Valutazione Stress cellulare e l'infiammazione nei Nuclei di cervello che secerne l'ossitocina discreti nel ratto neonatale prima e dopo la prima poppata di colostro

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Immunology and Infection

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Summary

Qui, presentiamo un protocollo per isolare i nuclei del cervello nel cervello del ratto neonatale in concomitanza con la prima alimentazione colostro. Questa tecnica permette lo studio dello stress nutritivo insufficienza nel cervello come modulata dalla segnalazione del enterocyte.

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Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

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Abstract

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare i nuclei del cervello ricco di ossitocina-recettore nel cervello neonatale prima e dopo la prima poppata di colostro. L'espressione di proteine note per rispondere agli stress metabolico è stato misurato in cervello-nuclei isolati mediante Western blotting. Questo è stato fatto per valutare se insufficienza metabolica indotta da stress in nutrienti nel corpo innescato lo stress di un neurone. Precedentemente abbiamo dimostrato che l'insufficienza dei nutrienti in neonati suscita lo sforzo metabolico nell'intestino. Inoltre, l'ossitocina colostro modula indicatori di risposta, l'infiammazione e l'autofagia stress cellulare nei villi dell'intestino di ratto neonato prima e dopo la prima poppata. Indicatori di proteina connessi con lo stress del reticolo endoplasmatico di segnalazione [ER chaperone immunoglobulina proteina (BiP), traduzione negli eucarioti iniziazione fattore 2A (eIF2a) ed eIF2a chinasi della chinasi di proteina R (p-PKR)], così come due infiammazione-segnalazione proteine [fattore nucleare-KB (NF-kB) e inibitore κB (IkB)], sono stati misurati nei nuclei del cervello neonato [nucleo del tratto solitario (NTS), nucleo paraventricolare (PVN), nucleo supra-ottica (figlio), corteccia (CX), nuclei del corpo striato (STR), e nucleo mediale preottica (MPO)] prima del primo feed (disinnestato da colostro) e dopo l'inizio della professione infermieristica (innescato da colostro). Espressione di BiP/GRP78 e p-eIF2a erano sovraregolati in unprimed e downregulated nel tessuto NTS innescato. NF-kB è stata mantenuta (alta) nel citoplasma CX, STR e MPO, considerando che NF-kB era più bassa e identicamente in NTS, PVN ed il figlio in entrambe le condizioni. Il collettivo BiP e p-eIF2 risultati sono coerenti con una risposta allo stress. eIf2a è stato fosforilati da chinasi dsRNA (p-PKR) nel figlio, CX, STR e MPO. Tuttavia, in NTS (e in misura minore nel PVN), eIf2a è stato fosforilato da un'altra chinasi, chinasi di nonderepressible-2 controllo generale (GCN2). I meccanismi di stress-modulanti precedentemente osservati negli enterociti neonato intestino sembrano riflettersi in alcune regioni del cervello di OTR-ricco. La NTS e PVN può utilizzare un meccanismo di fosforilazione differenti (sotto sottoalimentazione) da altre regioni ed essere refrattario all'impatto dell'insufficienza dei nutrienti. Collettivamente, questi dati suggeriscono che le risposte del cervello allo stress nutritivo insufficienza sono compensate da segnalazione da colostro-innescato enterociti.

Introduction

In contrasto con la nostra comprensione dello sviluppo iniziale del cervello che si verificano nel corso dei giorni a settimane dopo il parto, relativamente piccolo è conosciuto circa la miriade di cambiamenti dinamici che si verificano nelle prime ore di vita in ratti. Delle sfide principali è stata la piccola dimensione del cervello del ratto neonatale e un requisito per strumenti ad alta tecnologia isolare regioni discrete del cervello o singole cellule. Studi valutano spesso gene trascrizione e traduzione di non1,2, che non dà una solida comprensione dei livelli funzionali di molecole di segnalazione attivate. Altri esaminare l'espressione usando immunohistochemistry a regioni del cervello di riferimento, che non consente per la quantificazione dell'espressione livelli3. Nessuno studio finora ha esaminato l'attivazione di segnalazione vie connesse con il colostro primo dei ratti alimentare nelle regioni discrete del cervello, che richiede isolamento rapido e sacrificio e misura di espressione della proteina e fosforilazione della proteina mediante Western macchiare. Mentre il cervello microdissection viene eseguita su più vecchi e più grandi cervelli, non abbiamo individuato un riferimento eseguendo un pugno di cervello non-singolo-cellula in un cervello di P0. Questa carta presenta un protocollo per l'isolamento di ristrette regioni del cervello neonatale utilizzando una tecnica di pugno relativamente low-tech e un Western blotting procedura per misurare l'espressione di proteine in campioni relativamente piccoli. Questo protocollo può essere adatto per domande di ricerca che richiedono la valutazione dell'espressione della proteina e modificazioni post-traduzionali (ad es., fosforilazione) in regioni relativamente ristrette di piccoli cervelli di qualsiasi specie, a condizione che il utente può identificare visivamente la regione del cervello di interesse con un Atlante e identificabili luoghi d'interesse.

Questa tecnica è stata sviluppata per comprendere i cambiamenti che si verificano nel cervello a seguito di colostro primo dei ratti neonatali, feed, che è ricca di ossitocina (OT). OT è stato a lungo conosciuto per la sua capacità di stimolare la contrazione uterina e di delusione di latte. Tuttavia, OT ora è conosciuto per svolgere una vasta gamma di ruoli nella regolazione di molte funzioni corporee e comportamenti4. Ad esempio, OT si oppone lo stress e l'infiammazione in combinazione con comportamenti affiliativi adattivi5, ritarda lo svuotamento gastrico e rallenta il transito intestinale. Sono stati identificati recettori OT (OTR) in neuroni enterici ed epitelio intestinale6,7,8. Gli effetti gastrointestinali di OT sono particolarmente importanti per il bambino durante il primo periodo postnatale. Per esempio, l'allattamento al seno è associato con la consegna di quantitativi notevoli di OT per l'intestino neonatale9,10, e i dati mostrano che l'OTR è pesantemente overexpressed in villi perfusioni durante il latte lattante periodo8.

