H3 और H4 हिस्टोन प्रोटीन और कोशिकाओं और मस्तिष्क ऊतक में Acetylated हिस्टोन के निशान के ठहराव का शुद्धिकरण

Neuroscience
 

Summary

इस लेख का उद्देश्य histones H3 और H4 और acetylated हिस्टोन अवशेषों के ठहराव के कुशल शुद्धिकरण के लिए एक व्यापक, व्यवस्थित मार्गदर्शन प्रदान करना है ।

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Janczura, K. J., Volmar, C. H., Wahlestedt, C. Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue. J. Vis. Exp. (141), e58648, doi:10.3791/58648 (2018).

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Abstract

सभी eukaryotic जीवों में, क्रोमेटिन, सभी आनुवंशिक जानकारी का शारीरिक टेम्पलेट, आनुवंशिकता के लिए आवश्यक है । क्रोमेटिन विविध posttranslational संशोधनों (PTMs) है कि ज्यादातर हिस्टोन प्रोटीन (यानी, हिस्टोन पूंछ) के अमीनो टर्मिनी में होते है और अंतर्निहित डीएनए की पहुंच और कार्यात्मक राज्य को विनियमित की एक सरणी के अधीन है । हिस्टोन पूंछ nucleosome के कोर से विस्तार और हिस्टोन acetyltransferases (टोपी) और एसिटाइल हिस्टोन (deacetylases) द्वारा HDACs समूहों के हटाने के दौरान सेलुलर विकास और भेदभाव के दौरान एसिटाइल समूहों के अलावा के अधीन हैं । lysine पर विशिष्ट acetylation पैटर्न (कश्मीर) हिस्टोन पूंछ पर अवशेषों transcriptionally सक्रिय या transcriptionally दमित क्रोमेटिन के बीच एक गतिशील homeostasis निर्धारित (1) कोर हिस्टोन विधानसभा को प्रभावित करने और (2) भर्ती synergistic या प्रतिपक्षी क्रोमेटिन-प्रतिलेखन साइट के लिए प्रोटीन से जुड़े । हिस्टोन पूंछ PTMs की जटिल प्रकृति के मौलिक विनियामक तंत्र क्रोमेटिन के बहुमत-टेंपलेट प्रक्रियाओं और कोशिका परिपक्वता और दोनों सामांय और रोग के विकास में भेदभाव में परिवर्तन में परिणाम प्रभावित करता है । वर्तमान रिपोर्ट के लक्ष्य के लिए एक कुशल विधि के साथ एक नौसिखिया प्रदान करने के लिए कोशिकाओं और मस्तिष्क ऊतक से कोर हिस्टोन प्रोटीन शुद्ध और मज़बूती से histones H3 और H4 पर acetylation के निशान यों तो है ।

Introduction

शब्द epigenetics जीन गतिविधि है कि डीएनए अनुक्रम1,2में परिवर्तन से स्वतंत्र रूप से होने में heritable परिवर्तन करने के लिए संदर्भित करता है । जीन प्रतिलेखन और दमन (1) गुणसूत्र डीएनए की पहुंच से निर्धारित कर रहे है कोर हिस्टोन प्रोटीन के एक octamer के आसपास लिपटे (दो प्रतियां H2A, H2B, H3, और H4) और द्वारा (2) प्रतिलेखन कारकों और पाड़ प्रोटीन की उपलब्धता विशिष्ट प्रमोटर साइटों के लिए भर्ती3,4। जीन प्रतिलेखन एंजाइम-विशिष्ट डीएनए प्रमोटर साइटों की मध्यस्थता संशोधनों और हिस्टोन पूंछ5,6,7के PTMs द्वारा विनियमित है । एन-टर्मिनी हिस्टोन H3 और H4 के सबसे उच्च संरक्षित eukaryotic जीवों3में जाना जाता दृश्यों के बीच में हैं, और उनके posttranslational संशोधनों को बड़े पैमाने पर किया गया है क्रोमेटिन संरचना का निर्धारण करने में एक केंद्रीय भूमिका निभा दस्तावेज और समारोह8,9. हिस्टोन पूंछ पर PTMs (यानी, acetylation, मिथाइल, फास्फारिलीकरण, और ubiquitination) पूंछ की बातचीत की क्षमता को बदलने के लिए, संरचनात्मक राज्य और क्रोमेटिन फाइबर की तह को प्रभावित, और इस तरह, डीएनए पहुंच को विनियमित और प्रसंस्करण4,10,11,12। एसिटाइल समूहों को जोड़ा और हिस्टोन पूंछ पर कश्मीर अवशेषों से विशिष्ट हिस्टोन-बातचीत epigenetic एंजाइमों, अर्थात् टोपी और HDACs, क्रमशः13का एक सेट द्वारा हटा रहे हैं । उदाहरण के लिए, lysine 12 (H4K12ac) में हिस्टोन H4 की acetylation पहले स्मृति अधिग्रहण और समेकन14से संबंधित जीन की प्रतिलिपि को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है । इसके अतिरिक्त, सबूत के कई लाइनें सुझाव है कि जीन प्रतिलेखन के एंजाइम मध्यस्थता epigenetic नियंत्रण स्वस्थ सेलुलर विकास और भेदभाव6,15का एक महत्वपूर्ण पहलू है । जीन अभिव्यक्ति के epigenetic विनियमन में अदल-बदल, या तो डीएनए के epigenetic संशोधनों द्वारा या स्वयं epigenetic एंजाइमों के उत्परिवर्तन द्वारा, मानव रोगों में dysregulated होने के लिए दिखाया गया है जहां एक विशेष जीन गतिविधि में परिवर्तन एक बानगी है की विकृति (जैसे, कैंसर)6,16,17। इस प्रकार, कोर हिस्टोन PTMs में परिवर्तन के मूल्यांकन के संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक उच्च मूल्य लक्ष्य के रूप में उभर रहा है । हालांकि, बहुतायत का निर्धारण, बातचीत भागीदारों, और histones PTMs की विशिष्ट भूमिकाओं18चुनौतीपूर्ण साबित किया गया है ।

वर्तमान रिपोर्ट में, एक अनुकूलित, मध्यम प्रवाह रणनीति एक ही अंश में कोशिकाओं और मस्तिष्क के ऊतकों से कोर histones को शुद्ध करने के लिए, और histones H3 और H4 PTMs के ठहराव के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । नोट की, हालांकि वर्तमान में प्रकाशित एसिड आधारित शुद्धि तकनीक और एंटीबॉडी आधारित हिस्टोन का पता लगाने रणनीतियों व्यापक रूप से हिस्टोन लक्षण वर्णन के लिए अपनाया गया है, वे वर्णनात्मक प्रक्रिया के महत्वपूर्ण कदम के बारे में विवरण की कमी है, इस प्रकार त्वरित और replicable हिस्टोन निष्कर्षण और ठहराव बाधा. उदाहरण के लिए, सेल निकालने और ऊतक बायोप्सी के प्रसंस्करण सफल निष्कर्षण के लिए विभिंन उपकरणों और प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता है । इसके अलावा, अनुकूलित प्रोटोकॉल वर्तमान पांडुलिपि में प्रस्तुत एक व्यावहारिक, मध्यम प्रवाह दृष्टिकोण दर्शाता है । कोर histones एक एकल, शुद्ध अंश के रूप में निकाले जाते हैं, जो किसी भी दोष से हस्तक्षेप के बिना विश्वसनीय बहाव एंटीबॉडी-मध्यस्थता PTM का पता लगाने में सक्षम बनाता है । इसके अलावा, वर्तमान पांडुलिपि में, अपने छोटे आणविक वजन के कारण हिस्टोन का पता लगाने के बारे में चुनौतियों को दरकिनार किया गया है । आमतौर पर, शुद्धि, ठहराव, और जेल ट्रो प्रोटोकॉल के बीच अनुकूलता की कमी replicable और निर्णायक परिणाम प्राप्त करने से वैज्ञानिकों में बाधा । यहाँ, एक अनुकूलित कार्यप्रवाह कोशिकाओं और ऊतकों से कोर histones को शुद्ध और पश्चिमी दाग के माध्यम से बहाव PTM विश्लेषण के लिए उन्हें तैयार करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है.

वर्तमान प्रोटोकॉल कोर हिस्टोन प्रोटीन की शुद्धि के लिए सक्षम बनाता है, जबकि उनके मूल posttranslational संशोधनों के संरक्षण (यानी, acetylation, मिथाइल, और फास्फारिलीकरण) । चित्रा 1 हिस्टोन शुद्धि प्रोटोकॉल की समयरेखा को दर्शाया गया है ।

Protocol

विश्वविद्यालय मियामी मिलर स्कूल ऑफ मेडिसिन में आर्द्र-और तापमान नियंत्रित, AAALAC-मान्यता प्राप्त पशु सुविधा में सभी चूहों का घर रखा गया था । सभी प्रयोगों मियामी मिलर स्कूल ऑफ मेडिसिन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित और NIH के विनिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया

1. नमूना निकालने की तैयारी

  1. अनुयाई कक्ष
    1. उपयुक्त संस्कृति मीडिया में 10 सेमी डिश में प्लेट कोशिकाओं (1 x 106 करने के लिए 1 x 109 सेल लाइनों के लिए डिश प्रति कोशिकाओं, जैसे BV2, HEK-२९३, और श-SY5Y, लेकिन ~ 1 x 10 प्राथमिक कोशिकाओं, जैसे प्राथमिक cortical ंयूरॉंस के लिए पकवान प्रति15 कोशिकाओं) । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को समान रूप से थाली की पूरी सतह पर वितरित कर रहे है और कोशिकाओं को ४८ के लिए विकसित करने के लिए ज ~ १००% संगम (३७ ° c, 5% सह2) तक पहुंचने की अनुमति ।
    2. एक बार कोशिकाओं वांछित प्रवाह तक पहुंच चुके हैं, धीरे संस्कृति मीडिया महाप्राण और एक ऊतक संस्कृति हूड के तहत गर्म सीरम मुक्त मीडिया के साथ 2x कोशिकाओं धो लो ।
    3. महाप्राण डिश से सीरम मुक्त मीडिया और बर्फ के 1 मिलीलीटर-ठंडा निष्कर्षण बफर जोड़ें (०.४ एम सल्फर एसिड, 1 मिमी KCl, 1 मिमी MgCl2, ५० मिमी Tris-एचसीएल [पीएच ८.०] और 1x चिढ़ाने के कॉकटेल) प्रत्येक डिश के लिए ।
    4. एक प्लास्टिक सेल खुरचनी का प्रयोग करें निष्कर्षण बफर में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए (परिमार्जन द्वारा) और उंहें एक १,००० µ एल पिपेट के साथ एक १.५ मिलीलीटर लेबल ट्यूब के लिए स्थानांतरण । प्लास्टिक कोशिकाओं को ऊपर और नीचे 3x homogenization की सुविधा के लिए ।
    5. सभी ट्यूबों बंद करें और तुरंत उंहें बर्फ पर डाल दिया ।
  2. मस्तिष्क ऊतक
    1. यदि जमे हुए ऊतक इस्तेमाल किया जा रहा है, एक ठंडा १.५ मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक जगह और यह बर्फ पर संक्षेप में गल । यदि ताजा ऊतक इस्तेमाल किया जा रहा है, 1.2.2 कदम तुरंत आगे बढ़ना ।
      नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल जमे हुए माउस मस्तिष्क और माउस आकडे प्रांतस्था नमूनों का उपयोग प्रक्रियाओं का वर्णन करता है ।
    2. Homogenize एक handheld Dounce उपयोग homogenizer निष्कर्षण बफर की उचित मात्रा में और स्ट्रोक (तालिका 1) की सिफारिश की संख्या का उपयोग कर ऊतक । अत्यधिक क्रोमेटिन कटा हुआ से बचने के लिए, अनुशंसित स्ट्रोक की संख्या से अधिक नहीं है ।
    3. एक एकल चैनल १,००० µ एल पिपेट का उपयोग कर, एक ठंडा १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए homogenate हस्तांतरण । सभी ट्यूबों बंद करें और तुरंत उंहें बर्फ पर डाल दिया ।

2. क्रूड हिस्टोन निकालने की तैयारी

  1. १.५ मिलीलीटर ट्यूबों युक्त कोशिकाओं या ऊतक निष्कर्षण बफर में एक घूर्णन मंच पर निलंबित कर दिया है और 15 rpm पर 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाने के लिए कच्चे तेल की निकासी की अनुमति histones ।
    नोट: निष्कर्षण समय विभिंन कोशिका और ऊतक प्रकार के लिए भिंन हो सकते है और प्रत्येक प्रक्रिया के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । वर्तमान प्रोटोकॉल 15 मिनट, 2 एच, और निष्कर्षण के 24 ज (चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4, और चित्रा 5) के बाद प्राप्त परिणाम प्रस्तुत करता है ।
  2. 4 ° c के लिए microcentrifuge को हल्का करें । के बाद वांछित निष्कर्षण समय बीत चुका है, अधिकतम गति पर ट्यूबों 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में केंद्रापसारक ।
  3. एक नया, ठंडा १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए कच्चे histones सहित supernatant हस्तांतरण । गोली छोड़ें ।
  4. supernatant पर-८० ° c संग्रह (निष्कर्षण इस कदम पर रोका जा सकता है, चित्रा 1में "कदम रोकें" देखें) या तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ना ।
  5. 5x बेअसर बफर के 1/4 की मात्रा के साथ क्रूड histones बेअसर (जैसे, 5x बेअसर बफर के २५० µ एल जोड़ें कच्चे histones के 1 मिलीलीटर) । ऊपर और नीचे 6x pipetting करके अच्छी तरह मिलाएं ।
  6. पीएच स्ट्रिप्स के साथ मिश्रण के पीएच की जाँच करें । 7 के पीएच तक पहुँचने के लिए और अधिक बेअसर बफर जोड़कर तदनुसार समायोजित करें ।
  7. इस प्रकार (चित्रा 2) के रूप में क्रूड हिस्टोन निकालने में हिस्टोन और nonhistone प्रोटीन की उपस्थिति का मूल्यांकन करें ।
    1. नमूना के ३७.५ µ एल जोड़ें (Laemmli) नमूना बफर और ९९ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए प्रकृति के १२.५ µ एल के लिए ।
    2. नमूना एक एसडीएस-पृष्ठ जेल पर लोड और जेल चलाने के लिए 1 h पर १०० V.
    3. दाग Coomassie शानदार ब्लू आर-२५० धुंधला समाधान और तीन लगातार बहाकर (1 एच के दौरान दाग/Coomassie शानदार ब्लू आर-२५० धुंधला समाधान के साथ) रात भर जेल ।
      नोट: क्रूड histones (चित्रा 2) eluted और शुद्ध histones (यानी, कॉलम इनपुट [चित्रा 5]) के साथ तुलना की जा सकती है ।

3. कोर Histones का शुद्धिकरण

  1. स्पिन कॉलम equilibration
    1. equilibration बफर के प्रत्येक स्पिन कॉलम में ५०० µ एल जोड़ें इस्तेमाल किया जा रहा है । स्तंभ झिल्ली को स्पर्श न करें ।
    2. ८०० x जीपर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक प्रवाह के माध्यम से त्यागें । दोहराएँ 1x.
  2. हिस्टोन शुद्धिकरण
    1. स्तंभ के लिए चरण २.६ से ब्याज के नमूने के ५०० µ l जोड़ें । ८०० x जीपर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा ।
    2. स्तंभ पर पूरे नमूने को लोड करने के लिए आवश्यक के रूप में कई बार के रूप में पिछले चरण को दोहराएँ । स्पिन कॉलम को ज्यादा से ज्यादा न भरें ।
    3. प्रवाह का मिश्रण के माध्यम से प्रत्येक केंद्रापसारक कदम से कॉलम बाध्यकारी दक्षता (चित्रा 3) का विश्लेषण ।
    4. स्तंभ प्रवाह-थ्रू का विश्लेषण करने के लिए २.७ चरण का पालन करें ।
  3. स्तंभ वाश
    1. प्रत्येक स्तंभ के लिए वॉश बफ़र के ५०० µ l जोड़ें । ८०० x जीपर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक फ्लो-थ्रू वॉश (वॉश #1) लीजिए.
    2. तीन बहाकर की कुल के लिए 3.3.1 चरण दोहराएँ. फ्लो-थ्रू बहाकर #2 और #3 लीजिए. लगातार स्तंभ प्रवाह-के माध्यम से बहाकर पूल नहीं है ।
    3. आगे स्तंभ की हिस्टोन-बाइंडिंग दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, तीन स्तंभ बहाकर निम्न चरण २.७ (आरेख 4) का विश्लेषण करें ।
  4. हिस्टोन रेफरेंस
    1. स्तंभ को एक नई बला १.५ एमएल ट्यूब में स्थानांतरित ।
    2. हिस्टोन रेफरेंस बफर के ५० µ l को जोड़ें । ८०० x जीपर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक हिस्टोन प्रोटीन युक्त प्रवाह के माध्यम से सहेजें ।
    3. एक अतिरिक्त रेफरेंस के लिए स्टेप 3.4.2 को दोहराएं । पहली और दूसरी प्रवाह-eluates के माध्यम से गठबंधन मत के रूप में वे हिस्टोन मात्रा और शुद्धता में अलग ।

4. कोर Histones की वर्षा

  1. 4% पीसीए की एक अंतिम एकाग्रता के लिए शुद्ध histones के लिए perchloric एसिड (पीसीए) जोड़ें (जैसे, कदम histones से शुद्ध 3.4.2 के ५० µ एल के लिए ७०% पीसीए के 3 µ एल जोड़ें ।
  2. 3 एस के लिए केंद्रापसारक ट्यूब दीवार से सभी अवशिष्ट तरल इकट्ठा करने के लिए । pipetting ऊपर और नीचे 6x से मिश्रण ।
  3. एक रैक में ट्यूबों प्लेस और 4 ° c पर 24 घंटे के लिए मशीन ।
  4. अगले दिन, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक microcentrifuge को ठंडा और 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम गति से ७५ मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक ।
  5. के बाद केंद्रापसारक पूरा हो गया है, एक छोटी सी सफेद छर्रों युक्त histones ट्यूब के तल पर दिखाई जाएगी । नमूने का भंवर न करें ।
  6. ध्यान से महाप्राण supernatant और, गोली परेशान बिना, बर्फ के ५०० µ l-ठंडा 4% पीसीए नमूना जोड़ें ।
  7. अधिकतम गति से 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक । जतन महाप्राण supernatant.
  8. दोहराएँ चरण ४.७ 2x.
  9. गोली परेशान बिना, बर्फ ठंडा एसीटोन के ५०० µ एल जोड़ें । अधिकतम गति से 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक । जतन महाप्राण supernatant.
  10. दोहराएँ चरण ४.९ 2x.
  11. ध्यान से महाप्राण supernatant, छोड़ uncapp ट्यूबों, और नमूने के लिए बर्फ पर शुष्क करने की अनुमति 30 min. Check अगर सभी अवशिष्ट एसीटोन सुखाया है ।
  12. uncapp ट्यूबों छोड़ दो और कमरे के तापमान पर शुष्क करने के लिए नमूना अनुमति (आरटी) 5 मिनट के लिए ।
  13. बाँझ पानी की 30 µ एल में गोली resuspend । ऊपर और नीचे मत प्लास्टिक । एक उंगली से धीरे ट्यूब झटका ।
  14. सभी ट्यूबों कैप और histones 30-50 मिनट के लिए बर्फ पर पुनर्गठित करने की अनुमति, गोली के आकार पर निर्भर करता है । जांच करें कि क्या गोली resuspend है ।
  15. सभी ट्यूबों कैप और गोली आगे आरटी पर 5 मिनट के लिए resuspend करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: यह सॉल्यूशन (step 3.4.3 से पहला और दूसरा रेफरेंस) शुद्ध और नमकीन histones का गठन किया गया है और आगे ठहराव और हिस्टोन acetylation एनालिसिस के लिए इसका इस्तेमाल किया जा सकता है ।

5. ठहराव Eluted हिस्टोन प्रोटीन्स

  1. ४.१५ चरण में अंतिम रेफरेंस के बाद प्राप्त होने वाले कुल हिस्टोन प्रोटीनों का अंदाजा लगाने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक spectrophotometer का प्रयोग करें । २३० एनएम पर अवशोषक उपाय । A260/A280 अनुपात न्यूक्लिक एसिड के साथ नमूना संदूषण का संकेत रिकॉर्ड ।
  2. हिस्टोन एकाग्रता (x) की गणना करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें:
    Equation
    यहां, आयुध डिपो A230 एनएम पर मापा ऑप्टिकल घनत्व है ।
  3. एक हिस्टोन एकाग्रता की ~ १.५ मिलीग्राम/एमएल एक औसत उपज माना जाता है सेल लाइनों के लिए, जबकि ~ ५.० मिलीग्राम/एमएल के एक हिस्टोन एकाग्रता 30 मिलीग्राम ऊतक के लिए एक औसत उपज माना जाता है ।

6. पश्चिमी दाग विश्लेषण

  1. शुद्ध और eluted हिस्टोन को चरण ४.१५ से समायोजित करें ~ 10 µ जी का हिस्टोन प्रोटीन का नमूना/
  2. लोड हो रहा है वॉल्यूम को समायोजित करने के लिए पानी और 4x Laemmli नमूना बफ़र के उपयुक्त वॉल्यूम जोड़ें ।
  3. ९९ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूने स्वभाव । उंहें बर्फ पर ठंडा । 3 एस के लिए केंद्रापसारक ट्यूब दीवार से सभी अवशिष्ट तरल और संघनित्र इकट्ठा करने के लिए ।
  4. एक एसडीएस पर नमूने लोड-पृष्ठ जेल और चलाने के लिए 1 घंटे के लिए जेल १०० V ।
  5. कुल हिस्टोन प्रोटीन कल्पना, Coomassie शानदार ब्लू आर-२५० धुंधला समाधान और तीन लगातार बहाकर (1 ज/Coomassie शानदार ब्लू आर-२५० धुंधला समाधान के साथ के दौरान दाग) के साथ रात भर जेल दाग ।
    नोट: हिस्टोन प्रोटीन्स का पहला रेफरेंस हाई-क्वालिटी histones (फिगर 5) होता है जबकि दूसरा रेफरेंस में histones (फिगर 5B) का कोई स्तर कम होता है ।
  6. हिस्टोन PTMs का अंदाजा लगाने के लिए, एक स्थानांतरण प्रणाली का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) एक PVDF झिल्ली पर एसडीएस-पृष्ठ जेल (चरण ६.४) से हिस्टोन प्रोटीन स्थानांतरित करने के लिए ।
    1. हस्तांतरण सैंडविच को इकट्ठा करने के लिए, स्थानांतरण प्रणाली कैसेट खुला और PVDF झिल्ली ढेर जगह (नीचे के रूप में लेबल +) ऊपर का सामना करना पड़ झिल्ली के साथ कैसेट के तल पर । ढेर और झिल्ली के बीच से किसी भी हवा को दूर करने के लिए एक दाग रोलर के साथ धीरे से झिल्ली रोल ।
    2. झिल्ली के शीर्ष पर जेल देना, झिल्ली और जेल के बीच से किसी भी हवा को दूर करने के लिए एक दाग रोलर के साथ धीरे जेल रोल, और जेल पर शीर्ष ढेर जगह है । फिर धीरे से रोल और सैंडविच के शीर्ष पर कैसेट कवर जगह, मजबूती से नीचे प्रेस, और मस्तक दक्षिणावर्त बारी ताला ।
    3. स्थानांतरण प्रणाली स्लॉट के लिए कैसेट डालें । उपकरण स्क्रीन पर, टर्बो प्रोटोकॉलका चयन करें । एक मिनी जेल या दो से अधिक मिनी जैल के लिए एक 7 मिनट प्रोटोकॉल के लिए एक 3 मिनट प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।
    4. 5 मिनट के लिए दाग Ponceau एस के साथ झिल्ली दाग और कुल हिस्टोन प्रोटीन कल्पना ।
    5. उंहें 1x Tris में धो-खारा (टीबीएस) के साथ ०.१% 2 एच के लिए 20 के बीच और 5% दूध में उंहें ब्लॉक प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 1 घंटे (4 डिग्री सेल्सियस या आरटी पर 1 घंटे में, क्रमशः) या एक पहले से अनुकूलित प्रोटोकॉल के अनुसार ।
      नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में acetylated histones H4K12 (चित्रा 6 और चित्रा 7) और H3K27 (चित्रा8) के खिलाफ एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया ।

Representative Results

हिस्टोन शुद्धि प्रोटोकॉल और सभी विश्लेषण भिन्न की संरचना की प्रगति को समझाने के लिए, हम मानव microglial BV2 कोशिकाओं से विभिन्न हिस्टोन निष्कर्षों का मूल्यांकन किया. histones H3 और H4 PTMs (यानी, acetylation) के ठहराव को प्रदर्शित करने के लिए हमने ब्रेन टिशू lysates का इस्तेमाल किया ।

BV2 कोशिकाओं को 10 सेमी ऊतक संस्कृति में डिश प्रति 5 x 106 कोशिकाओं में चढ़ाया गया था-व्यंजन का इलाज किया और ४८ एच कोशिकाओं के लिए प्रवाह को विकसित करने की अनुमति दी तो एकत्र थे, और histones क्रोमेटिन से ०.४ मीटर निष्कर्षण बफर में एक मशीन द्वारा जारी किए गए थे सल्फर एसिड, 1 मिमी KCl, 1 मिमी MgCl2, ५० मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ८.०), और 1x चिढ़ाना अवरोधक । निष्कर्षण समय, 15 मिनट और 24 घंटे के बीच, कच्चे हिस्टोन निष्कर्षों की समग्र संरचना को प्रभावित नहीं किया है के रूप में Coomassie शानदार नीले दाग (चित्रा 2) द्वारा निर्धारित की । इसके बाद, क्रूड histones equilibrated हिस्टोन कॉलम के माध्यम से पारित किया गया और प्रवाह के माध्यम से विश्लेषण किया गया था । उच्च कॉलम-बाध्यकारी दक्षता प्रवाह में हिस्टोन प्रोटीन के अभाव द्वारा निर्धारित किया जाता है-के माध्यम से जब Coomassie शानदार नीले दाग से विश्लेषण किया । हम कॉलम-बाध्यकारी क्षमता निर्धारित करने के लिए १००% हो के रूप में वहां कोई detectable हिस्टोन विश्लेषण प्रवाह के माध्यम से (चित्रा 3) में मौजूद प्रोटीन थे । बंधे histones के साथ सभी झिल्ली तो धो बफर के साथ तीन बार धोया बफ़र किसी भी शेष अशुद्धियों को दूर करने के लिए, केवल हिस्टोन प्रोटीन सिलिका जेल के लिए बाध्य जा रहे थे । हम निर्धारित किया है कि, सभी हिस्टोन निष्कर्षण बार के लिए (यानी, 15 मिनट, 2 एच, और 24 एच), पहली झिल्ली धोने सबसे महत्वपूर्ण था स्तंभों से nonhistone संदूषणों को दूर करने के लिए, जबकि दूसरी और तीसरी बहाकर नमूना शुद्धता को प्रभावित नहीं किया । इस प्रकार, नमूना प्रकार के आधार पर, अंतिम दो बहाकर छोड़ा जा सकता है । स्तंभ से हिस्टोन प्रोटीन का पहला रेफरेंस के बाद (1mM NaCl और EDTA युक्त रेफरेंस बफर का उपयोग करते हुए), histones 4% perchloric एसिड के साथ रातोंरात उपजी और फिर गोली, धोया, और शुद्ध histones H3 की समृद्धता के लिए विश्लेषण किया गया और H4. हमने देखा है कि 24 घंटे के निष्कर्षण समय H3 और H4 histones की मात्रा में 15 मिनट की तुलना में शुद्ध अंश और निष्कर्षण समय के 2 ज (आंकड़ा 5 ए) बढ़ जाती है । कॉलम से दूसरे रेफरेंस में उच्च-गुणवत्ता या उच्च मात्रा में histones (फिगर 5B) का परिणाम नहीं आया ।

अगले, हम मस्तिष्क ऊतक homogenates हिस्टोन H3 और H4 PTMs, अर्थात् acetylation यों तो इस्तेमाल किया । वंय-प्रकार (C57BL6/पुरुष चूहों एक मोटे तौर पर अभिनय किया गया HDAC अवरोधक (tributyrin) 5 ग्राम की एक खुराक पर मौखिक रूप से 3 डी के लिए. पूरे मस्तिष्क ऊतक 4 दिन पर एकत्र किया गया था और कच्चे histones वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार निकाले गए थे. एक ख़राब टीपरीक्षण का उपयोग करते हुए, हम tributyrin कच्चे तेल निकालने में histones के acetylation बढ़ जाती है कि निर्धारित (टी(6) = ६.१८४, पी = ०.०००४); हालांकि, दोष निकालने में पाया जाता है (हिस्टोन बैंड स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं कर रहे हैं) । इस प्रकार, H4K12ac एंटीबॉडी एक उच्च विशिष्टता (चित्रा 6) नहीं है । आगे छोटे ऊतक वर्गों के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता का मूल्यांकन करने के लिए, हम ट्रिपल ट्रांसजेनिक अल्जाइमर रोग से आकडे प्रांतस्था एकत्र (3 एक्स टीजी-विज्ञापन) चूहों दैनिक इलाज के साथ 10 मिलीग्राम/kg M344, एक वर्ग मैं और IIb HDAC अवरोध करनेवाला, के लिए चार महीने. हिस्टोन शुद्धि और वर्षा के स्पेसिफिकेशंस वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था । शुद्ध हिस्टोन H3 और H4 अंश का उपयोग करते हुए, हम H4K12 acetylation (चित्रा 7) की एक उच्च विशिष्टता के साथ H4K12ac एंटीबॉडी २.४-गुना (टी(6) = १३.०३, पी < ०.०००१), M344 बढ़ जाती है कि निर्धारित किया है । इसी प्रकार, हम एक और HDAC अवरोध करनेवाला, अर्थात् चयनात्मक HDAC3 अवरोध करनेवाला, RGFP-९६६ के जवाब में BV2 कोशिकाओं में हिस्टोन H3 acetylation में वृद्धि मनाया । 10 RGFP-९६६ के µ एम के उपचार के 24 ज के बाद हिस्टोन H3K27 पर acetylation के एक लगभग दोहरा वृद्धि का कारण बनता है । छात्र के बिगड़ा टी-टेस्ट नियंत्रण बनाम इलाज कोशिकाओं की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: हिस्टोन शुद्धि प्रोटोकॉल की समयरेखा । हिस्टोन विश्लेषण के लिए सभी कदम हर कदम के लिए आवश्यक अनुमानित समय के साथ नीचे दिखाए जाते हैं । विशेष कदम के परिणाम चित्रण और पांडुलिपि के भीतर प्रस्तुत आंकड़े कोष्ठक में संदर्भित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि Coomassie प्रतिभाशाली नीले दाग histones प्रदर्शन कच्चे BV2 कोशिकाओं से निकाले गए जेल । हिस्टोन निष्कर्षण प्रोटोकॉल शुरू होने से पहले BV2 कोशिकाओं ४८ ज के लिए संस्कृति थे । क्रूड histones 15 मिनट, 2 एच, और 24 एच के लिए निकाले गए थे, के साथ तीन प्रत्येक समय बिंदु के लिए प्रतिकृतियां (यह भी आंकड़ा 3, चित्रा 4में मामला है, और चित्रा 5) । क्रूड हिस्टोन निकालने में दोनों nonhistone और हिस्टोन प्रोटीन मौजूद हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि Coomassie शानदार नीली दाग जेल कॉलम प्रवाह के माध्यम से हिस्टोन BV2 कोशिकाओं से शुद्ध कदम निंनलिखित के माध्यम से प्रदर्शन । हिस्टोन बाइंडिंग कॉलम के माध्यम से गुजर रहे कच्चे हिस्टोन के बाद, केवल nonhistone प्रोटीन प्रवाह के माध्यम से में मौजूद हैं । इस अंश में हिस्टोन प्रोटीन नदारद हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि Coomassie शानदार नीले दाग जेल BV2 कोशिकाओं से एक हिस्टोन शुद्धीकरण कदम के बाद एक कॉलम धोने का प्रदर्शन । चाहे हिस्टोन निष्कर्षण बार, जो थे (A) 15 min, (B) 2 h, or (C) 24 h, कम मात्रा में nonhistone प्रोटीन्स केवल पहले-वाश histonebinding कॉलम में मौजूद थे । सभी बहाकर में हिस्टोन प्रोटीन नदारद थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि Coomassie शानदार नीले दाग जेल BV2 कोशिकाओं से एक हिस्टोन शुद्धि कदम के बाद elutions का प्रदर्शन । () हिस्टोन शुद्धि स्तम्भ से प्रथम रेफरेंस के बाद उच्च गुणवत्ता वाले शुद्ध और हिस्टोन H3 तथा H4 का पता लगाया गया. () हिस्टोन शुद्धि स्तम्भ से दूसरा रेफरेंस एक उच्च गुणवत्ता या मात्रा में histones H3 या H4 की उपज नहीं था. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: मोटे तौर पर अभिनय HDAC अवरोध करनेवाला, tributyrin, जंगली प्रकार के चूहों के पूरे मस्तिष्क में H4K12 acetylation बढ़ता है. () इस पैनल के एक प्रतिनिधि पश्चिमी कच्चे हिस्टोन निकालने में H4K12 acetylation की वृद्धि को दर्शाने मोटे तौर पर अभिनय HDAC अवरोध करनेवाला, tributyrin के जवाब में जंगली प्रकार चूहों के पूरे मस्तिष्क से एकत्र दाग से पता चलता है । () यह पैनल वीवो मेंH4K12 acetylation में वृद्धि के ठहराव को दर्शाता है । न बिगड़ा t-परीक्षण समूहों (t(6) = ६.०७६, P = ०.०००५) की तुलना करने के लिए उपयोग किया गया था । सलाखों मतलब (SEM) के मानक त्रुटि ± का प्रतिनिधित्व करते हैं । N = 8. P < ०.०००१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: वर्ग मैं और IIb HDAC अवरोध करनेवाला, M344, ट्रिपल acetylation अल्जाइमर रोग (3 एक्स टीजी-विज्ञापन) चूहों के आकडे प्रांतस्था में H4K12 ट्रांसजेनिक बढ़ जाती है. () इस पैनल के एक प्रतिनिधि पश्चिमी शुद्ध और नमकीन हिस्टोन में acetylation H4K12 की वृद्धि का चित्रण दाग से पता चलता है 3 एक्स टीजी के आकडे प्रांतस्था से एकत्र-विज्ञापन चूहों HDACs द्वारा M344 के निषेध के जवाब में । () यह पैनल चार महीनों के लिए एक 10 मिलीग्राम/किलो दैनिक खुराक पर प्रशासित M344 के जवाब में H4K12 acetylation की वृद्धि की ठहराव को दर्शाता है । न बिगड़ा t-परीक्षण समूहों (t(6) = १३.३०, P < ०.०००१) की तुलना करने के लिए उपयोग किया गया था । सलाखों के अर्थ ± SEM. N = 8 प्रतिनिधित्व करते हैं । P < ०.००००१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: चयनात्मक HDAC3 अवरोध करनेवाला, RGFP-९६६, BV2 microglial कोशिकाओं में H3K27 acetylation बढ़ जाती है. () इस पैनल के एक प्रतिनिधि पश्चिमी शुद्ध और नमकीन हिस्टोन में H3K27 acetylation की वृद्धि का चित्रण दाग से पता चलता है HDAC3 द्वारा RGFP अवरोध के जवाब में BV2 कोशिकाओं से एकत्र निकालने-९६६ । () RGFP-९६६ कारण हिस्टोन H3 में acetylation की एक लगभग दोहरा वृद्धि और lysine (K) 27 के बाद 24 उपचार के ज. ख़राब t-परीक्षण नियंत्रण बनाम इलाज कोशिकाओं (t(4) = ५.९८१, P = ०.००२) की तुलना करने के लिए उपयोग किया गया था । सलाखों के अर्थ ± SEM. N = 6 प्रतिनिधित्व करते हैं । * *P < ०.०१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रतिनिधि ऊतक (एक गोलार्द्ध) * औसत ऊतक वजन (mg) निष्कर्षण बफ़र (एमएल) स्ट्रोक्स की संख्या
माउस सेरिबैलम ४० 1 ४०
माउस ललाट प्रांतस्था 30 ०.३ 20
माउस हिप्पोकैम्पस 27 ०.३ 18
माउस entorhinal प्रांतस्था 19 ०.३ 17
* सभी प्रयोगों वयस्क पुरुष चूहों पर प्रदर्शन किया गया.
औसत आयु: 16 महीने । औसत वजन: 30 ग्राम ।

तालिका 1: मस्तिष्क ऊतक homogenization के लिए अनुकूलित शर्त ।

Discussion

वर्तमान काम में, हम कोर हिस्टोन प्रोटीन और हिस्टोन H3 और H4 PTMs (जैसे, acetylation) यों तो शुद्ध करने के लिए एक अनुकूलित विधि का प्रदर्शन किया । प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक व्यापक कार्यप्रवाह है कि कोशिकाओं और मस्तिष्क ऊतक तैयार करने के बारे में अनुकूलित प्रक्रियाओं को शामिल किया गया है, क्रूड हिस्टोन शुद्धि, और विस्तृत हिस्टोन वर्षण, रेफरेंस, और ठहराव, जिसके बाद कर रहे हैं हिस्टोन ट्रो आणि दमदार हिस्टोन PTM ठहराव. विवरण की बड़ी राशि यहां प्रदान की उच्च गुणवत्ता वाले डेटा की एक replicable पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, हिस्टोन नमूनों की लंबी जोड़तोड़ की आवश्यकता के बावजूद ।

कई वर्तमान में प्रकाशित प्रोटोकॉल histones H3 और H419के शुद्ध अंशों को अलग करने के लिए HPLC के उपयोग की आवश्यकता है । हालांकि HPLC एक शक्तिशाली तकनीक है, इसकी जटिलता और कम प्रवाह सबसे आणविक जीव और इसके लगातार उपयोग से गैर विशेषज्ञों रोकते । दरअसल, HPLC कई प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं है, और अत्यधिक कुशल कर्मियों साधन संचालित करने के लिए आवश्यक है । HPLC बार समय लेने वाली है, महंगा है, और संभावित खतरनाक । यहां प्रस्तुत एक सस्ती, मध्यम प्रवाह के लिए समान गुणवत्ता जो HPLC बाईपास के परिणाम प्राप्त करने की रणनीति है । रिपोर्ट की रणनीति भी अधिक व्यावहारिक और लगभग किसी भी प्रयोगशाला में उपयोग के लिए उपयुक्त है के रूप में यह एक सरल स्पिन कॉलम दृष्टिकोण है कि विशेष साधन आपरेशन कौशल की आवश्यकता नहीं है का उपयोग करता है । इसके अतिरिक्त, हिस्टोन H3/H4 tetramer एक, शुद्ध, और प्रचुर मात्रा में एक प्रोटीन के प्रत्येक पर संरक्षित ठहराव के एक विश्वसनीय PTMs को सक्षम करने के रूप में निकाला जाता है ।

PTMs ऑक्सीडेटिव तनाव में परिवर्तन और पीएच20,21में परिवर्तन के लिए अत्यंत संवेदनशील हैं । इस प्रकार, पहले प्रकाशित तरीकों के विपरीत18, हम कोशिकाओं की एक न्यूनतम चयापचय अशांति सुनिश्चित करने के लिए और सीरम घटकों के साथ देशी PTMs के हस्तक्षेप से बचने के लिए सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं को धोने की एक कुशल रणनीति की रिपोर्ट. वर्तमान प्रोटोकॉल न केवल पारंपरिक नाभिक अलगाव बाईपास लेकिन यह भी सेल lysis और सटीक ऊतक homogenization प्रक्रिया के लिए इष्टतम समय प्रदान करता है कि परमाणु लिफाफे के संरक्षण के लिए अनुमति देता है, जबकि परमाणु एकत्रीकरण से परहेज । हालांकि निष्कर्षण समय कोशिकाओं की संख्या के आधार पर हेरफेर किया जा सकता है, कोशिका प्रकार का उपयोग किया, ऊतक आकार, आदि, विस्तारित lysis वांछनीय नहीं है के रूप में यह नाभिक और डीएनए रिहाई के lysis के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, नमूना मुश्किल को संभालने के लिए बना. महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल के भीतर कई चौकियों सफल हिस्टोन शुद्धिकरण (जैसे, कदम २.७ और 3.2.3) के सत्यापन के लिए मौजूद हैं । यह रणनीति भी लंबी प्रक्रिया में समस्या निवारण की सुविधा ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल की एक और महत्वपूर्ण और अनूठी विशेषता अपनी अनुप्रवाह पश्चिमी दाग विश्लेषण उपकरण और दूसरों के साथ पूर्ण अनुकूलता यदि ऐसा है तो वांछित है । हिस्टोन प्रोटीन पर पाए जाते हैं ~ 15 केडीए13,22,23 और, इसी तरह अन्य छोटे आणविक वजन प्रोटीन के लिए, मानक immunoblotting तकनीक से पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण साबित किया गया है. इष्टतम संकल्प प्रोटीन जैल के साथ संयोजन में एक उच्च प्रदर्शन और उच्च प्रवाह हस्तांतरण प्रणाली का उपयोग प्रोटीन देशी पुष्टि (एसडीएस के अभाव में) और एसडीएस और उच्च हस्तांतरण दक्षता के अभाव में गतिविधि के रखरखाव के लिए अनुमति देता है कम आणविक वजन हिस्टोन प्रोटीन की, इस प्रकार एक विश्वसनीय हिस्टोन PTM ठहराव आश्वस्त ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

लेखक स्वास्थ्य प्रवर्तन निदेशालय और Ethel मूर अल्जाइमर अनुसंधान कार्यक्रम (अनुदान 6AZ08 और 7AZ26), NIH-NIAAA (अनुदान 5R01AA023781-03), और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (अनुदान 17PRE33660831) के फ्लोरिडा विभाग के लिए उनका आभार व्यक्त करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes ThermoFiser Scientific 05-408-129 or equivalent from other sources
Sterile water Gibco 15-230-204 or equivalent from other sources
70% perchloric acid Sigma Aldrich 311421 or equivalent from other sources
100% acetone Sigma Aldrich 270725 or equivalent from other sources
pH-indicator strips, non-bleeding Milliipore Sigma 1095310001
4x SDS sample buffer BIO-RAD 161-0747
Benchtop rotor Cole-Parmer UX-04397-34 or equivalent from other sources
1.5 mL tube rack ThermoFiser Scientific 05-541 or equivalent from other sources
Histone purification mini kit Active Motif 40026 spin columns included in the kit
Protease Inhibitor Cocktail ThermoFiser Scientific 78430 or equivalent from other sources
Nanodrop instrument ThermoFiser Scientific ND-2000
Tissue culture dishes VWR 10062-880 required for histone extraction from cultured cells
Tissue culute media varies based on cell line used varies based on cell line used required for histone extraction from cultured cells
Low-serum media ThermoFiser Scientific 51985091 required for histone extraction from cultured cells
Plastic cell scraper Falcon 353086 required for histone extraction from cultured cells
SDS-PAGE gradient gel BIO-RAD 456-9035 required for histone extraction from cultured cells
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution BIO-RAD 1610436 required for histone extraction from cultured cells
Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution BIO-RAD 1610438 required for histone extraction from cultured cells
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs BIO-RAD 1704156 required for histone extraction from cultured cells
Trans-Blot Turbo Transfer System RIO-RAD 1704150 required for histone extraction from cultured cells
Ponceau S stain CellSignalling 59803S required for histone extraction from cultured cells
Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance Kimble Chase 885302-0007 required for histone extraction from tissues
100% bleach Clorox 68973 required for histone extraction from tissues
H4K12ac antibody Active Motif 39166 required for PTMs quantification via WB
H3K27ac antibody Active Motif 39134 required for PTMs quantification via WB

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References

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