Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

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Summary

En este estudio, presentamos un protocolo para realizar dos fotones intravital proyección de imagen y de la célula análisis de interacción en la mucosa traqueal murina después de la infección con virus de la gripe. Este Protocolo será relevante para los investigadores que estudian la dinámica celular inmune durante las infecciones respiratorias.

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Palomino-Segura, M., Virgilio, T., Morone, D., Pizzagalli, D. U., Gonzalez, S. F. Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58355, doi:10.3791/58355 (2018).

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Abstract

El análisis de célula o célula-patógeno interacción en vivo es una herramienta importante para entender la dinámica de la respuesta inmune a la infección. Dos fotones microscopía intravital (2P-IVM) permite la observación de las interacciones de la célula en tejidos profundos en animales vivos, reduciendo al mínimo el fotoblanqueo generado durante la adquisición de la imagen. Hasta la fecha, se han descrito distintos modelos de 2P-IVM de órganos linfoides y no linfoides. Sin embargo, la proyección de imagen de órganos respiratorios sigue siendo un reto debido al movimiento asociado con el ciclo de la respiración del animal.

Aquí, describimos un protocolo para visualizar en vivo la célula inmune interacciones en la tráquea de ratones infectados con el virus de la influenza usando 2P-IVM. Para ello, hemos desarrollado una plataforma de proyección de imagen personalizada, que incluía la exposición quirúrgica y la intubación de la tráquea, seguida por la adquisición de imágenes dinámicas de neutrófilos y células dendríticas (DC) en el epitelio de la mucosa. Además, detallan los pasos necesitados para llevar a cabo la gripe intranasal infección y flujo análisis cytometric de células inmunes en la tráquea. Finalmente, se analizaron del neutrófilo y motilidad de DC así como sus interacciones en el transcurso de una película. Este protocolo permite la generación de imágenes de 4D estable y brillante es necesario para la evaluación de las interacciones célula-célula en la tráquea.

Introduction

Dos fotones microscopía intravital (2P-IVM) es una técnica eficaz para proyección de imagen en tiempo real de las interacciones célula a célula que se producen en su entorno natural1. Una de las principales ventajas de este método es que permite el estudio de procesos celulares en una mayor profundidad de la muestra (500 μm a 1 mm) en comparación con otras técnicas por imágenes tradicionales2. Al mismo tiempo, el uso de dos fotones de baja energía generada por el láser de dos fotones reduce el foto-daño de tejido por lo general asociado con el proceso de adquisición de imagen2. Durante la última década, 2P-IVM ha sido aplicado para estudiar diferentes tipos de interacciones célula-célula en varias disciplinas3,4,5. Estos estudios han sido especialmente relevantes para investigar las células inmunes, que se caracterizan por su alto dinamismo y la formación de destacados contactos siguiendo las señales generadas por otras células y el medio ambiente. 2P-IVM se ha aplicado también para estudiar las interacciones entre el patógeno y huésped6. De hecho, se ha demostrado previamente que algunos patógenos pueden alterar el tipo y la duración de los contactos entre las células inmunes, dificultando, en consecuencia, la respuesta inmune7.

La mucosa de las vías respiratorias es el primer sitio en el que la respuesta inmune contra patógenos aerotransportados es generado por la8. Por lo tanto, en vivo análisis de las interacciones patógeno-host en este tejido es fundamental para entender la iniciación de los mecanismos de defensa del huésped durante la infección. Sin embargo, 2P-IVM de las vías respiratorias es difícil principalmente debido a los artefactos producidos por el ciclo de respiración de los animales, que compromete el proceso de adquisición de la imagen. Recientemente, se han descrito diferentes modelos quirúrgicos para imagen tráquea murino9,10,11,12 y pulmones13,14,15, 16. Modelos traqueal P 2-IVM representan una excelente configuración para visualizar la fase inicial de la reacción inmunitaria en las vías aéreas superiores, mientras que el pulmón alvéolos 2P-IVM modelos son más adecuados para el estudio de la fase tardía de infecciones. Los modelos de pulmón desarrollados presentan una limitación asociada a la presencia de alvéolos llenos de aire, que restringen la penetración óptica del láser y la capa mucosa de las vías aéreas intrapulmonares inaccesibles para el en vivo de17 . Por el contrario, la estructura de la tráquea, formada por un epitelio continuo, facilita la adquisición de la imagen.

Aquí, presentamos un protocolo que incluye una descripción detallada de los pasos necesarios para realizar la infección por influenza, preparación quirúrgica de los animales y 2P-IVM de la tráquea. Además, se describe un montaje experimental específico para la visualización de los neutrófilos y las células dendríticas (DC), dos tipos de células inmunes que juegan un papel importante como mediadores de lo mecanismo de defensa contra influenza virus18,19 . Por último, se describe un procedimiento para analizar las interacciones del neutrófilo-DC. Estos contactos se ha demostrado que modulan la activación de la DC y, posteriormente, afectar la respuesta inmune contra patógenos20.

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Protocol

Todos los procedimientos animales ratones que realizaron los animales protocolos y directrices de la Oficina veterinaria Federal de Suiza fueron aprobados por las autoridades veterinarias locales.

1. gripe infección de ratones de CD11c-YFP

  1. Seguridad de la biotecnología
    Nota: La cepa de ratón adaptado de gripe H1N1 de A/Puerto Rico/8/34 (PR8) fue cultivada en huevos fertilizados, purificada y valora como se describió anteriormente21. Todos los pasos que implican animales infectados o muestras biológicas se llevó a cabo bajo una bioseguridad gabinete según nivel de bioseguridad (BSL) 2 condiciones.
    1. Limpiar el gabinete de bioseguridad con una solución de etanol 70% antes y después del procedimiento de la infección.
    2. Deseche todos los residuos materiales producidos durante este procedimiento siguiente apropiado que las directrices de seguridad de la biotecnología (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Deseche los residuos sólidos en recipientes autoclavables y líquidos contaminados en bolsas de plástico rellenas de solución de etanol al 70% o desinfectante médico.
  2. Infección intranasal de la gripe
    NOTA: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 sobre un fondo de C57BL/6J se utilizaron en este estudio. Ratones fueron mantenidos en las instalaciones de libre de patógenos específicas en el Instituto de investigación en biomedicina.
    1. Colocar un máximo de 5 ratones de CD11c-YFP de edad y sexo-emparejaron (seis a ocho semanas de edad) por jaula. Espere al menos dos días de aclimatación de ratones a las condiciones de la vivienda antes del procedimiento de la infección.
    2. PR8 stock de descongelar y preparar la dilución correspondiente utilizando frío 1 x modificado fosfato buffer salino de Dulbecco sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio (PBS) para obtener una concentración final de 200 unidades formadoras de placa (UFP) en dilución 30 μl. subsistencia de virus en el hielo durante todo el procedimiento.
      Nota: valoración de cada lote de virus de la gripe antes de su uso se recomienda para asegurar una dosis exacta de infección.
    3. Inyectar una dosis de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) por vía intraperitoneal (i.p.) utilizando una jeringa de 1 mL aguja 26 G.
    4. Espere a que el ratón esté totalmente anestesia (pérdida completa del reflejo de retirada de adrizamiento y pedal). Anestesia profunda es necesaria para una infección óptima, ya que ratones no-completamente anestesiados se tragar o expeler el inóculo de virus, lo que las variaciones en la dosis de infección.
    5. Coloque el ratón anestesiado en posición supina. Recoge 15 μl del inóculo de virus. Coloque la punta de la pipeta cerca de la fosa nasal izquierda de ratón y distribuir el inóculo viral gota a gota. Como las gotas deben ser inhaladas, no pipetear directamente dentro de la cavidad de la nariz.
    6. Esperar 2-5 minutos y coloque la punta de la pipeta que contiene el restante 15 μl del inóculo de virus en la fosa nasal derecha.
      Nota: Para evitar la asfixia, eche gotas de pequeño tamaño en intervalos s aproximadamente 20.
    7. Compruebe que el ratón está respirando correctamente y colocarlo en una jaula en lateral decúbito. Seguimiento de recuperación de anestesia y respiración de ratón (aproximadamente 60 minutos después de la inducción).
      Nota: Es posible infectar a más de 1 ratón al mismo tiempo. En este caso, administrar inóculo viral en la fosa nasal izquierda de todos los ratones en una secuencia, espere de 2 a 5 min y luego administrar el virus en la fosa nasal derecha. Para evitar la variabilidad entre individuos, infectar ratones no más de 3 al mismo tiempo.
    8. Vigilar la salud animal estado y pérdida de peso diariamente.
    9. Eutanasia a ratones según el criterio de valoración humana determinada por las directrices de la autoridad. El método de eutanasia debe ser aprobada por las autoridades de la experimentación animal y debe respetar las normas éticas locales. Después de dos fotones experimentos, eutanasia ratones por administración de una sobredosis de ketamina/xilacina seguido por dislocación cervical. En todos los experimentos, usar la inhalación de CO2 como método de eutanasia.
      Nota: Para medir los títulos virales de tráquea infectado, ensayo de dosis infectiva (TCID50) 50% cultivo tisular o reacción en cadena de polimerasa en tiempo real Análisis (RT-PCR) pueden realizarse como se describió anteriormente23.
  3. Evaluación del reclutamiento de neutrófilo en la tráquea mediante citometría de flujo
    Nota: Esta parte del protocolo es opcional. El objetivo es evaluar reclutamiento neutrófilo en mucosa traqueal después de la infección por influenza.
    1. Eutanasia a ratones infectados y no infectados del control en la post-infección día 3 (p.i.) por la inhalación de CO2 .
      Nota: Para prevenir daño traqueal, evitar el uso de la dislocación cervical para eutanasia a animales. Además, la perfusión de ratones eutanasia es recomendable para evitar la contaminación de neutrófilos de la sangre.
    2. Rocíe el cuello del ratón con solución de etanol al 70% y realizar una incisión de piel con unas tijeras quirúrgicas desde el pecho hasta el mentón.
    3. Separe las glándulas salivales con unas pinzas y exponer la tráquea.
    4. Diseccionar los músculos alrededor de la tráquea utilizando pinzas y tijeras.
      Nota: Este paso debe realizarse con cuidado ya que la tráquea puede dañarse fácilmente durante el procedimiento.
    5. Sostenga la tráquea con pinza y separar cuidadosamente el esófago por la disección.
    6. Sostiene la parte intratorácica de la tráquea con pinzas, hacer una incisión en el comienzo del árbol bronquial. Luego separar la tráquea de la laringe y retire con cuidado cualquier musculatura a la izquierda.
    7. Colocar el órgano en un tubo de 1,5 mL que contiene RPMI 1640 + medio HEPES (RPMI) en hielo.
    8. Preparar la mezcla de enzimas para la digestión de la tráquea, que contiene 0.26 unidades/mL de colagenasa (I y II) y 0,2 mg/mL de DNasa I en RPMI.
    9. Lugar la tráquea disecada en una placa de 6 pozos que contiene 1 mL de mezcla de enzimas.
    10. Cortar los órganos en trozos pequeños con la ayuda de pinzas y tijeras. Mantenga la placa de hielo durante este paso.
    11. Incubar a 37 ° C por 45 minutos. Durante este tiempo, agitar la placa cada 15 minutos.
    12. Detener la digestión de la enzima agregando 1 mL de tampón de lavado FACS (2 mM EDTA y 2% inactivado con calor filtro esterilizado suero bovino fetal (FBS)) en PBS.
    13. Agite la solución con una pipeta de 1 mL a disociar las piezas parcialmente digeridas del tejido.
    14. Transferir la solución a otro bien pasando el contenido a través de un tamiz μm 40. Luego, aplastar suavemente las piezas restantes del órgano atrapado en la parte superior del filtro mediante un émbolo de la jeringa de 2 mL.
      Nota: Rompiendo piezas parcialmente digeridos de la tráquea sobre el colador es un paso crítico para obtener un número óptimo de células durante el análisis cytometric del flujo.
    15. Lavar el pozo y el filtro con lavado de FACS del almacenador intermediario y transferir la suspensión en un tubo de 5 mL mantener en hielo.
    16. Centrifugar los tubos a 166 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender las células en 100 μl de buffer de lavado de FACS.
    17. Proceda con el anticuerpo superficial de tinción para citometría de flujo. Brevemente, bloquean los receptores Fc de las células aisladas utilizando un anticuerpo contra el CD16/32, seguido por la coloración superficial. Para identificar correctamente los neutrófilos, el panel de la citometría de flujo debe contener los siguientes anticuerpos: αLy6G, αCD11b, αCD45, así como una viabilidad del tinte para excluir las células muertas.
    18. Ejecutar todo el contenido de las muestras en un citómetro de flujo y analizar los datos.
      1. Para obtener un número óptimo de células inmunes, ejecute la suspensión unicelular a una velocidad no superior a 3.000 eventos/s. Esto reducirá el número de eventos excluidos durante la adquisición. Mediante este protocolo, debe ser posible obtener 1 a 2 millones de células por la tráquea.

2. aislamiento e inyección de neutrófilos

Nota: en este procedimiento, B6.129 (ICR)-ratones Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J (ECFP-CK6) fueron usadas24. Estos animales expresan PPC en todos los tipos de células en el promotor humano de β-actina. Por otra parte, también es posible utilizar ratones C57BL/6J para aislar células y tinción según el protocolo descrito en el paso 2.6. La depuración y manipulación de los neutrófilos pueden aumentar su estado de activación, potencialmente alterar sus propiedades funcionales y migratorias.

  1. Eutanasia animal por inhalación de CO2 .
  2. Quitar ambos fémures y tibias y límpielos suavemente con unas pinzas.
  3. Cortar hueso epífisis y lavar la médula ósea con una jeringa de 1 mL con PBS estéril fría, en un tubo de 50 mL en hielo.
  4. Resuspender las células con una aguja de 18 G y la suspensión de células de filtro con un tamiz de 40 μm. Lavar una vez con PBS a 110 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender las células en 2 mL de PBS frío.
  5. Diluir 100% Percoll 9:1 en 10 x PBS y preparar soluciones gradiente de percoll 72%, 64% y 52% utilizando 1 x PBS. Cuidadosamente 2 mL de cada uno de los tres gradientes en un tubo de 15 mL de la capa, uno a partir de la más concentrada.
    1. Añadir cuidadosamente 2 mL de la suspensión de células de médula ósea sobre los gradientes y centrifugue a 1.100 x g durante 30 min a temperatura ambiente (RT) sin aceleración y freno.
  6. Retirar la banda en la interfaz entre 64% y 72% cuidadosamente y lavarla una vez a 200 x g durante 5 min a 4 ° C con PBS frío. Resuspender las células en un volumen de 100 μL de PBS y conservar en hielo. La pureza de los neutrófilos se espera que sea superior al 90%.
  7. Opcionalmente, neutrófilos de etiqueta con un kit de proliferación celular usando el protocolo del fabricante. Añadir el colorante a la suspensión de células a una concentración final de 10 μM en un volumen de 1 mL, incubar a 37 ° C por 30 min y lave (166 x g, 5 min).
  8. Estimar la concentración de células usando un hemocitómetro e inyectar por vía intravenosa de 5 x 106 células en un volumen máximo de 100 μL en los ratones previamente infectados de CD11c-YFP+ utilizando una jeringa de 1 mL aguja 26 G, 12 h antes de la proyección de imagen.

3. preparar el ratón para la proyección de imagen

  1. Anestesia
    1. Anestesiar ratones infectados de CD11c-YFP+ en día 3 p.i según paso 1.2.3.
    2. Una vez que los ratones son profundamente anestesiados, preparar un catéter de anestesia a dosis.
      1. Retire una jeringa con unas pinzas a una aguja de 30 G.
      2. Inserte la aguja a una pieza de 20 cm de tubo de silicona médica PE-10.
      3. Inserte una jeringa de aguja de 30 G con mezcla de ketamina/xilacina en el otro lado del tubo.
      4. Remover el aire dentro del tubo.
    3. Preparar un catéter de 20 G conectado a un tubo de una máquina de insuflación de oxígeno para mantener la ventilación automatizada (figura 1A). Establece en una relación de la respiración de 130 latidos por minuto (b.p.m.) con un volumen de 0,2 mL, utilizando una fuente de gas de oxígeno 100%.
  2. Preparar el mouse para la cirugía
    1. Mantenga el ratón sobre un tablero quirúrgico modificado para requisitos particulares específico (figura 1Aii-iii) sobre una placa caliente o un banco quirúrgico climatizado situado en 37 ° C para todo el tiempo de la cirugía.
    2. Afeitar el pelo del cuello del ratón con una afeitadora eléctrica y una crema depilatoria (figura 1Bi).
    3. Coloque el ratón por encima el ratón plástico posicional (figura 1Aii-a), manteniendo la cabeza animal fuera el posicional (figura 1Bii) para crear un ángulo que facilita la intubación de la tráquea.
    4. Fijar las patas delanteras, las patas y la cola con cinta quirúrgica, humedecer los ojos de ratón con un gel de vitamina A enriquecido y desinfectar el cuello del ratón (figura 1Bii).
  3. Cirugía
    1. Preparar artículos debidamente esterilizados, es decir, tijeras, tijeras de microcirugía y pinzas.
    2. Realizar una pequeña incisión en el eje largo medial del cuello, aproximadamente de 1 cm de largo, en la zona media entre la parte superior del pecho y la línea pasa por el punto inferior de la mandíbula (figura 1Biii).
    3. Mover lateralmente los parches de la piel y las glándulas salivales y visualizar la tráquea, cubierta por los músculos. Entonces, disecar los músculos traqueales cuidadosamente con las pinzas (figura 1Biii).
    4. Intubar el ratón con un catéter e iniciar ventilación artificial (figura 1Biv).
      Nota: El catéter se compone de una parte plástica externa, que protege a la mucosa traqueal y una aguja de hierro interior. La presencia de la aguja representa la solución ideal para ampliar y estabilizar la tráquea y a regular su exposición. Ventilación artificial a través del catéter garantizará la adecuada respiración del ratón.
    5. Inmediatamente iniciar la ventilación artificial a mouse monitor de respiración.
    6. Fijar el catéter altura y orientación mediante un gancho quirúrgico (figura 1Bv) conectado a la varilla específica en el tablero quirúrgico (ii-bde lafigura 1A). Exponer la tráquea a la altura de la barbilla.
    7. Rodean la tráquea con vaselina y cubrirla con unas gotas de PBS precalentada para garantizar una hidratación apropiada para el órgano (figura 1Bvi).
    8. Coloque el cubreobjetos sobre la preparación. Para este paso, pegar un cubreobjetos sobre un soporte metálico (figura 1Bvii), que se atornillarán al traductor XYZ (ii-cde lafigura 1A). Ajustar el traductor XYZ para colocar el cubreobjetos sobre la preparación quirúrgica.
    9. Coloque el catéter para la administración de la anestesia por vía intraperitoneal (figura 1Bviii).
    10. Inyectar el 50% de la dosis inicial de ketamina/xilacina mezcla cada 30 minutos.
      Nota: Vuelva a dosis de 50% a 25% de la mezcla inicial de ketamina/xilacina es una alternativa válida y segura25. Sin embargo, puesto que este protocolo es terminal y una estricta inmovilización del animal se requiere durante todo el procedimiento, utilizar dosis más altas para mantener un plano quirúrgico profundo de anestesia.

4. en Vivo imágenes de Time-lapse

Nota: Adquisición de imágenes se realizó con un microscopio de dos fotones vertical, equipado con dos láseres de Ti:Sa, cámara de incubación con temperatura controlada y una 25 X NA 1.1 objetivo de inmersión de agua. Los photomultipliers (PMT) utilizados para la adquisición de la imagen eran detectores de híbrido o alta sensibilidad GaAsP.

  1. Coloque el tablero quirúrgico con el ratón anestesiado dentro de la cámara de incubación de microscopio (precalentada a 37 – 38 ° C) y añadir una gota de agua sobre el cubreobjetos.
  2. Enfoque centro y encontrar en el tejido traqueal.
  3. La frecuencia de exploración a 800 Hz, con 520 x 520 pixeles, un campo de visión de 440 x 440 μm2 y línea media 1.
    1. Melodía Ti:Sa láser de 830 nm para excitar la generación de segundo armónico (SHG) de colágeno, con una potencia de indicativa en la fuente de 150 mW. Ajustar el segundo láser Ti:Sa 920 nm con 94 mW en origen, para excitar tanto PPC como YFP.
    2. Configuración 3D y modo de adquisición de timelapse con excitación simultánea
      Nota: Mantenga las potencias láser tan bajo como sea posible para minimizar el fotoblanqueo y fototoxicidad.
  4. Registro fluorescencia usando dos canales en modo no descanned, con un espejo dicroico amo a 560 nm. En la configuración utilizada en el presente Protocolo, un segundo espejo dicroico divide la señal a 495 nm para separar el canal 1 (filtro de emisión 475/50) de canal 2 (filtro de emisión de 525/50) (figura 2A). Esta configuración recoge SHG luz del colágeno en el primer canal, mientras que emisiones de CFP se recogen en ambos canales 1 y 2 y YFP se recoge únicamente en el canal 2.
  5. Definir un rango de 50 μm a lo largo del eje Z, con un tamaño de paso de 3 μm (μm del μm 0.86 x 3 del tamaño del voxel). Registro de imágenes cada 30 s para una duración total de 30 minutos.
  6. Si lo desea, adquirir múltiples regiones. Antes de ejecutar más adquisiciones, controlar signos vitales y reinyectar anestesia a través del catéter si es necesario (ver paso 3.3.10).
  7. Al final del proceso de proyección de imagen, eutanasia el ratón a través de la sobredosis de ketamina/xilacina seguido por dislocación cervical.

5. procesamiento y cuantitativo análisis de la motilidad de neutrófilos-DC y la interacción de la imagen

Nota: En el presente Protocolo, un software especializado de la proyección de imagen se utilizó para el análisis de los datos de microscopia.

  1. Después de completa la adquisición de imágenes de 4D, transferir los archivos (datos y metadatos) en una estación de trabajo con suficientes recursos computacionales (sugerido requisitos mínimos del sistema: 32 GB de RAM, CPU rápida sólido-estado-unidades, las últimas, dedicada GPU basada en un masivo arquitectura paralela).
  2. Abra los archivos en el software de imágenes.
  3. Reproducir el vídeo y asegúrese de que las células de interés son claramente visibles y que faltan artefactos de imagen.
    Nota: para ello, verificar que tanto el movimiento de la muestra y la variación de brillo son suficientemente confinado. De hecho, éstos representan retos para el análisis automático26. Si el movimiento de la muestra entre fotogramas adyacentes es excesivo, se aplica un método de corrección de deriva, usando por ejemplo el canal SHG como referencia fija. Esto permite medir mejor el movimiento de las células, más que el movimiento de la muestra. Además, en presencia de fondo claro o escombros, podar las superficies reconstruidas con volumen como un parámetro de selección.
  4. Generar un colocalización canal específico para las células de PPC+ , para separar la señal entre el PPC y el colágeno (SHG). Con este fin, denotan un polígono bloquea (figura 2B) que selecciona sólo los vóxeles tienen una intensidad positiva tanto en el canal verde y en el canal azul.
    Nota: Este procedimiento puede variar según el sistema de filtro del microscopio y la coloración de las células. Se logra seleccionando sólo vóxeles con suficiente intensidad en los canales azul y verde. Entre las herramientas disponibles, la funcionalidad de "coloc" puede utilizarse para calcular automáticamente el canal de colocalización basado en umbral de intensidad. Además, pueden utilizarse métodos basados en el aprender de máquina para este paso con la supervisión de un experto27.
  5. Detectar y rastrear las células PPC+ , con reconstrucción automática de la superficie y seguimiento (herramienta de superficie) por el canal de colocalización correspondiente.
    Nota: Curación Manual de seguimiento de eventuales errores y exclusión de pistas con una duración menor que un umbral definido (es decir, 150 s) pueden ser necesarios.
  6. Generar un colocalización canal específico para las células CD11c-YFP+ , para separar las señales de PPC y YFP. Con este fin, denotan un polígono bloquea (figura 2Bii) que selecciona sólo los vóxeles tienen una intensidad positiva en el canal verde, pero una baja intensidad en el canal azul.
    Nota: micrografías representativas que muestran las señales de canal 1, canal 2, el canal de la co-localización de CFP, el canal de la co-localización de YFP y la combinación de todos los canales se pueden encontrar en la figura 2Biii.
  7. Reconstruir la superficie de las células de CD11c-YFP+ y rastrear su posición en el tiempo (herramienta de superficie).
    Nota: Corrección Manual de errores de seguimiento eventual no es necesario para este paso. De hecho, debido a la compleja dinámica espacio-temporal de la C.C., reconstruyendo la superficie precisa de datos 2P-IVM es una tarea difícil que no se puede lograr con el software de segmentación disponibles. Entre las razones que hacen difícil esta tarea, delgadas salientes y variaciones de brillo no permiten el uso de ciertas técnicas de procesamiento de imágenes, tales como suavizado filtros o estático umbralización. Por otra parte, en una red de corriente continua, es difícil separar las células basadas sólo en su aspecto en datos 2P-IVM. Por estas razones, en lugar de intentar una segmentación precisa ajuste de parámetros del software, nos proponemos reconstruir superficies no precisa de DC. Luego, manejar los posibles errores mediante métricas robustos como se describe en 5.8.
  8. Migración de la célula de medida.
    1. Exportar las medidas clásicas de la migración para PPC+ y células CD11c-YFP+ . Entre ellas, el "promedio de velocidad de pista" indica el promedio de la velocidad migratoria de las células mientras que la "recta vía" indica la direccionalidad de las células. Estas medidas se pueden exportar como un archivo de hoja de cálculo desde el software de imágenes.
    2. En los archivos de hoja de cálculo exportado, calcular la "pista corregida rectitud" (también conocida como cociente corregido confinamiento) para PPC+ y células CD11c-YFP+ , que se define como "pista de rectitud" multiplicado por la raíz cuadrada de "duración de la pista" dividido por la raíz cuadrada de la duración del vídeo. Esta medida es más sólida que "vía recta" en presencia de corto seguimiento28, procedentes por ejemplo de seguimiento de errores.
      Nota: solo videos de la misma longitud pueden compararse con esta medida.
  9. Interacción de la célula de medida.
    1. Definir un contacto entre una célula de PPC+ y una célula de CD11c-YFP+ si su distancia (más voxels) es menor o igual a un umbral (es decir, 2 μm).
      Nota: Este umbral debe ser lo suficientemente estricto para detectar un contacto sólo cuando las células están muy cerca. Sin embargo, animamos a mantener este umbral mayor que 0, idealmente N veces más grande que el radio de voxel (N > 2), porque borde suavizado puede hacer la reconstrucción de las células más pequeñas que el tamaño de celda real.
    2. Cuenta el número y la duración de los contactos entre las células CD11c-YFP+ y PPC+ . En el software de imagen esto puede hacerse por ejemplo ejecutando un enchufe "kiss and run". Estas medidas se pueden exportar como un archivo de hoja de cálculo en la ficha estadísticas.
  10. Importar las medidas previamente computadas en un software estadístico, generar las parcelas y realizar pruebas estadísticas.

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Representative Results

En este trabajo describen un protocolo detallado para el estudio en vivo la motilidad y las interacciones entre neutrófilos y DC durante la infección por influenza en tráquea murino (Figura 3A). Para ello, se aislaron neutrófilos PPC+ (92% pureza; Figura 3B) de ECFP CK6 ratones y eventualmente trasladaron en un ratón de CD11c-YFP infectado con influenza. Después de eso, realizamos 2P-IVM de la tráquea en día 3 p.i En este momento observamos un claro reclutamiento de neutrófilos en el área infectada, como lo demuestra el análisis cytometric del flujo (figura 3). El protocolo de 2P-IVM requiere el uso de una placa quirúrgica específica y un proveedor de oxígeno para los roedores (figura 1A). Suministro de oxígeno a través de una cánula insertada en la tráquea ayudó al animal respirar, facilita la exposición de la tráquea y controla el movimiento del órgano asociado con la respiración (figura 1B). Tras este montaje experimental, adquirimos estable 4D imágenes en vivo en la tráquea infectada durante un período de 30 min (figura 3Dpelícula 1).

El análisis de las imágenes 4D adquirida a través de software especializado de imágenes permitió medir la migración de las células y para cuantificar la dinámica espacio-temporal de los neutrófilos y DC. En cuanto a la motilidad celular, observamos diferencias significativas entre el movimiento de la C.C. y los neutrófilos reclutados, que demostró una velocidad considerablemente más rápida que este último (Figura 4A). Este resultado confirma la naturaleza dinámica de los neutrófilos, descritas como células muy móviles capaces de migrar hacia un chemoattractant fuente29. Con respecto a direccionalidad, concluimos eso morfología compleja de la DC producida errores frecuentes en la célula de seguimiento, que a su vez produjo las pistas con la menor duración y mayor varianza del comportamiento direccional medido (Figura 4B). Por esta razón, se computaron una métrica robusta que es capaz de medir la direccionalidad considerando la duración de la pista. Usando esta métrica, observamos una diferencia significativa en la direccionalidad de neutrófilos vs DC (figura 4).

Adicionalmente, el cálculo de la distancia entre neutrófilos y DC permite detectar y analizar sus contactos con el tiempo. En este modelo experimental, se observan algunos neutrófilos que forman múltiples-breve contactos con DC y otros que no formaban ningún contacto durante el período de la imagen (figura 4). Por otra parte, el estudio de la tendencia promedio de la distancia entre neutrófilos y DC con el tiempo nos permitió estudiar el posicionamiento general de las células estudiadas (figura 4E), mientras que la investigación de la evolución de las células específicas que permiten caracterizar la comportamiento de cada célula individual (figura 4Fpelícula 2).

Figure 1
Figura 1: equipo y los pasos para P 2-IVM de tráquea murino. (Ai) El sistema de anestesia portátil animales a cargo de la ventilación automatizada está conectado a una bomba que suministra el oxígeno para el ratón. Vista frontal (Aii) y vista lateral (Aiii) de la Junta quirúrgica por encargo usada para el modelo traqueal. El Consejo está compuesto por una etapa de metal con un ratón de plástico posicional (Aii-a), una barra para sujetar una abrazadera movibles (Aii-b) y una multa ajustable traductor XYZ (Aii-c). (B) pasos secuenciales del modelo cirugía traqueal: retiro del pelo (Bi) del área quirúrgica, (Bii) posicionamiento del ratón anestesiado en el tablero quirúrgico, (Biii) exposición quirúrgica de la tráquea, (Biv ) intubación con catéter con ventilación artificial, (Bv) de fijación del catéter, además de (Bvi) de PBS la tráquea expuesta (Bvii) montaje del cubreobjetos y (Bviii) colocación de un catéter con la anestesia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: detección de la señal fluorescente durante IVM 2P. (A) representación esquemática de la detección del microscopio del filtro instalación y canales correspondientes. Espejo dicroico en 560 nm se separa azul/verde de rojas rojo/lejano emisiones. Espejo dicroico adicional a 495 nm se utiliza para reconocer más las diferentes subregiones del espectro de emisión. Canal 1 emplea un detector híbrido (filtro de emisión 475/50), mientras que la alta sensibilidad GaAsP PMT (filtro de emisión de 525/50) de canal 2 usos. (B) punto de dispersión representante parcelas de P 2 señales que muestran la estrategia bloquea para la generación de los canales de la colocalización de la identificación de la señal proveniente de la PPC (Bi) y los fluoróforos YFP (Bii). (Biii) Micrografías representativas que muestran las señales específicas de canal 1 (Ch 1, azul oscuro), canal 2 (Ch 2, verde), el canal de la co-localización de PPC (azul claro), el canal de la co-localización de YFP (amarillo) y la combinación de todos los canales (Ch 1 + Ch 2 + PPC + YFP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: imágenes 4D Intravital de neutrófilos y DC en una tráquea influenza infectada. (A) esquemático esquema del protocolo. (B) flujo representativo cytometric diagrama de dispersión que muestra el porcentaje de neutrófilos con respecto a las total células CD45 + en una suspensión de células aisladas de murina médula ósea utilizando el método de gradiente de Percoll. (C) flujo representativo cytometric diagramas de dispersión que muestra un aumento en la frecuencia de los neutrófilos en traquear de ratones no infectados en comparación con ratones infectados con el virus de la influenza en día 3 p.i (D) (panel izquierdo) anatómica de imagen de un murino tráquea que muestra el área seleccionado para la adquisición de la imagen. (Panel derecho) Representante de proyección en 3D de una micrografía de IVM P 2 mostrando la reconstrucción de la superficie de los neutrófilos (azul claro) y DC (amarillo) junto con sus huellas en el día 3 p.i señal SHG se muestra en oscuro azul. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: caracterización de neutrófilo y DC la migración y la interacción dinámica en tráquea influenza infectada. Parcelas representativas que muestran la velocidad significan (A), rectitud (B) de la pista y corrección rectitud de pista (C), según lo definido por Beltman y colaboradores (2009)28, de neutrófilos y DC en tráquea en día 3 p.i con virus de la gripe. La medición de rectitud pista corregida exhibe solidez para rastrear errores. (D) 2D histograma que muestra la frecuencia de neutrófilos según su número de contactos con la DC y la duración media de contacto. (E) distancia media de neutrófilos a la DC más cercano durante la duración de la película. (F) (izquierda) análisis de la distancia de un representante de neutrófilo a la DC más cercano en el tiempo. La línea roja punteada indica el límite de distancia para considerar que un neutrófilo estableció un contacto con un DC. (Derecho i-iii) Imágenes adquiridas en diferentes puntos temporales que representa la migración de un neutrófilo (azul claro) hacia un DC (amarillo). Pistas de celda se muestran como una línea multicolor que cambia de color de azul a rojo para representar la hora. Señal de SHG de colágeno fibrilar se muestra en azul oscuro. Barra de escala = 50 μm. En todas las cifras, los datos presentados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Resultados se dan como promedio ± SD. estadísticas por prueba de Welch. NS p > 0.05; p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Movie 1
1 película: neutrófilos y DC dinámica en la tráquea durante la infección por influenza. 30 min imagen 3D Time-lapse que muestra la dinámica de interacción entre neutrófilos (azul claro) y DC (amarillo), así como sus respectivas pistas con respecto a la red de colágeno (azul oscuro) de la tráquea. Representante del neutrófilo-DC interacciones están indicadas por flechas blancas. Pistas de celda se muestran como una línea multicolor que cambia de color de azul a rojo para representar la hora. Barra de escala = 50 μm. por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)

Movie 2
Película 2: Representante interacción neutrófilo-DC a corto plazo en la tráquea durante la infección por influenza. 30 min imagen 3D Time-lapse que muestra una interacción representativa entre un neutrófilo (azul claro) y una CC (amarillo) y sus respectivas pistas. Pistas de celda se muestran como una línea multicolor que cambia de color de azul a rojo para representar la hora. Señal de SHG de colágeno se muestra en azul oscuro. Barra de escala = 10 μm. por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)

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Discussion

Este trabajo presenta un protocolo detallado para la generación de imágenes de 4D que muestra la migración de neutrófilos eventualmente transferidos y sus interacciones con DC durante una infección de gripe en la tráquea de ratón. El modelo descrito P 2-IVM será relevante para el estudio de dinámica celular inmune durante una infección en las vías respiratorias.

Recientemente, varios modelos basados en la visualización de la dinámica de la célula en las vías respiratorias han sido desarrollados9,10,11,12,13,14,15 ,16. Sin embargo, es todavía un reto, teniendo en cuenta la posición anatómica de este órgano y las dificultades técnicas para reducir al mínimo el movimiento durante el ciclo de respiración30 en vivo la proyección de imagen del pulmón. Para superar estos problemas, algunos autores han propuesto el uso de una cámara de aspiración circular a la medida, que se inserta quirúrgicamente en el tórax13,14. Sin embargo, este procedimiento requiere una intervención invasiva que podría comprometer los resultados, especialmente en aquellos estudios que se han centrado en la investigación de la respuesta inflamatoria. Además, modelos quirúrgica pulmonar presentan una limitación para la proyección de imagen de tejido profundo debido a la refracción de la luz originada por el aire en los alvéolos17. Por el contrario, diferentes modelos traqueales han sido recientemente empleados para estudiar la dinámica celular en el epitelio de las vías respiratorias. Proyección de imagen de este órgano presenta claras ventajas en comparación con el pulmón, como la cirugía relativamente simple para exponer e inmovilizar el órgano, así como la mayor accesibilidad al epitelio traqueal. El modelo propuesto traqueal es también relevante para investigar la iniciación de la respuesta contra patógenos de las vías respiratorias, tales como virus de la influenza, ya que la tráquea es uno de los primeros sitios de replicación viral durante el curso de una infección de influenza8.

Curiosamente, un estudio que muestra una alternativa libre de intubación método de proyección de imagen la tráquea ha sido recientemente publicado12. Este método se caracteriza por una inflamación de la disminución y muestra claras ventajas en los estudios donde debe conservarse la función mucociliarity de las células epiteliales. Sin embargo, este método no garantiza una estabilidad suficiente y la adquisición de más brillantes señales necesarias para el estudio de contactos de la célula en un rango de unos pocos μm. por el contrario, el método presentado en el actual protocolo proporciona la mejor inmovilización del órgano Gracias a la intubación y permite la detección de la señal de fluorescencia más intensa debido a la distancia más corta entre el órgano y el cubreobjetos12.

Lograr la inmovilización de tejido durante la adquisición de imágenes en vivo P 2-IVM es el paso más crítico para generar datos óptimos. Algunas medidas cruciales que contribuyen a la estabilidad del método presentado incluyen: una anestesia adecuada ratón; una intubación correcta ratón; y una exposición quirúrgica de la tráquea que permite un fácil acceso al órgano por el cubreobjetos. Además, proyección de imagen el número correcto de células (idealmente 30 por campo de visión) servirá para fortalecer los resultados obtenidos. El reclutamiento del número óptimo de células dependerá en gran parte de la dosis de infección viral, que está muy influenciada por la adecuada administración del inóculo viral.

Otro paso fundamental del protocolo es la exposición quirúrgica de la tráquea. Pueden adoptarse diversas medidas para minimizar el daño causado a los órganos durante la cirugía. Por ejemplo, la tráquea no se debe tocar directamente con las herramientas quirúrgicas. En cambio, debe exponerse mediante la manipulación de sólo los tejidos circundantes (piel, glándulas salivales y músculos). Si es estrictamente necesario, la tráquea debe ser manejada con objetos sin filo. Además, deben realizarse esfuerzos para evitar el daño de los vasos sanguíneos. Finalmente, para evitar la deshidratación del órgano, también es importante cubrirse con PBS inmediatamente después de la cirugía.

A pesar de las ventajas únicas de este método sobre los métodos previamente descritos para la visualización de las interacciones de la célula inmune en la mucosa traqueal, el uso de este modelo presenta algunas limitaciones. Como se describió anteriormente, la presencia de inflamación asociados con la cirugía traqueal podría representar un inconveniente al estudiar la respuesta inmune. Para superar esta limitación, es posible administrar fármacos antiinflamatorios antes de la iniciación del procedimiento. Otra limitación de este modelo se relaciona con la presencia de una señal de Autofluorescencia fuerte existente en las vías respiratorias, que se genera principalmente por las células residentes y la capa de moco. Esta fluorescencia inespecífica crea artefactos que puedan interferir con el análisis. Además, se puede generar engañosa cálculo del parámetro de rectitud de pista cuando célula compara pistas de diferentes duraciones y al seguimiento de errores introducen pistas de corta duración26. Para superar este problema, se aplicó un coeficiente de penalización para corregir la rectitud del camino. Esa corrección se pretende minimizar el efecto de miss-seguimiento de resultados28.

Un aspecto crucial de experimentos P 2-IVM es la posibilidad de volver a utilizar los ratones que han sido sometidos a cirugía y la proyección de imagen. El en vivo imagen protocolo descrito aquí no requiere colección eutanasia u órgano animal, dejando así la posibilidad de recuperar y reutilizar ratones después de la cirugía para otros procedimientos. Uso de un ratón, por ejemplo, para realizar proyección de imagen de tráquea en momento diferentes puntos podrían disminuir considerablemente el número de animales totales en un experimento, apoyando el principio de la reducción de animales . Por otra parte, también podrían reducir variabilidad interindividual. Sin embargo, la reutilización y recuperación de animales deben seguir los estándares de bienestar animal que incluya la administración apropiadas analgésicos y antibióticos a los animales durante el tiempo de recuperación. Todos estos procedimientos deben incluidos en el protocolo de experimentación animal y aprobados por las autoridades veterinarias locales.

El protocolo descrito puede adaptarse fácilmente al estudio de otros tipos de células inmunes. Por ejemplo, aislamiento y la inyección de células de T de patógeno específico (fluorescentes o manchadas) podrían utilizarse para el estudio de la célula de T activación dinámica31 así como su interacción con otras células como los DC traqueal. De manera similar, la visualización de la sangre o los vasos linfáticos podría representar un enfoque interesante para estudiar el reclutamiento de células inflamatorias en el tejido traqueal durante el curso de la infección. Por otra parte, 2P-IVM de la tráquea también podría aplicarse para estudiar la dinámica de la respuesta inmune a otros patógenos aerotransportados. Por lo tanto, el uso de transgénicos fluorescentes patógenos aerotransportados, como Streptococcus pneumoniae32, creará nuevas oportunidades para el estudio de sus interacciones con el sistema inmunitario. Aunque este procedimiento se centra en medir la dinámica de las células inmunes durante la infección, podría ser también aplicado a diferentes campos como el cáncer, asma, o cicatrización de heridas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por las donaciones de la Fundación Nacional Suiza (SNF) (176124 145038 y 148183), europeo Marie Curie reintegración subvención de la Comisión (612742) y SystemsX.ch para una beca a D.U.P. (2013/124).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gigasept instru AF Schülke & Mayr GmbH 4% solution
CD11c-YFP mice Jackson Laboratories 008829 mice were bred in-house
CK6-ECFP mice Jackson Laboratories 004218 mice were bred in-house
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D8537-500ML
10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D1408-500ML
Percoll PLUS Sigma E0414-1L Store at 4°C
Ketamin Labatec Labatec Pharma 7680632310024 Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture
Rompun 2% (Xylazin) Bayer 6293841.00.00 Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak BD Plastipak 305501
30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes BD 324826
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
2 mL Syringes BD Plastipak 300185
Microlance 3x 18 G needles BD 304622
Introcan Safety 20 G (catheter) Braun 4251652.01
6 Well Cell Culture Cluster Costar 3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1x) ThermoFisher Scientific 42401-018 Store at 4°C
Liberase TL Research Grade Roche 5401020001 Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture
DNAse I Amresco (VWR) 0649-50KU Store at -20 °C
CellTrace Violet stain ThermoFisher Scientific C34557 Store at -20 °C
EDTA Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106 Store at -20 °C
PE-10 Micro Medical Tubing 2Biological Instruments SNC #BB31695-PE/1
Surgical Plastic Tape M Plast
Viscotears Bausch & Lomb Store at RT
Plasticine Ohropax
High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round Warner Instruments 64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Nuvo Lite mark 5 GCE medline 14111211
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) Tem Sega
SURGICAL BOARD University of Bern
TrimScope II Two-photon microscope LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasers Coherent Inc.
25X NA 1.05 water immersion objective Olympus XLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller Life imaging Services
Imaris 9.1.0 Bitplane Imaging software
GraphPad Prism 7 GraphPad Statistical software

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References

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