다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

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Bioengineering

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Summary

우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.

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Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Sagredo, S., Simmel, F. C. Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography. J. Vis. Exp. (140), e58634, doi:10.3791/58634 (2018).

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Abstract

있고 구조화 된 표면에 유전자의 동원 정지에 오픈 미세 생물 반응 기 시스템에서 식 프로세스를 compartmentalized 유전자의 연구 수 있습니다. 인공 세포 시스템으로 다른 접근, 달리 등 설치 유전자 표현 시 약 및 동시 배출 폐기물의 지속적인 공급에 대 한 수 있습니다. 이 동적 유전자 규정 피드백 시스템의 실현을 위한 중요 한 시간의 연장된 기간 동안 셀 무료 유전자 식 프로세스의 구현을 지원 합니다. 여기 우리 기술을 사용 하 여는 사용 하기 간단 석판 DNA 가닥 변위 반응에 따라 독점적으로 상업적으로 사용 가능한 구성 요소를 사용 하 여 유전 봄에는 제작에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리 또한 제공 하는 프로토콜 compartmentalized 유전자의 통합에입니다 (PDMS)-미세 시스템을 기반으로. 또한, 우리는 시스템 DNA와 식 믹스에 포함 된 분자 사이 분자 상호 작용의 직접적인 관측을 위해 사용 될 수 있는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경과 호환 되는지 보여줍니다.

Introduction

세포-유전자 발현 반응 생화학, 생명 공학, 및 합성 생물학에 다양 한 응용 프로그램에 대 한 큰 관심은 무료. 단백질 세포 자유로운 표현의 구조 생물학에서 수많은 연구를 위한 기초를 했다 순수 단백질 견본의 준비를 위한 수단이 되었다. 예를 들어, 셀-무료 시스템 성공적으로 어려운 셀 기반으로 식을 사용 하 여 생산 하는 단백질 단지1 또는 막 단백질2의 식에 사용 되었다. 특히, 셀-무료 유전자 발현 반응 했다 또한 19613Nirenberg 그리고 Matthaei에 의해 획기적인 실험과 함께 시작 하는 유전 코드의 구조를 명료 하 게 하는 데 사용 됩니다.

최근, 생명 공학 및 합성 생물학4,,56셀 자유로운 방법에 관심을 갱신된 되었습니다. 셀-무료 시스템 비 생물학 화합물, 증강 될 수 및 다양 한 생물학 근원의 부품을 보다 쉽게 결합 될 수 있다7. 비록 셀 무료 시스템 명백한 단점은 "성장 하 고 분할" 하지 않습니다, 그것은 오픈 셀 무료 bioreactors 기본적인 신진 대사 기능을 준비 하 고 합성 대사 간단한 탄소 및 에너지 제공 하는 때 그들을 입력8. 합성 생물학의 신흥 분야, 내 셀 무료 시스템 예측 "섀시" 구현 위한 합성 생물학 기능 되도록 약속 드립니다.

현재, 셀-무료 유전자 식 반응 중 하나를 사용 하 여 수행 됩니다 (다른 소스에서 박테리아, 효 모, 곤충 등), 셀 추출 또는 다른 응용 프로그램 (예를 들어, 최적화 된 전사/번역 시스템 간결한 진 핵 유전자 식, 막 단백질 의 생산). 세균성 세포 추출 물 (일반적으로 TXTL에 게 불리는)의 준비에 대 한 인기 있는 프로토콜 V. Noireaux와 동료9에의해 최근 제공 했다. 생물 속성 철저 하 게 특징이10, 그리고 TXTL 시스템은 이미 성공적으로 사용 되어 일련의 복잡 한 생 화 확 적인 작업을 수행 하기 위해: 예를 들어, 을 통해 기능 살 균 소의 어셈블리 셀-무료 식 살 균 소 게놈11, 세균성 단백질 필 라 멘 트12, 합성 또는 셀 무료 유전자 회로13,14의 구현입니다.

셀-무료 합성 생물학에서 인기 있는 또 다른 시스템은 정화 부품15,16에서 재구성 순수한 시스템. TXTL 시스템에 비해, 그것은 포함 하지 않는다 nucleases 또는 단백질 저하 기계. 동안 선형 DNA의 저하, RNA 분자 또는 단백질은 문제점의 더 적은 순수한 시스템에서 충 경로 실제로 동적 기능 구현에 대 한 중요 한. (RecBCD)를 통해 TXTL 시스템에서 선형 유전자 템플릿의 exonuclease 저하의 영향을 줄이기 위해 최종 보호 GamS 단백질을 추가할 수 있다. TXTL와 순수 시스템 모두 상업적으로 사용할 수 있습니다.

주제를 밀접 하 게 관련 셀 무료 생물학 문제에 생 화 확 적인 반응에 구획의 효과 및 추가 인공 세포와 같은 구조 또는 protocells17,18,19의 창조의 연구 ,20. 인공 세포에 대 한 연구는 일반적으로 내부 기공을 구획 인지질 또는 다른 amphiphiles에서 만든 생 화 확 적인 반응 시스템의 캡슐화를 포함 한다. 동안 이러한 시스템 구획의 근본적인 측면 또는 cellularity 각자 복제의 출현을 탐구 하는 데 도움이, 그들은 폐쇄 시스템의 일반적인 문제를 직면 하는 것: 작동 물질 대사 및 적절 한 부재에 막 전송 메커니즘, 그것은 한정된 반응 시간의 연장된 기간에 대 한 실행을 계속 하기 어려운-연료 분자 사용 되 고 폐기물 축적.

이러한 셀을 흉내 낸 구획 내부 구획에 흥미 있는 대안 photolithographic 방법을 사용 하 여 유전 물질의 공간 조직 이다. "칩에 유전자"의 동원 정지 바이 츠만 연구소에 바-Ziv 그룹으로 10 여 년 전 개척 했다21. 주요 문제를 확인할 수 있도록 했다 중 DNA의 일반적인 흡착 및 칩 표면에 단백질의 잠재적인 변성 했다. 바-Ziv 외. "데이지", immobilization 이산화 규소 표면에 저항 분자의 긴 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 스페이서 보장에 대 한 반응성 터미널 실 란의 구성 되었다 불리는 전용된 사진 평판 저항 개발 생체 적합성, 그리고 방사선 자외선 (UV) 빛에 따라 반응 아민으로 개조 되었다 photocleavable headgroup. 그것은 데이지 유전자 길이 DNA 분자 (몇 킬로 기본적인 쌍 (kbp)의 길이)와 칩 표면에 고정 하는 데 사용 될 수 표시 되었습니다. 고분자 물리학의 관점에서 시스템 고체 기판에 융합 하는 고분자 브러쉬 표시. DNA의 전해질 특성상 이러한 브러시의 구조는 삼 투 및 기타 이온 특정 효과22,23강력 하 게 영향을.

가장 중요 한 것은, 그것은 기판 움직일 유전자 여전히 작동 하 고 베낀 고로 번역 해 RNA와 단백질 수 표시 되었습니다. 유전자 브러쉬 솔루션24에서 RNA polymerases 액세스할 수 있습니다 그리고 녹음/번역의 복잡 한 고분자 혼합물은 표면에 변성 되지. 기판에 유전 구성의 동원 정지의 장점 중 하나는 그들은 작은 선구자 분자와 어떤 폐기물 제거25 수에서 지속적으로 제공 하는 열린 미세 반응 기 시스템에서 동작할 수 있습니다. , 26.

우리는 최근 변종 (생체 전자 빔 및 감광 제)에 대 한 Bephore27, 상업적으로 사용 가능한 구성 요소에 독점적으로 근거 했다 하 고 시퀀스 특정 DNA 가닥 침공에 대 한 반응을 활용 되 나이 방법의 개발 칩 기반 인공 세포의 생성에 대 한 간단한 구현 다단계 리소 그래피 절차의 실현. 절차의 개요 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 그것은 DNA 머리 핀 분자 photocleavable 그룹을 포함 하는 생체 못 레이어에 움직일을 기반으로 합니다. Photocleavage는 머리 핀의 어떤 DNA를 통해 ("전치" 표시 시퀀스를 포함 하는)의 분자 발 중재 가닥 침략에 연결 된 를 통해 수 단일 가닥 발 시퀀스를 제공 합니다.

데이지의 매우 조밀 하 고 깨끗 한 수 Bephore 잠재적으로 간단 하 게 구현 하는, "유전자 브러쉬", 특정 응용 프로그램에서 장점을. 그러나 원칙적으로,, 데이지와 Bephore 석판 수 쉽게 결합. DNA를 구성 하기 위한 DNA 가닥 변위 골드 브러쉬 활용 관련된 리소 그래피 방법 이전 황 외.에 의해 개발 되었다 하지만 하지 셀 무료 유전자 식28,29의 문맥에서 이용 되었다.

다음 프로토콜 Bephore 메서드를 사용 하 여 셀 무료 유전자 발현에 대 한 브러쉬 DNA의 생산에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 우리는 유전자 칩 조작 방법과 칩에 유전자의 공간 구조적된 동원 정지에 대 한 다단계 포토 리소 그래피의 사용을 설명 합니다. 우리는 또한 반응 챔버의 제조 및 마이크로 칩에 유전자 식 반응의 성능에 대 한 응용 프로그램 토론.

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Protocol

참고: 다른 섹션에서 단계에 대 한 시간 일정 보충 정보 (제 1)에서 주어진 다.

1. 칩 제조

참고: 기판, 실리콘이 산화물 또는 유리 슬라이드 (24 mm x 24 mm, no. 1.5; 22 m m x 50 m m, 제 4 호)의 50 nm 두꺼운 층으로 사용 하 여 실리콘 웨이퍼 (100 m m 직경, 0.525 m m 두께)로. 응용 프로그램에 따라 다른 크기와 두께 더 적합 한 수 있습니다.

  1. 기판 통해 는 RCA 청소 절차를 청소 (물, 암모니아 솔루션 NH3(aq) 30%와 30% 과산화 수소 H2O2 비율 5:1:1)
    1. 유리 비이 커에에서 물과 암모니아 솔루션을 혼합 하 고 혼합 교 반 하면서 뜨거운 접시에 70 ° C에가 열.
    2. 과산화 수소와 기판 추가 합니다. 더 높은 처리량에 대 한 소계 (PTFE) 보유자에 여러 기판 (특히 작은 유리 슬라이드)를 배치 합니다.
    3. 30 분 후 꺼내 기판, 철저 하 게 세척 병에서 물으로 린스와 질소 총 건조. 기판의 PEGylation 즉시 진행.
      주의: 피부와 눈 보호를 착용 하 고 증기 두건에서 작동. 할 닫지 폐기물 컨테이너 단단히 혼합물에서 가스 방출에 대 한 허용 하기 위하여.
  2. 기판의 PEGylation
    참고: 반복 중지 및 재개 Biotin-말뚝-Silane의 공기 수 분의 응축으로 인해 silane의 반응성을 감소 시킨다. 따라서, 적절 한 양의 Biotin-말뚝-실 란 5 mL 튜브 준비 (예: 10-20 밀리 그램) 건조 아르곤 사용까지 그들을 동결 하기 전에 그들을 채울.
    1. Vortexing (5 mg/mL)에 의해 건조 톨루엔에 Biotin-말뚝-Silane을 디졸브.
    2. 증기 두건에서 (120 cm 직경, 높이 2cm) 유리 페 트리 접시에 기질을 놓습니다.
    3. 플라스틱 표면 전체를 덮고 기판에 솔루션 (단일 유리 커버 슬립에 대 한 ≈200 µ L, 대형 실리콘 웨이퍼에 대 한 몇 mL) 하지만 기판의 가장자리를 통해 흐르는 하는 솔루션을 피하십시오.
    4. 페 트리 접시를 닫습니다. 기판의 건조를 줄이기 위해, 젖은 종이 타월로 추가 커버를 추가 합니다.
    5. 30 분 후 이소프로필 알콜의 약 40 ml를 추가 기판 밖으로, 이소프로필 알콜으로 다시 그것을 철저 하 게 씻어 그리고 질소 총 건조 (유리 슬라이드에 대 한 기억 PEGylated 쪽). 어둠 속에서 사용까지 기판을 저장 합니다.
      주의: 피부와 눈 보호를 착용 하 고 증기 두건에서 작동.

2입니다. 동원 정지에 대 한 유전자의 준비

참고: 뇌관 시퀀스, DNA 수정과 모범적인 PCR 프로토콜 보충 정보 (섹션 2-4)에 부여 됩니다.

  1. 수정 된 프라이 머를 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 관심사의 유전자를 증폭 하는. 한 뇌관 운반 fluorophore 시각화를 위한 형광 현미경 검사 법, 그리고 다른 뇌관은 구분 표시 순서에서 triethylene 글리콜 스페이서 PCR 통해 단일 가닥 표시 순서를 유지 하기 위하여.
  2. 스핀 열 정화 키트를 사용 하 여 DNA를 정화 하 고 흡수 광도 계를 사용 하 여 그것의 농도 측정. 농도 100 보다 훨씬 낮은 해서는 안 nM.
  3. 집중된 5 M NaCl 솔루션을 사용 하 여 1 m NaCl의 농도 조정 합니다. 높은 소금 농도 DNA 브러쉬 어셈블리 프로세스22를 촉진 한다.

3입니다. 사진 평판

참고: photocleavable DNA (PC)만 노란 빛 환경에서에서 처리 되어야 합니다. Cleanrooms 노란색 호 기존의 흰 빛 램프의 빛을 필터링을 사용할 수 있습니다.

  1. 기판의 준비
    1. Bephore-혼합 (1 µ M streptavidin, 1.5 µ M PC DNA, 7.5 µ M PH DNA 1 x PBS (인산 염 버퍼 염 분)에) 준비 및 패 시 베이 션 믹스 (10 µ M 1 x PBS에 DIS DNA, 1 mg/mL BSA (소 혈 청 알 부), 레이블 없음). 모두 몇 주 동안 냉장고에서 어둠 속에 저장할 수 있습니다.
    2. 유리 커터를 사용 하 여 또는 메스와 가장자리에 눌러 크리스탈 라인 실리콘 웨이퍼를 끊어서 기판 (몇 cm2) 작은 조각으로 잘라. 간단한 정렬 표시로 서 유리 커터를 사용 하 여 기판의 가장자리 쪽으로 센터에서 짧은 스크래치를 만듭니다. 불어 작은 입자에서 질소 총 칩.
    3. 2 구성 요소 실리콘 접착제, 예: 피 펫 팁, 감동 두 방울을 혼합 하 고 칩, 스크래치의 팁 주변을 비워 (그림 2A)의 표면에 접착제를 적용. 접착제는 세척 단계를 용이 하 게 하 고 외피에 필요한 DNA의 양을 줄여 소수 성 장벽을 제공 합니다. 나중 단계에서 접착제 수 수 쉽게 벗 겨.
    4. 10 µ L을 품 어 (또는 칩을 충당 하기 위해 필요한 만큼) 칩에 상 온 (RT) Bephore-믹스의. 외피, 동안 장소 예: 피 펫 팁 상자 상자에서 칩은 부분적으로 증발을 줄이기 위해 물으로 가득 합니다.
    5. 1 h, 칩 세척 후 제거 1 x PBS와 pipetting으로 여러 (5 x 50 µ L) 번 Bephore-믹스 언바운드.
    6. 칩 건조 하지 않고 가능한 많은 버퍼를 이륙 하 고 실시간에 칩에 패 시 베이 션 믹스의 10 µ L을 품 어
    7. 2 시간 후 씻어 칩와 언바운드 패 시 베이 션 에이전트를 제거 하려면 1 x PBS에 pipetting으로 몇 (10 x 50 µ L) 시간.
  2. 투영 리소 그래피
    참고: 리소 그래피를 위한 물 침수 목표 x 60 똑바로 현미경 사용할 수 있습니다. 조명 시간 목적, 광원, 마스크에 따라, 기판 (실리콘 칩 또는 유리 슬라이드) 및 원하는 DNA 표면 밀도. 60 x 목표와 함께 일반적인 노출 시간 겹치는 영역 2 단계 리소 그래피에 대 일 분까지 원거리 (15 실리콘 칩, 45에 대 한 s s 유리 슬라이드에 대 한) 전체 노출에 대 한 2-3 분. 때문에 자외선 차단에 기판 위에 (융합 된 석 영)를 제외 하 고 커버 슬립을 사용 하지 마십시오.
    1. 인쇄 포토 마스크를 잘라 (모범적인 리소 그래피 마스크와 보조 섹션 5 보조 파일 참조) 적합 한 마스크 홀더에 맞게 적절 한 크기로 필드 정지 (그림 2B)의 위치에 삽입할 수 있습니다. 정확한 다단계 리소 그래피에 대 한 정렬 표시 소유자와 마스크를 맞춥니다.
    2. 현미경 슬라이드에 기질을 놓고 현미경 단계로 이동 합니다. Bephore 유리 슬라이드의 패턴에 대 한 현미경 슬라이드와 리소 그래피에 대 한 어두운 배경 수 있도록 Bephore 슬라이드 사이의 검은 호 일 (예: 예비 포 일에서 인쇄 포토)를 삽입 합니다.
    3. 조명 경로, 기판 표면에 초점에 빨간색 필터를 삽입 하 고 노출 될 기판의 지역 예: 스크래치의 끝 지역 이동 합니다.
    4. 마스크 홀더, 조명 차단 넣고 UV 필터 (그림 2C)로 변경 합니다. 낮은 광도에 셔터 열고 카메라를 사용 하 여 기판에 마스크를 신속 하 게 초점.
    5. 카메라 빛 경로 차단 하 고 원하는 노출 시간에 대 한 높은 빛의 강도에 기판 조명.
    6. 현미경에서 샘플을가지고 고 조심 스럽게 제거 많은 버퍼 가능한 기판에서 그것을 건조 하지 않고.
    7. 표시 순서를 가진 DNA의 10-20 µ L를 추가 합니다. 장소는 젖은 상자에 기판 건조에서 그것을 유지. 2 h (micromolar 집중에 oligonucleotides) 또는 실시간에 몇 시간/하룻밤 (약 100 nM 농도에서 kbp 긴 DNA) 기판에 DNA를 품 어
    8. 칩에서 DNA를 제거 하 고 1 x PBS로 여러 번 씻. (특히에 대 한 긴 조각) DNA의 낭비를 줄이기 위해 기판에서 가져온 DNA를 저장 하 고 다시 사용 합니다.
  3. 여러 단계 리소 그래피
    참고: 단일 영역에 두 개 이상의 노출의 정확한 정렬, 각도 오차를 피하기 위해 무대에서 샘플을 유지. 칩 건조 하지 않고 다는 것을 확인 하십시오. 드라이브에 전동된 스테이지를 사용 하 여 지정 된 지역에 여러 DNA 브러시는 기판에 여러 지역에서의 위치에 대 한 적절 한 정렬 표시 기판 사용할 수도 있습니다.
    1. 첫 번째 노출 (3.2 단원), 후 기판에 표시 순서 DNA를 품 어. 첫 번째 노출에서 유래 하는 모든 바인딩 사이트 점유 된다 중요 하다. 따라서, oligonucleotides (10 µ M) 약 3 h 실시간에 품 어
    2. 표시 표시 유전자를 무력화 하 몇 시간 동안 그들을 기판에 배치 또는 RT에서 하룻밤 다음 세척 샘플 하 고 실시간 진행에 다음 노출을 추가 하는 또 다른 2 시간을 위한 패 시 베이 션 믹스.
    3. 추가 노출에 대 한 이전 단계를 반복 (3.2.3-3.3.2).

4. PDMS 장치

참고: 선호, 클린 룸에서 작동 합니다. 맥도날드 에 의해 설명 같은 PDMS 장치 제조 표준 프로토콜을 다음과 30

  1. 사진 평판을 통해 마스터 금형의 제작
    1. 쥡니다 아세톤 높은 전력에서 5 분에 의해 실리콘 웨이퍼 (76.2 m m 직경, 525 µ m 두께)을 청소 하 고 이소프로필 알콜와 드 이온된 물으로 린스. 나중에 15 분 동안 150 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다.
    2. 필요에 따라 개선 하기 위해 웨이퍼에 레지스트의 접착, 2-3 mL 접착 촉진제를 추가 하 고 2 분 동안 120 ° C를 웨이퍼 30 미 열에 대 한 3000 rpm에 회전 키를 누릅니다.
    3. 2-3 mL 포토 레지스트에 대 한 추가 ( 재료의 표참조). 15에 대 한 웨이퍼를 회전 s 500 rpm에서 다음 30 3000 rpm에서 s. 이 인해 20 µ m 두꺼운 층의 감광 한다. 감광 레이어를 10 분 동안 실내 온도에 휴식을 보자.
    4. 사전 노출 빵에 대 한 다음 5 분 동안 85 ° C에서 2 분 동안 50 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다.
    5. 구획의 청사진 포토 마스크에서 웨이퍼를 놓습니다. 가급적, 마스크 동기 기를 사용 하 여. 포토 마스크는 64000 dpi의 해상도 있어야 (리소 그래피 마스크와 보조 섹션 5 보조 파일 참조).
    6. 포토 마스크를 통해 자외선 (난-5-10 mW/cm2)과 1 분 동안 웨이퍼를 노출 합니다.
    7. 사후 노출 빵에 대 일 분 동안 50 ° C에서 그리고 5 분 동안 85 ° C에서 웨이퍼를 놓습니다. 진정 하 고 실 온에서 1 h 동안 휴식 웨이퍼를 하자.
    8. 부드럽게 비 커를 교 반 하면서 3 분에 대 한 개발자와 함께 접시에 웨이퍼를 놓습니다. 이소프로필 알콜으로 웨이퍼를 헹 구 고 질소 총 건조. 45 분 동안 130 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다.
  2. PDMS 장치 준비
    1. 믹스 PDMS 기지 고 PDMS 경화제 10:1 비율에 부 어 약 5 mm의 계층까지 닫힌된 컨테이너에서 웨이퍼에 웨이퍼 위에 형성 했다. 유일한 1 m m 두께의 PDMS 장치를, 대신 코트 2 분 100 rpm에서 PDMS와 웨이퍼를 회전 합니다.
    2. desiccator에 컨테이너를 놓고 진공 (약 85 kPa) 약 30 분에 대 한 적용 합니다. 그런 다음, 약 70 ° c 오븐에 1-2 h에 대 한 PDMS 열.
    3. 웨이퍼에서 PDMS 장치를 분리 합니다. 각 구획의 1 세트에 포함 되도록 석판으로 된 PDMS를 잘라. 경우는 PDMS 미세 설치에 연결 될 것입니다, 펀치 구멍 (직경 1 m m) 입구와 콘센트 공급 채널의 끝에.
    4. 이소프로필 알콜와 드 이온된 수 PDMS를 청소 하 고 질소 총 건조. 먼지가 PDMS를 저장 합니다.

5.로 한정된 유전자 발현

참고: 다음 절차 설명 합니다 샘플 홀더 (그림 3)의 어셈블리를 compartmentalized 유전자 발현의 관찰에 대 한 거꾸로 현미경에 케이지 인큐베이터 온도 제어와. 홀더 쉽게 사용할 수 있는 재료와 도구 (3.5-5 m m 두꺼운 폴 리 염화 비닐 (PVC) 플라스틱, 나사 및 너트, 드릴)을 사용 하 고, 현미경의 종류에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다. 5.1 및 5.2에서 설명 하는 단계는 소유자의 두 부분을 동시에 준비가 수행 되어야 한다.

  1. 하단 홀더 어셈블리
    1. 맞춤 표시 (예: 스크래치) Bephore 칩을 준비 하 고 양면 접착 테이프 (그림 3B)를 사용 하 여 칩 홀더에 접착제. 칩 그것을 다룰 것입니다 PDMS 장치 보다 더 큰 해야 합니다.
    2. 하나 또는 여러 개의 유전자 칩에 고정 (2 및 3 참조).
    3. 다음 하단 보유자의 중앙 구멍 주위 일부 진공 그리스 추가 칩 홀더를 연결 합니다.
      참고: 칩 홀더 지금 준수 하단 홀더는 그리스에 의하여 다시 x y 평면에서 칩의 위치에 대 한 가능성을 유지 하면서 합니다.
  2. 최고 홀더 어셈블리
    1. 단계 4.2.1에서에서 스핀 코팅 절차를 사용 하 여 구획 얇은 PDMS 칩을 준비 합니다. 채널을 보급 하 여 낭비와 선구자 분자의 교환 수 있도록 한쪽을 열어두고 PDMS, 가능한 작게 잘라.
    2. 유리 커버 슬립 (24 mm x 24 mm, no. 1.5) 및 산소 플라즈마 42에 대 한 PDMS 칩 (구획 없이 쪽)의 뒷면을 청소 s (200 W와 패러데이 케이지 샘플 0.8 mbar에서 운영 하는).
    3. 위쪽으로 가리키는 구획 PDMS 칩 유리 슬라이드의 가운데에 배치 합니다. 70 ° c.에 1 시간에 대 한 PDMS와 유리를 구워
    4. 일부 진공 그리스 최고 소유자의 큰 구멍 주위를 추가 합니다.
    5. 실험을 시작 하기 전에 깨끗 한 유리 슬라이드와는 PDMS 칩 42 산소 플라즈마와 친수성는 PDMS를 렌더링 하는 s.
    6. 최고 홀더 ( 그림 3C) 위에 PDMS와 유리 슬라이드를 놓고 그리스 (그림 3C)에 유리를 조심 스럽게 누릅니다.
  3. 홀더 어셈블리
    1. 셀-무료 식 시스템의 100 µ L를 준비 하 고 얼음에 그것을 유지.
    2. 조심 스럽게 칩에서 버퍼를 제거 하 고 세포 무료 식 시스템의 10 µ L로 한 번 씻. 다음으로, 칩에 셀 무료 식 시스템의 60 µ L을 추가 하 고 (이미 그림 3B에서 제거 되는) 칩의 가장자리에서 두 구성 요소 실리콘 접착제를 제거.
    3. PDMS에 식 시스템의 20 µ L를 추가 합니다. PDMS에 물방울을 배치 후 신속 하 게 검사는 구획은 잘 젖은 입체 현미경에서 기포 없이. 공기 방울 경우 셀 무료 식 시스템의 나머지와 함께 그들을 씻어 보십시오.
    4. 2 조립 나사 2 개 소유자의 챔버 및 DNA 브러쉬 정렬, 입체 현미경 작동 하 고 그래서 그리퍼 팔 아래쪽 홀더를 고정 하 조각 및 wingnuts 양손으로 쉽게 액세스할 수 있습니다 (그림 3D-F ).
    5. 하단 보유자에 상위 홀더를 삽입 하 고 셀 무료 식 시스템 방울 퓨즈 (그림 3D) 때까지 낮은. 여부는 구획 및 정렬 마크 x y 평면에서 비슷한 지역에는 입체 현미경을 통해 확인, 그렇지 않으면 최고 보유자와 다시 위치 최고 소유자 유리 슬라이드를 올려.
    6. 밑에서 나사로 죈 다는 wingnuts 그들은 소유자의 하단 쪽 터치까지. 신중 하 게 구획 및 칩은 x-y-비행기 를 통해 칩 홀더 (그림 3E)의 하단에 핸들에 정렬 하는 동안, wingnuts를 조입니다. 한 번 접촉, 강화는 wingnuts 매우 부드럽게 (그림 3 층).
      참고:이 단계는 몇 가지 경험을 요구 하 고 실험 설정에 따라 다릅니다. 현미경, PDMS와 유리 사이의 액체에서 발생 하는 간섭 패턴 적용 된 힘은 너무 작고, 너무 높은에서 구획 힌트의 중심에 (DNA 브러시 또는 표현된 단백질)에서 낮은 형광 강도 동안 나타낼 수 있습니다. 압력 (보충 정보, 섹션 6 참조).
    7. 물으로 안티 증발에 스폰지를 스프레이 상자에 소유자를 삽입. 2 구성 요소 실리콘 접착제 5 mL 주사기를 봉인 상자 (그림 3G)를 사용 하 여.
    8. 온도 제어 현미경 상자를 전송 및 이미지 DNA 브러시 및 형광 현미경 검사 법에 반응. 조명 없이 DNA 브러시의 형광 셀 무료 식 시스템에 사라져 요. 그럼에도 불구 하 고, 브러시 같은 브러쉬에서 반복 된 유전자 발현에 의해 표시 될 수로 그것의 활동을 유지 합니다.
      참고: Bephore 유리 슬라이드를 사용 하 여 실리콘 칩 대신, PDMS 및 Bephore 칩의 위치 (위/아래) 교환할 수 있습니다, 작은 작업 거리를 가진 목표의 사용에 대 한 허용.

6. 지속적인된 식 미세 장치

참고: 실험적인 체제는 그림 4A에 표시 된 부분에서 조립 된다. 온도 제어 스테이지의 어셈블리에 대 한 내용은 보충 정보 (섹션 7)에 부여 됩니다.

  1. 셀-무료 식 시스템 및 튜브
    1. 샘플 튜브 (약 200 µ L) 셀 무료 식 시스템을 준비 합니다. 형광 염료로 표시 된 폴리스 티 렌 구슬 공급 채널을 통해 유량 나중에 모니터를 추가할 수 있습니다.
    2. 압력 컨트롤러에 튜브를 연결 합니다. 약 12 시간 동안 차가운 유지 하는 큰 얼음 저수지에 튜브를 놓습니다. 필요한 경우에 얼음을 리필.
      참고: 압력 컨트롤러 대신, 주사기 펌프 흐름 저항 변화 예: 장기적으로 도움이 될 수도 있는 기포 때문에 실험 하는 경우에 셀 무료 식 시스템의 일정 한 흐름 율을 제공.
    3. PTFE에 셀 무료 식 시스템 들어 있는 튜브를 연결 튜브 (내부 직경 0.8 m m)가 열된 단계에 도달. PTFE 튜브 원피스 삽입을 무딘 끝 1-2 cm 조각으로 주사기 바늘 (0.9 m m의 직경)를 끊고. 그것은 나중에 PDMS에 커넥터 될 것입니다. 무대와 튜브 (그림 4C) 사이의 배관의 길이 최소화 하십시오.
    4. PTFE 튜브를 냉각, 얼음 물 저수지와 연동 펌프에 연결 된 더 큰 고무 튜브 주위 랩. 스카치 테이프 (그림 4C)와 함께 그들을 테이프.
  2. 최고 홀더 어셈블리
    1. 산소 플라즈마와 PDMS 칩의 편평한 측을 청소 (42 s) 피팅 입구 및 PDMS (그림 4B)의 콘센트 구멍 현미경 슬라이드 위에 놓습니다. 머리 드릴링 유리 유리에 구멍을 미리 뚫고 수 수 있습니다. 마이크로-챔버 유리 슬라이드에 직면 하지는 다는 것을 확인 하십시오.
    2. PDMS 소유자의 편평한 측에 양면 접착 테이프를 적용 됩니다. 접착 테이프에서 배경 형광을 피하기 위해 소유자의 두 구멍 사이 지역에서 한 조각의 검은 호 일 (예: 리소 그래피 마스크에서)를 스틱.
    3. 스틱 홀더에 PDMS 칩 유리 슬라이드.
    4. 치료는 PDMS와 연결 된 유리를 가진 PDMS 홀더 청소기 산소 플라즈마는 플라즈마에 슬라이드 (42 s).
    5. 진공 그리스에 가기 홀더 큰 구멍 주위를 적용 하 고 삽입 PDMS 홀더 (그림 4B). PDMS 홀더 지금 다시 x-y 방향으로 위치에 대 한 가능성을 유지 하면서 최고 홀더 준수 합니다.
    6. PTFE 튜브 주사기 바늘 커넥터 PDMS 칩의 입구를 연결 합니다. 상위 홀더를 통해 PDMS에 대 한 액세스를 촉진 하기 위하여 상단 플라스틱 플레이트는이 고 다음 단계에 대 한 간단히 제거할 수 있습니다.
    7. PTFE 주사기 바늘 커넥터 (그림 4D) 콘센트에 (약 5cm) 튜브의 두 번째 작품을 삽입 합니다.
    8. 그래서 그것은 모든 방향으로 이동 하 게 자유롭게 가기 홀더에서 PDMS 홀더를 배치 합니다. 장소 열띤된 무대에 느슨하게 최고 홀더는 어떤 wingnuts 강화 없이 그림 4E 에서처럼.
    9. 현미경, PDMS 구획의 위치를 이동 하 고 카메라의 시야에 센터. 이 시점에서 단계를 이동 하지 마십시오.
    10. 무대에서는 PDMS와 상위 홀더를 제거 합니다.
  3. 열띤된 무대와 Bephore 유리 슬라이드
    1. 열띤된 무대의 온도 37 ° C를 설정
    2. 현미경의 시야의 중심에서 약 맞춤 표시로 이중 양면된 접착 테이프를 사용 하 여 거꾸로 형광 현미경의 온도 제어 단계로 유전자 브러쉬로 Bephore 유리 슬라이드를 (4 호)를 붙입니다. 맞춤 표시의 포지셔닝이 구획은 동일한 지역에 대략 인하 될 보장 합니다.
    3. 유전자의 해당 형광 채널에서 이미지를 받아 고 카메라 이미지에서의 위치를 표시 합니다.
    4. 유전자 브러시에서 버퍼를 제거 하지만 그것을 건조 하지 마십시오. 유전자 브러시에 셀-표현의 자유 시스템의 20 µ L을 추가 하 고 실리콘 접착제 프레임을 제거 하는 핀셋을 사용.
  4. 미세 설정의 조립
    1. 셀 무료 식 시스템은 PTFE 튜빙 채워지고 PDMS 장치의 아래쪽에 나타납니다 때까지 샘플 튜브에 압력을 추가 합니다. 또한, 10 µ L는 PDMS에 마이크로 챔버에 세포 무료 식 시스템의 플라스틱. 구획은 공기 방울의 무료 다는 것을 확인 하십시오.
    2. 신중 하 게 낮은 유리 슬라이드에 최고 소유자와 유전자 브러시로 마이크로 챔버를 맞춥니다. PDMS와 정렬 마크 같은 초점면에 도달 하기 전에 PDMS 홀더 뒤 작은 나사를 사용 하 여 x-y-위치 및 PDMS 장치 유전자 브러쉬 (그림 4E)의 방향을 정확 하 게 맞춥니다.
    3. 위치 하 고 (그림 4E) 현미경 단계로 가기 홀더를 연결 하는 나사를 따라 wingnuts 강화 하 여 유리 슬라이드 위에 PDMS를 누릅니다.
    4. (그림 4 층) 셀 무료 식 시스템 모니터 공급 채널 (시간당 0.5 ~ 5 µ l 사이 속도 권장 흐름)을 통해 형광 구슬의 흐름을 포함 하는 튜브에 압력을 증가. 필요한 경우는 wingnuts 강화 하 여 유리에 PDMS의 압력을 증가.

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Representative Results

2 단계 리소 그래피: 그림 5 겹치는 붙일 레이블된 표시 가닥의 패턴 유리 슬라이드에는 두 단계로 석판의 결과 보여 줍니다.

형광 단백질 유전자 브러시에서의 표현: 그림 6 고정된 DNA에서 형광 단백질 YPet의 식을 보여 줍니다. 여러 지점에서 시간에 우리는 부분적으로 형광 단백질을 표백 하 고 형광 신호의 복구를 관찰 하 여 진 식 속도 평가, 단백질 식에서 발생 하지 않는 즉각적인 복구 무시. 첫 번째 표백 후 식의 2 시간에서 형광 강도 신속 하 게 복구 고 그 값 보다는 표백 하기 전에. 4 ~ 6 시간 후 형광은 신선한 식 혼합의 공급 없이 반응 약 3-4 시간 후 종료를 나타내는 그것의 이전 강도에 복구 되지 않았다.

마이크로 커플링: 유전자 발현 마이크로 통해 추가 선구자 분자와 식 구획을 제공 하 여 오랜 시간 동안 지속 될 수 있습니다. 그림 7 YPet 이상 10 h의 식 사용 같은 시스템을 보여준다.

TIRF 관찰: Bephore 단일 분자 수준에서 DNA 브러시로 붙일 레이블된 단백질의 상호 작용 연구에 적용할 수 있습니다. 특히 시끄러운 환경에서에서 리소 그래피 각각 특정 및 불특정 상호 브러시 또는 표면 사이 구별 하는 데 도움이 됩니다. 그림 8 붙일 레이블된 T7 RNA 중 합 효소 바인딩 또는 DNA 브러쉬 주위 표면에 비해 우선적으로 준수와 같은 예제를 제공 합니다.

Figure 1
그림 1 : Bephore 사진 평판. A. 이산화 규소 (SiO2)의 표면 가진 기판 biotinylated 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG-bt), 생체 이며의는 photocleavable DNA 머리 핀을 통해 첨부 파일에 대 한 수의 층으로 덮여 있다 biotin streptavidin의 상호 PC 시퀀스 도메인 abcb * 및 photocleavable 수정 (보라색 별)를 포함 하는 여기, 물가 PH 도메인에 때 교배와 는 *. B. 자외선 (자외선) 조명 앞 PC, 솔루션에 DNA 파편 (cb *) 방출. C-디. 발 붙일 레이블된 (녹색 별)으로 PH의 변위에 대 한 PC (b) 에이즈에 결과 단일 좌초 지역 표시 가닥. E. 또한 더, 이중 가닥 DNA (이 하 "서식 파일") 장착할 수 무늬 표면에. 이러한 DNA의 5' 끝에, 뇌관 및 표시 표시 PCR 동안 단일 가닥을 유지 하는 triethylene 글리콜 공백에 의해 구분 됩니다 표시 순서를 들고 뇌관 PCR에 의해 준비 (보충 정보 참조, 섹션 2-4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 2
그림 2 : 샘플 사진 평판에 대 한 준비. A. 현미경 슬라이드 또는 다른 칩 홀더 (예: 그림 3B에서 홀더)에 정렬 마크와 Bephore 칩을 배치. 2 구성 요소 실리콘 접착제 (단계 3.1.2-3) 칩의 가장자리를 따라 소수 성 장벽을 적용 됩니다. B. 마스크 홀더에 마스크를 배치 합니다. 여기, 우리는 필드 정지의 아이리스 제거 마스크는 작은 자석에 의해 열릴 수 있다 그래서 그것의 홀더를 수정. 다단계 리소 그래피 정확한 줄 맞춤 (각도), 맞춤 홀더 및 마스크 일치 (3.2.1 단계)에 표시를 확인 하십시오. C. 칩에 탐색 하 고 칩의 정렬 표시와 함께 마스크를 정렬 하려면, 빨간 필터에 슬라이드. 자외선 노출에 대 한 UV 필터 (단계 3.2.2-5)을 삽입 합니다. 그림 이전 작업27의 지원 정보에서 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : Compartmentalized 유전자 발현의 관찰에 대 한 소유자의 조립. A. 는 소유자의 부분 (눈금자 단위: cm). B c. 소유자의 위쪽 및 아래쪽 부분 패턴된 Bephore 칩 (섹션 5.1)를 들고 하단 보유자와 구획 (섹션 5.2) PDMS 칩을 들고 가기 홀더 별도로 조립 됩니다. D-f. 칩 및 PDMS는 신중 하 게 가져온 꽉 접촉으로 동시에 관찰 하 고 구획 및 입체 현미경 (단계 5.3.1-6) DNA 브러쉬를 정렬 하는 동안. G. 온도 제어, 거꾸로 현미경 홀더를 전송 하기 전에 전체 시스템 안티 증발 상자 (단계 5.3.7-8)에 캡슐화 됩니다. 그림 이전 작업27의 지원 정보에서 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : Compartmentalized 유전자 발현에 대 한 미세 설치 및 샘플 홀더. A. 부분의 샘플 홀더, PDMS 장치, 온도 제어 현미경 단계 및 Bephore 유리 슬라이드 (눈금자 단위: cm). B. 현미경 슬라이드 구획 PDMS를 들고 PDMS 홀더에 붙어 고 청소기 플라즈마에서 PDMS 함께 산소 플라즈마에 노출. PDMS 다음 상위 홀더 (단계 6.2.2-5)에 삽입 됩니다. C. 셀 무료 식 시스템 튜브는 압력 컨트롤러에 연결 하 고 얼음에 배치. 셀-무료 식 시스템에 대 한 튜브 (빨간색 파선은 삽입에)은 고무 (파란색 파선) 얼음 물 (6.1 단원) 연동 펌프에 의해 양수 된다를 통해 튜브에 의해 냉각 된다. 튜브 PDMS 장치에 있는 입구의 위치에 연결 된다. 튜브의 또 다른 조각 (단계 6.2.6-7) 콘센트에 연결 됩니다. E. 최고 홀더는 현미경 스테이지에 배치 하 고 신중 하 게 Bephore 슬라이드 쪽으로 인하. PDMS 홀더 여전히 Bephore 칩에 유전자 브러시로 PDMS에 구획에 맞게 x-y-비행기에서 이동할 수 있습니다. wingnuts Bephore 칩 위에 PDMS를 누르고 최고 보유자 현미경 단계 (단계 6.4.1-3)를 해결 하는 데 사용 됩니다. F. 셀 무료 식 시스템에는 PDMS 마이크로 채널을 통해 펌핑입니다 그리고 유전자 발현 DNA 브러쉬에서 epifluorescence 현미경 검사 법 (6.4.4 단계)에서 모니터링할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 2 단계 사진 평판. . 붙일 oligonucleotides 표시 (녹색: ATTO 532; 레드: 알 렉 사 Fluor 647)는 Bephore 유리 슬라이드를 통해 마스크 투영 리소 그래피 45 s. C. 의 노출 시간에 연속적으로 동원 했다 A와 B, 단일 노출의 정확한 맞춤을 보여주는 subfigures의 오버레이. 스케일 바: 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : 유전자 발현 들 에게만. A. Bephore 유리 슬라이드에 A DNA 브러쉬 (UV 노출 시간: 2 분), YPet (섹션 5 참조 하십시오 및 그림 3) PDMS 칩에 구획 정렬 했다 형광 성 단백질에 대 한 코딩. B. 유전자 발현 DNA와 챔버에는 PDMS 장치 외부 식 혼합 챔버를 연결 하는 채널에 따라 형성 단백질 농도 기온 변화도 가진 강한 형광 신호를 얻지 못했다. 고정된 유전자 없이 제어 챔버에 상대적으로 어두운 남아 있었다. C. 형광 강도 두 약 실 전부에 대 한 시간이 지남에 프로 파일. 2 시간 마다 형광 단백질은 부분적으로 표백 (검은 화살표) 식은 여전히 활성 상태 인지 확인 하. 4 h 후 형광 식 종료 했다 나타내는 그것의 이전 강도에 복구 되지 않았다. 바 규모: 300 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 : 지속적인된 compartmentalized 유전자 발현. A. Bephore 유리 슬라이드에 A DNA 브러쉬 (UV 노출 시간: 2 분), 코딩을 위한 YPet 구획 PDMS 칩에 정렬 했다. 구획은 공급 채널 (흰색 화살표) 통해 셀 무료 식 시스템이 양수 (섹션 6 및 그림 4참조)에 연결 됩니다. B. 유전자 브러시를 포함 하는 구획 셀 무료 유전자 표현 시스템에 의해 (녹색)에 YPet 식에서 형광 신호를 보여준다. 유전자 브러시 없이 인접 구획 상대적으로 어두운 남아 있습니다. 셀-무료 식 시스템의 신선한 구성 요소 공급 채널을 통과 하 고 폐기물 멀리 이송 하는 동안에 구획으로 확산. C. 형광 강도 두 약 실 전부에 대 한 시간이 지남에 프로 파일. 형광 단백질 식 여전히 활성 여부를 확인 하는 시간 (검은 화살표)에 서로 다른 지점에서 부분적으로 표백 했다. 공급 채널의 흐름으로 인해 유전자 발현 이상 10 헤 (빨간색 화살표에 의해 표시 된 빨간색 추적에 피크 기인 했다 공기 방울이 일시적으로 배수는 구획에서 솔루션)에 대 한 유지 했다. 스케일 바: 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8 : Bephore에 대 한 단일 분자 연구 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) 슬라이드 유리. A. 목표 형 TIRFM 수 유리-물 인터페이스에 가까운 단일 분자 이미징. 우리가 움직일 붙일 레이블된 유전자 (녹색, ATTO 532, UV 노출 시간: 2 분)는 T7 발기인 함께 있고 정의 줄무늬와 T7 RNA 중 합 효소의 행동을 관찰 (오렌지, 알 렉 사 Fluor 647와 레이블이) 표면 상호 작용. B. 형광 이미지 고정된 유전자의 2 개의 줄무늬를 보여주는. C. T7 RNA polymerases 연결 특히 및 비-구체적으로 (단일 이미지, 50 ms 노출 시간) 표면에. 평균 이미지 비디오 형광의 모든 프레임에서 얻은 (서브 피겨 C에서에서 처럼 5, 000 프레임) DNA 브러시로 RNA 중 합 효소의 특정 상호 작용을 제공합니다. 스케일 바: 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

Bephore 리소 그래피는 DNA 또는 RNA의 꽃무늬 동원 정지에 대 한 강력 하 고 다재 다능 한 기술입니다. 그러나, 절차-변경-실패에 대 한 원천이 될 수 있습니다 몇 가지 단계를 포함 하거나 시스템의 성능 감소.

Bephore 칩의 제조에 중요 한 단계는 표면의 생체 적합성을 제공 하는 기판의 PEGylation 이다. 여기, RCA 절차와 청소 단계 중요 하다, 때문에 그것은 또한 후속 silanization에 대 한 표면 활성화. 실제 PEGylation 동안 기판 밖으로 건조 하지 해야 합니다. 또한, Silane 못 Biotin 저장 되어야 한다 제대로 그것의 반응성 (섹션 1.2)를 보존 하 고 가교를 피하기 위하여. PEGylation의 결과 평가 하기 위해 기판 붙일 레이블된 streptavidin과 인 큐베이 팅 고 비 PEGylated 컨트롤에 비해 수 수 있습니다. 성공적으로 PEGylated 기판 컨트롤 보다 상당히 더 많은 streptavidin을 바인딩 한다.

또한, 석판 과정의 나중 단계, 칩의 건조에 불리 한 효과, 예를 들어 이미 바인딩된 DNA의 제거 또는 DNA의 높은 흡착 기판에 노출 되지 않은 지역에 발생 합니다.

(섹션 3.2) 위에서 설명 했 듯이, 리소 그래피 과정과 필요한 노출 시간 해상도 실험 설정 (목적, 광원, )에 따라 달라 집니다. 따라서, 첫 번째 단계에서 다양 한 노출 시간 테스트 되어야 합니다.

유전자 식 실험, 실험 설치 (현미경, 온도 제어, ) 사용 가능한 하드웨어에 맞게 사용자 지정할 수 합니다. 우리가 보여준 이러한 두 구현, 어디 시스템 식 믹스의 증발을 줄이기 위해 상자에 캡슐화는, 짧은 실험 (4, 5 절), 및 긴 관찰 (6 단원)에 대 한 미세 장치는 연속 사용 선구자 분자의 공급입니다. 두 경우 모두, DNA의 맞춤 기판에 브러쉬 하 고는 PDMS에 구획 까다로운 단계를 표시 합니다. 따라서 패턴된 하나를 사용 하기 전에 더미 기질을이 여러 번 시도 것이 좋습니다 (보충 정보, 섹션 6 참조). 고유한 유전자의 대형 시스템의 어셈블리에서 브러쉬, 긴 외피 시간, 챔버 및 장거리, 및 패 시 베이 션의 품질에 따라 비 패턴 영역에 DNA의 흡착에 의해 오염 브러시의 정확한 각도 맞춤 수 있습니다. 실질적으로 가능한 시스템의 크기에 한계를 포즈.

이 기술 대신 Karzbrun 그 외 여러분 에 의해 입증 되었다 25를 창조한 구획 하 여 칩에 유도 결합 플라즈마 반응성 이온 에칭 (Bosch 과정), 이산화 실리콘 층의 플라즈마 강화 된 증기 증 착 (PECVD)에 의해 따라. 후 표면 기능화, 모방 및 pipetting 로봇에 의해 nanoliter DNA 방울의 배치, 구획 PDMS 덮인 유리 슬라이드 폐쇄 했다. 이 절차는 DNA를 직접 챔버, 인근 훼손의 위험 없이 구획 안에 움직일 수 수 하지만 추가적인 제조 단계 및 실험실 장비 필요 이점이 있다.

여기에 제시 된 프로토콜 셀 무료 합성 생물학에서 연구원은 칩 기반 반응 용기에 학문의 그들의 시스템 솔루션 기반 설정에서 전송 수 있습니다. 저항을 개발 하는 동안 중앙 단계 활용 DNA 가닥 변위 생체 다단계 리소 그래피 쪽으로 손쉬운 접근을 제공 독특한 DNA 시퀀스, 노출 영역의 라벨 수 있습니다. 마이크로 함께 시간의 연장된 기간 동안 유전자의 관측 식 프로세스 수 있습니다. 오픈 흐름 반응 기 조건 하에서 세포 무료 유전자 식 프로세스의 조사를 제외 하 고 동일한 방법론 고정 공간 칩 표면에 다른 생체를 구성 하 사용 될 수 있습니다. 이 단일 분자 형광 기반 실험 시연 여기와 같은 다양 한 기능 및 생물 연구에 대 한 유용한 증명 해야 합니다.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

Acknowledgments

우리는 기꺼이 폭스바겐 재단 (부여 번호 89 883)와 유럽 연구 위원회 (보조금 계약 번호 694410-AEDNA)이이 프로젝트에 대 한 재정 지원을 인정 한다. 석사-미 지원을 통해 GRK 2062 DFG 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4 Menzel 22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5 Assistent 24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-Silane Laysan Bio MW 5,000
Anhydrous toluene Sigma Aldrich (Merck) 244511
Streptavidin Thermo-Fisher Scientific S888
DNA Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S PCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281 Spin-column PCR clean-up kit
PURExpress New England Biolabs E6800S Cell-free expression system
PDMS  Dow Corning Slygard 184
FluoSpheres Thermo-Fisher Scientific F8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) Bola S 1810-10
EpoCore 20 micro resist technology GmbH Photoresist
mr-Dev 600 micro resist technology GmbH Photoresist developer
Ti-Prime MicroChemicals Adhesion promoter
Two-component silicon glue Picodent Twinsil 
UV-protection yellow foil Lithoprotect (via MicroChemicals) Y520E212
Equipment
Masks for photolithography Zitzmann GmbH 64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscope Olympus BX51 Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.5
Camera Photometrics Coolsnap HQ Used with Olympus BX51
Ligtht source EXFO X-Cite 120Q Used with Olympus BX51
Inverted microscope Nikon Ti2-E Fluorescence imaging of gene expression
4x objective Nikon CFI P-Apo 4x Lambda Used with Nikon Ti2-E
Camera Andor Neo5.5 Used with Nikon Ti2-E
Light source Lumencor SOLA SM II Used with Nikon Ti2-E
Cage incubator Okolab bold line Used with Nikon Ti2-E
Pressure Controller Elveflow OB1 MK3
NanoPhotometer Implen DNA concentration measurement
Plasma cleaner Diener Femto 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage

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References

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