Esperimenti in vitro utilizzando una linea cellulare di intestino hanno dimostrato a livello cellulare che l'ossitocina modula importanti molecole nello stress signaling pathway11,12 e svolge un ruolo regolatore nella traduzione delle proteine 12. questi studi suggeriscono che i componenti del latte, tra cui l'ossitocina esogena dalla madre, sono importanti in unfolded protein response in neonati per ridurre stress cellulare13.

Studi in vivo ed ex vivo hanno dimostrato che il colostro OT modula i marcatori di autofagia, infiammazione e la risposta di stress cellulare nei villi dell'intestino di ratto neonato. Enterociti neonati soffrono stress cellulare sostanziale sul loro lato luminal quando l'intestino è esposto simultaneamente a microbiota dalla madre nel colostro14,15 e numerose proteine, tra cui gli ormoni quali OT9 , 10 , 16.

Gli effetti di OT sul cervello sono stati studiati17. Tuttavia, i meccanismi di segnalazione OT ha dimostrati nell'intestino durante il periodo postnatale precoce non sono stati studiati nel cervello. In questa carta, un metodo per isolare nuclei discrete del cervello nel tronco cerebrale neonatale del ratto e ipotalamo usando l'elettroforesi viene utilizzato per profilare regioni isolate del cervello. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di acquisire lo stato di segnalazione delle cellule nelle aree del cervello più vicino possibile alla nascita, prima e dopo il primo latte lattante, nel tessuto cerebrale con l'indice più basso di neuroni e glia. La spiegazione razionale per lo sviluppo di questa tecnica è che permette l'isolamento rapido delle regioni limitate, microscopico cervello neonatale cuccioli con una collezione più omogenea dei neuroni per studi ex vivo utilizzando un automatizzato macchiarsi occidentale metodologia, offrendo risultati altamente coerenti su relativamente piccoli campioni sezionati. Una lacuna del precedente lavoro comprende più di dissezione lorda (fettine di cervello o cervello intero) e più vecchi animali18,19. I cervelli di giovani cuccioli sono incredibilmente dinamici, caratterizzato da onde di differenziazione gliale dopo la nascita. Al fine di studiare i cambiamenti del cervello influenzato da cuccioli prima alimentazione, studiando con restrizioni nuclei neuronali con dissezione riproducibile è necessario.

Latte foraggio solitamente viene analizzato per il suo impatto immunologico e nutrizionale sull'espressione del gene o di salute (ad esempio, in enterociti20,21), mentre il suo effetto sulle aree del cervello durante lo sviluppo cerebrale è raramente studiato. In riferimento a gut colecistochinina recettori vagali relè a nuclei del tronco cerebrale, ma non a intracellulare segnalazione vie22è stato analizzato l'effetto del transito di latte nell'intestino sulla funzione del cervello. C'è una vasta letteratura sulla vulnerabilità del cervello in via di sviluppo neonato a malnutrizione delle madri durante la gravidanza23, ma non vengono affrontati i segnali di sforzo e l'infiammazione. D'importanza, il metodo corrente si avvale di un fenomeno nei neonati di ratto zero-day che gli stimoli di colostro anima-nati dal relè vagale di stimoli viscerali di isola. Questo è il periodo di IPO-reattività del cosiddetto stress caratterizzato da nucleo immaturo tractus solitarius (NTS)-ipotalamico circuito immediatamente dopo la nascita24,25 che limita il NTS, nucleo paraventricolare (PVN), e Nucleo Sopraottico (figlio) segnali agli stimoli di anima-nati.

Questo metodo è utile per l'analisi delle molteplici vie di segnalazione e relativamente limitato di cellule neuronali, purché il tessuto cerebrale è raccolto al giorno-0 postnatale nei ratti, oltre a se le madri sono state contestate o non di qualsiasi tipo di trattamento durante la gravidanza. Cucciolate possono essere analizzati per gli effetti del colostro alimentazione contro pre-alimentazione segnalazione. Quando si confrontano i segnali tra aree del cervello con poveri contro resa ricca di proteine, questo metodo consente la determinazione nel capillare delle proteine totali delle bande del polipeptide in capillari corrono paralleli immunitario-quantificazione di antigeni della proteina. Questo metodo consente il confronto quantitativo, usando unità arbitrarie, dei risultati ottenuti dall'anticorpo stesso senza curve standard quantitativi e con riferimento alle proteine totali a capillare. Confrontando i risultati ottenuti dagli anticorpi differenti è possibile solo utilizzando le curve standard quantitative.

Questo metodo ha permesso per la valutazione della segnalazione che si verificano tra l'intestino e il cervello e che possa avere un impatto funzione in entrambi gli organi26bidirezionale. L'associazione fra ingestione di cibo e l'ossitocina, che è stato ampiamente studiato in anni recenti27, sostiene un collegamento tra segnalazione aumentata l'ossitocina e la disponibilità di nutrienti. Questi studi inoltre sostengono il concetto di converse che i deficit sono accoppiati con le riduzioni di ossitocina ipotalamico segnalazione l'energia.

Precedenti studi sull'effetto di OT su attività di cervello hanno dimostrato che l'infiammazione intestinale indotta ha suscitato cFos trascrizione nella corteccia PVN, amigdala e piriform ipotalamica che era refrattaria a vagotomia28. Tuttavia, l'infusione sistemica di OT con secretina è diminuito la risposta di cFos cervello alla reazione infiammatoria provocata nell' intestino28. Ciò ha suggerito che l'effetto di OT esogeno è stato effettuato da percorsi diversi da relè vagale, possibilmente via ematica molecole di segnalazione effettuate attraverso l'area postrema6,29.

In questo studio, le vie di segnalazione di stress cellulare che precedentemente hanno osservato nell'intestino sono state valutate nel cervello. L'ipotesi era che componenti di latte possono proteggere o rimandare l'effetto di infiammazione su permeabilità dell'intestino ai metaboliti microbici e altri, e a sua volta, gli effetti sulla funzione cerebrale. Le differenze chiaro antagonistiche di IkB contro BiP di segnalazione trovato nei villi, prima e dopo l'innesco di colostro13, ha suggerito che i cervelli dei neonati, ancora in fase di sviluppo, possono percepire questi segnali indotti da colostro gut.

Segnalazione marcatori proteici utilizzati in precedenti esperimenti di intestino che sono associati con lo stress del reticolo endoplasmatico sono stati misurati. Essi comprendono il chaperone ER BiP, traduzione iniziazione fattore eIF2a (che serve come una risposta di stress integrator30), eIF2a chinasi p-PKR e due proteine di infiammazione-segnalazione (NF-kB e suo inibitore, IkB).

Sei regioni cerebrali basate sulla loro capacità negli adulti a secernere o rispondere agli OT sono stati scelti. La NTS, situata presso il midollo superiore, è il primo relè dell'input viscerale e riceve la segnalazione diretta dai neuroni sensoriali vagali nell'intestino31 e citochine possibilmente anima-nati, tossine e ormoni attraverso l' adiacente zona-postrema32. PVN, Nucleo Sopraottico (figlio), nuclei del corpo striato (STR), corteccia cerebrale (CX) e nucleo mediale preottica (MPO) ricevere segnalazione dall'intestino tramite NTS.

Risultati hanno mostrato che la risposta cellulare allo stress durante il periodo postnatale immediato prima dell'innesco di colostro e immediatamente dopo la prima alimentazione è diverso in NTS rispetto al PVN e figlio. Segnalazione in CX, STR e MPO differiva da quella del PVN e figlio, pure. Le funzioni di protezione distinte di OT indicato precedentemente per modulare lo sforzo delle cellule e l'infiammazione nell'intestino sono probabilmente percepite da alcune zone del cervello. Collettivamente, i dati indicano che a livello cellulare, durante le prime ore dopo la nascita, il cervello risponde allo stress metabolici connessi con insufficienza dei nutrienti. I dati mostrano anche che la misura e la direzione degli effetti di modulazione del colostro alimentazione dipendono dalla regione e che in alcune regioni, essi rispecchiano gli effetti OT illustrati in precedenza nell'intestino.

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Protocol

Questo studio è stato approvato dalle commissioni di utilizzo alla Columbia University e l'istituto psichiatrico dello stato di New York e istituzionali Animal Care.

1. tessuto preparazione

  1. Ordine di ratte gravide temporizzate dal fornitore.
  2. Seguire ratti incinti temporizzati osservando loro addomi crescente nelle settimane dopo il loro arrivo e successivamente cercando cuccioli alla data di consegna prevista controllando la gabbia ogni 2 h fino a consegna inizia.
  3. Rimuovere cuccioli con una mano guantata di loro coda prima di loro primo feed per disinneschi cuccioli (no pancia bianco latte è apparente durante la visualizzazione dell'addome) o dopo il primo pasto per cuccioli innescati (al punto che un ventre bianco sarà visibile sul loro addome) come descritto nella timeli ne (Figura S1).
    Nota: La prima poppata di colostro è definita come innesco il pup; così, un cucciolo è disinneschi fino a quando la prima poppata, dopo che essi sono colostro-innescato.
  4. Rapidamente di decapitare il pup non anestetizzata sveglia utilizzando forbici taglienti e pulite chirurgiche.
  5. Rimuovere il cervello tagliando la pelle lungo la linea mediana e la superficie superiore del cranio al naso. Quindi, usando il forcipe, delicatamente leva via l'osso per esporre il cervello (Figura 1A) e localizzare il bregma, contrassegnandolo con una penna, come le piastre dell'osso sono rimossi (Figura 1B).
  6. Posizionare rapidamente l'intero cervello in uno stampo di cervello del metacrilato di polimetile a temperatura ambiente per coronale affettare a temperatura ambiente (Figura 1).
  7. Senza indugio, rendere 500 fette di spessore mm utilizzando una lama di rasoio fresca. Posare le fette rostrale a caudale in una capsula Petri per mantenere l'orientamento delle sezioni (Figura 2).
  8. Aggiungere del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF; 1,0 mM KH2PO4, 26mm NaHCO3, 118,6 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 203,3 mM MgCl2-6 H2O) senza glucosio rapidamente e incubare le fette per 60 min a 28-30 ° C, mescolando costantemente su un agitatore orbitale metabolicamente e differenzialmente sfidare la disinneschi contro i tessuti colostro-innescato.
  9. Identificare i nuclei del cervello che sono tenuti a pugni utilizzando un cervello Atlante33 e limiti anatomici sulla sezione del tessuto. Posizionare questa fetta con i nuclei di interesse in una capsula di Petri e spostarlo al microscopio per dissezione.
  10. Una volta visualizzato, rapidamente pugno fuori 4 di 6 diversi nuclei utilizzando uno strumento di carotaggio, selezione delle dimensioni per meglio perforare il nucleo in questione e coerente tra i campioni (Figura 2).
    Nota: È possibile che la restante fetta di cervello avrà ora un buco dove il tessuto cerebrale è stato rimosso. In questo studio, abbiamo asportato i seguenti nuclei utilizzando il sotto le coordinate. Tutto anteriore/posteriore (A / P) sono coordinate dal Bregma (ad eccezione di NTS, che è per quanto riguarda il Calamus Scriptorius). Tutte le coordinate (D/V) di dorsale/ventrale sono dalla superficie della corteccia (ad eccezione di NTS, ovvero dalla superficie del midollo). Includono le seguenti coordinate A / P, mediale/laterale (M/L) e D/V in mm: 1) nucleo del tratto solitario (NTS, A / P, 0,4-0,8; L, ± 0.2; D/V, 0,3 (dalla superficie del midollo), 2) nucleo paraventricolare (PVN, -0,8; ± 0.2; 0), 3) supra-ottica nucleo (figlio, -1,1; ± 1.4; 4.3), 4) corteccia (CX, zona della corteccia parziale 1, -2,8; ± 1,5; 0,6), 5) i nuclei del corpo striato (STR, -0,0; ± 1.6; 1.8) e 6) mediale preottica nucleo (MPO, -0,6; ± 0.2; 4.2).
  11. Immergere rapidamente i nuclei perforati in 0,06 mL di tampone di estrazione ghiacciata, proteina contenente inibitori di proteasi e inibitori delle fosfatasi per 60 minuti (Vedi punto 2.3).

2. estrazione di proteine

  1. Preparare la soluzione di estrazione della proteina utilizzando il kit di lisi di proteina (Tabella materiali) il giorno prima della consegna prevista pup.
  2. Disgelo (su ghiaccio) la soluzione acquosa congelati (-20 ° C) degli inibitori della proteasi e fosfatasi del kit di buffer di lisi e mettere il tampone di lisi e la soluzione di DMSO degli inibitori della proteasi/fosfatasi sul ghiaccio.
  3. Aggiungere 1,85 mL di tampone di lisi in una provetta pulita, ghiacciata 15 mL. Quindi, aggiungere 0,1 mL di soluzione acquosa di inibitori e 0,05 mL di DMSO-dissolta inibitori. Infine, tappo e brevemente vortice il tubo e la tiene a-20 ° C fino all'utilizzo.
  4. Etichettare provette microcentrifuga pulito 24 (0,5 mL ciascuna) per la procedura di lisi. Designato 12 tubi al cervello per il gruppo di colostro-disinnestato (U) [6 sinistro (L) e 6 nuclei di cervello destro (R)] e l'etichetta secondo acronimo di nuclei, lato e condizione (ad es., NTS-L-U, U-R-NTS, ecc.). Il secondo gruppo di 12 tubi per gli esempi di colostro-innescato l'etichetta.
  5. Etichetta, due set di tubi come fatto nel passaggio 2.4 per gli estratti di proteina stock (utilizzando provette da 1,5 mL Eppendorf-stile) e per il primo set di preparazione del campione (utilizzando provette da 0,5 mL). Mantenere questi tubi in due scatole separate, con etichettate congelamento (ciascuno progettato per 100 tubi). Una scatola serviranno per i campioni non adescati e l'altro per i campioni innescati.
  6. Scongelare la soluzione di lisi su ghiaccio il giorno in cui i cuccioli vengono consegnati e mentre incubando fettine di cervello in ACSF, soluzione di lisi di aliquota 0,06 mL nelle provette Lisi procedura (dal punto 2.4) e aggiungere pugni di nuclei e incubare in ghiaccio per 60 min.
  7. Centrifugare i nuclei lisati incubati per 30 min in una mini-centrifuga di raffreddata a 14000 giri/min (10.000 x g) e aspirare accuratamente 0,055 mL di surnatante con una pipetta correttamente impostata. Trasferire il surnatante nelle provette da 1,5 mL pre-raffreddata stock (dal punto 2.5) e metterli sul ghiaccio. Prima del congelamento (a-20 ° C) i tubi di stock di proteina, trasferire 0,012 mL di surnatante nei tubi pre-raffreddata 0,5 mL per la preparazione del campione prima (dal punto 2.5) e lasciarli sul ghiaccio.

3. preparazione del campione per la misura della proteina In-capillare

  1. Utilizzare un kit e preparare i reagenti per la separazione secondo le indicazioni del produttore. Aggiungere 0,003 mL di reagente master-mix per ciascuno dei 12 campioni in 0,5 mL provette (dal punto 2.5) sul ghiaccio che contengono 0,012 mL degli estratti della proteina.
  2. Attivare il blocco di riscaldamento a 95 ° C e aggiungere 0,004 mL di reagente preparato al punto 3.1 per scala di biotinylated peso molecolare (MW) in un tubo con 0,016 mL di acqua deionizzata. Per denaturare la scaletta e gli esempi, è necessario posizionare il tubo di scaletta e 12 campioni di estratti proteici disinneschi nel blocco calore a 95 ° C per 5 min e conservarli a 4 ° C fino all'utilizzo.
  3. Ripetere i passaggi da 2.0 a 3,2, dall'estrazione di proteine alla preparazione del campione, per i nuclei perforati dai ratti colostro-innescato.

4. elettroforesi preparazione

  1. Scongelare la biotina etichettatura reagente (memorizzati in abbattitore a-80 oC) in panchina e preparare il kit di rilevazione della proteina sul ghiaccio a 4 ° C, seguendo le indicazioni del produttore.
  2. Mescolare 0,15 mL di luminolo con 0,15 mL di perossido e caricare 0,01 mL in 25 pozzetti (riga E, pozzi 1-25) della piastra per la macchina occidentale automatica. Caricare 0,008 mL di streptavidina-HRP dal kit nei pozzetti D1 a D25
  3. Caricare 0,01 mL di anticorpo soluzione diluente nei pozzetti C1 C25 e B1.
  4. Girare i 24 campioni proteici e scaletta tubi brevemente (2-3 secondi) in una minicentrifuge piscina giù acqua evaporata dai tappi tubo.
  5. Caricare 0,003 mL di 12 disinneschi campioni nei pozzetti A2 A13, 0,003 mL di 12 campioni di colostro-innescato in pozzetti A14 A25 e 0,005 mL della scala biotinilati in pozzetto A1.
  6. Lasciare vuota la riga F e caricare 0,45 mL di tampone di lavaggio in ciascuna delle 5 scomparti in ognuna delle 3 righe sotto la riga F. coprire la piastra con il coperchio in plastica per evitare l'evaporazione durante le procedure rimanenti.
  7. Brevemente vortice la biotina scongelata etichettatura reagente e aggiungere 0,15 mL di reagente al suo tubo designato; quindi aggiungere ad essa 0,15 mL dell'agente la ricostituzione della proteina totale e mescolarli ad omogeneità.
  8. Rimuovere il coperchio dalla piastra e caricare 0,01 mL di agenti 1 e 2 nei pozzetti B2 a B25. Coprire la piastra e si centrifuga per 10 min a 1.000 x g per rimuovere eventuali bolle d'aria dalle varie soluzioni. Utilizzare un piatto vuoto nella centrifuga per equilibrio.

5. elettroforesi

  1. Mentre gira la piastra, è possibile aprire un file di esecuzione nel computer attaccato macchina occidentale automatico che indica nella pagina elenco a discesa da "file" per eseguire un'analisi della proteina totale e cliccando i rispettivi punti.
  2. Annotare i campioni da pozzo nel computer. Quindi, rimuovere la piastra dal centrifuga remove il coperchio e rimuovere con cautela il coperchio di alluminio dai compartimenti di soluzione di separazione.
  3. Posizionare la piastra nello strumento occidentale automatizzato, staccare il coperchio dalla scatola cartuccia capillare, inserire la cartuccia nel suo posto designato e chiudere la porta.
  4. Fare clic sul pulsante "Esegui" e quando viene richiesto con il tipo del test ("proteina totale"), digitare il nome dei campioni (ad esempio, "disinnestato 2-13 e colostro-innescato 14-25"). Fare clic su "OK" e quando richiesto dal attivato Data di esecuzione e il numero di ID del file esecuzione, prendere nota del tempo quando termina l'esecuzione.
  5. Alla fine della corsa (170 min dopo l'inizio), aprire la porta strumenti, rimuovere la cartuccia capillare e gettarlo nella di Sharps. Scartare la piastra lo smaltimento di materiale biologico.
  6. Fare clic sull'icona curve di separazione nella pagina analisi del file esecuzione e verifica che tutti i campioni sono eseguiti correttamente e sono risultati più curve di proteina in tutti i capillari.

6. analisi delle proteine di segnalazione

  1. In una provetta con etichetta 1,5 mL, aggiungere 0,003 mL di coniglio anti anticorpi fosfo-eIF2a (p-eIF2a) e sospenderlo in 0,3 mL (diluizione 1: 100) in diluente da kit adatto rilevazione dell'anticorpo. Quindi, tenere il ghiaccio.
  2. Etichettare una provetta di luminol e aggiungere 0,15 mL di luminolo e 0,15 mL di perossido da questo corredo del modulo di rilevamento e pipettare 0,01 mL nei pozzetti E1 a E25 un piatto fresco, automatizzato occidentale.
  3. Dispensare 0,01 mL del secondario anti anticorpo di coniglio in pozzetti D2 a D25 e aggiungere 0,01 mL di streptavidina-HRP da kit a ben D1.
  4. Dispensare 0,01 mL di anticorpo primario (dal punto 6.1) nei pozzetti C2 per C25 ed aggiungere 0,01 mL di diluente 2 soluzione di anticorpo a pozzetti C1 e B1 a B25.
  5. Lasciare i pozzetti di riga F vuota e inserire 0,45 mL di tampone di lavaggio nei 5 scomparti di 3 righe sotto la riga F.
  6. Girare brevemente i campioni refrigerati per 3 s e aggiungere 0,003 mL di ogni campione alla riga A nello stesso ordine sono stati aggiunti per l'analisi della proteina totale, a partire da A2 a A25. Aggiungere mL 0,005 della scala MW biotinilato per bene la A1 e la piastra di copertura.
  7. Centrifugare la piastra come fatto nel passo 4.8. Mentre la piastra è la filatura, aprire (nel software automatizzato Western-collegato e computer) un nuovo file di esecuzione e indicare nella pagina elenco a discesa da "File" per eseguire un test di prova di dimensioni molecolari cliccando i rispettivi punti.
  8. Nella pagina di test, digitare i nomi di esempio in ogni capillare, quindi digitare il nome dell'anticorpo primario nel posto assegnato e l'anticorpo secondario anti-coniglio sotto di essa.
  9. Al termine della centrifugazione, ripetere passaggi 5.3 – 5.5, tranne il nome assegnato al file esecuzione questa volta dovrebbe essere "p-eIF2a su disinneschi 2 – 13 e 14 – 25 colostro-innescato".
  10. Dopo la separazione di elettroforesi, controllare il file di esecuzione per i picchi di reattività immunitaria degli antigeni alle dimensioni di 40 – 43 kDa. Dove MW di picchi di questa dimensione sono mancanti, destro sotto la curva e indicare all'interno dell'elenco a discesa per aggiungere MW per la vetta, che assicura che le dimensioni e la quantità arbitraria sotto la curva vengono registrate.

7. elaborazione dei risultati

  1. Apri un file di foglio di calcolo per proteina totale eseguire nel Western automatizzato eseguire file e fornire un numero di ID.
  2. Aprire il file di esecuzione del test della proteina totale alla pagina di analisi nella modalità curva e segnare tutte le cime in singoli vasi capillari. Quindi, copiare e incollare il foglio di calcolo e sommare le aree sotto la curva di tutti i picchi registrati nel capillare intero.
  3. In una colonna separata, organizzare la quantità totale di proteine per ogni colonna con numeri capillari, nomi dei nuclei cerebrali rispettivi e i numeri di ID dei file di esecuzione.
  4. Aprire un foglio di calcolo per l'antigene p-eIF2a e in una singola colonna, l'area sotto la curva da ogni capillare side-by-side di registrare con il suo rispettivo numero di capillarità, il nome di nucleo del cervello e il numero di ID del file esecuzione.
  5. Copiare la colonna di proteine totali (parallelo ai quantitativi curva p-eIF2a) in un terzo foglio di calcolo e calcolare p-eIF2a:total rapporti di proteina in una terza colonna.
  6. Raccogliere risultati da passaggi da 4 a 6 per ogni nucleo di cervello, disporli nei gruppi dei nuclei e generare un grafico a barre.

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Representative Results

Le bande rappresentative di immunoreactivity relativa proteina totale mostrano che ci sono nuclei di cervello con raccolto molto povera in proteine. Questo richiede l'utilizzo della tecnica automatizzata Western blot, che è altamente sensibile rispetto al canonico Western blot. Questo approccio può essere eseguito con fortyfold meno proteine per capillare rispetto a-corsia in Western blot.

Effetti differenziali di priming di colostro il BiP livelli nei nuclei del cervello

Sezioni coronali del cervello di ratto sono state raccolte prima il colostro primo alimentazione (disinneschi) e dopo la prima alimentazione (primer). Campioni sono stati frazionati mediante elettroforesi capillare (su WES) e proteine sono state quantificate utilizzando il kit per colorazione di proteine totali nel capillare (Vedi protocollo). Ulteriore immuni frazionamento capillare sul lato occidentale automatizzato fornito l'identificazione degli antigeni della proteina rispettivi. In Figura 3A, espressione di proteina BiP rappresentativa viene visualizzato nel pannello superiore, con la corrispondente proteina totale mostrata di seguito. BiP è una proteina chaperon ER. In Figura 3B, quantificato immunoreactivities sono presentati da grafici a barre relativo la corrispondente proteina totale.

All'interno i campioni di tessuto unprimed, livelli di BiP in NTS erano significativamente più alto rispetto a tutte le altre regioni (p < 0,05, n = 4 nuclei). Innesco del tessuto dell'intestino con colostro ha avuto un effetto opposto in NTS, confrontato con BiP aumentata in altre regioni, non adescato tessuto (Figura 3B) relativo. Adescamento è diminuito di BiP in NTS (Figura 3B) e non ha avuto effetto su PVN e SOPT. Tuttavia, adescamento aumentato BiP in CX, STR e MPO disinneschi tessuto relativo. Questi dati implica che BiP livelli nei vari nuclei testata cervello rispondono diversamente al adescamento dell'intestino e che ci non è ancora affatto dimostrata cross-talk tra i vari nuclei testato.

Effetti differenziali di priming di colostro su ElF2a e p-elF2a livelli nei nuclei del cervello

Campioni di tessuto del cervello sono stati preparati, analizzati e quantificati come mostrato in Figura 3A e 3B. Come con BiP livelli (Figura 3B), elF2a e p-elF2a livelli in NTS sono stati elevati nella condizione disinneschi rispetto altri nuclei (Figura 4B e 4C). Come dimostrato con livelli di BiP, la risposta in NTS al adescamento del tessuto dell'intestino con colostro era opposto a quello in altri nuclei. Livelli di elF2a e di p-elF2a in NTS sono state ridotte rispetto al tessuto non adescato. In tutti gli altri nuclei testati, adescamento livelli aumentati in elF2a e p-elF2a disinneschi tessuto (Figura 4B e 4C) relativo.

Fosforilazione di elF2a dalla chinasi GCN2 in NTS e PVN dopo l'innesco di colostro

Campioni di tessuto del cervello sono stati preparati, analizzati e quantificati come mostrato nella Figura 3. Adescamento defunto p-PKR nel PVN (χ2 p = 0,025), a differenza di tutte le altre regioni dove è stato aumentato. Al contrario di p-elF2a risultati (Figura 4), i livelli di p-PKR erano basse in unprimed esempi relativi campioni innescati in NTS (Figura 5A). Fosforilazione di elF2a è solitamente catalizzata dalla sua chinasi PKR in risposta al virus34 e da OT nell'intestino, come precedentemente dimostrato11. Tuttavia, il fatto che i livelli di p-PKR erano molto bassi in disinnestato contro innescato NTS (rispetto ad altri nuclei, Figura 5A) fortemente suggerisce che un'altra chinasi deve essere coinvolto nella fosforilazione elF2a (Figura 4). Di conseguenza, livelli di GCN2 sono stati testati in NTS e PVN perché è anche una nota chinasi di elF2a35. I livelli di p-GCN2 (forma attiva) erano più alti nei campioni disinneschi confrontati ai campioni innescati in NTS e PVN (figura 5B) e GCN2 (forma inattiva), rispetto al p-GCN2, inversamente è stato espresso nel PVN (Figura 5). pGCN2 in NTS (Figura 5) è stato espresso inversamente a pPKR (Figura 5A) in NTS disinneschi sia innescata. Nel tessuto innescato, p-eIF2a era notevolmente inferiore in NTS rispetto a tutte le altre regioni del cervello [PVN (p < 0,01), figlio (p < 0,01), CX (p < 0,01) e MPO (p = 0,02)]. Questo indica che tale pGCN2, anziché pPKR, è stato responsabile per l'inibizione di eIF2 in NTS.

Adescamento di colostro inibisce NF-kB in CX, STR e MPO

Figura 6A spettacoli che IkB livelli erano significativamente più alti nel figlio disinnestato campioni vs innescato. Livelli di IkB nel figlio, CX, STR e MPO tendenza più in alto nella stessa direzione. In Figura 6, livelli di NF-kB in CX, STR e MPO erano significativamente più alti nel innescato contro tessuto disinneschi. Tuttavia, livelli di NF-kB erano significativamente più bassi nel tessuto NTS innescato, che suggerisce che il colostro ha avuto un effetto antinfiammatorio distinto su questa regione del cervello. Citosolico NF-kB era superiore (mantenuti) in campioni di unprimed NTS, mentre suo inibitore IkB era basso e immutato nei campioni innescati. Ciò suggerisce che un meccanismo antinfiammatorio distinto sta regolando NF-kB in NTS. Questo effetto di stress nutritivo insufficienza è coerenza con i risultati attuali che lo stress marcatori BiP e p-eIF2a sono regolati dalla presenza di adescamento di colostro (figure 3 e 4, rispettivamente), anche mostrato nella precedente BiP e p-elF2a Risultati10. La ragione per la risposta distinta di IkB e NF-kB in NTS confrontato con CX, STR e MPO ancora completamente non è capita. Tuttavia, è coerenza con l'osservazione che la NTS, che trasmette i segnali dall'intestino al cervello, possono svolgere un ruolo cruciale nel rispondere in modo univoco e in modo opposto rispetto a altre regioni del cervello rispetto a infiammazione periferica36. I livelli di IkB in CX, STR e MPO erano basso (Figura 6A), rispetto agli alti livelli di NF-kB nelle stesse aree (Figura 6). Mentre questo che trova apparentemente contraddice la premessa che IkB è vincolante e mantenendo NFkB nel citosol, differenti di calcolo dei dati che combina e confronta tutto innescati campioni in CX, STR e MPO usando spettacoli di analisi di regressione che NF-kB altamente correla con IkB (p < 0.0001, n = 24)

Figure 1
Figura 1: dissecato cervello neonatale del ratto. (A) il cervello sezionato è mostrato con ossa rimosso rostral al bregma. (B), il cervello viene visualizzato dopo che è stata tracciata una linea al bregma, dopo che sono stati rimossi i restanti placche ossee. (C) il cervello è illustrato in uno stampo di cervello in metacrilato di polimetile prima di essere affettato con una lama di rasoio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: fette organizzati da rostral alla caudale con pugni (cerchi rossi) del cervello. Abbreviazioni: CX: corteccia, lobo parietale; MPO: area preottica mediale; NTS: solitari nucleo tractus; PVN: nucleo paraventricolare; FIGLIO: Nucleo Sopraottico; e STR: corpo striato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: risposta di BiP/GRP78 in NTS è invertito a quella di altri nuclei. (A) espressione della proteina BiP rappresentante nel pannello superiore rispetto la proteina totale presentato nel pannello qui sotto. Nota che la densità di proteine totali nei vari capillari sono eterogenei, e questi sono utilizzati per equalizzare l'espressione di BiP rispettivo per proteina nel pannello b. (B) mostrato è il BiP medio rispetto al totale della proteina nei nuclei del cervello dei campioni non adescata ( blu) contro il colostro-innescato campioni (marroni). Asterischi di rispettivi colori designano differenze significative (p < 0,05, n = 4 nuclei) tra BiP in NTS contro BiP in altri nuclei. Espressione di BiP in unprimed contro innescati campioni in NTS sono significativamente invertito a quelli STR (χ2 p = 0,028, n = 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: eIF2a attivi e inattivi (p-eIF2a) risposta all'innesco di colostro contro campioni disinneschi in NTS invertito a quella di altri nuclei. (A) rappresentante eIF2a e p-eIF2a di espressioni della proteina sono mostrate in pannelli superiori. Le corsie di proteine totali sono presentate nel pannello inferiore. (B) indicato è la media eIF2a di 4 campioni espresse in relazione della proteina totale (da pannello inferiore A) nei nuclei del cervello di unprimed campioni (blu) contro il colostro-innescato campioni (marroni) e (C), la forma inattiva di eIF2a (p-eIF2a). Asterischi di rispettivi colori designano differenze significative (p < 0,05, n = 4 nuclei) tra entrambe le forme eIF2a in NTS contro rispettivi livelli in altri nuclei. Espressione di eIF2a attivo in unprimed contro innescati campioni in NTS sono significativamente invertito a quelli in CX, STR e MPO (χ2 p < 0,05 contro tutti i tre nuclei, n = 4). Barre di errore rappresentano errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: NTS esprime eIF2a chinasi p-GCN2 in accordo con p-eIF2 livello ed inversamente al livello p-PKR. (A) il livello di p-PKR (dsRNA attivata della chinasi di eIF2a) è espressa in disinnestato contro colostro-innescato NTS inversamente a 1) il livello di p-PKR nel PVN (χ2 p = 0,025) e 2) i valori attesi mirati substrato eIF2a dopo la sua fosforilazione (a p-eIF2a, Figura 2). Si noti che il modello di p-PKR nel figlio, CX, STR e MPO di unprimed contro campioni colostro-innescato adatto per i rispettivi modelli di p-eIF2a da Figura 2. (B) attivo eIF2a chinasi (p-GCN2) in disinnestato contro innescato NTS campioni segue un modello simile di espressione di p-eIF2a dalla Figura 2 e un modello inverso dell'espressione di pPRK da Figura 3A2 p = 0,028). C = i livelli medi di GCN2 inattivo. Barre di errore rappresentano errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: espressione citoplasmica di NF-kB e IkB nei nuclei del cervello dai campioni di intestino non adescata e colostro-innescati. (A) media espressione citoplasmica di IkB relativa proteina totale (da pannello C) ai nuclei del cervello indicato. (B) rappresentante citoplasmici bande di proteine IkB sono presentati nel pannello superiore e densità di proteine totali nelle rispettive corsie nel pannello inferiore. (C) media espressione citoplasmica di NF-kB relativo della proteina totale (da pannello D) ai nuclei del cervello indicato. (D) rappresentante citoplasmici bande di bande di NF-kB sono presentati nel pannello superiore e densità totale di proteina citoplasmatica in rispettive corsie nel pannello inferiore. Asterischi colorati designano differenze significative tra i campioni indicati (p < 0,05, n = 4). Si noti che citoplasmici livelli di NF-kB sono più alti nel colostro-innescati CX, STR e MPO rispetto nei nuclei ipotalamici NTS, PVN ed il figlio in disaccordo con i livelli di inibitore di NF-kB (IkB). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: confronto schematico supposto OT segnalazione nelle regioni di intestino e cervello colostro-innescati. (A) il colostro OT negli enterociti attiva del suo recettore tramite l'interazione diretta con l'OTR, riducendo l'infiammazione tramite segnalazione a valle di IkB aumentata. Traduzione di proteina è inibita aumentando p-PKR, che fa diminuire l'attività di elF2a attraverso la fosforilazione. L'omeostasi è ripristinato tramite aumentato BiP gene espressione13,37. (B) Neuronal o circolatori OT attiva del suo recettore nelle regioni del cervello, CS, STR e MPO downregulating infiammazione e proteina traduzione tramite le stesse molecole come l'intestino (vedi pannello A). (C) i supposti effetti di priming di colostro della regione NTS del cervello sono distinti e opposto da quelle a pannelli A e B. GCN2, che è sensibile al rifornimento di aminoacidi, aumenta la eIF2a e la proteina di traduzione. Allo stesso tempo, bassi livelli di IkB permettono di NF-kB entrare nel nucleo ed induce l'infiammazione. Si noti che il BiP agisce allo stesso modo per ripristinare l'omeostasi nell'intestino e nel NTS nel cervello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure
Complementare figura 1: schema che mostra la timeline di protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Una tecnica per microdissezione di discreti, nuclei del cervello di OTR-ricchi nel cervello del ratto neonatale è presentata in questa carta. È riconosciuto bene che i neuroni sono altamente specializzati, anche all'interno dei nuclei ben caratterizzati nel cervello. Questo approccio altamente riproducibile per isolare specifici nuclei di OTR-ricchi permette test di ipotesi robusto. Mediante Western blotting automatizzato, la coerenza e la riproducibilità dei risultati sono stati ulteriormente migliorate. Mentre una limitazione di questa tecnica rimane variabilità di pugno del cervello modesto; Questa tecnica rappresenta un anticipo su cella singola, intero cervello o cervello fetta approcci. Cella singola approcci sono complicati fornendo istantanee molto limitato. Utilizzando l'intero cervello, qualsiasi risultato può essere diluito se l'effetto è limitato a una regione del cervello o un sottotipo di un neurone. Approcci di fetta di cervello senza microdissection possono introdurre profonda variabilità nei risultati entro pochi micron in una fetta, che è particolarmente problematico per l'ipotalamo in questo studio, a causa di clustering stretto dei nuclei distinti. Usando un punzone standardizzato e l'assistenza di un microscopio, la variabilità nelle misurazioni della proteina è stata ridotta.

Ci sono diversi passaggi critici all'interno di questo protocollo. Questi includono rispetto ai tempi del raccolto del tessuto per quanto riguarda la prima poppata, utilizzando un minimo volume di tampone di estrazione di proteine, l'incubazione delle fette del cervello in ACSF, in modo che possono essere utilizzati inibitori molecolari o stimolanti e utilizzando un sensibile immunitario-elettroforetica dispositivo. Modifiche possibili includono la scelta di reagenti per l'incubazione e la durata dell'incubazione e prolungare il tempo di morire di fame non adescata per confrontare il cervello a volte equivalente. Limitazioni importanti comprendono la presenza di alcune cellule non neuronali (anche durante questo periodo neonatale molto presto) e un numero limitato di campioni che possono essere preparati da una cucciolata di neonati in un giorno. Inoltre, questo approccio è completamente dipendente da quando sono nati i cuccioli. Per quanto riguarda i metodi esistenti, espressione genica nel cervello a questa età è in genere e più convenientemente valutati a livello trascrizionale. Tuttavia, per analisi di segnalazione delle cellule, l'approccio proteomico eseguito da impianto di nucleo è più costoso rispetto al desktop strumenti automatizzati. Il metodo convenzionale Western blot richiede molto più proteine, richiede diversi giorni per completare e coinvolge più passaggi di manipolazione con la manodopera tecnica. Questo approccio automatizzato richiede 0,8 µ g di proteine per capillare, una volta caricato nello strumento tutti i passaggi vengono eseguiti senza umani mano interferenze e prende 2 h e 50 min per completare l'esecuzione. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare lo sviluppo del cervello postnatale immediato nei ratti e vasta gamma di modelli murini geneticamente manipolati.

Utilizzando questa tecnica, gli effetti di OT a livello cellulare, in particolare nel periodo molto critico tra la nascita e l'allattamento, sono stati studiati quando l'OTR è al massimo espresso in epitelio8. In precedenza sono stati dimostrati gli effetti di modulazione di OT su molecole in cellule intestinali, sia in una cella linea37 e in vivo13, di segnalazione delle cellule. Nello studio presente, gli effetti osservati in cellule intestinali sono stati valutati nelle regioni del cervello ricche di OTR. L'espressione di BiP/GRP78 e p-eIF2a era upregulated in unprimed (coerente con come previsto la risposta allo stress) e downregulated nel tessuto NTS innescato (coerenza con una risposta attenuata allo stress), considerando che NF-kB è stata elevata e stabile in entrambe le condizioni 38. espressioni di BiP e NF-kB sono stati lo stesso nelle altre regioni testati in condizioni disinneschi sia innescate. eIf2a è stato fosforilati da chinasi dsRNA (pPKR) nel figlio, CX, STR e MPO. Tuttavia, in NTS e in misura minore nel PVN, eIf2a era fosforilato da un'altra chinasi, chinasi di nonderepressible-2 controllo generale (GCN2). Una schematica raffigurante supposto differenze nella segnalazione nel cervello e intestino provocata dall'esposizione di colostro è presentato nella Figura 7.

Questo rende di tecnica di microdissezione permette di testare le ipotesi relative all'impatto del colostro primo si nutrono di sollecit-relativi segnalazione nei nuclei di OTR-ricchi discreti nel cervello neonatale. Questi dati suggeriscono che i meccanismi di modulazione stress precedentemente osservati negli enterociti dell'intestino nuovo Nato si specchiano nelle regioni specifiche del cervello ricche di OTR, come mostrato da una maggiore ritenzione citosolico di NFKB (PVN, figlio CX, STR e MPO). Risultati inoltre indicano che NTS e PVN utilizzano un meccanismo di fosforilazione diverso dalle altre regioni che possono essere refrattari all'impatto dell'insufficienza dei nutrienti. Collettivamente, i dati indicano che la segnalazione delle cellule nel cervello connesso con insufficienza di nutrienti ed ormonale durante le prime ore dopo la nascita è simile al cellulare di segnalazione nell'intestino alle stesse condizioni. Questi dati supportano l'importanza del latte materno al momento della nascita per la modulazione dello stress in intestino e cervello. Questi risultati sottolineano la necessità di un'ulteriore analisi dell'impatto del colostro sulla funzione del cervello.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Manon Ranger e Alexandra Schulz per la loro assistenza nella preparazione di questo protocollo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

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