CD4 का अलगाव+ टी कोशिकाओं और परिचालित टी के विश्लेषण-तोंसिल्लितिस सहायक (cTfh) परिधीय रक्त से सेल सबसेट का उपयोग कर 6-रंग प्रवाह Cytometry

Biology

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Summary

यहां, मानव परिधीय रक्त से CD4+ टी सेल सबसेट के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । शुद्ध CD4+ टी कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण कर रहे है टी के अनुपात-तोंसिल्लितिस सहायक सेल सबसेट निर्धारित करते हैं ।

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Byford, E., Carr, M., Piñon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e58431, doi:10.3791/58431 (2019).

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Abstract

ंयायपालिका टी-तोंसिल्लितिस सहायक (Tfh) सेल गतिविधि स्व-प्रतिरक्षित परिस्थितियों में detectable है और उनकी उपस्थिति नैदानिक परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है जब लिम्फ नोड बी में microenvironment-सेल गैर Hodgkin लिंफोमा का विश्लेषण किया है । परिचालित टी-फुफ्फुसीय सहायक कोशिकाओं (cTfh), रक्त में Tfh कोशिकाओं के परिसंचारी स्मृति डिब्बे के उपसमुच्चय, भी रोग में परेशान और इसलिए संभावित उपंयास पूर्वानुमानात्मक मार्क्स का प्रतिनिधित्व करते हैं । परिधीय रक्त आधारित परीक्षण लाभप्रद है क्योंकि यह अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव है और सरल धारावाहिक की निगरानी की अनुमति देता है । यह आलेख मानव रक्त से CD4+ T-कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, और cTfh कोशिकाओं और उनके विभिन्न उपसमुच्चय के अनुपात की गणना करने के लिए प्रवाह-cytometry द्वारा आगे विश्लेषण (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1, 2, 17 और cTfh1/17). इन उपसमुच्चय के स्तर पर तो सामांय विषयों और लिंफोमा के साथ रोगियों के बीच की तुलना में था । हमने पाया है कि विधि काफी मजबूत करने के लिए नियमित रूप से एकत्र रोगी सामग्री से विश्वसनीय परिणाम प्राप्त किया गया । तकनीक हम विश्लेषण के लिए वर्णन आसानी से सेल छंटाई और बहाव के रूप में आवेदन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है आरटी-पीसीआर ।

Introduction

t-तोंसिल्लितिस सहायक कोशिकाओं (Tfh) एक CD4+ टी-सेल सबसेट है कि शुरू में लसीकावत् ऊतकों में विशेषता थी1। इन कोशिकाओं पीडी-1 और CXCR5 सतह रिसेप्टर्स, स्रावित आईएल-21 और आईएल-4 और लेखन फैक्टर, BCL-62,3की परमाणु अभिव्यक्ति दिखाने एक्सप्रेस । जैसा कि उनके नाम से पता चलता है, वे कीटाणु केंद्रों में पाए जाते है और उच्च समानता एंटीबॉडी उत्पादन1के लिए आवश्यक हैं ।

Dysregulated Tfh प्रतिक्रियाओं रोग रोगजनन में फंसाया गया है, सबसे विशेष रूप से स्व-प्रतिरक्षित रोग, जहां वे के विस्तार को बढ़ावा देने के लिए प्रतिक्रिया बी कोशिकाओं4. ये दोनों सॉलिड5,6 और लसीकावत् कैंसर7के ट्यूमर microenvironment में भी भूमिका निभाते हैं । इसके विपरीत, inducible टी सेल costimulator (ICOS) मानव इम्यूनो सिंड्रोम8में परिणाम के रूप में Tfh समारोह के लिए आवश्यक सतह प्रोटीन के आनुवंशिक दोषों । CD4+ CXCR5+ मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं में परिचालित टी-फुफ्फुसीय सहायक कोशिकाओं (cTfh) है और माना जाता है Tfh कोशिकाओं के ऊतकों में स्मृति डिब्बे9। यहां वर्णित विधि का उद्देश्य परिधीय रक्त के नमूनों से CD4+ कोशिका अलगाव के बाद cTfh उपसमुच्चय का विश्लेषण है ।

कई cTfh सबसेट को परिभाषित किया गया है और वे B-कक्ष मदद प्रदान करने वाली दक्षता के लिए एक उपसमुच्चय से भिंन है9,10,11,12। इन उपसमुच्चय के सापेक्ष अनुपात रोगों की एक संख्या में बदल रहे हैं, सबसे प्रमुखता से स्व-प्रतिरक्षित रोग है जिसमें लगभग हमेशा अधिक कार्यात्मक पीडी में एक सापेक्ष वृद्धि है-1+/hi और/या cTfh2 या कम करने के लिए तुलना में cTfh17 सबसेट कार्यात्मक पीडी-1- और/cTfh1 उपसमुच्चय12. इन परिवर्तनों की हद तक अक्सर रोग गतिविधि और autoantibody titers सहित नैदानिक मापदंडों के साथ संबद्ध है, रोग में एक शकुन के रूप में cTfh सबसेट वितरण की एक संभावित भूमिका का संकेत है, जो में Tfh की गतिविधि को प्रतिबिंबित कर सकते है लसीकावत् ऊतकों9,12,13,14. इसके अतिरिक्त, प्रतिभागियों से रक्त के नमूने लेने, त्वरित सुरक्षित और स्वीकार्य है, और इसलिए रोग की प्रगति या चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए धारावाहिक की निगरानी की अनुमति देता है ।

पारंपरिक परिधीय रक्त mononuclear कोशिका (PBMNC) सस्पेंशनों पर पृथक CD4+ T-कोशिकाओं का उपयोग विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में cTfh कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय को कम करके उच्च प्रवाह प्रवाह cytometry प्रयोगों को सक्षम बनाता है । यह विशेष रूप से उपयोगी है जब दुर्लभ cTfh उपसमुच्चय से कोशिकाओं छंटाई प्रवाह सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) का उपयोग कर । दक्षता को सहायता करने के लिए, इन सस्पेंशन को cryopreserved के प्रवाह cytometry प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले नमूनों की "बैचिंग" को सक्षम करने के लिए किया जा सकता है । परीक्षण करने पर CD4+ पवित्रता को cryopreservation से कम नहीं किया गया ।

जबकि विभिंन प्रयोगशालाओं उनकी खोज के प्रारंभिक दौर में cTfh कोशिकाओं वर्गीकृत करने के लिए अलग मार्करों का इस्तेमाल किया, विधि यहां प्रस्तुत सेल के दो समूहों के एक एकीकृत योजना का उपयोग करता है-सतह मार्करों के रूप में श्मिट एट अल.12द्वारा प्रस्तावित, 15 एक एकल प्रवाह cytometry प्रयोग में cTfh और उनके नौ मांयता प्राप्त सबसेट के एक साथ पहचान सक्षम करने के लिए ।

केवल सेल सतह मार्करों का उपयोग किया जाता है के रूप में, कोशिकाओं निर्धारण या permeabilization की आवश्यकता नहीं है, और इस प्रकार बहाव कार्यात्मक अध्ययन के लिए जीवित रह सकते हैं । यह सेल छंटाई एक ही एंटीबॉडी पैनल के साथ FACS का उपयोग करके सुविधा हो सकती है । इस पैनल को अंय मार्करों शामिल विस्तार किया जा सकता है, प्रवाह cytometer के प्रतिबंधों के लिए अनुमति इस्तेमाल किया जा रहा है ।

बहु रंग प्रवाह cytometry प्रयोगों के विश्लेषण 2 आयामी डॉट भूखंड पर गेटिंग के स्वाभाविक व्यक्तिपरक प्रकृति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर जब कोशिका आबादी मार्कर प्रतिदीप्ति में एक स्पष्ट द्वि-मोडल वितरण नहीं है, के रूप में है cTfh कोशिकाओं और उनके सबसेट के लिए मामला । इस कारण से, यह आवश्यक है कि कलाकृतियों को कम करने के लिए प्रभावी नियंत्रण स्थापित करने के लिए आबादी का बेहतर समाधान सक्षम और गेटिंग रणनीतियों आत्मविश्वास से स्थापित करें । जैसे, एंटीबॉडी पैनल डिजाइन और एक प्रवाह cytometry प्रयोग के लिए बुनियादी नियंत्रण के सेट अप, यानी, मुआवजा और FMO नियंत्रण का उपयोग कर चरण 3.4.2 और 3.4.3, क्रमशः में उल्लिखित हैं ।

सभी cTfh कक्षों को CD4+ CXCR5+ CD45RA-के रूप में परिभाषित किया गया है । विशेषता Tfh सक्रियण मार्कर पीडी-1 की अभिव्यक्ति का स्तर तब पीडी-1-, पीडी-1+ या पीडी-1हाय cTfh कोशिकाओं के सबसेट की पहचान करने के लिए निर्धारित किया जा सकता है । फिर, chemokine रिसेप्टर्स CXCR3 और CCR6 का एक संयोजन है, जो अंतर पारंपरिक Th1, 2 या 17 कोशिकाओं द्वारा व्यक्त कर रहे हैं का उपयोग कर, cTfh cTfh1 के रूप में विशेषता जा सकता है, 2 या 17-CXCR3 की एकप्रोफ़ाइल द्वारा की तरह+ CCR6-, CXCR3- CCR6- , और CXCR3- CCR6+, क्रमशः ।

हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रयुक्त एंटीबॉडी पैनल 1 तालिकामें प्रदर्शित किया जाता है । उपयोगकर्ता उनके fluorophore चयन उनके स्थानीय प्रवाह cytometer पर उपलब्ध लेज़र और प्रकाश फ़िल्टर कॉन्फ़िगरेशन के लिए खाते के लिए अनुकूलित करने के लिए पड़ सकता है ।

निंनलिखित विचार fluorophores की पसंद को प्रभावित करते हैं । जहां संभव हो उज्ज्वल fluorophores का प्रयोग करें । विशेष रूप से, dimms (कम अत्यधिक व्यक्त) मार्करों पर प्रतिभाशाली उपलब्ध fluorophores का उपयोग करें । dimmer मार्करों पीडी-1, CXCR3 और CCR6, और एक हद तक कम करने के लिए, CXCR5 शामिल हैं । हम विशेष रूप से नई बीबी, बी. वी. और BUV fluorophores जो उत्कृष्ट चमक प्रदान करते है और इस प्रकार कोशिकाओं की अलग आबादी का आसान समाधान सक्षम का उपयोग किया ।

वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करने के लिए जितना संभव हो और इस प्रकार मुआवजे के स्तर की आवश्यकता के रूप में उत्सर्जन स्पेक्ट्रा भर में fluorophore चयन फैलाओ । एक मुक्त, ऑनलाइन उपकरण है कि एक प्रवाह cytometry पैनल डिजाइन की सहायता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यहां पाया जा सकता है: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer । उत्सर्जन स्पेक्ट्रम पर अंतरिक्ष को बचाने के लिए, हम एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य कि APC-H7 के साथ ओवरलैप के साथ एक व्यवहार्यता डाई का उपयोग करके एक "डंप चैनल" नियोजित (संयुग्मित करने के लिए CD45RA) का पता लगाने (और अपवर्जन) दोनों मृत और/या CD45RA+ का उपयोग कर सक्षम करने के लिए एकल डिटेक्टर ।

यहां, एक प्रोटोकॉल परिधीय रक्त CD4 के अलगाव के लिए प्रस्तुत किया जाता है+ टी कोशिकाओं और उनके बाद विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा अलग और हाल ही में प्रसारित उपसमुच्चय वर्णित के अनुपात का निर्धारण करने के लिए ।

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Protocol

रक्त के नमूने सामांय विषयों (एन एस) (n = 12) के साथ ही सीमांत क्षेत्र लिंफोमा (MZL) के साथ रोगियों (n = 7) और बी के अंय प्रकार-सेल गैर Hodgkin लिंफोमा (BNHL) (6 FL रोगियों से प्राप्त किया गया, 2 lymphoplasmacytic लिंफोमा रोगियों और 1 कम ग्रेड बी सेल गैर है Hodgkin लिंफोमा अंयथा रोगी निर्दिष्ट नहीं) । मरीजों को सभी अध्ययनों के लिए जगह में नैतिक स्वीकृति के साथ, सूचित, लिखित सहमति होने के बाद लीसेस्टर रॉयल दृढ़ता में रुधिर क्लीनिक से भर्ती किया गया । लिसेस्टरशायर, Northamptonshire और रटलैंड अनुसंधान आचार समिति द्वारा 1, संदर्भ 06/Q2501/122 रोगी नमूनों के लिए और स्वास्थ्य अनुसंधान प्राधिकरण (एचआरए) NRES समिति पूर्व मिडलैंड्स-डर्बी, संदर्भ 14/EM/1176 के लिए नैतिक अनुमोदन प्राप्त किया गया सामांय विषयों ।

1. CD4 के अलगाव+ टी कोशिकाओं पूरे परिधीय रक्त से

  1. ताजा परिधीय रक्त लें (2 से 15 एमएल) कश्मीर में2EDTA ट्यूबों मानक venipuncture और प्रक्रिया के रूप में जल्द से अधिकतम व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए संभव द्वारा ।
    नोट: मानक प्रयोगशाला व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (कोट, दस्ताने, चश्मा) का उपयोग करें और एक वर्ग द्वितीय सुरक्षा कैबिनेट में काम ले ।
  2. रक्त और सभी आवश्यक रिएजेंट (CD4+ संवर्धन कॉकटेल, 2% भ्रूण गोजातीय सीरम/फास्फेट बफर खारा (FBS/पंजाब), घनत्व ढाल मीडिया, और ठंड मध्यम अगर cryopreserving कोशिकाओं) कमरे के तापमान को लाओ ।
  3. मानव CD4+ टी कोशिकाओं के संवर्धन के लिए एंटीबॉडी के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉकटेल के साथ रक्त मिश्रण । रक्त के हर 1 मिलीलीटर के लिए रिएजेंट के ५० µ एल का उपयोग करें । 5 से 15 मिलीलीटर रक्त के लिए ५० मिलीलीटर शंकु के ट्यूब का उपयोग करें ।
    नोट: यदि रक्त के 2 से 4 मिलीलीटर का उपयोग कर, एक 14 मिलीलीटर शंकु के ट्यूब में इस कदम का प्रदर्शन ।
  4. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण की मशीन ।
  5. 2% FBS की एक बराबर मात्रा के साथ मिश्रण पतला/
  6. परत घनत्व ढाल मीडिया के शीर्ष पर इस पतला मिश्रण धीरे अंतरफलक परेशान से बचने के लिए और तुरंत केंद्रापसारक को घनत्व ढाल माध्यम में रक्त के प्रसार से बचने के लिए आगे बढ़ना ।
    1. रक्त के 2 से 3 मिलीलीटर के लिए, एक 14 मिलीलीटर शंकु के रूप में 3 मिलीलीटर ढाल मध्यम ट्यूब का उपयोग करें, लेकिन रक्त की 4 मिलीलीटर के लिए, एक 14 मिलीलीटर शंकु के में घनत्व ढाल मध्यम के 4 मिलीलीटर का उपयोग करें और 5 के लिए 15 मिलीलीटर रक्त , एक ५० मिलीलीटर शंकु के ट्यूब में घनत्व ढाल मध्यम के 15 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
  7. 20 डिग्री सेल्सियस पर बंद ब्रेक के साथ १,२०० x जी में २० मिनट के लिए स्तरित मिश्रण केंद्रापसारक ।
    नोट: परिवेश के नीचे एक तापमान लाल रक्त कोशिकाओं और granulocytes के साथ संक्रमण में परिणाम हो सकता है । CD4+ आइसोलेशन प्रक्रिया विफल करने के लिए एक कम गति का कारण होगा । लगे तोड़ को छोड़कर कोशिका उपज में कमी आएगी. एयरोसोल्स से बचने के लिए बंद किया जा सकता है कि रोटर के साथ एक बेंच शीर्ष केंद्रापसारक का प्रयोग करें ।
  8. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग अंतरफलक से समृद्ध CD4+ सेल परत को हटा दें ।
    नोट: समृद्ध कोशिका परत सफेद बादल कोशिकाओं के एक मानक "buffy कोट" सदृश होगी, लेकिन केवल CD4+ कोशिकाओं के रूप में मौजूद हैं, यह स्वाभाविक रूप से छोटे और अधिक देखने के लिए मुश्किल हो जाएगा ।
  9. 2% FBS/पंजाबियों CD4+ कोशिकाओं को 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा तक जोड़ें और फिर प्रत्येक धोने के दौरान ४०० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा 2% FBS/
  10. 2% FBS/पंजाब में गोली resuspend और सेल संख्या और व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एक महत्वपूर्ण डाई (trypan नीला) के साथ दाग कोशिकाओं गिनती ।
  11. वैकल्पिक चरण: 5 x 105 से 1 x 106 कोशिकाओं को ठंड में मध्यम (10% dimethyl sulfoxide FBS में) 1 मिलीलीटर aliquots में resuspend ।
    नोट: कुछ सतह मार्करों के स्तर क्रायो-संरक्षण और गल द्वारा बदला जा सकता है । यह है, इसलिए, बहुत महत्वपूर्ण है कि सभी नमूनों लगातार संसाधित कर रहे हैं । विश्लेषणात्मक चर में अंतर को कम करने के लिए, नमूने क्रायो संरक्षित किया गया और इस अध्ययन में विश्लेषण के लिए बैच ।

2. फ्लो Cytometry

  1. गल cryopreserved CD4+ कोशिकाओं को जल्दी से ३७ ° c में एक पानी स्नान में और पूर्व गर्म मध्यम (RPMI १६४० + एल-glutamine 10% FBS और 1x पेनिसिलिन-streptomycin के साथ पूरक) में एक बार धो लें ।
  2. मध्यम के 9 मिलीलीटर के लिए कोशिकाओं को जोड़ने, ४०० x जी पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant हटा दें ।
  3. पंजाब (५० µ एल) में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित ताकि प्रत्येक शर्त का परीक्षण किया जा करने के लिए 5 x 105 और 1 x 106 कोशिकाओं के बीच का उपयोग करता है ।
  4. धुंधला बफर के साथ कोशिकाओं मिश्रण (५० µ एल) ।
    नोट: शानदार दाग बफर विभिन्न धुंधला कलाकृतियों है कि डेटा विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं रोकता है जब दो या अधिक बी. वी. या BUV दाग एक साथ इन रंगों के अंतर्निहित रासायनिक गुणों के कारण उपयोग किया जाता है । एकल या दाग स्थितियों में, शानदार दाग बफर के ५० µ एल 1% BSA के ५० µ l के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता/
  5. कोशिकाओं को एंटीबॉडी जोड़ें (के रूप में " 1 तालिका मेंस्तंभ" इस्तेमाल किया मात्रा के अनुसार) और अंधेरे में बर्फ पर गर्मी के लिए 30 मिनट ।
  6. प्रत्येक धो के दौरान ६०० x g पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा 1% BSA/
  7. 1% BSA/पंजाब (४०० µ l) में पुनर्स्थगित और एक प्रवाह cytometry अधिग्रहण ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  8. भंवर एक प्रवाह cytometer पर डेटा प्राप्त करने से पहले धीरे कोशिकाओं:

3. प्रवाह Cytometry नियंत्रण और सेट अप

  1. एक दाग नमूने का उपयोग करना, photodiode वोल्टेज सेट इतना है कि लिम्फोसाइटों स्पष्ट मलबे और मृत कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है (हाई साइड कैटर (एसएससी) क्षेत्र और कम आगे तितर बितर (FSC) क्षेत्र के साथ घटनाएं)16। एक दाग नमूने का प्रयोग, सेट photomultiplier (PMT) वोल्टेज इतना है कि सकारात्मक प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से विचार किया जा सकता है, जबकि सुनिश्चित करें कि सभी घटनाओं पता लगाने के पैमाने के भीतर गिर कर ।
    नोट: एक सुधार के लिए प्रत्येक pmt dimly फ्लोरोसेंट मोतियों का उपयोग करने के लिए इष्टतम संकल्प ("पीक 2" विधि19) के लिए न्यूनतम वोल्टेज खोजने के लिए पीएमटी वोल्टेज के खिलाफ CV प्लॉट करने के लिए होगा ।
  2. वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए एक मुआवजा उत्पादन द्वारा कब्जा मोतियों के साथ एक दाग मैट्रिक्स का उपयोग करके खाते । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मुआवजा मोती (६० µ l) जोड़ें, और नकारात्मक नियंत्रण मोती (६० µ l) को 1% BSA/पंजाब (१०० µ l), और भंवर ।
    नोट: कब्जा मोतियों का इस्तेमाल किया जा रहा एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों और आईजीजी isotype से मेल खाना चाहिए । मुआवजा मैट्रिक्स फिर से होना चाहिए अगर किसी भी मिलकर रंजक परिवर्तन की बहुत संख्या की गणना, के रूप में वे बहुत से अपने उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में काफी परिवर्तनशीलता प्रदर्शित कर सकते हैं ।
  3. एक एकल एंटीबॉडी (20 µ एल) और भंवर जोड़ें ।
  4. 30 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर मशीन ।
  5. 10 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  6. 1% BSA/पंजाब (५०० µ l) और भंवर में पुनर्स्थगित ।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में निर्दिष्ट क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स जनरेटर का उपयोग कर एक प्रवाह cytometer के साथ नमूना प्राप्त करें ।
  8. FMO नियंत्रण का प्रयोग करें सकारात्मक मार्कर प्रतिदीप्ति के लिए गेट्स के स्थान पर डाई फैल के लिए खाते में गाइड, जो पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का मुख्य स्रोत ≥ 4 रंग16का उपयोग प्रयोग में है । चरण 3 में वर्णित के रूप में सामांय सेल-सतह धुंधला प्रोटोकॉल का पालन करें, लेकिन प्रत्येक शर्त के लिए, एक fluorophores से धुंधला कदम (जहां CD45RA छोड़ा जाता है, छोड़/मृत दाग भी छोड़) । प्रत्येक शर्त के लिए १००,००० लिम्फोसाइटों का अधिग्रहण ।
  9. ≤ ०.५% कोशिकाओं पर गेट धनात्मकता सेट करें । FMO नियंत्रण का एक सचित्र उदाहरण के लिए चित्रा 2 देखें ।

4. डेटा विश्लेषण

  1. बहुत छोटे मलबे को बाहर करने के लिए FSC पैरामीटर पर ५,००० इकाइयों की दहलीज सेट करने के लिए प्रवाह है cytometer अधिग्रहण सॉफ्टवेयर को रोजगार ।
  2. १०,००० cTfh कोशिकाओं (CD4+ CD45RA- CXCR5+) प्राप्त करने के लिए एक रोक गेट का उपयोग करें ।
    नोट: व्यक्तिगत उपयोगकर्ता १०,००० से अधिक कक्षों को एकत्रित कर सकते हैं । यह संख्या सार्थक परिणाम प्रदान करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को इकट्ठा करने और संग्रह के लिए लिया गया समय के बीच एक समझौता था ।
  3. एक FSC-क्षेत्र/SSC-क्षेत्र डॉट प्लॉट का उपयोग करके, मलबे और खुलकर मृत कोशिकाओं (एक उच्च एसएससी-क्षेत्र और कम FSC-क्षेत्र के साथ घटनाओं) को छोड़कर whilst लिम्फोसाइटों की आबादी का चयन करने के लिए एक दीर्घवृत्त या बहुभुज फाटक ड्रा ।
  4. एक FSC-क्षेत्र/FSC-चौड़ाई डॉट प्लॉट का उपयोग करके, दोहरी को छोड़कर एकल कक्षों का चयन करने के लिए बहुभुज द्वार आरेखित करें (दोहरी एक बढ़ा हुआ क्षेत्र लेकिन एकल कक्षों के समान चौड़ाई है) ।
  5. FSC-क्षेत्र/CD45RA और व्यवहार्यता मार्कर डॉट प्लॉट का उपयोग करके, लाइव, CD45RA- कक्षों (इस मार्कर के लिए कम प्रतिदीप्ति वाले कक्षों) का चयन करने के लिए आयताकार गेट आरेखित करें ।
  6. एक FSC-क्षेत्र/CD4 डॉट भूखंड का उपयोग कर, CD4+ कोशिकाओं (इस मार्कर के लिए एक उच्च प्रतिदीप्ति के साथ कोशिकाओं) का चयन करने के लिए एक आयताकार गेट ड्रा ।
  7. एक CD4/CXCR5 डॉट भूखंड का उपयोग कर, CXCR5+ (यानी, cTfh) कोशिकाओं (इस मार्कर के लिए एक उच्च प्रतिदीप्ति के साथ कोशिकाओं) का चयन करने के लिए एक आयताकार गेट ड्रा ।
  8. एक CXCR3/CCR6 डॉट प्लॉट का उपयोग कर, एक ट्रैक्टर गेट cTfh1, 2 और 17 कोशिकाओं (कोशिकाओं है कि उच्च और प्रत्येक मार्कर के लिए कम कर रहे हैं) में cTfh कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए जगह है ।
    नोट: phenotype CD4 + CXCR5 + CXCR3 + CCR6+ के साथ कोशिकाओं खराब विशेषता हैं । हम cTfh1/1718 के रूप में इन कोशिकाओं को देखें क्योंकि पारंपरिक सहायक टी कोशिकाओं (CD4+ CXCR5-) है कि Th17 और Th1 CXCR3 और CCR6 के शो अभिव्यक्ति के बीच संक्रमण कर रहे है और cTfh1/1719के रूप में वर्णित किया गया है ।
  9. एक पीडी-1 हिस्टोग्राम का उपयोग करना, cTfh कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए रेंज उपकरण का उपयोग करें (या यदि पसंदीदा, व्यक्तिगत cTfh1, 2, 17 या 1/17 उपसमुच्चय) पीडी-1-/+ या हाय आबादी में.
    नोट: पीडी-1+ और पीडी-1हाय के बीच भेद साहित्य में अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है । दहलीज उसी पीडी-1 तीव्रता के रूप में स्थापित किया गया था बोना-Tfh मानव tonsil लिम्फोसाइट में एक ही एंटीबॉडी पैनल के साथ प्रवाह cytometry का उपयोग कर निलंबन का पता लगाने के लिए आवश्यक है । वैकल्पिक रूप से, ICOS के लिए एक मार्कर एंटीबॉडी पैनल के लिए जोड़ा जा सकता है, के रूप में केवल PD1hi कोशिकाओं ICOS+रहे हैं ।

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Representative Results

उच्च CD4+ शुद्धता CD4+ अलगाव प्रोटोकॉल है, जो हमारे द्वारा परीक्षण सभी रक्त के नमूनों में विश्वसनीय था का उपयोग कर हासिल किया गया था (मतलब: ९६.६%, एसडी: २.३८, एन = 31) (चित्रा 3).

एक प्रतिनिधि सामांय विषय में cTfh (CD4+ CXCR5+ कोशिकाओं) की पहचान (चित्रा 4) प्रस्तुत की है । CD4+ कोशिकाओं के भीतर कुल cTfh कोशिकाओं के अनुपात में 12 सामान्य विषयों के पार २९.४% (अंतर-चतुर्थक रेंज (IQR) = १०.८) का एक औसत मूल्य था. hepatocellular कार्सिनोमा17,20, प्रणालीगत एक प्रकार एरीथेमेटस11,21, और रुमेटी गठिया11,14 सहित कई विभिंन रोगों के पार एकाधिक अध्ययन के लिए एक समग्र cTfh में एक अंतर का पता लगाने की क्षमता में परस्पर विरोधी है नियंत्रण और रोगियों । सामान्य विषयों और MZL या BNHL रोगियों (चित्रा 4बी)21के बीच समग्र cTfh में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया.

एक प्रतिनिधि सामान्य विषय से cTfh कोशिकाओं के भीतर पीडी-1 अभिव्यक्ति की पहचान और तुलना के लिए BNHL रोगी चित्रा 5में दिखाया गया है. पीडी-1 अभिव्यक्ति सामान्य विषयों (चित्रा 5बी)21की तुलना में MZL और BNHL रोगियों में काफी अधिक थी । पीडी-1 अभिव्यक्ति में समान वृद्धि एकाधिक स्व-प्रतिरक्षित विकारों में प्रदर्शन किया गया है11,12,13,14.

एक प्रतिनिधि सामांय विषय से CXCR3 और CCR6 अभिव्यक्ति का उपयोग cTfh कोशिकाओं की जनसंख्या के भीतर cTfh1, 2, 17 और 1/17 की पहचान चित्रा 6में दिखाया गया है । सामान्य विषयों की तुलना में MZL और BNHL रोगियों में cTfh1 कोशिकाओं का अनुपात काफी अधिक था (चित्रा ६बी)२१.

Figure 1
चित्रा 1 : समग्र गेटिंग रणनीति का चित्रण cTfh कोशिकाओं और उनके सबसेट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया । ऊपर बाएं से, लिम्फोसाइटों की आबादी प्रतिष्ठित हैं, और दोहरी को बाहर रखा गया है । Live CD45RA- कक्ष एक "डंप चैनल" का उपयोग कर चयनित हैं । CD4+ कोशिकाएं gated होती हैं और CXCR5+ कोशिकाएं cTfh के रूप में पहचानी जाती हैं. cTfh cTfh1, 2 या 17 में विभाजित है CXCR3 और CCR6 अभिव्यक्ति का उपयोग कर की तरह । इन उपसमुच्चय के भीतर पीडी-1 अभिव्यक्ति तो प्रतिष्ठित है । एक प्रतिनिधि सामांय विषय रक्त नमूना से लिया आंकड़े । FSC-अ, FSC क्षेत्र; एसएससी-एक एसएससी क्षेत्र; FSC-W, FSC चौड़ाई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : FMO नियंत्रणों का चित्रण । प्रत्येक द्विअक्षीय प्रवाह cytometry भूखंड से पता चलता है CD4+ कोशिकाओं ब्याज की एक को छोड़कर सभी fluorophores के साथ दाग को ंयूनतम जो प्रतिदीप्ति धनात्मकता के लिए गेट्स सेट किया जा सकता है प्रदर्शित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : द्विअक्षीय फ्लो cytometry प्लाट में दिखा CD4 की पहचान + गेटिंग के बाद कोशिकाओं को लिम्फोसाइटों रहते हैं. एक प्रतिनिधि सामांय विषय रक्त नमूना से लिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : cTfh कोशिकाओं की पहचान । () CD4+ CD45RA-के लिए कोशिकाओं पर gated CXCR5+ अभिव्यक्ति दिखा द्विअक्षीय प्रवाह cytometry प्लाट. एक प्रतिनिधि सामांय विषय से लिया । (B) सामान्य विषयों में कुल CD4+ कक्षों के भीतर cTfh का सापेक्ष प्रतिशत (n = 12), MZL (n = 7), BNHL (n = 9). क्षैतिज रेखाएं माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं, और त्रुटि पट्टियां अंतर-चतुर्थक श्रेणी का प्रतिनिधित्व करती हैं । मान-Whitney यू टेस्ट का उपयोग करने वाले समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया. यह आंकड़ा Byford एट अल.21से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : पीडी-1 अभिव्यक्ति और cTfh कोशिकाओं के संबंध. () कुल cTfh कक्षों के भीतर पीडी-१ व्यंजक निर्धारित करने के लिए प्रवाहित cytometry हिस्टोग्राम का उपयोग किया गया. एक प्रतिनिधि सामांय विषय और BNHL रोगी से लिया । () पीडी-१+ कोशिकाओं को कुल cTfh कोशिकाओं के अनुपात के रूप में. क्षैतिज रेखाएं माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं, और त्रुटि पट्टियां अंतर-चतुर्थक श्रेणी का प्रतिनिधित्व करती हैं । माध्य महत्वपूर्ण है (मान-Whitney U-परीक्षण) सामांय विषयों के बीच अलग (२१.५%, IQR = १०.८, n = 12) और लिंफोमा रोगियों (MZL ५४.१%, IQR = २१.२, एन = 7, पी = ०.०००८ और BNHL ४५.२%, IQR = ११.४, एन = 9, पी = ०.०००३) । यह आंकड़ा Byford एट अल.21से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : CXCR3 और CCR6 अभिव्यक्ति और उनके संबंध cTfh1 संख्या के लिए । () CD4+ CD45RA- CXCR5+ कोशिकाओं पर CXCR3 और CCR6 की अभिव्यक्ति दिखाते हुए द्विअक्षीय फ्लो cytometry प्लाट. एक प्रतिनिधि सामांय विषय और BNHL रोगी से लिया । (B) कुल cTfh कक्षों के प्रतिशत के रूप में cTfh1 कक्ष. क्षैतिज रेखाएं माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं, और त्रुटि पट्टियां अंतर-चतुर्थक श्रेणी का प्रतिनिधित्व करती हैं । माध्य महत्वपूर्ण है (मान-Whitney U-परीक्षण) सामांय विषयों के बीच अलग (२०.८%, IQR = ६.७, n = 12) और लिंफोमा रोगियों (MZL ३२.१%, IQR = ६.८, एन = 7, पी = ०.०१३, और BNHL ३५.४%, IQR = ७.६%, एन = 9, पी = ०.००५६) । यह आंकड़ा Byford एट अल.21से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: प्रवाह cytometry एंटीबॉडी पैनल

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के लिए एक सरल और कारगर तरीका परिधीय रक्त cTfh कोशिकाओं का विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करता है, सभी प्रासंगिक साहित्य में पहचान सेट का पता लगाने को सक्षम करने के इस प्रकार अब तक । रक्त के नमूनों को आसानी से और कुशलता से मानक बाहर के भाग के रूप में प्राप्त कर सकते हैं-रोगी क्लीनिक और सीरियल नमूने नैदानिक डेटा के साथ समानांतर में एकत्र किया जा सकता है. बारी में, इस संभावित रोग प्रगति या उपचार के लिए प्रतिक्रिया के लिए cTfh सबसेट के रूप में उपसमुच्चय का मूल्यांकन अध्ययन में सक्षम बनाता है । ये अध्ययन रोग में विशेष रूप से वारंट किया जाएगा जहां Tfh dysregulation रोगजनन में ऐसी प्रतिरक्षा और ठोस और haematological कैंसर के कुछ प्रकार के रूप में फंसाया जाता है । इसके अलावा, रोग में cTfh समारोह में परिवर्तन केवल सेल सतह मार्करों इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है के रूप में प्रवाह cytometry का उपयोग कर cTfh कोशिकाओं छंटाई द्वारा जांच की जा सकती है । MZL रोगियों में cTfh कोशिकाओं छंटाई हमें जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल में मतभेदों को खोजने के लिए जब सामांय21विषयों की तुलना में सक्षम होना चाहिए ।

हमने पाया है कि कुशल CD4+ टी सेल अलगाव डेटा विश्लेषण में सुधार । हम विस्तार में शामिल कदम का वर्णन है क्योंकि छोटे मुद्दों जैसे ब्रेक लगाना और गति अलगाव की प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण थे । एक और महत्वपूर्ण कदम, सभी प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए के रूप में, मुआवजा और FMO नियंत्रण सेट है ।

पीडी-1 अभिव्यक्ति cTfh कोशिकाओं पर भिन्न होता है और उच्चतम पीडी-1 के साथ उन कोशिकाओं को सबसे अधिक कार्यात्मक और इसलिए प्रासंगिक हो सकता है, विशेष रूप से स्व-प्रतिरक्षित रोग के अध्ययन के लिए11,12. एक महत्वपूर्ण मुद्दा पीडी-1हाय कोशिकाओं, सक्रिय cTfh सबसेट की पहचान के लिए गेट तय करना था, के रूप में कोई मानक सीमा साहित्य में परिभाषित किया गया है । यह महत्वपूर्ण है लेकिन छोटे सबसेट शायद लसीकावत् ऊतक11में सक्रिय Tfh भेदभाव को दर्शाता है । इस चुनौती को दूर करने के लिए, दहलीज ऐसी है कि यह एक ही एंटीबॉडी पैनल के साथ मानव tonsil से बोना-Tfh कोशिकाओं का पता लगाने के लिए आवश्यक के रूप में एक ही था निर्धारित किया गया था । हम समझते है कि प्राप्त tonsils कुछ उपयोगकर्ताओं के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है । एक विकल्प, विरोधी ICOS के अलावा द्वारा इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी पैनल का विस्तार होगा, केवल पीडी-1हाय कोशिकाओं के रूप में ICOS+ 12रहे हैं ।

यहां, हम CD4+ टी कोशिकाओं घूम की सतह मार्करों की विशेषता का पता लगाने के लिए एक एंटीबॉडी पैनल पेश करते हैं । परिसंचारी टी-तोंसिल्लितिस विनियामक कोशिकाओं (cTfr) टी के रक्त स्मृति डिब्बे-तोंसिल्लितिस विनियामक कोशिकाओं (टीएफआर) है कि लसीकावत् ऊतक में निवास कर रहे है और कीटाणु केंद्र प्रतिक्रिया22,23 को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका है . cTfr रक्त CD4+ CXCR5+ कोशिकाओं कि सह एक्सप्रेस टी-विनियामक सेल मार्करों प्रतिलेखन कारक सहित FoxP3 हैं । cTfh के साथ cTfr मापने कीटाणु केंद्र में गतिविधि की एक और अधिक पूरी तस्वीर प्रदान कर सकते हैं, और अपने ही अधिकार24में रोग में एक अगोचर उपस्थित सकता है । हालांकि cTfr संख्या स्वाभाविक रूप से कम कर रहे है (मतलब: १.८२%, एसडी: १.४०, n = कुल CD4 के 24+ हमारे अपने प्रयोगों में कोशिकाओं), cTfh से cTfr अलग भी cTfh विश्लेषण की विशिष्टता में वृद्धि होगी । CD25 और CD12725 के रूप में हमारे पैनल के लिए विशिष्ट टी-विनियामक सेल-सतह मार्कर का एक संयोजन जोड़ना एक बहुत ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक ही प्रयोग में सभी cTfh उपसमुच्चय के अलावा cTfr का पता लगाने में सक्षम होगा. वैकल्पिक रूप से, अधिक शास्त्रीय intracellular विनियामक मार्कर FoxP3 इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि इस निर्धारण और permeabilization बहाव कार्यात्मक परख को रोकने की आवश्यकता है । cTfh विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करने में, तथापि, वहां भी एक ंयूनतम पैनल है कि एक मानक प्रयोगशाला प्रवाह cytometer के साथ संयोजन के रूप में नियोजित किया जा सकता नैदानिक या प्रयोगात्मक उपयोगी परिणाम प्राप्त परिभाषित करने के लिए लाभ कर रहे हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

काम ल्यूकीमिया ब्रिटेन से ETB और MJA के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL TECHNOLOGIES 15062
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 BD Horizon 565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 BD Horizon 563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 BD Horizon 562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4 BD Horizon 564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 BD Pharmingen 557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100 BD Pharmingen 560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific L34973
Brilliant Stain Buffer BD Horizon 563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set BD CompBead 552843
FACS Aria II Flow Cytometer BD Biosciences 644832
FACSDiva 6.1.3 BD Biosciences 643629 Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2 Treestar Inc. Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody BD Horizon  565223
Anti-CCR6 antibody BD Horizon  563923
Anti-CXCR5 antibody BD Horizon  562747
Anti-CD4 antibody BD Horizon  564419
Anti-PD-1 antibody BD Pharmingen  557946
Anti-CD45RA antibody BD Pharmingen  560674
Viability Marker ThermoFisher Scientific  L34973

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References

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