för 60 min.
  7. Centrifugera ruvade lyserat atomkärnor i 30 min i en kyld mini Centrifugera vid 14000 rpm (10 000 x g) och sug noga ut 0,055 mL av supernatanten med korrekt inställda pipett. Överför supernatanten till nedkylda 1,5 mL lager rören (från steg 2.5) och sätta dem på isen. Innan frysning (vid-20 ° C) protein lager rören, överför 0,012 mL av supernatanten till 0,5 mL nedkylda rören för den första provberedningen (från steg 2.5) och lämna dem på isen.

3. provberedning för i-kapillär Protein mätning

  1. Använda ett kit och förbereda reagenser för separation enligt tillverkarens anvisningar. Lägga till 0,003 mL master-mix reagens varje 12 prov i 0.5 mL märkt rör (från steg 2.5) på is som innehåller 0,012 mL extrakt av protein.
  2. Slå på blocket uppvärmning till 95 ° C och tillsätt 0,004 mL reagens bereddes i steg 3.1 till en biotinylerade molekylvikt (MW) stege i ett rör med 0,016 mL avjoniserat vatten. För att denaturera de stege och prover, placera stege röret och de 12 proverna av ovaccinerade protein extrakt i värmen blockera vid 95 ° C i 5 min och lagra dem vid 4 ° C fram till användning.
  3. Upprepa steg 2.0 och 3.2, från protein utvinning för provberedning, för atomkärnor stansade från råmjölk-primade råttor.

4. elektrofores förberedelse

  1. Tina den biotin märkning reagens (lagras i en frys vid-80 oC) på bänken och förbereda protein upptäckt kit på isen vid 4 ° C efter tillverkarens anvisningar.
  2. Blanda 0,15 mL urin med 0,15 mL väteperoxid och ladda 0,01 mL i 25 brunnar (rad E, brunnar 1-25) av plattan för automatiserad västra maskinen. Ladda 0,008 mL streptividin-HRP från kit i brunnar D1 till D25
  3. Ladda 0,01 mL av antikropp spädningsvätska lösningen i brunnar C1 till C25 och B1.
  4. Snurra den 24 protein prov och stege rör kort (2-3 sekunder) i en minicentrifuge till poolen ner avdunstat vatten från tube mössor.
  5. Ladda 0,003 mL 12 ovaccinerade prover i brunnar A2 A13, 0,003 mL 12 råmjölk-primade prover i brunnar A14 till A25 och 0,005 mL av biotinylerade stege till väl A1.
  6. Lämna raden F tomt och läsa in 0,45 mL tvättbuffert i varje av de 5 fack i varje 3 rader nedanför rad F. omslaget plattan med dess plast lock för att undvika avdunstning under de återstående procedurerna.
  7. Kort vortex den tinade biotin märkning reagens och tillsätt 0,15 mL reagens till dess utsedda röret; sedan lägga till 0,15 mL av totalprotein beredning agent och blanda dem till homogenitet.
  8. Ta bort locket från plattan och ladda 0,01 mL av agenter 1 och 2 i brunnar B2 till B25. Täcka plattan och centrifugera det i 10 min vid 1 000 x g ta bort eventuella luftbubblor från de olika lösningarna. Använd en tom platta i centrifugen för balans.

5. elektrofores

  1. Medan plattan snurrar, öppna en fil i automatiserade västra maskin-anslutna datorn genom att ange i dropdown sida från ”fil” för att köra en totalprotein analysen och att klicka på respektive plats.
  2. Kommentera proverna med brunn i datorn. Ta sedan bort plattan från centrifug ta bort locket och dra försiktigt av aluminium locket från separation lösning facken.
  3. Placera plattan i automatiserade västerländska instrumentet, lossnar locket från rutan kapillär patron, sätt i bläckpatronen i dess anvisad plats och Stäng luckan.
  4. Klicka på knappen ”Kör”, och när du uppmanas med typ av analysen (”totalprotein”), Skriv in namnet på proverna (till exempel ”ovaccinerade 2-13 och råmjölk-primade 14-25”). Klicka ”OK”, och när du uppmanas av aktiverade körningsdatum och ID-nummer av filen kör, anteckna när körningen avslutas.
  5. I slutet av körningen (170 min efter start), öppna dörren instrument, ta kapillär tonerkassetten och kasta den i sharps förfogande. Kassera plattan i biologiskt material förfogande.
  6. Klicka på ikonen separation kurvor på sidan analys av kör filen och kontrollera att alla prover har kört ordentligt och visar flera protein kurvor i alla kapillärer.

6. analys av signalering proteiner

  1. I en märkt 1,5 mL tub, tillsätt 0,003 mL kanin anti phospho-eIF2a (p-eIF2a) antikropp och avbryta det i 0,3 mL (spädning 1: 100) i antikropp spädningsvätska från lämplig upptäckt kit. Sedan, hålla den på is.
  2. Märka en urin röret och lägga till 0,15 mL urin och 0,15 mL peroxid från denna upptäckt modul kit och fördela 0,01 mL i brunnar E1 till E25 färska, automatiserade västra platta.
  3. Fördela 0,01 mL för sekundärt anti kanin antikroppar i brunnar D2 till D25, och Lägg till 0,01 mL streptividin-HRP från kit väl D1.
  4. Fördela 0,01 mL av den primära antikroppen (från steg 6.1) i brunnar C2 C25, och Lägg till 0,01 mL antikropp spädningsvätska 2 lösning brunnar C1 och B1 till B25.
  5. Lämna raden F brunnarna Tom och fyll 0,45 mL av tvättlösning i de 5 fack 3 rader under raden F.
  6. Kort snurra de kylda proverna för 3 s, och lägga till 0,003 mL av varje prov i rad A i den ordning som de lades till för totalprotein analysen, start från A2 till A25. Lägg till 0,005 mL av biotinylerade MW stege att väl A1 och täcka plattan.
  7. Centrifugera plattan som gjort steg 4,8. Medan plattan snurrar, öppna (i automatiserade Western-associerade program och dator) en ny fil och ange i dropdown sidan från ”fil” för att köra en molekylär storlek analys genom att klicka på respektive plats.
  8. Test på sidan skriver provet namnen i varje kapillär och skriv namnet på den primära antikroppen i tilldelade plats och den sekundära anti-kanin-antikroppen undertill.
  9. I slutet av centrifugering, upprepa steg 5.3 – 5.5, förutom namnet på filen kör denna tid bör vara ”p-eIF2a på ovaccinerade 2 – 13 och råmjölk-primade 14-25”.
  10. Efter elektrofores avskiljandet, kontrollera filen kör för immun-reaktivitet toppar av antigener på storlekar av 40 – 43 kDa. Om MW toppar denna storlek saknas, Högerklicka nedanför kurvan och ange inuti den nedrullningsbara listan lägga till MW till toppen, vilket säkerställer att storlek och godtycklig kvantitet nedanför kurvan registreras.

7. behandling resultaten

  1. Öppna en kalkylbladsfil för totalprotein kör i automatiserade västra kör filen och ange ett ID-nummer.
  2. Öppna filen kör totalprotein analysens på sidan analys på den kurva läget och markera alla topparna i enskilda kapillärerna. Kopiera och klistra in dem i kalkylbladet och sedan summera områdena under kurvan för alla toppar som registrerats i hela kapillären.
  3. I en separat kolumn, ordna den totala mängden protein varje kolumn med kapillär nummer, namn på respektive hjärnan atomkärnor och de ID-numren kör filer.
  4. Öppna ett kalkylblad för p-eIF2a antigen, och i en enda kolumn, spela in arean under kurvan från varje kapillär side-by-side med dess respektive kapillär nummer, namn hjärnan nucleus och ID-nummer av kör filen.
  5. Kopiera kolumnen totalt protein (parallell till de p-eIF2a kurva kvantiteterna) till en tredje kalkylblad och beräkna p-eIF2a:total protein nyckeltal i en tredje kolumn.
  6. Samla in resultat från steg 4 till 6 för varje hjärna nucleus, ordna dem i grupper av atomkärnor och generera ett stapeldiagram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunoreaktivitet i förhållande till totalt protein representativa band visar att det finns hjärnan atomkärnor med mycket låg skördade protein. Detta kräver användning av automatiserade Western blot tekniken, som är mycket känsliga jämfört den kanoniska Western blot. Detta tillvägagångssätt kan köras med fortyfold mindre protein per kapillär jämfört med den per-lanen i Western blotting.

Differentiella effekter av råmjölk grundning på BiP nivåer i hjärnan kärnor

Koronalt avsnitt av råtta hjärnor skördats före den första råmjölken utfodring (ovaccinerade) och efter första utfodring (primas). Proverna var fractionated av kapillärelektrofores (på WES) och proteiner kvantifierades med hjälp av kit för i-kapillär totalprotein färgning (se protokoll). Ytterligare immun kapillär fraktionering på den automatisera väst också identifiering av respektive proteinantigener. I figur 3Avisas representativa BiP proteinuttryck i den övre panelen, med motsvarande totala proteinet visas nedan. BiP är en ER förkläde protein. I figur 3Bpresenteras quantitated immunoreactivities av stapeldiagram i förhållande till de motsvarande totala proteinet.

Inom de ovaccinerade vävnadsproverna, BiP nivåer i NTS var betydligt högre jämfört med övriga regioner (p < 0,05, n = 4 kärnor). Grundning av gut vävnad med råmjölk hade en motsatt effekt i NTS, jämfört med ökad BiP i andra regioner, i förhållande till ovaccinerade vävnad (figur 3B). Priming minskade BiP i NTS (figur 3B) och hade ingen effekt på PVN och SOPT. Priming ökade dock BiP i CX, STR och MPO i förhållande till ovaccinerade vävnad. Denna data antyder att BiP nivåer i de olika testade hjärnan kärnorna svarar olika på gut priming och att det inte ännu någon påvisad överhörning mellan de olika atomkärnor som testas.

Differentiella effekter av råmjölk grundning på ElF2a och p-elF2a nivåer i hjärnan kärnor

Hjärnan vävnadsprover var beredd, analyseras och kvantifieras som visas i figur 3A och 3B. Som med BiP nivåer (figur 3B), elF2a och p-elF2a var nivåer i NTS förhöjda i ovaccinerade skick i förhållande till andra kärnor (figur 4B och 4 C). Som visat med BiP nivåer, var responsen i NTS priming av gut vävnad med råmjölk motsatt den i andra kärnor. Nivåerna av både elF2a och p-elF2a i NTS minskade i förhållande till ovaccinerade vävnad. I alla andra testade kärnor, priming ökade nivåer i elF2a och p-elF2a i förhållande till ovaccinerade vävnad (figur 4B och 4 C).

Fosforylering av elF2a av Kinas GCN2 i NTS och PVN efter råmjölk priming

Hjärnan vävnadsprover var beredd, analyseras och kvantifieras som visas i figur 3. Grundning död p-PKR i PVN (χ2 p = 0,025), till skillnad från i alla andra regioner där det ökades. I motsats till p-elF2a resultaten (figur 4 c), nivåer av p-PKR var låga i ovaccinerade prover i förhållande till primade prover i NTS (figur 5A). Fosforylering av elF2a är oftast katalyseras genom dess PKR-Kinas svar på virus34 och OT i tarmen, som tidigare visats11. Det faktum att p-PKR nivåer var mycket låg i ovaccinerade kontra primade NTS (i förhållande till andra kärnor, figur 5A) starkt tyder dock på att en annan kinase måste involveras i phosphorylating elF2a (figur 4 c). Därför testades GCN2 nivåer i NTS och PVN eftersom det är också en känd Kinas elF2a35. Nivåer av p-GCN2 (aktiv form) var högre i ovaccinerade prover jämfört med primade prover i NTS och PVN (figur 5B) och GCN2 (inaktiv form), jämfört med p-GCN2, var omvänt uttryckt i PVN (figur 5 c). pGCN2 i NTS (figur 5 c) uttrycktes omvänt till pPKR (figur 5A) i både ovaccinerade och grundmålade NTS. I primade vävnad, p-eIF2a var betydligt lägre i NTS än i alla andra regioner i hjärnan [PVN (p < 0,01), sonen (p < 0,01), CX (p < 0,01) och MPO (p = 0,02)]. Detta indikerar att pGCN2, snarare än pPKR, var ansvarig för eIF2 hämning i NTS.

Råmjölk priming hämmar NF-kB i CX, STR och MPO

Ovaccinerade figur 6A visar att IkB nivåer var betydligt högre i SON prov vs primas prov. IkB nivåer i SON, CX, STR och MPO trended högre i samma riktning. I figur 6 cvar NF-kB nivåer i CX, STR och MPO signifikant högre i primas jämfört med ovaccinerade vävnad. NF-kB nivåer var dock betydligt lägre i primade NTS vävnad, vilket tyder på att råmjölk hade en distinkt antiinflammatorisk effekt på hjärnregionen. Cytosoliska NF-kB var högre (balanserad) i ovaccinerade NTS prover, medan dess hämmare IkB var låg och oförändrad i primade prover. Detta tyder på att en distinkt antiinflammatorisk mekanism reglerar NF-kB i NTS. Denna näringsrika insufficiens stress effekt är förenliga med nuvarande slutsatser att stress markörer BiP och p-eIF2a regleras både av närvaron av råmjölk priming (figur 3 och 4, respektive), också visat i tidigare BiP och p-elF2a resultat10. Anledningen till IkB och NF-kB i NTS jämfört med CX, STR och MPO distinkta svar är ännu inte helt klarlagt. Det är dock förenligt med iakttagelsen att NTS, som förmedlar signaler från tarmen till hjärnan, kan spela en avgörande roll i att svara unikt och motsatt jämfört med andra regioner i hjärnan jämfört med perifer inflammation36. Nivåerna av IkB i CX, STR och MPO var låg (figur 6A), jämfört med höga nivåer av NF-kB i samma områden (figur 6 c). Medan denna slutsats motsäger uppenbarligen förutsättningen att IkB bindande och behålla NFkB i cytosolen, olika beräkning av data som kombinerar och jämför alla primade prover i CX, STR och MPO använda regression analys visar att NF-kB mycket korrelerar med IkB (p < 0,0001, n = 24)

Figure 1
Figur 1: dissekeras neonatal råtthjärna. (A) dissekerade hjärnan visas med ben bort rostralt om bregma. (B), hjärnan visas efter en linje har tagits på bregma, varefter de återstående benplattor togs bort. (C) hjärnan visas i en polymethyl form hjärnan mögel strax före att vara skivad med ett rakblad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: hjärnan skivor ordnade från rostralt om stjärtfena med stämplingar (röda cirklar). Förkortningar: CX: cortex, tinningloben; MPO: mediala preoptic område. NTS: nucleus tractus solitaries; PVN: paraventricular nucleus; SON: supraoptic kärna; och STR: striatum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: BiP/GRP78 svar i NTS är inverterad som andra kärnor. (A) representant BiP proteinuttryck i den övre panelen i förhållande till den totala protein som presenteras i panelen nedan. Observera att den totala protein tätheten i olika kapillärerna är heterogena, och dessa används för att utjämna respektive BiP uttrycket per protein i panelen B. (B) visas är den genomsnittliga BiP i förhållande till totalt protein i hjärnan kärnor av ovaccinerade prover ( blå) kontra råmjölk-primade prover (brun). Asterisker respektive färger utse signifikanta skillnader (p < 0,05, n = 4 kärnor) mellan BiP i NTS kontra BiP i andra atomkärnor. BiP uttryck i ovaccinerade kontra primade prover i NTS inverteras betydligt de STR (χ2 p = 0,028, n = 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: aktiva och inaktiva eIF2a (p-eIF2a) svar på råmjölk grundningen jämfört med ovaccinerade prover i NTS inverterad som andra kärnor. (A) representativa eIF2a och p-eIF2a protein uttrycken visas i de övre panelerna. Totalprotein lanesna presenteras vid den nedre panelen. (B) visas är den genomsnittliga eIF2a av 4 prover uttryckt i förhållande till totala protein (från nedre panel A) i hjärnans kärnor av ovaccinerade prover (blå) kontra råmjölk-primade prover (brun) och (C), inaktiv form av eIF2a (p-eIF2a). Asterisker respektive färger utse signifikanta skillnader (p < 0,05, n = 4 kärnor) mellan båda eIF2a bildar i NTS kontra respektive nivåer i andra kärnor. Aktiva eIF2a uttryck i ovaccinerade kontra primade prover i NTS inverteras betydligt till dem i CX, STR och MPO (χ2 p < 0,05 kontra alla tre kärnor, n = 4). Felstaplar representera standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: NTS uttrycker eIF2a kinase p-GCN2 i enlighet med p-eIF2 nivå och omvänt till p-PKR nivå. (A) nivån på p-PKR (aktiverat dsRNA kinase av eIF2a) uttrycks i ovaccinerade kontra råmjölk-primade NTS omvänt till 1) nivån på p-PKR i PVN (χ2 p = 0,025) och 2) dess beräknade riktade substrat eIF2a efter dess fosforylering (till p-eIF2a, figur 2 c). Observera att mönstret av p-PKR i SON, CX, STR och MPO av ovaccinerade kontra råmjölk-primade prover passar de respektiva mönster av p-eIF2a från figur 2 c. (B) aktivt eIF2a kinase (p-GCN2) i unprimed kontra primade NTS prover följer ett liknande mönster av p-eIF2a uttryck från figur 2 c och en omvänd mönster av pPRK uttryck från figur 3A2 p = 0,028). C = genomsnittlig nivåer av inaktiva GCN2. Felstaplar representera standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: cytoplasmiska uttryck av NF-kB och IkB i hjärnan kärnor från ovaccinerade och råmjölk-primas gut prover. (A) Genomsnittlig cytoplasmiska uttryck för IkB i förhållande till totalt protein (från panel C) på angivna hjärnan atomkärnor. (B) representativa cytoplasmiska band IkB protein presenteras i den övre panelen och totalprotein täthet i respektive körfält i den nedre panelen. (C) Genomsnittlig cytoplasmiska uttryck för NF-kB i förhållande till totalt protein (från panelen D) på angivna hjärnan atomkärnor. (D) representativa cytoplasmiska band av NF-kB band presenteras i den övre panelen och cytoplasmiska totalprotein täthet i respektive körfält i den nedre panelen. Färgade asterisker utse betydande skillnader mellan angivna prover (p < 0,05, n = 4). Observera att cytoplasmiska NF-kB är högre i råmjölk-primade CX, STR och MPO än i hypotalamus kärnor NTS, PVN och SON i oenighet med nivåer av NF-kB-hämmare (IkB). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Schematisk jämföra hypotes om OT signalering i råmjölk-primade tarmen och hjärnan regioner. (A) råmjölk OT i enterocyter aktiveras dess receptor via direkt interaktion med den OTR, minska inflammation via ökad IkB nedströms signalering. Protein översättning hämmas genom att öka p-PKR, vilket minskar elF2a aktivitet genom fosforylering. Homeostasen återställs via ökad BiP gen uttryck13,37. (B) Neuronal eller cirkulatorisk OT aktiverar dess receptor i CS, STR och MPO regioner av hjärnan, downregulating inflammation och protein översättning via samma molekyler som tarmen (se panel A). (C) den hypotetisk effekterna av råmjölk grundning i regionen NTS i hjärnan är distinkta och motsatsen från dem i paneler A och B. GCN2, som är känslig för aminosyra leverans, ökar både eIF2a och protein översättning. Samtidigt att låga nivåer av IkB NF-kB att ange kärnan och framkalla inflammation. Observera att BiP agerar på samma sätt om du vill återställa homeostasen i tarmen och i NTS i hjärnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure
Kompletterande Figur1: Schematisk visar protokollet tidslinjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En teknik för lokalt av diskreta, OTR-rika hjärnan kärnor i hjärnans neonatal råtta presenteras i denna uppsats. Det är väl känt att nervceller är högt specialiserade, även inom välkarakteriserad kärnor i hjärnan. Mycket reproducerbara sätt att isolera specifika OTR-rika atomkärnor kan robust hypotesprövning. Med hjälp av automatiserade Western blotting, förbättrades konsekvens och reproducerbarheten för resultaten ytterligare. En begränsning av denna teknik är fortfarande blygsam hjärnan punch variabilitet; Denna teknik representerar ett förskott över encelliga, hela hjärnan eller hjärnan slice metoder. Encelliga strategier försvåras genom att tillhandahålla mycket begränsad Snapshots. Använda hela hjärnan, kan eventuella resultat spädas om effekten är begränsad till en hjärnregionen eller neuronala undertyp. Hjärnan slice metoder utan lokalt kan införa genomgripande variation i resultat inom enbart mikrometer i ett segment, vilket är särskilt problematiskt för hypotalamus i denna studie på grund av snäva klustring av olika kärnor. Använda en standardiserad punch och hjälp av ett mikroskop, reducerades variabiliteten i protein mätningar.

I området i närheten finns det flera kritiska steg inom detta protokoll. Dessa inkluderar anslutning till tidpunkten för vävnad skörd med avseende på det första fodret, använder en minimal mängd protein utvinning buffert, inkubation av hjärnan skivor i ACSF så att molekylär hämmare eller stimulantia kan användas och använder en känslig immun-elektrofores enhet. Möjliga ändringar inkluderar val av reagenser för inkubation och varaktighet inkubation och förlänger tiden till ovaccinerade svält för att jämföra hjärnor vid motsvarande tidpunkter. Viktiga begränsningar inkluderar förekomsten av vissa icke-neuronala celler (även under denna mycket tidig neonatal period) och ett begränsat antal prover som kan framställas från en kull av nyfödda i en dag. Detta tillvägagångssätt är dessutom helt beroende på när valparna föds. Med avseende på befintliga metoder bedöms genuttrycket i hjärnan vid denna ålder mer bekvämt och vanligtvis på transkriptionell nivå. Men för cell signalering analys, är metoden proteomiska avrättades av core facility utrustning dyrare än de stationära automatiserade instrument. Den konventionella Western blot-metoden kräver mycket mer protein, tar flera dagar att slutföra, och omfattar flera manipulation steg av teknisk arbetskraft. Denna automatiserade tillvägagångssätt kräver 0,8 µg protein per kapillär, en gång lastat in i instrumentet alla stegen utförs utan mänskliga händer störningar och tar 2 tim och 50 min att slutföra körningen. Denna teknik kan användas för att studera omedelbara postnatala hjärnans utveckling hos råttor och brett utbud av genmanipulerade musmodeller.

Med denna teknik, undersöktes effekterna av OT på cellnivå, särskilt i den mycket kritiska perioden mellan födelse och utfodring, när OTR uttrycks maximally i epitel8. OT modulerande effekter på cellen signalmolekyler i gut celler, både i en cell linje37 och invivo13, visades tidigare. I den aktuella studien bedömdes de effekter som observerats i gut celler i hjärnan som är rik på OTR. Uttryck för BiP/GRP78 och p-eIF2a var uppreglerad i ovaccinerade (i enlighet med en förväntad reaktion på stress) och nedreglerade i primade NTS vävnad (i enlighet med ett försvagat reaktion på stress), medan NF-kB var hög och stabil i båda villkoren 38. uttryck av BiP och NF-kB var desamma i de andra testa regionerna i både ovaccinerade och grundmålade. eIf2a var fosforyleras av dsRNA beroende kinase (pPKR) i SON, CX, STR och MPO. Dock var i NTS, och i mindre utsträckning i PVN, eIf2a fosforyleras av ett annat kinase, allmän kontroll nonderepressible-2 tyrosinkinashämmare (GCN2). En schematisk föreställande en hypotes om skillnader i signalering i hjärnan och tarmen som framkallas av råmjölk exponering presenteras i figur 7.

Denna lokalt teknik gör det möjligt att testa hypoteser som relaterade till effekterna av den första råmjölken foder på stressrelaterade signalering i diskreta OTR-rika kärnor i neonatal hjärnan. Dessa data tyder på att stress modulerande mekanismerna tidigare observerade hos nyfödda gut enterocyter speglas i delar av hjärnan rik på OTR, vilket framgår av ökad cytosoliska äganderättsförbehåll NFKB (PVN, SON CX, STR och MPO). Resultaten indikerar också att NTS och PVN utnyttja en annan fosforylering mekanism från andra regioner som kan vara refraktära mot effekterna av näringsämnen insufficiens. Data visar sammantaget att cellsignalering i hjärnan associerade med näringsämnen och hormonell insufficiens under de första timmarna följande födelse är liknande till cell signalering i tarmen på samma villkor. Dessa data stöder vikten av bröstmjölk vid tidpunkten för födelsen för stress modulering i både tarmen och hjärnan. Dessa resultat understryker behovet av ytterligare utforskning av effekterna av råmjölk på hjärnans funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Manon Ranger och Alexandra Schulz för deras hjälp i utarbetandet av detta protokoll.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2, (4-5), 173-183 (2009).
  2. Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123, (3), 715-724 (2004).
  3. Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327, (4), 618-629 (1993).
  4. Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. (2017).
  5. Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
  6. Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine". Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32, (4), 163-180 (2012).
  7. Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307, (8), G848-G862 (2014).
  8. Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512, (2), 256-270 (2009).
  9. Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636, (1), 111-115 (2009).
  10. Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23, (9), 1007-1013 (2009).
  11. Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19, (4), 465-477 (2014).
  12. Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432, (3), 466-471 (2013).
  13. Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487, (1), 47-53 (2017).
  14. Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69, (3), 407-415 (2010).
  15. Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells? Pediatrics. 119, (3), e724-e732 (2007).
  16. Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33, (6), 821-826 (1986).
  17. Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5, (1), 205 (2016).
  18. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3, (1), 79-83 (1979).
  19. Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).
  20. Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10, (3), (2011).
  21. Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55, (2), 139-148 (2009).
  22. Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104, (4), 632-640 (2011).
  23. Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4, (12), 1500-1513 (1998).
  24. Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300, (2), R222-R235 (2011).
  25. Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
  26. Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).
  27. Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14, (4), 311-329 (2013).
  28. Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22, (6), 654 (2010).
  29. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85, (1-3), 1-17 (2000).
  30. Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886 (2016).
  31. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283, (2), 248-268 (1989).
  32. Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234, (3), 344-364 (1985).
  33. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. (1997).
  34. Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81, (21), 11908-11916 (2007).
  35. Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284, (37), 25254-25267 (2009).
  36. Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
  37. Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860, (2), 402-411 (2016).
  38. Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1, (3), a001271 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics