En potens-analys i real tid för chimeric antigen receptor T-celler riktade mot solida och hematologiska cancer celler

Immunology and Infection
 

Summary

Vi beskriver en kvantitativ realtid in vitro cytolys assay system för att utvärdera styrkan av chimär antigen receptor T celler inriktning flytande och fasta tumörceller. Detta protokoll kan utökas för att bedöma andra immuneffektorceller, samt kombinationsbehandlingar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Xi, B., Berahovich, R., Zhou, H., Xu, S., Wei, Y., Guan, J., Harto, H., Guan, J., Wu, L., Santa Ana, D., Cerignoil, F., Lamarche, B., Abassi, Y. A., Golubovskaya, V. A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells. J. Vis. Exp. (153), e59033, doi:10.3791/59033 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Chimeric antigen receptor (bil) T-cellterapi för cancer har uppnått betydande klinisk nytta för resistenta och refraktära hematologiska maligniteter såsom barndom akut lymfatisk leukemi. Ansträngningar för närvarande pågår för att förlänga denna lovande behandling till solida tumörer utöver andra hematologiska cancerformer. Här beskriver vi utveckling och produktion av potenta bil T-celler riktade mot antigener med unika eller förmånliga uttryck på solida och flytande tumörceller. In vitro-potensen av dessa bil-T-celler utvärderas sedan i realtid med hjälp av den mycket känsliga impedansbaserade Xcelta-analysen. Specifikt, effekten av olika Co-signalering domäner, såsom glukokortikoid-inducerad tumörnekrosfaktor receptor (tnfr)-relaterat protein (gitr), på in vitro-potensen av bil T-celler undersöks. Denna rapport innehåller protokoll för: generering av bil T-celler för prekliniska studier med hjälp av lentiviral gentransduktion, expanderande bil T-celler, validering av bil uttryck och löpning och analys av potensanalyser av Xcelys.

Introduction

Under de senaste åren, bil T-cellterapi har varit en av de mest framträdande genombrott inom cancer immunoterapi för recidiverade och refraktära hematopoietiska maligniteter. Med den senaste amerikanska Food and Drug Administration (FDA) godkännande av CD19-riktade bil T-celler för akut lymfatisk leukemi, non-Hodgkins lymfom, och diffus stora b-cellslymfom, och utnämningen av genombrotts terapi för B-cell mognad antigen (bcma)-riktad bil T celler för multipela myelom, denna teknik har genererat stor spänning i det vetenskapliga samfundet och har drivs många grundläggande, tillämpad, och kliniska studier över hela världen1,2,3, 4,5. I januari 2019 registrerades mer än 700 kliniska prövningar i databasen för klinisk prövning (clinicaltrials.gov). omkring 450 av dessa prövningar var antingen på väg att starta eller var aktivt rekrytera patienter. De flesta av de kliniska prövningarna är inriktade på hematologiska maligniteter, och kliniska prövningar med hjälp av bilar T-celler inriktning CD20, CD22, och bcmas, förutom CD19, pågår också6,7. Medan de flesta av försöken använder autolog bil t-cellterapi, ett betydande antal av dem är också att utforska nyttan av allogena bil T-celler8,9,10. Trots lovande resultat med hematologiska maligniteter, användning av bil T-celler för att rikta solida tumörer har visat sig vara mycket svårare i kliniken av olika skäl, inklusive men inte begränsat till bristen på bra mål som uteslutande uttrycks i tumören, heterogenitet solida tumörer och tumör "flykt", och svårigheten att bil T-celler har att få tillgång till tumören mikromiljö11,12,13,14, 15. det finns ett kritiskt behov av utveckling av fasta TUMÖRSPECIFIKA bil T-celler som kan övervinna dessa hinder för effekt och problemet med "på mål-off tumör" toxicitet. Medan en mängd in vitro-och in vivo-metoder är motiverade vid utformningen och provningen av bil T-celler, är en robust och prediktiv in vitro-potensanalys av primär betydelse16,17.

För att bedöma styrkan hos bil T-celler har olika in vitro-metoder utvecklats. I allmänhet, dessa potens analyser kan delas in i två breda kategorier beroende på om de (i) direkt mäta cytolytisk aktiviteten av bil T-celler mot mål tumörceller, eller (II) mäta surrogatmarkörer såsom cytokiner som släpps av bilen t-celler som de dödar målcellerna. Tekniker som mäter cytolytisk aktivitet direkt inkluderar krom-51 release assay (CRA)18, Imaging-baserade analyser som mäter apoptos av målceller med hjälp av fluorescerande sonder19,20, och flödescytometri analyser som detekterar apoptotiska målceller21. I dessa analyser är bil T-celler vanligtvis samodlade med målceller som har förmärkts med radioaktiva eller fluorescerande sonder, följt av lämplig mätning. Även om det har länge ansetts guldmynt standard i fältet på grund av dess känslighet, CRA har vissanackdelar. Först är det en Endpoint-analys och ger inte kinetisk information. För det andra måste målcellerna märkas med krom-51 som tenderar att läcka ut ur cellerna och kan avsevärt öka bakgrundsbrus22. Slutligen krävs lämpliga försiktighetsåtgärder och bortskaffande av radioaktivt avfall. Alternativa analyser, som mäter biprodukter av bil T-cells interaktion med målceller som en indikation på potens, inkluderar kvantifiering av olika cytokiner som släppts av bil T-celler med antingen flödescytometribaserade metoder eller enzymlänkade immunsorbent-analyser. Än en gång, dessa är Endpoint analyser som mäter den kumulativa frisättning av cytokiner vid en given tidpunkt och, således, inte nödvändigtvis återspeglar den faktiska cytolytisk aktivitet av bilen T-celler.

När du utvecklar en potens analys, särskilt en som definierar release kriterier för en cell-baserad behandling såsom en bil T-cell, är det viktigt att analysen innebär minimala Manipulationer och hands-on tid eftersom varje interaktion är en annan variabel som måste redovisas och kan minska den övergripande robusthet och konsekvens av analysen. Vidare, samspelet mellan bil T-celler med tumörcellerna är en dynamisk process, och ge information om dessa dynamiska interaktioner, såsom graden av cytolys, är av primär betydelse för potens utvärdering. Med dessa kriterier i åtanke har vi utvecklat en etikettfri kinetisk potens-analys för bil T-celler som utnyttjar Xceltiers realtids cell analys (RTCA)-plattform. Xcelintelligens använder specialiserade mikrotiterplattor (E-plattor) som innehåller guld biosensorer inbäddade i botten av varje brunn. Arbeta med antingen anhängare fasta tumörceller, eller flytande cancerceller som har tjudrad med hjälp av specifika antikroppar, dessa biosensorer övervaka i realtid bil T cell-inducerad förändringar i målet cellantal, Cellstorlek, cell-substrat fastsättning styrka, och cell-cell interaktioner (dvs. barriärfunktion)17,23,24,25,26,27,28. Arbetsflödet är enkelt och innebär helt enkelt sådd målceller i brunnarna av E-plattor, följt av tillsats av bil T-celler vid olika effektor till mål förhållanden (figur 1). Därefter, eftersom bio sensorerna kontinuerligt övervakar mål cellernas livskraft, visas data automatiskt i realtid.

Under de senaste 15 åren har xcelys-analysen validerats för att bedöma styrkan hos naturliga mördarceller, t-celler, bil-t-celler, Checkpoint-hämmare, bispecifika antikroppar, onkolytiska virus och vissa kombinationsterapier17,29,30,31,32,33,34. Nyligen, den Xcelssed potens analysen utvärderades för tillverkning T-cell receptor (TCR)-konstruerade T-celler35. Här rapporterar vi anställa RTCA-systemet för att utvärdera in vitro-potensen av bil T-celler utformade för att rikta solida tumörer och flytande tumörer i kliniska terapier.

Protocol

1. generering av bil-kodning lentivirus

Obs: när den specifika bilen T-cell plasmid konstruktion är klar (CD47 och andra), lentiviral bilar genereras av standardförfarandet, med hjälp av 293 FT celler, en lentiviral förpackning mix, och transfektion agenter (se tabellen av material) som beskrivs29. Därefter använder en kvantitativ omvänd Transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR) kit och en termisk apparat (se tabellen av material) för att bestämma viruset titer genom att mäta lentiviral RNA-belopp enligt tillverkarens protokoll. Det är viktigt att alla lentivirala procedurer utförs strikt efter säkerhetskrav.

  1. Utsäde 15 x 106 HEK293FT celler i Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) och inkubera cellerna över natten vid 37 ° c i 1 150 mm skålen inuti en fuktad 5% Co2 inkubator.
  2. Förbered 2 15 mL rör med transfection Complex. Det första röret innehåller lentiviral Vector plasmid DNA (5 μg) och lentiviral förpackning mix (22,5 μg) i 2,5 mL lösning spädningsvätska. Det andra röret innehåller 82,5 μL transfektionsreagens i 2,5 mL lösning för spädningsvätska (se tabell över material).
  3. Pipet innehållet i röret 1 i röret 2, och inkubera blandningen vid rumstemperatur i 15 min.
  4. Överför innehållet i röret droppvis till skålen av HEK293FT celler och inkubera provet över natten vid 37 ° c i en fuktad 5% Co2 inkubator.
  5. Nästa dag, ersätta det befintliga mediet med 19 mL färskt DMEM odlingssubstrat och fortsätta att Inkubera cellerna över natten inuti den befuktade 5% CO2 inkubator vid 37 ° c.
  6. Överför mediet från skålen till ett 50 mL centrifugeringsrör. Förvara röret med det virusinnehållande mediet i kylskåpet.
  7. Upprepa ovanstående förfarande, lägga till färska DMEM och samla in den igen efter 1 dag.
  8. Kombinera två samlingar av media i en centrifug tub. Centrifugera röret vid 2 000 x g i 30 min vid 4 ° c.
  9. Överför de flesta av de lentivirus-innehållande supernatanten till en kostar centrifug tub. Lämna en minsta volym, ca 1 mL, av supernatanten för att undvika att störa pelleten som kan innehålla celler och/eller skräp.
  10. Ultracentrifuge ovanstående förtydligade supernatanten på 110 000 x g för 100 min vid 4 ° c.
  11. Ta försiktigt bort supernatanten och tillsätt försiktigt 100 μL av DMEM-mediet till virupelleten vid rör bottnen. Lämna röret på is i 15 min. Blanda lösningen försiktigt och alikvot lentivirus lösningen i förkylda sterila rör. Förvara dessa virus lager rören i en-80 ° c frys.
  12. Använd en kvantitativ RT-PCR kit för att bestämma titern av lentivirus enligt tillverkarens protokoll, som extraherar och mäter lentiviral RNA.

2. generering och utbyggnad av bil T-celler

  1. Aktivera tidigare frysta humana PBMCs (ca 1 x 106 till 2 x 106 celler) i 1 ml bil T-cells medium med lika många CD3/CD28-belagda mikrokulor (se tabellen av material) och inkubera cellerna vid 37 ° c i en fuktad 5% Co2 inkubator för 24 h.
  2. Tina en alikvot av lentivirus beståndet på is.
  3. Tillsätt 1 μL transduktion förbättra medlet i brunnen med cellerna och blanda.
  4. Tillsätt lentivirus till cellerna vid en multiplicity av infektion (MOI) av 5:1 och blanda försiktigt. På nästa dag, upprepa detta steg (24 h efter den första Transduction).
  5. Övervaka T-cellernas tillväxt var 2-3 dag. Tillsätt mer färsk bil T-cells medium för att bibehålla cellerna med en densitet av 1 x 106 till 2 x 106 celler/ml.
  6. Frys ner BILENS T-celler med ett standardprotokoll med frys lösning (se material tabellen).
  7. Tina bil T-celler med en standardmetod och preculture dem i bilen T-cells medium för ca ~ 2-4 h med IL-2 (300 enheter/mL) innan de tillämpas på analysen.

3. detektering av bil uttryck genom flödescytometri

  1. Överför 3 x 105 bil t-celler och icke-Omvandliga t-celler till två separata 1,5 ml microcentrifugerör.
  2. Centrifugera rören vid 300 x g i 2 min och Omsuspendera cellerna i 200 μl fluorescensaktiverad cellsorteringsbuffert (FACS) innehållande 1% humant serum.
  3. Pipet 100 μL cell lösning i två 5 mL polystyren FACS-rör och håll rören på is i 5 min.
  4. Tillsätt 1 μL biotinylerat get-antimusf (AB ')2 till ett rör av varje celltyp. Tillsätt sedan 2 μL PE-märkt anti-taggantikropp (se tabellen med material) till det andra röret i varje celltyp. Blanda väl och inkubera dem på is i 30 min.
  5. Tvätta cellerna med 3 mL FACS-buffert i varje tub och centrifugera rören vid 300 x g i 5 min. Kassera supernatanterna och Vortex mycket kortfattat eller skaka rören en kort stund för att Omsuspendera cellerna i restvätskan.
  6. Tillsätt 2 μL APC anti-CD3 och 2 μL av 7-AAD antikropps lösning (se tabellen med material) till varje tub. I röret av celler färgade med anti-F (AB ')2 AB, tillsätt 1 μl PE-märkta streptavidin. Blanda kort och inkubera rören på is för 30 mer min.
  7. Använd FACS buffert för att tvätta cellerna igen enligt beskrivningen i steg 3,5 och tillsätt ytterligare 200 μL FACS-buffert till varje tub.
  8. Använd flödescytometri för att analysera cellerna genom att först gating på T-cellerna i ett framåtspritt-eller sido spridningsdiagram och sedan gating på de levande cellerna (7-AAD-Negative) i en CD3 vs. 7-AAD-Plot. Det sista steget är att analysera anti-tag, anti-ScFv eller anti-F (AB ')2 vs CD3.

4. cytolys potens analys i real tid

Anmärkning: utför RTCA-analysen enligt tillverkarens rekommenderade villkor. I korthet, första plattan målcellerna i brunnarna av E-plattan, följt av tillsats av bil T-celler på nästa dag. Cytolys aktivitet av bil T-celler mot målceller övervakas i realtid. T-celler och mock-transduced T-celler (mock CAR T-celler) används som negativa effektor cell kontroller. Följande protokoll beskriver en in vitro-cytolys potens analys i realtid för anhängare av tumörcellinjer.

  1. Tillsätt 100 μL av mål cells odlingsmediet till varje brunn på den xcelta E-plattan, placera plattan inuti xceldigt-instrumentet och ta en bakgrunds avläsning. Sedan överföra E-plattan till en vävnad kultur huva för cell sådd.
  2. Använd ett standardprotokoll för att trypsinize mål cancerceller från kulturen enheten. Överför sedan cellerna till ett 15 mL centrifugeringsrör och tillsätt färskt odlingsmedium, upp till 15 mL. Pelleten cellerna genom centrifugering för 5 min vid 200 x g. Kassera supernatanten, tillsätt 5 mL färskt medium och Använd en serologisk pipett för att försiktigt Omsuspendera cellpelleten. Räkna tätheten av levande celler med hjälp av en hemocytometern och Mikroskop.
  3. Justera CELLTÄTHETEN på lämpligt sätt och tillsätt sedan 100 L av cellsuspensionen till varje brunn av E-plattan. Målet cell nummer är vanligtvis runt 10 000 celler/väl för anhängare cellinjer (BxPC3, hela-CD19, och SKOV3), eller 30 000 celler/väl för suspension celler såsom Raji (se nedan för detaljer om precoating brunnar med antikroppar för att tjuder flytande cancerceller).
  4. Equilibrate E-plattan vid rumstemperatur i 30 min så att cellerna att bosätta sig jämnt på botten av brunnen (detta är kritisk; hoppa inte över det här steget).
  5. Placera E-plattan i Xcelsitens instrument inne i cellkulturens inkubator och börja mäta impedansen, visas som cell index kontra tid, automatiskt var 15 min.
  6. Nästa dag, Förbered effektor bil T celler. Se till att förbereda lämpliga kontroller (t. ex., Mock CAR T-celler, icke-transduced kontroll T-celler, och/eller orelaterade bil T-celler) i förväg för att säkerställa att alla celler är klara på samma gång. Justera effektorcellerna och kontroll cellerna till rätt densitet och Förbered seriella utspädningar för att säkerställa att önskade E:T-förhållanden uppnås när 100 μL av effektorcellsus pensionen läggs till i varje brunn i steg 9.
  7. Pausa Xcellighet datainsamling och ta med E-plattan från inkubatorn till en cell Culture Hood.
  8. