בידוד של CD4+ תאי-T וניתוח של מחזורי Helper T-הזקיקים (cTfh) קבוצות משנה תא מ באמצעות דם היקפיים של Cytometry זרימה 6-צבע

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

. הנה, עבור בידוד ואפיון של CD4 פרוטוקול+ T-cell קבוצות משנה של דם היקפיים אדם מתואר. לטהר CD4+ תאי-T הם נותחו על ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של T-הזקיקים תא מסייע קבוצות משנה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Byford, E., Carr, M., Piñon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e58431, doi:10.3791/58431 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

חריגה הזקיקים-T helper (Tfh) תא לזיהוי של מחלות אוטואימוניות ולא נוכחותם קשורה עם התוצאות הקליניות כאשר הצומת לימפה microenvironment ב B-cell לימפומה שאינה הודג'קין של ניתוח. קבוצות משנה של מחזורי T-helper תאי (cTfh), תא זיכרון מחזורי Tfh תאים בדם, הם גם מוטרד במחלה, לפיכך מייצגות פוטנציאל סמנים ביולוגיים חזוי הרומן. בדיקות מבוססות-דם היקפיים היא יתרון כי היא יחסית לא פולשנית, מאפשר ניטור טורי פשוטה. מאמר זה מתאר שיטה אנליטית CD4+ תאי T-דם אנושי, ולאחר ניתוח נוסף מאת cytometry זרימה לספור תאים cTfh, את הפרופורציות של קבוצות משנה שונים שלהם (cTfhPD-1-/ + / שלום, cTfh1, 2, 17 ו- cTfh1/17). הרמה של קבוצות משנה אלה השוו בין נושאים נורמליים, חולים עם לימפומה. מצאנו כי שיטת הפעולה היתה יציבה מספיק כדי להשיג תוצאות אמינות של החומר המטופל שנאספו באופן שגרתי. הטכניקה שנתאר לניתוח ניתן להתאים בקלות מיון תא ויישומים במורד הזרם כגון RT-PCR.

Introduction

T-helper תאי (Tfh) הם CD4+ משנה T-cell שאפיינו היה בתחילה רקמות הלימפה1. תאים אלה מביעים PD-1 קולטנים משטח CXCR5, מפרישים IL-21 ו- IL-4 ולהראות ביטוי הגרעין של הגורם שעתוק, BCL-62,3. כפי שמרמז שמם, הם נמצאים במרכזים נבטי, הם חיוניים עבור ייצור נוגדנים זיקה גבוהה1.

תגובות Dysregulated Tfh היו מעורבים בפתוגנזה מחלה, מחלות אוטואימוניות שהבולט, איפה הם מקדמים את התרחבות autoreactive B תאים4. הם גם לשחק תפקיד microenvironment הגידול של סרטן הלימפה7והן מוצק5,6 . לעומת זאת, פגמים גנטיים של חלבונים פני שטח חיוני Tfh לתפקד כמו התוצאה costimulator (ICOS) T-cell inducible הכשל החיסוני האנושי תסמונות8. CD4+ CXCR5+ בתאי דם היקפיים אדם מכונים במחזור T-helper תאי (cTfh), מאמינים כי תא זיכרון Tfh תאים ברקמות9. מטרת השיטה המתוארת כאן היא הניתוח של קבוצות משנה cTfh בעקבות CD4+ תא בידוד של דגימות דם היקפיים.

מספר קבוצות משנה cTfh הוגדרו, היעילות שבה הם מספקים עזרה B-cell שונה משנה אחת עוד9,10,11,12. כמויות יחסיות של קבוצות משנה אלה שונו במספר מחלות, לרוב בצורה בולטת מחלות אוטואימוניות שבו שם הוא כמעט תמיד עלייה יחסית יותר פונקציונלי PD-1/ היי ו/או קבוצות משנה cTfh2 או cTfh17, לעומת הפחות משטרת פונקציונלי- 1 ו/או קבוצות משנה cTfh112. היקף השינויים הללו לעתים קרובות לשייך פרמטרים קליניים, כולל מחלת titers פעילות של נוגדן עצמי, המעידים על תפקיד אפשרי של התפלגות משנה cTfh כמו סמן prognostic במחלה, אשר עשוי לשקף את הפעילות של Tfh ב רקמות הלימפה9,12,13,14. בנוסף, לקחת דגימות דם המשתתפים זו קביל, מהירה ובטוחה, ומאפשר אז טורי ניטור לניתוח של התקדמות המחלה או תגובה לטיפול.

השימוש של CD4 מבודד+ תאי-T על המתלים תאי תא (PBMNC) המסורתית דם היקפיים מאפשר גבוה יותר תפוקה לזרום cytometry ניסויים על-ידי צמצום הזמן הנדרש כדי לרכוש מספר ניכר של תאים cTfh לניתוח. אפשרות זו שימושית במיוחד בעת מיון תאים cTfh נדיר קבוצות משנה באמצעות זרימת הפעלת התא מיון (FACS). לסייע את היעילות, תרחיפים אלה יכול להיות cryopreserved כדי לאפשר "אצווה" של דגימות ייעשה הניסוי cytometry זרימה. על בדיקות, CD4 את+ טוהר לא נוכה הקפאה קריוגנית.

בעוד מעבדות שונות נעשה שימוש סמנים שונים כדי סיווג חלוקה לקטגוריות cTfh תאים בשלבים המוקדמים של גילוין, השיטה המוצגת כאן עושה שימוש ערכה אחידה של שתי קבוצות של תאים-פני סמני כפי שהוצע על ידי שמידט ואח12, 15 כדי לאפשר זיהוי סימולטני cTfh ו שלהם קבוצות משנה מוכרת תשע ב cytometry זרימה יחיד הניסוי.

היחידה סמני פני שטח התא משמשים, התאים אינם מצריכים קיבוע או permeabilization, ולכן יכול להישאר בחיים ללימודי פונקציונלי במורד הזרם. זה יכול להיות בהנחייתם של התא מיון באמצעות FACS באותו פאנל נוגדן. לוח זה יכול להיות מורחבת לכלול סמנים אחרים, ומאפשר ההגבלות של cytometer זרימת בשימוש.

הניתוח של ניסויים cytometry זרימה צבע רב יכול להיות מאתגר בשל אופיו מטבעם סובייקטיביות של gating על נקודה 2-ממדי חלקות, במיוחד כאשר אוכלוסיות תאים שאין התפלגות ברורה bi-מודאלי סמן פלורסצנטיות, כמו גם במקרה של תאים cTfh, קבוצות משנה שלהם. מסיבה זו, זה הכרחי כדי להגדיר את הפקדים יעיל כדי להפחית את חפצי אמנות כדי לאפשר רזולוציה טובה יותר של אוכלוסיות וכדי להגדיר gating אסטרטגיות בביטחון. ככזה, עיצוב לוח נוגדן, את הסידור של פקדים בסיסיים עבור cytometry זרימה הניסוי, קרי, באמצעות פיצוי, FMO הפקדים יוקפו בקו שלב 3.4.2 ועל 3.4.3,respectively.

כל התאים cTfh מוגדרים CD4+ CXCR5+ CD45RA. ניתן לקבוע את רמת הביטוי של דה מרקר הפעלה האופיינית Tfh PD-1 ואז לזהות תת-קבוצות של PD-1-, PD-1+ או PD-1היי cTfh תאים. לאחר מכן, באמצעות שילוב של קולטני כימוקין CXCR3 ו CCR6, אשר מתבטאים באופן שונה על ידי Th1 מסורתיים, 2 או 17 תאים, cTfh שניתן לאפיין cTfh1, 2 או דמוי-17 על ידי פרופיל של CXCR3+ CCR6-, CXCR3CCR6- , ו CXCR3CCR6+, בהתאמה.

לוח הנוגדן בשימוש על ידי המעבדה שלנו מוצג בטבלה1. המשתמש, ייתכן שיהיה עליך להתאים את הבחירה שלהם fluorophore לקחת בחשבון הלייזר ואת תצורת המסנן קלות זמינים על cytometer זרימה המקומי שלהם.

השיקולים הבאים להשפיע על בחירתו של fluorophores. השתמש fluorophores בהיר במידת האפשר. בפרט, להשתמש fluorophores זמין המבריקים של הסמנים (ביטוי פחות מאוד) dimmest. סמני דימר כוללים PD-1, CXCR3, CCR6, וכדי במידה פחותה CXCR5. אנחנו ספציפית הפך השימוש החדשים BB, BV, שתקנה לעצמך fluorophores אשר לספק בהירות מצוינת, ובכך לאפשר פתרון קל יותר של אוכלוסיות שונות של תאי.

מורחים את הבחירה fluorophore על פני ספקטרום פליטה ככל האפשר למזער חפיפה ספקטרלי וכך רמת הפיצוי הנדרש. כלי מקוון חינם, ניתן להשתמש כדי לסייע בתכנון לוח cytometry זרימה ניתן למצוא כאן: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. כדי לחסוך מקום על ספקטרום הפליטה, אנחנו מועסקים "ערוץ ה-dump" באמצעות צבע הכדאיות עם אורך גל פליטה החופפים עם זה של APC-H7 (מצומדת כדי CD45RA) כדי לאפשר את איתור (להדרה) של שניהם מתים ו/או CD45RA+ שימוש גלאי יחיד.

. הנה, פרוטוקול מוצג הבידוד של דם היקפיים CD4+ תאי-T וניתוח עוקבות שלהם על-ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של שונות, תיאר לאחרונה במחזור קבוצות משנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דגימות דם, התקבלו נושאים נורמליים (NS) (n = 12) כמו גם בחולים עם לימפומה אזור שוליים (MZL) (n = 7) ובסוגים אחרים של B-cell לימפומה שאינה הודג'קין של (BNHL) (פל 6 חולים, חולי לימפומה lymphoplasmacytic 2 ו 1 בדרגה נמוכה B-cell לימפומה הודג'קין לא צוין אחרת החולה). חולים גויסו מן המרפאות המטולוגיה-במרפאה המלכותית לסטר לאחר בנתינתו הודיעו, הסכמה בכתב, באישור אתית במקום עבור כל מחקרים. אישור מוסרי היה מתקבל על ידי לאיססטרשיר, נורת'האמפטונשייר ראטלנד מחקר אתיקה הוועדה 1, התייחסות 06/Q2501/122 רשות המחקר תקינות (HRA) NRES ועדת מזרח המידלנדס-הדרבי ודוגמאות החולה, הפניה 14/EM/1176 עבור נושאים נורמליים.

1. בידוד של CD4+ T-תאים מדם היקפי לגמרי

  1. לקחת דם היקפיים טרי (2-15 מ"ל) K2EDTA צינורות מאת venipuncture רגיל ותהליך בהקדם האפשרי כדי לשמור על יכולת הקיום המרבי.
    הערה: לשימוש מעבדה סטנדרטיים ציוד מגן אישי (מעיל, כפפות, משקפיים) ולבצע את העבודה בכיתה II אבטחה הקבינט.
  2. להביא את הדם, ריאגנטים נחוץ כל (CD4+ העשרה קוקטייל, 2% עוברית שור סרום/פוספט buffered תמיסת מלח (FBS/PBS), מדיה הדרגתיות צפיפות ומקפיא בינונית אם cryopreserving תאים) לטמפרטורת החדר.
  3. לערבב את הדם עם קוקטייל זמינים מסחרית של נוגדנים עבור העשרת של CD4 האנושי+ תאי T. השתמש µL 50 מהתרכובת עבור כל 1 מ"ל של דם. השתמש צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל 5-15 מ של דם.
    הערה: אם משתמש 2-4 מ"ל של דם, לבצע שלב זה צינור פוליפרופילן חרוט 14 מ.
  4. דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
  5. לדלל את התערובת עם אמצעי אחסון שווה 2% FBS/PBS
  6. שכבה זו תערובת מדולל על המדיה הדרגתי של צפיפות לאט כדי להימנע מהפרעה הממשק והמשך צנטריפוגה מיד כדי למנוע דיפוזיה של הדם לתוך המדיום הדרגתיות צפיפות.
    1. עבור 2-3 מ"ל של דם, להשתמש 3 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור פוליפרופילן חרוט 14 מ"ל, אך עבור 4 מ"ל של דם, להשתמש 4 מ של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור פוליפרופילן חרוט 14 מ"ל, 5-15 מ"ל דם , להשתמש 15 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל.
  7. Centrifuge התערובת שכבתית עבור 20 דקות ב x 1200 גרם עם הבלמים ב 20 º C.
    הערה: טמפרטורה מתחת לממוצע עלול לגרום לזיהום עם כדוריות דם אדומות, גרנולוציטים. מהירות נמוכה יותר יגרום CD4 את+ בתהליך בידוד להיכשל. עוזב את הפסקה העוסקת יקטן תא התשואה. השתמש צנטריפוגה העליון ספסל עם רוטורים כי ניתן לסגור כדי להימנע אירוסולים.
  8. הסר את CD4 מועשר+ שכבת תאים מממשק באמצעות פיפטה של פסטר.
    הערה: השכבה תא מועשר ידמה תקן "המעיל באפי" של תאים לבנים מעוננים, אלא רק CD4+ תאים קיימים, זה כמובן יהיה קטן יותר, קשה יותר לראות.
  9. להוסיף 2% FBS/PBS כדי CD4+ תאים עד הנפח הכולל של 10 מ"ל, ואז לשטוף פעמיים עם 2% FBS/PBS מאת צריך שתוציאו 10 דקות ב x 400 גרם במהלך כל כביסה.
  10. Resuspend בגדר ב 2% FBS/PBS, ספירת התאים צבעונית עם צבע חיוני (trypan blue) כדי לקבוע את מספרי הטלפון הנייד ואת הכדאיות.
  11. שלב אופציונלי: resuspend 5 x 105 עונה 1 פרק 10 תאים6 קפואים בינוני (10% דימתיל סולפוקסיד ב FBS) aliquots 1 מ"ל.
    הערה: רמות של כמה סימונים משטח עשוי להשתנות על ידי שימור-הקפאה והפשרה. זה, לכן, חשוב מאוד כי כל דוגמאות מעובדות בצורה עיקבית. כדי למזער את הבדלי במשתני אנליטית, הדגימות היו הקפאה- משומרים אצווה עבור ניתוח במחקר זה.

2. דנ

  1. להפשיר את CD4 cryopreserved+ תאים במהירות בתוך אמבט מים 37 ° C ו לשטוף פעם בכמה מראש ומחוממת בינוניים (RPMI 1640 + -גלוטמין בתוספת 10% FBS ו 1 x פניצילין-סטרפטומיצין).
  2. להוסיף את התאים 9 מ של מדיום, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 400 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
  3. Resuspend תאי 1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS (50 µL) כך כל תנאי להיבדק משתמשת בין 5 x 105 עונה 1 פרק 106 תאים.
  4. מערבבים את התאים עם מאגר מכתים (50 µL).
    הערה: מאגר כתם מבריק מונע חפצי מכתימים שונות שעלולות לפגוע ניתוח נתונים כאשר שניים או יותר BV או שתקנה לעצמך כתמי משמשים בו זמנית עקב הטבועה את התכונות הכימיות של צבעים אלה. בתנאים יחיד או מוכתם, µL 50 כתם מבריק מאגר הרבה מכדי µL 50% 1 BSA/PBS.
  5. להוסיף את הנוגדנים לתאים (לפי "אחסון בו נעשה שימוש" טור ב טבלה 1), דגירה על קרח בחושך למשך 30 דקות.
  6. לשטוף את התאים פעמיים ב 1% BSA/PBS מאת צריך שתוציאו למשך 3 דקות ב x 600 גרם במהלך כל כביסה.
  7. Resuspend 1% BSA/PBS (400 µL), העברת צינור רכישה של cytometry זרימה.
  8. מערבולת התאים בעדינות לפני רכישת על cytometer זרימת נתונים:

3. לזרום Cytometry פקדים והתקנה

  1. באמצעות דוגמה וללא רבב, להגדיר את המתחים פוטודיודה כך לימפוציטים ניתן להפריד פסולת ברור, תאים מתים (אירועים עם צד גבוהה פיזור (האס) אזור ואזור פיזור קדמי נמוך (FSC))16. באמצעות דגימות מוכתם יחיד, להגדיר האופטיקה המתחים (PMT) כך פלורסצנטיות חיובי מבחינים מן הרקע פלורסצנטיות תוך הקפדה כי כל האירועים למניית בסולם לזיהוי.
    הערה: שיפור יהיה מגרש של קורות חיים נגד מתח PMT בכל PMT באמצעות חרוזים במעומעם פלורסנט כדי למצוא את המתח המינימלי לפתרון האופטימלי ("שיא 2" שיטת19).
  2. חשבון עבור ספקטרלי חפיפה על ידי יצירת מטריצה פיצוי באמצעות כתמים יחיד עם לכידת חרוזים. להוסיף חרוזים פיצוי זמינים מסחרית (60 µL), וחרוזים בקרה שלילית (60 µL) 1% BSA/PBS (100 µL), ו מערבולת.
    הערה: החרוזים ללכוד להשתמש להתאים את המארח מינים ו IgG isotype של הנוגדן בשימוש. המטריקס הפיצוי צריך להיות מחושב מחדש אם המספר הרבה של כל טנדם צבענים שינויים, כפי הם יכולים להציג את השתנות ניכר ב ספקטרום הפליטה שלהם בין מגרשים.
  3. להוסיף נוגדן בודד (20 µL) ו מערבולת.
  4. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות.
  5. צנטריפוגה ב x 200 גר' 10 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  6. Resuspend, 1%BSA/PBS (500 µL) ו מערבולת.
  7. רוכשים את הדגימה עם cytometer זרימה באמצעות הגנרטור מטריקס פיצוי המיועד לכך בתוכנה רכישה בהתאם להוראות היצרן.
  8. השתמש בפקדים FMO להנחות את המיקום של השערים עבור קרינה פלואורסצנטית סמן חיובי עבור לשפוך צבע, אשר הוא המקור העיקרי של רקע זריחה בניסויים באמצעות צבעים ≥416. בצע ההכתמה תא-פני כללי הפרוטוקול כפי שמתואר בשלב 3, אבל עבור כל תנאי, להשמיט אחד fluorophores מהשלב מכתימים (היכן CD45RA מושמט, גם להשמיט את הכתם חי/מת). רוכשים לימפוציטים 100,000 עבור כל תנאי.
  9. להגדיר את הגישה החיובית שער ב- % ≤0.5 של תאים. ראה איור 2 לדוגמא מאויר של פקדים FMO.

4. ניתוח נתונים

  1. מעסיקים רכישת תוכנה של cytometer זרימה כדי לקבוע סף של 5,000 יחידות על הפרמטר FSC להוציא פסולת קטן מאוד.
  2. השתמש שער עוצר כדי להשיג 10,000 תאים cTfh (CD4+ CD45RA CXCR5+).
    הערה: המשתמש הבודד יכול לאסוף יותר מ-10,000 תאי. מספר זה היה פשרה בין איסוף מספיק תאים לספק תוצאה משמעותית את משך הזמן לאוסף.
  3. באמצעות FSC-אזור / מגרש נקודה האס-אזור, לצייר דרך שער אליפסה או מצולע כדי לבחור את אוכלוסיית לימפוציטים בזמן למעט פסולת, בגלוי מת תאים (אירועים עם האס גבוהה-אזור ואזור נמוך FSC-).
  4. באמצעות FSC-אזור FSC ברוחב נקודה העלילה, צייר מצולע שער כדי לבחור תאים בודדים שיתופם של doublets (doublets יש אזור מוגברת אבל רוחב דומים לתאים בודדים).
  5. באמצעות FSC-אזור / סמן CD45RA ואת הכדאיות לנקד העלילה, לצייר שער מלבני כדי לבחור לחיות, CD45RA תאים (תאים עם פלורסצנטיות נמוך עבור סמן זה).
  6. באמצעות FSC-אזור / CD4 לנקד העלילה, לצייר שער מלבני לבחירת CD4+ תאים (תאים עם פלורסצנטיות גבוהה עבור סמן זה).
  7. שימוש של CD4 / CXCR5 נקודה העלילה, לצייר שער מלבני לבחירת CXCR5+ (קרי cTfh) תאים (תאים עם פלורסצנטיות גבוהה עבור סמן זה).
  8. באמצעות CXCR3 של CCR6 נקודה העלילה, לפני ארבע ליבות שער משנית cTfh תאים לתוך cTfh1, תאים 2 ו- 17 (תאים שנמצאים גבוה ונמוך עבור כל סמן).
    הערה: תאים בעלי פנוטיפ CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ הן מאופיינות היטב. אנחנו מתייחסים לתאים אלו cTfh1/1718 כי המסייע קונבנציונאלי תאי-T (CD4+ CXCR5) זה עושים מעבר מיגדרי בין Th17 ו- Th1 הצג ביטוי של CXCR3 CCR6, תוארו cTfh1/1719.
  9. באמצעות היסטוגרמה PD-1, השתמש בכלי טווח משנית תאים cTfh (או אם מועדף, cTfh1 בודדים, קבוצות משנה 2, 17 או 1/17) לתוך PD-1-/ + או אוכלוסיות שלום .
    הערה: ההבחנה בין PD-1+ ו- PD-1היי אינה מוגדרת היטב בספרות. הסף נקבע כמו באותה אינטנסיביות PD-1 הדרוש לאיתור תמת-Tfh ב השעיות לימפוציט שקדים האנושי באמצעות cytometry זרימה עם נוגדן באותו הפאנל. לחלופין, ניתן להוסיף סמן ICOS ללוח נוגדן, כפי PD1שלום תאים ICOS+.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CD4 גבוהה+ טוהר הושג באמצעות CD4 את+ בידוד פרוטוקול, אשר היה אמין בכל הדוגמאות הדם נבדק על ידינו (כלומר: 96.6%, SD: 2.38, n = 31) (איור 3).

זיהוי של cTfh (CD4+ CXCR5+ תאים) בנושא נורמלי נציג מוצג (איור 4א). חלקם של cTfh הכולל תאים בתוך CD4+ תאים היה ערך החציוני של 29.4% (הבין-הרביעון טווח (IQR) = 10.8) על פני 12 נושאים נורמליים. מחקרים רבים על פני מספר מחלות שונות כולל17,קרצינומה hepatocellular20, זאבת מערכתית erythematous11,21ו דלקת מפרקים שגרונית11,14 היו מתנגשים ביכולת לזהות הבדל בין הפקדים heathy חולים cTfh הכללית. אין הבדלים משמעותיים נמצאו cTfh הכללית בין נושאים נורמליים MZL או BNHL חולים (איור 4B)21.

זיהוי של PD-1 ביטוי בתוך התאים cTfh נציג הנושא נורמלי, BNHL החולה להשוואה מוצג באיור 5א. הביטוי PD-1 היה גבוה באופן משמעותי בחולים MZL ו- BNHL נושאים נורמליים (איור 5B)21. דומה העלאות PD-1 ביטוי הוכחו במספר הפרעות אוטואימוניות11,12,13,14.

זיהוי של cTfh1, 2, 17 ו- 1/17 בתוך האוכלוסייה של תאים cTfh שימוש בביטוי CXCR3 ו- CCR6 מנושא נורמלי נציג מוצג באיור 6א. הפרופורציה של תאים cTfh1 היה גבוה באופן משמעותי בחולים MZL ו- BNHL נושאים נורמליים (איור 6B)21.

Figure 1
איור 1 : איור של הכללית אסטרטגיה המגביל המשמש לזיהוי תאי cTfh ואת קבוצות משנה שלהם. משמאל למעלה, אוכלוסיה של לימפוציטים נבדלים, doublets אינם נכללים. חיים CD45RA התאים שנבחרו באמצעות ערוץ"המזבלה". CD4+ תאים הן פיקוח ו CXCR5+ תאים אלה מזוהות cTfh. cTfh מחולקים cTfh1, 2 או 17 כמו שימוש בביטוי CXCR3 ו- CCR6. PD-1 הביטוי בתוך קבוצות משנה אלה ואז מכובד. דמויות נלקח דגימת דם הנושא נציג רגיל. FSC-A, אזור FSC; באזור האס האס-A; FSC-W, רוחב FSC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : שולט איור של FMO. כל חלקה cytometry זרימה biaxial מראה CD4+ תאים מוכתם fluorophores כל. מלבד עניין כדי להדגים את המינימום בשערי אילו עבור קרינה פלואורסצנטית חיוביות ניתן להגדיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : מגרש cytometry זרימה biaxial מציג את הזיהוי של CD4 + תאים לאחר gating לחיות לימפוציטים. נלקח מתוך דגימת דם הנושא נציג רגיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : זיהוי של תאים cTfh. (א) Biaxial לזרום cytometry מגרש מציג CXCR5+ ביטוי בתאי מגודרת עבור CD4+ CD45RA. נלקח מתוך נושא נורמלי נציג. (B) האחוזים היחסיים של cTfh בתוך CD4 הכולל+ תאים במקצועות נורמלי (n = 12), MZL (n = 7), BNHL (n = 9). קווים אופקיים לייצג את החציון, קווי שגיאה מייצגים הבין-הרביעון טווח. אין הבדלים משמעותיים נמצאו בין הקבוצות באמצעות מבחן מאן-ויטני U. איור זה השתנה Byford et al.21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : PD-1 ביטוי ומערכת היחסים לתאים cTfh. (א) לזרום cytometry היסטוגרמה לקביעת PD-1 ביטוי בתוך התאים cTfh הכולל. שנלקחו נציג הנושא נורמלי, BNHL החולה. (B) PD-1+ תאים ביחס cTfh הכולל תאים. קווים אופקיים לייצג את החציון, קווי שגיאה מייצגים הבין-הרביעון טווח. Medians הם באופן משמעותי (מאן-ויטני U-מבחן) שונה בין נושאים נורמליים (21.5%, IQR 10.8, n = = 12), חולי לימפומה (MZL 54.1%, IQR = 21.2, n = 7, p = 0.0008 ו- BNHL 45.2%, IQR = 11.4, n = 9, p = 0.0003). איור זה השתנה Byford et al.21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : CXCR3 CCR6 הבעה והקשר שלהן למספרים cTfh1. (א) Biaxial זרימה cytometry מגרש מציג את הביטוי של CXCR3 ו CCR6-CD4+ CD45RA CXCR5+ תאים. שנלקחו נציג הנושא נורמלי, BNHL החולה. תאים cTfh1 (B) כאחוז של תאים cTfh הכולל. קווים אופקיים לייצג את החציון, קווי שגיאה מייצגים הבין-הרביעון טווח. Medians הם באופן משמעותי (מאן-ויטני U-מבחן) שונה בין נושאים נורמליים (20.8%, IQR = 6.7, n = 12), חולי לימפומה (MZL – 32.1%, IQR = 6.8, n = 7, p = 0.013 ולאחר BNHL 35.4%, IQR = 7.6%, n = 9, p = 0.0056). איור זה השתנה Byford et al.21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Table 1
טבלה 1: לוח נוגדן cytometry זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מייצג דרך פשוטה ויעילה כדי לנתח את היקפי cTfh כדוריות הדם, המאפשר הזיהוי של כל קבוצות משנה רלוונטיים שזוהו עד כה בספרות. דגימות דם ניתן בקלות וביעילות להשיג כפי ניתן לאסוף חלק סטנדרטי-חולה מרפאות ודוגמאות טורי במקביל נתונים קליניים. בתורו, פעולה זו מאפשרת מחקרים להערכת ערכות משנה cTfh כמו סמנים ביולוגיים עבור התקדמות המחלה או התגובה לטיפול. מחקרים אלו להיות מוצדקת במיוחד מחלת איפה Tfh dysregulation מעורבים בפתוגנזה כגון מחלת חיסון עצמי וסוגים מסוימים של סרטן haematological ומוצקה. בנוסף, השינויים בתפקוד cTfh מחלה יכולה ייבדקו על-ידי מיון cTfh תאים באמצעות cytometry זרימה כמו היחידה סמני פני שטח התא נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה. מיון cTfh תאים בחולים MZL אפשרה לנו למצוא הבדלים ג'ין פרופילי ביטוי בהשוואה נורמלי נושאים21.

מצאנו את זה יעיל CD4+ T-cell בידוד משופר ניתוח הנתונים. אנו מתארים את השלבים הכרוכים בפירוט בגלל בעיות משניות כגון צנטריפוגה בלימה ומהירות היו קריטיים להליך בידוד. צעד חשוב נוסף, כמו כל ניתוח cytometry זרימה, הוא להגדיר את הפיצוי בקרות FMO.

PD-1 ביטוי משתנה על תאים cTfh, תאים המכילים הגבוהים של PD-1 יכול להיות הכי פונקציונלי, לכן רלוונטי, במיוחד לצורך המחקר של מחלות אוטואימוניות11,12. נושא חשוב אחד היה להחליט את השער לצורך זיהוי PD-1היי תאים, המשנה cTfh מופעל, אין גבול רגיל מוגדר בספרות. משנה זה חשוב אבל קטין משקף כנראה הפעילה Tfh התמיינות רקמות הלימפה11. כדי להתגבר על האתגר הזה, הסף נקבע כך זה היה זהה לזה הנדרש כדי לזהות תמת-Tfh תאים אנושיים שקדים עם הפאנל נוגדן באותו. אנו מכירים כי קבלת השקדים עשוי להיות בעייתי עבור משתמשים מסוימים. לחלופין, יהיה להרחבת החלונית הנוגדן בשימוש פרוטוקול זה תוספת של אנטי-ICOS, כמו רק PD-1היי תאים ICOS+ 12.

כאן, אנו מציגים לוח נוגדנים כדי לזהות האופיינית של מחזורי CD4 משטח סמנים+ תאי-T. מחזורי תאים תקינה T-הזקיקים (cTfr) הם תא זיכרון דם של תאים תקינה T-הזקיקים (Tfr) כי תושב ברקמת הלימפה, יש תפקידים חשובים בוויסות מרכז נבטי תגובה22,23 . cTfr הם דם CD4+ CXCR5+ תאים הזה שותף אקספרס T רגולטורי תא סמני כולל את הפקטור שעתוק FoxP3. מדידת cTfr לצד cTfh עשוי לספק תמונה שלמה יותר של פעילות במרכז נבטי, יכול להציג סמן למחלה משלו נכון24. למרות cTfr מספרים נמוכים מטבעו (כלומר: 1.82%, SD: 1.40, n = 24 של CD4 הכולל+ תאים בניסויים שלנו), הפרדת cTfr מ- cTfh גם יגדל יחודיות של ניתוח cTfh. הוספת שילוב מסוים סמנים תא-פני T רגולטורי ללוח שלנו כגון CD25, CD12725 תאפשר זיהוי cTfr בנוסף כל קבוצות משנה cTfh בניסוי אותו באמצעות פרוטוקול דומה מאוד. לחלופין, ניתן להשתמש בסמן רגולטוריות תאיים הקלאסית יותר FoxP3, אבל זה דורש קיבוע permeabilization מניעת מבחני פונקציונלי במורד הזרם. להתרכז על ניתוח cTfh, עם זאת, ישנם גם יתרונות הגדרת לוח מינימום זה יכול להיות מועסק בשיתוף עם cytometer זרימה של מעבדה רגיל להשיג קלינית או תוצאות שימושיות השפעול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

העבודה נתמך על ידי מענק של לוקמיה בבריטניה ETB ו MJA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL TECHNOLOGIES 15062
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 BD Horizon 565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 BD Horizon 563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 BD Horizon 562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4 BD Horizon 564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 BD Pharmingen 557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100 BD Pharmingen 560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific L34973
Brilliant Stain Buffer BD Horizon 563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set BD CompBead 552843
FACS Aria II Flow Cytometer BD Biosciences 644832
FACSDiva 6.1.3 BD Biosciences 643629 Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2 Treestar Inc. Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody BD Horizon  565223
Anti-CCR6 antibody BD Horizon  563923
Anti-CXCR5 antibody BD Horizon  562747
Anti-CD4 antibody BD Horizon  564419
Anti-PD-1 antibody BD Pharmingen  557946
Anti-CD45RA antibody BD Pharmingen  560674
Viability Marker ThermoFisher Scientific  L34973

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34, (1), 335-368 (2016).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325, (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).
  3. Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192, (11), 1545-1552 (2000).
  4. Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206, (3), 561-576 (2009).
  5. Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39, (4), 782-795 (2013).
  6. Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123, (7), 2873-2892 (2013).
  7. Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26, (5), 1053-1063 (2012).
  8. Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177, (7), 4927-4932 (2006).
  9. Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34, (1), 108-121 (2011).
  10. Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39, (4), 758-769 (2013).
  11. He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39, (4), 770-781 (2013).
  12. Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35, (9), 436-442 (2014).
  13. Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62, (1), 234-244 (2010).
  14. Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174, (2), 212-220 (2013).
  15. Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
  16. Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69, (9), 1037-1042 (2006).
  17. Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10, (2), 0117458 (2015).
  18. Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13, (1), 0190468 (2018).
  19. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204, (8), 1849-1861 (2007).
  20. Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6, (42), 44239-44253 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24, (9), 909-917 (2015).
  22. Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14, (2), 152-161 (2013).
  23. Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124, (12), 5191-5204 (2014).
  24. Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12, (2), 163-171 (2015).
  25. Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35, (6), 1773-1780 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics