정량 검사의 항생제 자화 율 Neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 ATP 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩

Immunology and Infection

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Summary

간단한 ATP 측정 분석 결과 및 라이브/죽은 방법 얼룩 계량 ceftriaxone 치료 후 Neisseria gonorrhoeae 생존을 시각화 하 사용 되었다. 이 프로토콜 검사 어떤 항생제의 항균 효과를 확장할 수 있습니다 고 박테리아 biofilms에서 항생제의 최소 억제 농도 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.

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Wang, L. C., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

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Abstract

항생제 내성 Neisseria gonorrhoeae (GC)의 출현은 세계적인 건강 위협이 고 치료 하지 못하는 개인을 식별 하는 필요를 강조. 이 그램 음성 박테리아는 인간에서 독점적으로 임 질을 발생합니다. 감염, 동안 양식 집계 biofilms 하 수 있다. 최소 억제 농도 (MIC) 테스트 항생제 자화 율을 결정 하 고 적절 한 치료를 정의 하기 위해 사용 됩니다. 그러나, vivo에서 박멸 및 실험실 결과 관계의 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. GC 집계 항생제 자화 율에 영향을 미치는 방법과 집계 크기와 항생제 자화 율 사이의 관계를 표시를 검사 하는 방법 개발 되었다. 때 GC 집계, 그들은 더 죽이 항생제에 저항력이, 센터에서 박테리아와 함께 주변에 그 보다 더 나은 ceftriaxone 치료를 생존. 데이터 표시 N. gonorrhoeae 집계 표준 한 천 격판덮개 기반 마이크 메서드를 사용 하 여 반영 되지 않습니다 ceftriaxone의 민감성을 줄일 수 있습니다. 이 연구에 사용 되는 방법은 연구자 임상 관련 조건 하에서 세균 자화 율 테스트를 수 있습니다.

Introduction

임 질은 일반적인 성병 감염 (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), 그람 음성 diplococcal 박테리아는이 질병의 원인이 되는 대리인. 생식 기 감염의 증상 통증 배 뇨, 일반화 된 생식 기 통증, 그리고 요도 방전 하는 동안 발생할 수 있습니다. 감염이 종종 무 증상2,3,,45, 이며 이로써 확장된 식민. 그들은 유기 체의 전송을 촉진 가능성이 있고이 골반 염증 성 질환 (PID) 등의 합병증으로 이어질 수 있습니다 gonococcal 감염 (DGI)6전파 이러한 치료 감염 주요 건강 관심사는. 항생제 내성 임 질은 중요 한 공중 위생 위기와 증가 사회경제적 부담7. Cephalosporins 감소 민감성 ceftriaxone8azithromycin 또는 doxycycline 결합 듀얼 치료에서 단일 항생제 치료 처방 변경 결과입니다. Ceftriaxone 및 azithromycin9,10, 함께 무 증상 감염의 증가 실패 임 질 치료 실패를 이해 하기 위한 필요를 강조 한다.

한 천 희석 및 디스크 확산 테스트를 포함 하 여 최소 억제 농도 (MIC) 테스트는 항생제에 저항을 식별에 대 한 표준 의학 시험으로 사용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 마이크 테스트 세균성 항 생 저항 vivo에서 반영 하는 경우에 명확 하지 않습니다. 항생제의 살 균 농도의 박테리아의 생존에 기여 하는 박테리아 biofilms의 형성: 마이크 테스트 하는 것은이 효과11을 감지할 수. GC는12점 막 표면 biofilms을 형성할 수 있다, 때문에 우리가 가설 그 항생제 자화 율 집계 내 개별 GC에서 본 다른 것. 또한, 연구 3 상 가변 표면 분자, Pili, 불투명도 관련 단백질 (Opa), 및 lipooligosaccharides (로스), 규제 간 박테리아 상호 작용, 다른 크기의 집계13, 으로 이어질 14 , 15. 항생제 저항에 이러한 구성의 기여 적절 한 방법의 부족으로 검사 하지.

현재, biofilm 박멸을 측정 하기 위해 여러 가지 방법이 있다. 가장 널리 사용 되는 양적 방법 크리스탈 바이올렛16얼룩을 사용 하 여 바이오 매스의 변화를 측정 하는 것입니다. 그러나, 방법 중요 한 실험적인 조작 실험 반복17에서 잠재적으로 오류를 생성할 수 있는 필요 합니다. 여기에 사용 되는 라이브/죽은 착 방법 라이브 하 고 죽은 박테리아와 그들의 분포는 biofilm 내의 시각화 수 있습니다. 그러나, biofilm 구조의 염료 침투를 감소 시키는 물리적 장벽으로 발생할 수 있습니다. 따라서, 그룹 내에서 라이브/죽은 박테리아를 계량 하는 얼룩 작은 biofilms 또는 그것의 선구자-microcolonies 또는 집계로 제한 됩니다. 다른 방법을, 한 천 희석 및 디스크 확산 테스트를 포함 하 여 집단의 효과 측정할 수 없습니다. 것 필요 모두를 측정할 수 있는 정량적 분석 결과 박테리아 생활과 그들의 분포를 시각화 항생제 노출, 이상적인 방법 집계에서 GC 민감성을 검사 합니다.

여기에 설명 된 절차는 ATP 사용률 측정 결합 및 라이브/죽은 얼룩을 양적 분석 결과 항생제의 집계에서 GC 민감성을 시각적으로 검사.

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Protocol

1. 일반적인 유지 보수의 GC 변종

  1. N. gonorrhoeae 긴장 행진 1% GCK agar에 켈로그18 (표 1, 표 2) 냉장고 주식에서 보충 하 고 5% CO2 16-18 헤 사용 MS11 단계 변수 Opa (MS11Opa +), 아니 Opa (MS11ΔOpa), 표현에 대 한 37 ° C를 품 어 또는 잘린된 로스 (MS11ΔLgtE)입니다.
  2. 신중 하 게 부정적인 pili (어두운 가장자리 없이 식민지) 또는 양성 (어두운 가장자리 식민지) 식민지 식민지 형태학19 해 가벼운 현미경 및 새로운 GCK 플레이트에 연속 사용에 따라 각 스트레인에서 선택 합니다.
  3. 사용 하기 전에 16-18 h 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어.

2. 생존 GC 집계의 정량화

  1. 메 마른 주걱을 사용 하 여 GC를 수집 합니다. 면봉 접시에서 GC와 미리 데워 국물 (GCP, 표 3)에 다시 중단 GC 1%와 4.2% NaHCO3 켈로그 솔루션18보충. 분 광 광도 법을 사용 하 여 650의 파장에서 nm (1의 OD650 ~ 109 CFU/mL x 1 =) 중단된 박테리아의 농도 결정 하.
  2. ~ 1 × 10로 GC의 농도 조정8 CFU/mL.
  3. 96 잘 접시의 우물으로 조정 GC 중지 99 µ L를 추가 합니다.
  4. 박테리아 수 있도록 5% CO2 와 37 ℃에서 6 h에 대 한 접시를 품 어 집계에.
  5. 추가 1 µ L의 직렬 희석된 ceftriaxone (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 µ g/mL) 각 우물에. 치료 컨트롤 역할을 일부 우물을 남겨 주세요.
  6. 5% CO2와 37 ℃에서 24 h에 대 한 접시를 품 어.
  7. 3 번에 5 144 W에서 s 및 20 kHz에 대 한 각 잘 정지 sonicate
  8. 각 잘으로 100 µ L 상용 ATP 이용 발광 시 약의 추가, 최대 플라스틱-그리고 3 번, 아래로 5% CO2와 37 ° C에서 15 분 동안 품 어.
  9. 신중 하 게 96-잘 검은 microplate에 새로운 우물에 각 우물에서 혼합물의 150 µ L를 전송 하 고 거품을 도입 방지.
  10. 각 560에서의 흡 광도 측정 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.
  11. 직렬 ceftriaxone 치료 후 치료 우물에서 독서를 얻은 독서의 비율에 의해 생존 율을 계산 합니다.

3. 라이브/죽은 GC의의 형광 현미경 분석

  1. 메 마른 주걱을 사용 하 여 GC를 수집 합니다. 접시에서 면봉 GC와 미리 따뜻하게 GCP 미디어 플러스 1%에서 GC 다시 중단 켈로그 보충.
  2. 650의 파장에서 분 광 광도 법으로 박테리아의 수를 결정 nm ~ 1 x 10 GC의 농도 조정 하 고7 CFU/mL.
  3. 8 잘 coverslip 아래쪽 챔버에 198 µ L로 GC 중지를 추가 합니다.
  4. 집계 형성 수 있도록 5% CO2 와 37 ℃에서 6 h는 챔버를 품 어.
  5. 각 잘 각 집계 조건 내에 ceftriaxone (100 µ g/mL 또는 다양 한 희석)의 2 µ L를 추가 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 원하는 시간에 품 어.
  6. 각 우물에 라이브/죽은 얼룩 솔루션 혼합물의 0.6 µ L을 추가 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 20 분 동안 품 어.
  7. Confocal 현미경 (동등한 현미경은 사용할 수 있습니다)를 사용 하 여 Z-시리즈 이미지를 취득 합니다.
  8. ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 GC 집계와 라이브-에-죽은 각 집계에 얼룩의 형광 강도 비율 (FIR)의 크기의 측정에 대 한 이미지를 분석 합니다.

4. 이미지 분석

  1. 세균의 크기 추정
    1. ImageJ 열고 ImageJ 메뉴 모음에는 raw 이미지 파일을 드래그 하 여 이미지를 엽니다.
    2. ImageJ 메뉴 막대에서 프리 핸드 라인 을 클릭 하 고 이미지에서 각 집단의 영역 원형.
    3. 클릭 분석 | 측정 ImageJ 메뉴 표시줄에서.
    4. 지역 열 아래에서 새 창에 번호를 가져올.
  2. 집계의 라이브-에-죽은 비율의 정량화
    1. ImageJ 열고 ImageJ 메뉴 모음에는 raw 이미지 파일을 드래그 하 여 이미지를 엽니다.
    2. 클릭 분석 | 설정 측정 ImageJ 메뉴 표시줄에서.
    3. 팝업 창에서 통합된 밀도 확인 하 고 확인을 클릭 합니다.
    4. 이미지 클릭 | 컬러 | 도구 채널 메뉴 막대에 있는 선택 색상.
    5. 채널 1 라이브 박테리아 얼룩에 대 한 형광으로 확인 합니다.
    6. ImageJ 메뉴 막대에서 프리 핸드 라인 을 클릭 하 고 각 집단의 영역 원형.
    7. 클릭 분석 | 측정 ImageJ 메뉴 표시줄에서.
    8. IntDen 열 수를 가져옵니다.
    9. 죽은 세균성 얼룩에 대 한 형광으로 채널 2 를 확인 합니다. 4.2.6-4.2.8 단계를 반복 합니다.
    10. 숫자 단계의 4.2.8 단계의 4.2.9 숫자로 나누어 살고 죽은 비율을 얻을.
  3. 통계 분석
    1. GraphPad Prism 열고 원하는 열에 ImageJ에서 얻은 번호를 입력 합니다.
    2. 분석 을 클릭 하 고 열 분석에서 t 테스트 를 선택 합니다.
    3. 비교에 대 한 원하는 열을 확인 하 고 확인을 클릭 합니다.
    4. 분석 창에서 P-값을 구할.
    5. 단계 4.3.3에서에서 XY 분석 에서 선형 회귀 를 선택합니다
    6. R-광장 및 분석 창에서 P-값 을 가져옵니다.

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Representative Results

두 가지 방법을 사용 했다: ATP 사용률 분석 결과 및 라이브/죽은 얼룩 분석 결과. 결과 결합 하거나 개별적으로 항생제 치료 후 집계 내 세균 생존을 검토를 위해 사용 될 수 있습니다 합니다. ATP 사용률 분석 결과 미 균 biofilms20,21에서 정확 하 게 실행 가능한 박테리아를 측정 하기 위해 표시 되었습니다. 여기, MS11Opa + 필 + 스트레인 항생제 자화 율에서 GC 집계의 역할 검사 사용 되었다. 비 집계 MS11Opa + 필 +, 집계 MS11Opa + 필 +, 또는 집계 및 다음 쥡니다 MS11Opa + 필에 의해 중단 + 직렬 희석 ceftriaxone 및 ATP 수준 측정 (그림 1A)로 치료 했다. 비교 백분율 생존와 항생제 치료를 하지 않고, 미리 집계 GC 했다 동등한 ceftriaxone (한 천 희석 테스트 ( 에서에서 마이크의 0.015 µ g/mL 이상으로 비 집계 또는 집계 중단 GC 보다 상당히 높은 생존 표 4)). MS11Opa + 필-, MS11ΔOpa 또는 MS11ΔLgtE 같은 한 천 희석 마이크 (표 4), 양식 작은 집계 하지만, 했다 검사 고 MS11Opa + 필 + (그림 1B)에 비해. MS11Opa + 필 +, 형성 하는 큰 집계, 돌연변이 체 긴장 보다 ceftriaxone 치료와 함께 더 높은 ATP 수준을 했다.

라이브/죽은 얼룩은 여러 biofilm/집계 관련 연구22,23에 사용 되었습니다. 집계의 효과 결정, 사전 집계 MS11Opa + 필 + 또는 ceftriaxone 없이 치료 되었고 몇 군데를. 그러면 시각화 (이 정해질 수 있습니다)와 항생제 치료 (그림 2A-2 패널 왼쪽) 후 라이브 및 죽은 GC의 분포. 반면 라이브 GC (녹색) 주로 ceftriaxone 치료의 핵심에 위치 하 고 있었다 죽은 박테리아 (레드) 크게 외부 층에 위치 했다. 이 절차는 MS11Opa + 필으로 수행 되었다-, MS11ΔOpa 또는 MS11ΔLgtE, 조사 집계 크기와 생존 율 (그림 2A). MS11Opa + 필 + 가장 큰 형태와 MS11Opa + 필 표시 했다-작은 집계 (그림 2A, B). MS11Opa + 필 + 집계 코어 계층에 아직도 살아 있었다 반면 MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + 필의 작은 느슨한 집계에서 GC-, MS11ΔLgtEPil + 죽 었 고 (그림 2A, C). 크기와 생존을 바탕으로, 상관 관계 그래프 집계 크기와 항생제 생존 (그림 2D)의 관계를 검사를 그릴 수 있습니다.

Table 1
표 1: GCK 천 배지 1 L에 대 한 제조 법.

Table 2
표 2: 100 x 켈로그의 보충의 1 L에 대 한 제조 법.

Table 3
표 3: GCP 세균성 성장 매체의 1 L에 대 한 제조 법.

Table 4
표 4: 최소 억제 농도의 GC 변종 ceftriaxone 치료. MS11Opa + 필 +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE, 및 MS11Opa + 필-성장 하 고 GCP에 중단 했다. 한 천 희석 시험 직렬 농도로 ceftriaxone 0.0016-에서 수행한 다음 0.25 µ g/mL.

Figure 1
그림 1 : Ceftriaxone 치료 ATP 사용률 분석 결과에서 집계 된 GC의 생존 율의 대표적인 데이터. (A) 생존 사전 집계, 사전 6 h에 대 한 집계 또는 MS11Opa + 필 집계 6 h 6 헤 (B) 생존 율 비교에 대 한 사전 집계 후 방해 없이 + MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + MS11Opa + 필 + 서 스 펜 션의 비교 평가 필-또는 MS11ΔLgtEPil +입니다. 표시는 평균 값 (±SD)에서 얻은 3 개의 독립적인 실험. p < 0.001; p < 0.01; p < 0.05입니다. 이 그림은 이전에 게시 24 고 허가 함께 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : Ceftriaxone 치료에서 집계 내 라이브/죽은 박테리아 분포의 대표적인 데이터. (A) 사전 집계 MS11Opa + 필 +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + 필-, 또는 MS11ΔLgtEPil + 중 2 h. 집계 가능한 (녹색) 및 죽은 (레드) GC 시각화를 묻은 다음 있었고 함께 시각 1 µ g/mL ceftriaxone의 유무에 인 큐베이 팅 공초점 형광으로 현미경 눈금 막대: 50 µ m. 이미지 (B) 집계 크기에 대 한 다음 분석 했다 고 죽은 라이브 GC 및 (D) 상관 관계 그래프의 (C) 비율 다음 만들었습니다. 표시는 평균 값 (SD)에서 얻은 3 개의 독립적인 실험의 > 40 이미지. p < 0.001; p < 0.01; p < 0.05입니다. 이 그림은 이전에 게시 24고 허가 함께 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

박테리아는 인체 감염 시 biofilms을 형성할 수 있다. 전통적인 마이크 테스트는 biofilm에서 박테리아를 박멸 하는 데 필요한 농도 반영 되지 않을 수 있습니다. biofilm에 항균 효과 테스트 하려면 방법 biofilm 바이오 매스를 기반으로 CFUs 도금 biofilm 구조의 영향으로 인해 잘못 된 될 수 있습니다. 예를 들어 도금 방법은는 biofilm 중단 될 수 있습니다 하는 경우 작동 합니다. 따라서, 얻은 CFU 실행 가능한 박테리아의 실제 번호 보다 낮은 수 있습니다. 그러나 머릿속 죽은 및 라이브 박테리아는 biofilm 내의 측정 biofilm 내의 박테리아의 생존에 대 한 설립 되었습니다,, 구조와 biofilm의 밀도 따라 얼룩이 지는 실패할 수 있습니다는 biofilm에 침투 하 여 발생 한 부정확 하 고 과소 평가 생존 속도입니다.

여기 방법의 치료 후 세균 생존을 측정 하는 양적 및 시각화 분석 결과 사용 합니다. 이 방법의 장점은 실제 감염에서 본 것에 가까운 환경에서 세균 생존 측정. 비 집계 및 집계 박테리아 사이의 생존 율 차이 생체 외에서 마이크 vivo에서 마이크와 상관 관계가 있는지 확인 하기 위해 우리 것을 허용할 것 이다.

ATP 생산을 측정, ATP 사용률 분석 결과 양적 집계의 생존을 측정할 수 있습니다. 분석 결과 더 민감한 고 항생제 농도, 다른 유사한 분석 실험에 비해 작은 차이 사이 생존을 분화 할 수 있다. 그러나,이 분석 결과의 높은 감도 때문에 세균성 세포 세포의 용 해의 보증은 중요 합니다. 따라서, 쥡니다 단계 사용 되었다. 또한,이 방법은 세균 생존 때문에 많은 양의 ATP 세균성 ATP 수준 마스크 수 호스트 세포 생산 vivo에서 측정을 사용할 수 없습니다. 또한, 호스트 세포의 박테리아 상호 작용 수 있습니다 세균 ATP 생산에 영향을. 이 분석 결과 사용 하 여 안료로 박테리아에 안료는 읽기를 방해할 수로 제한 수 있습니다.

라이브/죽은 얼룩 biofilm 연구에서 널리 사용 되었습니다. 그러나, 착 색 염료의 침투는 코어 얼룩이 지지 않을 수 있습니다 반면만 바깥쪽 박테리아, 얼룩 수 있습니다. 따라서, 그것은 단지 시각화 하지만 하지 정량화, 염료의 고르지 못한 배급 때문에 사용할 수 있습니다. 우리이 얼룩에 대 한 작은 집계를 사용 하 고이 분석 결과 계량 집계 내 전체 세균 생존 하는 데 사용할 수 있습니다 입증. 또한, 부정과 긍정적인 컨트롤 다른 박테리아에 대 한 염료의 농도 조정 하기 위해 필요 합니다.

함께 마이크 프로토콜, ATP 사용률 분석 결과 및 라이브/죽은 얼룩 양적 및 시각적으로 뿐만 아니라 다른 세균 집계25,26 N.gonorrhoeae 를 분석 하는 효과적인 방법으로 사용할 수 있습니다. 결합 된 프로토콜의 응용 프로그램 박테리아 biofilms에 따라 마약 검사에서의 다양 한 사용과 함께 질병 형성의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다. 이 메서드는 vivo에서 항생제의 마이크 더 정확 하 게 반영 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 D.C.S.를 되었다 AI123340 건강의 국립 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다. L.-C.W., jw 메리어트, 교류, E.N. 부분/메릴랜드 대학에 의해 투자 하는 "첫 해 혁신 및 연구 경험" 프로그램에 참여에 지원 했다. Funders 게시, 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 또는 원고 준비에 전혀 역할을 했다. 우리는 모든 현미경 실험을 위한 UMD CBMG 이미징 코어를 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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