淋菌ATP の使用率が集計を使用して商業試金およびライブ/デッド染色の抗生物質感受性の定量的検討

Immunology and Infection

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Summary

単純な ATP 測定法およびライブ/デッド染色法は、定量化し、セフトリアキソン、治療後の淋菌生存を視覚化する使用されました。このプロトコルを拡張して任意の抗生物質の抗菌効果を確認して、細菌バイオ フィルムにおける抗生物質の最小発育阻止濃度を定義する使用ことができます。

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Wang, L. C., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

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Abstract

抗生物質耐性淋菌(GC) の出現は、世界的な健康の脅威であるし、治療に失敗する人を識別する必要性を強調します。このグラム陰性細菌は、ヒトの排他的淋疾を引き起こします。感染、時にバイオ フィルムおよび/または集合体を形成することです。最小発育阻止濃度 (MIC) テストは、適切な治療の定義、抗生物質に対する感受性を決定するために使用されます。しかし、生体内での撲滅と検査結果の関係のメカニズムは知られていません。GC 集計の抗生物質感受性に影響を与えるし、骨材粒径と抗生物質感受性との関係を示していますどのように調べ方法が開発されました。GC 集計、彼らは抗生物質の殺害に抵抗力があるが、中心部の細菌の存続セフトリアキソン治療よりも周囲の。データを示す淋菌集計が標準寒天培地プレート ベース マイク メソッドを使用して反映されていないセフトリアキソンに感受性を減らすことができます。本研究で用いられた方法は臨床的に関連する条件の下で細菌の感受性をテストする研究者になります。

Introduction

淋病は、性感の一般的な感染症 (STI)1です。淋菌(GC)、グラム陰性菌 diplococcal 菌がこの病気の原因となるエージェントです。性器の感染症の症状は尿道分泌物、全身性器の痛み、排尿時の痛みになります。感染はしばしば無症候性2,3,45であり拡張植民地化できます。これらの未処理の伝染は、有機物の伝達を容易にする可能性がある、これは骨盤の炎症性病気 (PID) などの合併症につながることができ、播種性淋菌感染症 (DGI)6に主要な健康の心配。抗生物質耐性の淋病は主要な公衆衛生の危機および増加の社会経済的負担7 です。セファロスポリンに感受性の低下は、単一抗生物質から8セフトリアキソンとアジスロマイシンまたはドキシサイクリンを組み合わせたデュアル療法への治療レジメン変更になりました。セフトリアキソンとアジスロマイシン9,10, 無症候性感染症との組み合わせでの増加の障害は、淋病の治療の失敗を理解する必要性を強調表示します。

寒天培地希釈法とディスク拡散テストを含む、最小発育阻止濃度 (MIC) テストは、抗生物質への抵抗を識別する標準的な検査として使用されています。それにもかかわらず、マイクのテストは、生体内で細菌の抗生物質耐性を反映している場合は明らかです。抗生物質の殺菌濃度の存在下で細菌の生存に貢献する細菌バイオ フィルムの形成: マイクのテストはこの効果11を検出することができるではないです。我々 はその抗生物質仮説 GC は、粘膜の表面12バイオ フィルムを形作ることができる、ため凝集感受性は個人総合順位で見られると異なるでしょう。さらに、研究の 3 段階可変表面分子、Pili、不透明度関連タンパク質 (Opa)、異なった大きさで分類された骨材13,につながる細菌間の相互作用を調節する、lipooligosaccharides (ロサンゼルス)、示されています。14,15します。 適切な方法の不足のため抗生の抵抗をこれらのコンポーネントの貢献は検査されなかった。

現在、バイオ フィルム撲滅を測定するいくつかの方法があります。最も広く使用されている定量法は、クリスタル バイオレット染色16を用いたバイオマスの変化を測定することによってです。ただし、メソッドには、実験繰り返し17のエラー メッセージを生成することができます潜在的重要な実験操作が必要です。ここで使用されるライブ/デッド染色法では、ライブとデッドの細菌とバイオ フィルム内の分布の可視化ことができます。しかし、バイオ フィルムの構造は、染料の浸透を軽減する物理的な障壁として提起できます。したがって、グループ内でのライブ/デッド細菌を定量化する染色するは、小さなバイオ フィルムまたはその前駆体 microcolonies または集計に限定されます。寒天培地希釈法とディスク拡散テストを含む他の方法は、凝集の効果を測定することは。必要両方が測定できる定量細菌を生きていると、その分布を可視化する理想的な方法抗菌薬曝露後の集計内で GC の感受性を調べる。

ここで説明する手順を組み合わせた ATP 使用率測定して GC 感受性抗生物質の存在下で凝集を目視で調べてライブ/死んで染色定量的に分析します。

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Protocol

1 GC 系統の一般的なメンテナンス

  1. 淋菌株を連勝 GCK 1% 寒天培地にケロッグ サプリメント18 (表 1、表 2) 冷凍庫株からと 5% CO2 16 18 h. 使用 MS11 相変数 Opa (MS11Opa +)、ない Opa (MS11ΔOpa) を表現するために 37 ° C の孵化または切り捨てられたロス (MS11ΔLgtE)。
  2. Pili 負 (コロニー暗い縁なし) または解剖顕微鏡および新しい GCK プレート上に連勝を使用してコロニー形態19に基づいて各株から正 (暗いエッジを持つコロニー) 植民地を慎重に選択します。
  3. 16-18 時間使用する前に 5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。

2 GC の集計の生存率の定量化

  1. 滅菌アプリケータを使用して GC を収集します。綿棒プレートから GC と予め温めておいたスープ (GCP、表 3) で再停止 GC は 1% 4.2% NaHCO3とケロッグ ソリューション18を補った。650 の波長での吸光光度法を使用して nm (1 の OD650 = ~ 109 CFU/mL x 1) 浮遊菌の濃度を決定します。
  2. 1 ~ 10 x に GC の濃度を調整する8 CFU/mL。
  3. 96 ウェル プレートのウェルに調整された GC の懸濁液の 99 μ L を追加します。
  4. 細菌を許可する 5% CO2と 37 ° C で 6 時間プレートをインキュベート集計します。
  5. シリアル希薄セフトリアキソンの 1 μ L を追加 (1000、100、50、25、12.5、6.2、3.1、1.5、0.8、0.4 0.2 μ G/ml) を各ウェルに。未処理のコントロールとして機能するいくつかの井戸を残します。
  6. 5% CO2と 37 ° C で 24 時間のプレートを孵化させなさい。
  7. 3 回 5 144 W で s と 20 kHz の各ウェルの懸濁液を超音波照射します。
  8. 各ウェルに 100 μ L 市販 ATP 利用グロー試薬を追加、ピペットを- と 3 回にダウンし、5% CO2と 37 ° C で 15 分間インキュベートします。
  9. 慎重に各ウェルから黒 96 ウェル マイクロ プレートで新しい井戸に 150 μ L の混合物を転送し、気泡を導入することを避けるため。
  10. 560 で各ウェルの吸光度を測定プレート リーダーを使用して nm。
  11. 未処理井戸からの読み取り中にシリアル セフトリアキソン治療後に得られる読書の割合によって生存率を計算します。

3. 蛍光顕微解析 GC 骨材のライブ/デッド

  1. 滅菌アプリケータを使用して GC を収集します。プレートから綿棒 GC と予め温めておいた GCP メディア プラス 1% で再停止 GC ケロッグのサプリメントします。
  2. 650 の波長吸光光度法による細菌数を決定する nm 〜 10 x 1 GC の濃度を調整し、7 CFU/mL。
  3. 8 ウェル coverslip 下部チャンバ内に GC を懸濁液の 198 μ L を追加します。
  4. 商工会議所集約の形成を許可する 5% CO2と 37 ° C で 6 時間孵化させなさい。
  5. 各集計条件の中を各ウェルにセフトリアキソン (100 μ g/mL または様々 な希釈液) の 2 μ L を追加します。5% CO2と 37 ° C で希望の時間孵化させなさい。
  6. 各ウェルに生きる/デッド染色溶液の 0.6 μ L を追加し、5% CO2と 37 ° C で 20 分間インキュベートします。
  7. (相当顕微鏡を使用することができます)、共焦点顕微鏡を用いた Z シリーズ画像を取得します。
  8. GC の骨材とライブに死者染色各集計の蛍光強度比 (FIR) 径計測の ImageJ ソフトウェアを使用して画像を分析します。

4. 画像解析

  1. 細菌の集合体のサイズの推定。
    1. ImageJ、ImageJ メニュー バーに raw イメージ ファイルをドラッグして、イメージを開きます。
    2. ImageJ メニュー バーでフリーハンドの線をクリックし、サークルのイメージで各集計の領域。
    3. [分析 |メジャー ImageJ のメニュー バーにします。
    4. 分野] 列の下で新しいウィンドウの番号を取得します。
  2. 集計のライブに死者率の定量化
    1. ImageJ、ImageJ メニュー バーに raw イメージ ファイルをドラッグして、イメージを開きます。
    2. [分析 |測定を設定ImageJ のメニュー バーにします。
    3. ポップアップ ウィンドウに統合された密度を確認し、 [ok]をクリックします。
    4. 画像をクリックして |カラー |チャンネルはツールメニュー バーのを選択します。
    5. 生きたバクテリア染色用蛍光としてチャネル 1を確認します。
    6. ImageJ メニュー バーでフリーハンドの線をクリックし、サークルの各集計の領域。
    7. [分析 |メジャー ImageJ のメニュー バーにします。
    8. [ IntDen ] 列の数を取得します。
    9. 死んだ細菌染色用蛍光としてチャネル 2を確認してください。4.2.6-4.2.8 の手順を繰り返します。
    10. 4.2.8 のステップからステップ 4.2.9 から番号の数で割ってライブに死者比率を取得します。
  3. 統計解析
    1. グラフパッド プリズムを開き、目的の列に ImageJ から得られた数字を入力します。
    2. 分析] をクリックし、列の解析t 検定を選択します。
    3. 比較の目的の列を確認し、 [ok]をクリックします。
    4. 解析ウィンドウの下の P 値を取得します。
    5. 4.3.3 のステップからXY 分析の下で線形回帰を選択します。
    6. R 二乗と [解析] ウィンドウの下のP 値を取得します。

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Representative Results

2 つの方法を用いて: atp 利用と生きる/デッド染色法。結果は結合または、個別に集計内抗生物質治療後の生存細菌を検査するため使用できます。黄色ブドウ球菌のバイオ フィルム20,21正確に生菌数を測定する atp 利用を示されています。ここでは、抗生物質感受性で GC 集合の役割を調べる MS11Opa + ピル + ひずみが使用されました。+ MS11Opa + Pil の非集計は、集計 MS11Opa + Pil +、または集計し、超音波 MS11Opa + Pil によって混乱 + セフトリアキソンと ATP のレベルを測定 (図 1A) のシリアル希薄を施した。パーセント生存抗生物質による治療と比較すると、事前に集計された GC は、等しいセフトリアキソン (寒天培地希釈テスト (からマイクの 0.015 μ G/ml 以上で非集約または集計中断 GC よりも有意に高い生存を持っていた。表 4))。MS11Opa + Pil-、MS11ΔOpa または MS11ΔLgtE、検討され、MS11Opa + ピル + (図 1B) と比較して小さな集合体を形成、寒天平板の希釈法が同じマイク (表 4) があります。MS11Opa + ピル + より大きな凝集体を形成、セフトリアキソン治療変異株よりも高い ATP レベルを持っていた。

ライブ/死者の染色は、いくつかのバイオ フィルム/集計関連研究22,23で使用されています。集約の効果を決定する事前 MS11Opa + Pil に集計 + だった治療セフトリアキソンの有無、イメージします。これにより可視化 (定量化することができる) や抗生物質による治療 (図 2Aの 2 つのパネルを左) 後ライブとデッド GC の分布。ライブ GC (緑) が治療セフトリアキソン骨材のコアを中心に位置していたに対し、死菌 (赤), 外側の層主地。この手順を行った MS11Opa + Pil-、MS11ΔOpa または MS11ΔLgtE、集計のサイズと生存率 (図 2A) を検討します。MS11Opa + Pil 最大フォームと MS11Opa + Pil に示された + -最小集計 (図 2A、B)。MS11Opa + ピル + 集計がコア層でまだ生きていたに対し MS11ΔOpaPil +、MS11Opa + Pil の緩やかな集約が小規模で GC-、MS11ΔLgtEPil + 死んでいたと (図 2A、C)。サイズと生存に基づいて、集計のサイズと抗生物質生存 (図 2D) との関係を調べるため相関グラフをプロットできます。

Table 1
表 1: GCK 寒天培地の 1 L のレシピ。

Table 2
表 2: ケロッグ サプリメント x 100 の 1 L のレシピ。

Table 3
表 3: GCP 細菌の成長媒体の 1 L のレシピ。

Table 4
表 4: GC 系統の最小発育阻止濃度治療セフトリアキソン。MS11Opa + ピル +、MS11ΔOpa、MS11ΔLgtE、および MS11Opa + Pil - 栽培され、GCP で中断します。セフトリアキソン 0.0016 - からのシリアル濃度寒天培地希釈試験を行った、0.25 μ g/mL。

Figure 1
図 1: ATP 利用アッセイによるセフトリアキソン治療下で集約された GC の生存率の代表的なデータです。+ MS11ΔOpaPil + MS11Opa + 事前集計または 6 時間、事前集約、MS11Opa + Pil を集計済み 6 h の 6 h (B) の生存率比較のため集計後中断することがなく、(A) 生存率 MS11Opa + ピル + 懸濁液の比較Pil- または MS11ΔLgtEPil +。平均値 (±SD) が 3 つの独立した実験から得られたが示されています。p < 0.001;p < 0.01;p < 0.05。この図は、以前に公開された24をされ、許可を得て使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: セフトリアキソン治療下の総計内ライブ/デッド細菌分布の代表的なデータです。(A) 事前集計 MS11Opa + ピル +、MS11ΔOpaPil +、MS11Opa + Pil-、または MS11ΔLgtEPil + 2 h. 集計、実行可能な (緑) と死者 (赤) GC を視覚化する染色されと可視化の 1 μ G/ml セフトリアキソンの有無どちらか培養だった共焦点レーザー蛍光顕微鏡。スケール バー: (B) 集計のサイズの 50 μ m 画像を行ったし、ライブに死者 GC の相関グラフ (D) (C) 比が作成され。示されている平均値 (SD)、> 40 の画像を 3 つの独立した実験から得します。p < 0.001;p < 0.01;p < 0.05。この図は、以前に公開された24をされ、許可を得て使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

細菌は、人間の体の感染時にバイオ フィルムを形成できます。従来のマイクのテストでは、バイオ フィルム中の細菌を根絶するために必要な濃度を表さない場合があります。バイオ フィルムに抗菌薬の効果をテストするため CFUs のめっきと同様にバイオ フィルムのバイオマスに基づくメソッドがバイオ フィルムの構造の影響により誤ったことができます。たとえば、めっき法は、バイオ フィルムを破壊することが場合のみ動作します。したがって、得られた CFU は生菌数の実際の数よりも低い可能性があります。バイオ フィルム内で可視化の死者と生きている細菌はバイオ フィルム内の細菌の生存率を測定するために確立されている、ただし、構造およびバイオ フィルムの密度によって染色できないバイオ フィルムに浸透して、不正確な過小評価の生存率。

ここにメソッドは、集計の治療後の細菌の生存を測定するのに量的と可視化分析を使用します。このメソッドの利点は、その対策は実際の感染で見られるものに近い環境で細菌の生存です。非集約と集約された細菌の生存率の違いは、私たち体内のマイクと相関する生体外でマイクを決定することができます。

ATP の生産を測定する ATP 利用アッセイ定量的骨材の生存率を測定できます。試金はより敏感であり生存の抗生の集中、他の同様の試金と比較してわずかな違いの間で区別できます。しかし、この試金の高い感受性のため、細菌の細胞の換散の保証は重要です。したがって、超音波処理ステップが使用されました。さらに、細菌の ATP レベルをマスクできる宿主細胞を作り出す ATP の大きい量のため生体内で細菌の生存を測定するこのメソッドを使用できません。また、細菌と宿主の相互作用は細菌の ATP 産生に影響があります。読み取りを妨げる可能性がある顔料、顔料と細菌のこの試金を使用してを制限があります。

ライブ/死者の汚れはバイオ フィルム研究で広く使用されています。ただし、コアを汚れていないことに対し、染色染料の浸透は最も外側の細菌だけを汚すことがあります。したがって、可視化がない定量化、染料の不均等な配分のためにのみ使用することができます。この染色の小さい骨材を使用し、この試金は集計内で全体的な細菌の生存を定量化する使用ことができますを示します。さらに、正と負のコントロールは、さまざまな細菌の色素の濃度を調整するため必要です。

マイクのプロトコルと組み合わせて、ATP 利用アッセイと生きる/デッド染色は、定量的かつ視覚的に他の細菌集計25,26と同様、 N.gonorrhoeaeを分析する効果的な方法として使用できます。結合されたプロトコルのアプリケーションは、細菌バイオ フィルムに基づく創薬スクリーニングでその多彩な用途と疾患形成のより良い理解を提供できます。このメソッドは、生体内で抗生物質の MIC より正確に反映するかもしれません。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、D.C.S. と W.S. AI123340 に国立衛生研究所からの助成金によって支えられました。J.W.、l. c. w. a. c.、e. n. がパーツ/メリーランド大学によって資金を供給された「初年度イノベーション & 研究体験」プログラムに参加でサポートされていたとします。資金提供者を発行し、研究デザイン、データ収集、分析、決定または原稿の準備で役割がなかった。我々 はすべての顕微鏡実験のため UMD CBMG イメージング コアを認めます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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