Nicel muayene, antibiyotik duyarlılık Neisseria gonorrhoeae toplamları kullanarak ATP-kullanımı ticari deneyleri ve canlı/ölü boyama

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Basit bir ATP ölçme tahlil ve canlı/ölü boyama yöntemi ölçmek ve Neisseria gonorrhoeae hayatta kalma ceftriaxone ile tedaviden sonra görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı herhangi bir antibiyotik antimikrobiyal etkilerini incelemek için genişletilmiş ve minimum inhibitör konsantrasyonu antibiyotik bakteriyel biyofilmler tanımlamak için kullanılır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, L. C., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antibiyotik dirençli Neisseria gonorrhoeae (GC) ortaya çıkması bir dünya çapında sağlık tehdidi ve tedavi başarısız bireyler belirlemek gerektiğini vurgulamaktadır. Bu gram-negatif bakteri bel soğukluğu sadece insanlarda neden olur. Enfeksiyon sırasında form toplamları ve/veya biyofilmler yapabiliyor. Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) testi için antibiyotik duyarlılık belirlemek için ve uygun tedavi tanımlamak için kullanılır. Ancak, içinde vivo ortadan kaldırılması ve laboratuvar sonuçları ile ilişkisi mekanizmasının bilinen değil. Nasıl GC toplama antibiyotik duyarlılık etkiler ve toplam boyutu ve antibiyotik duyarlılık arasındaki ilişkiyi gösterir inceliyor bir yöntem geliştirildi. GC toplamak, antibiyotik öldürmeye daha dayanıklı oldukları zaman, bakteri merkezi ile ceftriaxone tedavi daha iyi daha fazla çevre olan hayatta kalmak için. Verileri N. gonorrhoeae toplama standart agar plaka tabanlı mikrofon yöntemleri kullanarak yansıtılmamış ceftriaxone onun duyarlılık azaltabilir gösterir. Bu çalışmada kullanılan yöntem araştırmacılar bakteri duyarlılık klinik koşullarda test etmek izin verir.

Introduction

Bel soğukluğu ortak bir cinsel enfeksiyon (STI)1iletilen olduğunu. Neisseria gonorrhoeae (GC), gram-negatif bir diplococcal bakteri bu hastalık hastalığının olduğunu. Genital enfeksiyonu belirtileri ağrı idrara çıkma, genelleştirilmiş genital ağrı ve üretral akıntı sırasında neden olabilir. Enfeksiyon genellikle asemptomatik2,3,4,5ve bu genişletilmiş kolonizasyon için sağlar. Bunlar tedavi edilmezse hastalık iletim organizmanın kolaylaştırmak için potansiyel var ve bu Pelvik inflamatuar hastalığa (PID) gibi komplikasyonlara yol açabilir ve dissemine Gonokokal Enfeksiyon (DGI)6gibi büyük sağlık kaygı vardır. Antibiyotik dirençli bel soğukluğu önemli halk sağlığı kriz ve artan bir sosyo-ekonomik yük7var. Sefalosporinler düşük duyarlılık tedavi rejimi değişikliğinden tek bir antibiyotik azitromisin veya doksisiklin ceftriaxone8ile birleştiren çift terapisi, sonuçlandı. Ceftriaxone ve Azitromisin9,10, asemptomatik enfeksiyondan ile birlikte artan başarısızlık bel soğukluğu tedavisi hataları anlama gereğini vurgulamaktadır.

Agar seyreltme ve disk difüzyon testleri, dahil olmak üzere minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) testi bir antibiyotik direnç tanımlamak için standart tıbbi test olarak kullanılmıştır. Yine de, mikrofon test bakteriyel antibiyotik direnci içinde vivo yansıtır Eğer belli değildir. Bakterilerin antibiyotik bakteri yok edici konsantrasyonları huzurunda yaşama bakteriyel biyofilmler oluşumuna katkıda: mikrofon test bu etkisi11algılayamadı. GC biyofilmler mukozal yüzeyler12tarihinde oluşturabilir çünkü biz o antibiyotik broşürüne duyarlılık toplamları içinde bireysel GC içinde görülen farklı olurdu. Ayrıca, çalışmalar üç değişken yüzey molekülleri, Pili, opaklık ilişkili protein (Opa) faz ve arası bakteri etkileşimleri düzenleyen, lipooligosaccharides (LOS), farklı büyüklükte toplamları13için, yol göstermiştir 14 , 15. katkı antibiyotik direnci için bu bileşenlerin uygun yöntemleri eksikliği nedeniyle muayene değil.

Şu anda biyofilm ortadan kaldırılması ölçmek için çeşitli yöntemler vardır. En çok kullanılan nicel biyokütle kristal16boyama violet kullanarak değişiklikleri ölçerek yöntemidir. Ancak, yöntem potansiyel olarak deney tekrarlar17' hatalara neden olabilir önemli deneysel manipülasyon gerektirir. Burada kullanılan canlı/ölü boyama yöntemi canlı ve ölü bakteriler ve biyofilm içinde dağılımını görselleştirme sağlar. Ancak, biyofilm yapısı boya penetrasyon azaltır fiziksel bir engel olarak oluşturabilir. Bu nedenle, bir grup içindeki canlı/ölü bakteriler ölçmek için boyama küçük biyofilmler veya onun öncü-microcolonies veya toplamalardan sınırlıdır. Agar seyreltme ve disk difüzyon testleri de dahil olmak üzere diğer yöntemleri toplama etkilerini ölçmek mümkün değildir. GC duyarlılık toplama sonra antibiyotik pozlama, ideal bir yöntem içinde her ikisi için ölçebilen bir nicel tahlil bakteriler yaşamak ve onların dağılımını görselleştirmenizi incelemek için.

Burada açıklanan yordamı bir ATP-kullanımı ölçüm birleştirir ve Canlı/Boyama ölü bir nicelik tahlil ve GC duyarlılık toplamları antibiyotik varlığında içinde görsel olarak inceleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. genel bakım GC suşları

  1. N. gonorrhoeae suşları çizgi GCK agar % 1 Kellogg18 (Tablo 1, tablo 2) derin dondurucu stokları takviyeleri ve 37 ° C % 5 CO2 16-18 h. kullanım MS11 faz-değişken Opa (MS11Opa +), hiçbir Opa (MS11ΔOpa), ifade için kuluçkaya veya kesilmiş LOS (MS11ΔLgtE).
  2. Dikkatlice pili negatif (koloni karanlık kenarı olmayan) veya pozitif (koloni karanlık kenarı ile) kolonilerin koloni morfolojisi19 bir diseksiyon ışık mikroskobu ve yeni GCK plaka üzerine çizgi kullanarak temel her zorlanma seç.
  3. 16-18 h kullanmadan önce için % 5 CO2 ile 37 ° C'de kuluçkaya.

2. canlılığı miktar GC toplamalardan

  1. Steril bir aplikatör kullanarak GC toplamak. Çubukla GC plaka ve yeniden askıya GC önceden ısıtılmış suyu (GCP, Tablo 3) içinde % 1 ile % 4.2 NaHCO3 Kellogg çözümleri18takıma. Spectrophotometry dalga boyu 650 kullanın nm (1 OD650 = ~ 1 x 109 CFU/mL) askıya alınan bakteri konsantrasyonu belirlemek için.
  2. GC konsantrasyon ~ 1 10 x ayarlamak8 CFU/mL.
  3. 99 µL ayarlanan GC süspansiyon, bir 96-şey plaka kuyu ekleyin.
  4. Bakteri izin vermek için % 5 CO2 37 ° c 6 h plaka kuluçkaya toplamak için.
  5. Seri seyreltilmiş ceftriaxone 1 µL ekleyin (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0,4, 0.2 µg/mL) her kuyuya. Denetimleri hizmet etmek için tedavi edilmezse bazı kuyular bırakın.
  6. %5 CO237 ° C'de 24 h plaka kuluçkaya.
  7. Süspansiyon 3 kez her şey 5 144 W, s ve 20 kHz için solüsyon içeren temizleyicide.
  8. Piyasada bulunan ATP kullanımı kızdırma reaktif 100 µL her kuyuya eklemek, pipet yukarı-aşağı için 3 kere ve % 5 CO237 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
  9. Dikkatli 96-şey siyah Mikroplaka yeni bir kuyuya her kuyudan karışımı 150 µL aktarmak ve kabarcıklar tanıtan kaçının.
  10. 560 her kuyuda absorbans ölçmek plaka okuyucu kullanarak nm.
  11. Seri ceftriaxone tedaviden sonra okunurken işlenmemiş kuyulardan elde edilen okuma oranı tarafından sağkalım oranı hesaplar.

3. floresans mikroskobik analizlerin yapıldığı canlı/ölü GC toplamları

  1. Steril bir aplikatör kullanarak GC toplamak. Pamuklu çubuk GC plaka ve yeniden askıya GC önceden ısıtılmış GCP medya artı % 1 Kellogg tamamlar.
  2. Tarafından spectrophotometry bir dalga boyu 650 adlı bakteri sayısını belirlemek nm ve GC konsantrasyon ~ 1 10 x ayarlamak7 CFU/mL.
  3. 8-şey coverslip-alt odasında 198 µL GC süspansiyon ekleyin.
  4. Odası 6 h 37 ° c % 5 CO2 toplama oluşumu izin vermek için kuluçkaya.
  5. Her toplama koşul içinde her kuyuya ceftriaxone (100 µg/mL ya da çeşitli dilutions) 2 µL ekleyin. 37 ° C % 5 CO2ile istediğiniz saatte için kuluçkaya.
  6. Her kuyuya 0.6 µL canlı/ölü boyama çözüm karışımı ekleyin ve %5 CO2ile 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya.
  7. Z-serisi görüntüleri (eşdeğer bir mikroskop kullanılabilir) confocal mikroskop kullanarak elde.
  8. GC toplamları ve canlı ölü her toplam olarak boyama floresan yoğunluğu oranı (FIR) boyutunu ölçümü için ImageJ yazılım kullanarak görüntüleri analiz.

4. görüntü analizi

  1. Bakteriyel toplamları boyutunu tahmin.
    1. ImageJ açın ve ImageJ menü çubuğuna bir raw resim dosyasını sürükleyerek bir resim açın.
    2. Serbest çizgiler ImageJ menü çubuğunu tıklatın ve görüntüdeki her toplama alanı daire.
    3. Tıklayın analiz | Ölçü ImageJ menü çubuğunda.
    4. Alan sütununda yeni bir pencerede numarası edinmek.
  2. Toplamalardan canlı ölü oranı miktar
    1. ImageJ açın ve ImageJ menü çubuğuna bir raw resim dosyasını sürükleyerek bir resim açın.
    2. Tıklayın analiz | Ayarla ölçümleri ImageJ menü çubuğunda.
    3. Açılan pencerede entegre yoğunluğu kontrol edin ve Tamam' ı tıklatın.
    4. Resmi tıklayın | Renk | Kanalları aracı menü çubuğu ve renkseç.
    5. Kanal 1 floresan için boyama canlı bakteri olarak kontrol edin.
    6. ImageJ menü çubuğunda Serbest çizgiler ' i tıklatın ve her toplama alanı daire.
    7. Tıklayın analiz | Ölçü ImageJ menü çubuğunda.
    8. IntDen sütununun altında numarası edinmek.
    9. Kanal 2 ölü bakteriyel boyama için floresans olarak kontrol edin. Adımları 4.2.6-4.2.8 tekrarlayın.
    10. Canlı ölü oranı numarasına adım 4.2.8 numarasına adım 4.2.9 bölerek elde etmek.
  3. İstatistiksel analiz
    1. GraphPad prizma açın ve ImageJ istenen kolona elde numaralarını girin.
    2. Çözümle ' yi tıklatın ve sütun analizlerialtında t testleri seçin.
    3. Karşılaştırma için istenen sütununu kontrol edin ve Tamam' ı tıklatın.
    4. Analiz penceresi altındaki P değeri elde edilir.
    5. XY analizleri altında Doğrusal regresyon 4.3.3 adımından seçin
    6. R-kare ve analiz pencerenin altındaki P-değeri elde edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İki yöntem istihdam: bir ATP kullanımı tahlil ve canlı/ölü boyama tahlil. Sonuçları birlikte veya ayrı ayrı toplamları içinde bakteriyel yaşam antibiyotik tedavisinden sonra incelemek için kullanılır. ATP kullanımı tahlil S. aureus biyofilmler20,21doğru canlı bakteri ölçmek için gösterilmiştir. Burada, MS11Opa + Pil + zorlanma GC toplama rolü antibiyotik duyarlılık incelemek için kullanıldı. Sigara toplanan MS11Opa + Pil +, toplanan MS11Opa + Pil +, veya toplanan ve daha sonra sonication MS11Opa + Pil tarafından kesintiye + seri dilutions gelmeye ve düzeyde ölçülen ATP (Şekil 1A) ile tedavi edildi. Yüzde hayatta kalma ve antibiyotik tedavisi olmayan karşılaştırarak, pre-aggregated GC ile eşit ya da ceftriaxone (MIC agar seyreltme test ( 0,015 µg/mL üzerinde sigara toplanan ya da toplama bozulmuş GC daha anlamlı olarak daha yüksek yaşam vardı Tablo 4)). MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa veya MS11ΔLgtE, formu daha küçük toplamları ama aynı agar seyreltme mikrofon (Tablo 4), var, muayene ve karşılaştırıldığında MS11Opa + Pil + (Şekil 1B). MS11Opa + Pil + büyük toplamları, şekillendirme ceftriaxone tedavi daha yüksek ATP düzeyiyle mutant suşları daha vardı.

Canlı/ölü boyama birkaç biyofilm/toplama-ilgili çalışmaları22,23' kullanılmıştır. Toplama etkisini belirlemek, MS11Opa + Pil önceden toplanan + ya da ceftriaxone olmadan tedavi ve yansıma için. Bu görselleştirme (hangi sayılabilir) ve canlı ve ölü GC dağıtım sonra antibiyotik tedavisi (Şekil 2Aiki panel yaptı -) sağlar. Canlı GC (yeşil) bulunan ise esas olarak tedavi ceftriaxone toplamları çekirdek içinde ölü bakteriler (kırmızı) dış katmanlarını büyük ölçüde yerleşmişti. Bu yordamı MS11Opa + Pil ile gerçekleştirildi-, MS11ΔOpa veya MS11ΔLgtE, toplama boyutu ve hayatta kalma oranı (resim 2A) incelemek için. MS11Opa + Pil + formu en büyük ve MS11Opa + Pil gösterildi-En küçük toplamları (Şekil 2A, B). MS11Opa + Pil + toplamları çekirdek katmanında hayatta olsaydı, ancak küçük gevşek agrega MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil GC-, ve MS11ΔLgtEPil + ölü (Şekil 2A, C). Boyutu ve hayatta kalma temel alınarak, toplama boyutu ve antibiyotik hayatta kalma (Şekil 2D) arasındaki ilişkiyi incelemek için bir korelasyon grafiği çizilebilir.

Table 1
Tablo 1: 1 L GCK Agar plaka tarifini.

Table 2
Tablo 2: Tarifi için 1 L / 100 Kellogg's ek x.

Table 3
Tablo 3: 1 L GCP bakteriyel büyüme ortamının tarifini.

Table 4
Tablo 4: Minimum inhibitör konsantrasyonu GC suşlarının tedavi ile ceftriaxone. MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE ve MS11Opa + Pil - yetiştirilen ve GCP içinde askıya alındı. Agar seyreltme test sonra gelmeye 0.0016 - dan seri konsantrasyonu ile gerçekleştirilen 0,25 µg/mL.

Figure 1
Resim 1 : ATP-kullanımı tahlil tarafından ceftriaxone tedavi altında toplanan GC survival oranı temsil eden veri. (A)hayatta kalma oranı karşılaştırma MS11Opa + Pil + süspansiyon önceden toplayarak, 6 h için önceden toplayarak veya 6 h. (B) hayatta kalma oranı karşılaştırma 6 h için önceden toplayarak toplanan MS11Opa + Pil sonra kesintiye olmadan + MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, ya da MS11ΔLgtEPil +. Gösterilen ortalama değerleri (±SD) üç bağımsız deneylerden elde edilir. p < 0,001; p < 0,01; p < 0.05. Bu rakam daha önce yayımlanmış 24 yapıldı ve izni ile kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Canlı/ölü bakteriler dağıtım toplamları ceftriaxone tedavi altında içinde temsilcisi veri. (A)öncesi toplanan MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, ya da MS11ΔLgtEPil + oldu ya inkübe 1 µg/mL ceftriaxone içinde 2 h. agrega sonra uygun (yeşil) ve ölü (kırmızı) GC görselleştirmek için lekeli ve ile görüntülenir confocal floresan mikroskop. Ölçek çubuğu: 50 µm. fotoğraf sonra (B) toplama boyutu için analiz ve (C) oranı canlı ölü GC ve (D) bir korelasyon grafik sonra oluşturuldu. Gösterilen ortalama değerleri (SD) üç bağımsız deneyler > 40 görüntülerden elde edilir. p < 0,001; p < 0,01; p < 0.05. Bu rakam daha önce yayımlanmış 24yapıldı ve izni ile kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bakteri biyofilmler insan vücudu enfeksiyon sırasında oluşabilir. Geleneksel mikrofon test bir biyofilm bakteri ortadan kaldırmak için gerekli toplama yansıtmaz. Bir biyofilm antimicrobials etkileri test etmek için yanı sıra biyofilm biyokütle esaslı CFUs kaplama yöntemleri biyofilm yapı etkisi nedeniyle hatalı olabilir. Örneğin, kaplama yöntem biricik inşaat eğer biyofilm bozulur. Bu nedenle, elde edilen CFU canlı bakteri gerçek sayısından daha düşük olabilir. Görüntülenmesi ölü ve canlı bakteri içinde biyofilm bakteri biyofilm içinde yaşama ölçmek için kurulmuştur, ancak, yapısı ve biyofilm yoğunluğuna bağlı olarak, boyama biyofilm nüfuz ve neden başarısız olabilir bir yanlış ve hafife sağkalım oranı.

Toplamları tedavi sonrasında bakteriyel hayatta kalma ölçmek için bir nicel ve görselleştirme tahlil burada yöntemini kullanır. Bu yöntemin avantajı, ne gerçek bir enfeksiyonu görülme daha yakın bir ortamda bakteri hayatta kalma önlemler var. Sigara toplanan ve toplanan bakteriler hayatta kalma oranı farklılıkları tüp mikrofon içinde vivo mikrofon ile ilişkili olan olup olmadığını belirlemek izin verecek.

ATP üretimi ölçen ATP kullanımı tahlil kantitatif toplamları yaşama ölçebilirsiniz. Tahlil daha duyarlıdır ve hayatta kalma antibiyotik konsantrasyon, diğer benzer deneyleri için karşılaştırıldığında küçük farklılıklar arasında ayırt edebilir. Ancak, bu tahlil yüksek duyarlılık nedeniyle, bakteri hücre lizis güvencesi önemlidir. Bu nedenle, bir sonication adım kullanıldı. Buna ek olarak, bu yöntem bakteriyel yaşam içinde vivo bakteriyel ATP düzeyi maske yapabilirsiniz konak hücreleri üreten ATP büyük miktarda nedeniyle ölçmek için kullanılamaz. Ayrıca, konak hücreleri bakteri ile etkileşimi bakteriyel ATP üretimi etkileyebilir. Olarak pigmentler ile okuma engelleyebilir bu tahlil pigmentler ile bakteri kullanarak sınırlama.

Canlı/ölü leke biyofilm çalışmalarda yaygın olarak kullanılır. Ancak, boyama boya penetrasyon çekirdek değil lekeli, ancak yalnızca en dıştaki bakteri, leke. Bu nedenle, bu yalnızca görselleştirme ama boyayı düzensiz dağılımı nedeniyle değil miktar için kullanılabilir. Biz küçük toplamları bu boyama için kullanılan ve bu tahlil agrega içinde genel olarak bakteriyel yaşam ölçmek için kullanılabilir gösterdi. Ayrıca, negatif ve pozitif denetimleri farklı bakteriler için boya konsantrasyonu ayarlamak için ihtiyaç vardır.

Mikrofon protokolü ile birlikte, ATP kullanımı tahlil ve canlı/ölü leke nicelik ve görsel olarak diğer bakteriyel toplamalardan25,26yanı sıra N.gonorrhoeae de analiz için etkili bir yöntem hizmet verebilir. Birleştirilmiş iletişim kuralı uygulama hastalık oluşumu ile birlikte çok yönlü kullanımları uyuşturucu tarama bakteri biyofilmler üzerinde dayalı olarak daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir. Bu yöntem daha doğru bir şekilde vivo içinde mikrofon bir antibiyotik yansıtıyor olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüsü teşkilat ve WS AI123340 için bir hibe tarafından desteklenmiştir. L.-CW, JW, A.C., ve E.N. bölümü/Maryland Üniversitesi tarafından finanse edilen "birinci sınıf yenilik & araştırma deneyimi" programına katılmak içinde desteklenen. Fon yayımlamak için çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. UMD CBMG Imaging Core tüm mikroskobu deneyler için anıyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
  2. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17, (1), (2017).
  3. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90, (4), 634-635 (1977).
  4. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43, (10), 608-616 (2016).
  5. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. accessed Oct 5 (2011).
  6. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86, (10), 931-938 (2012).
  7. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14, (7), (2017).
  8. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  9. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), (2018).
  10. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14, (7), 1002344 (2017).
  11. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  12. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73, (4), 1964-1970 (2005).
  13. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7, (1), (2017).
  14. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10, (8), 0134342 (2015).
  15. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194, (23), 6468-6478 (2012).
  16. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
  17. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72, (2), 157-165 (2008).
  18. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  19. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134, (4), 886-906 (1971).
  20. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
  21. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14, (1), 23-31 (1999).
  22. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185, (15), 4585-4592 (2003).
  23. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  24. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7, (2), (2018).
  25. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78, (3), 510-543 (2014).
  26. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65, (2), 127-145 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics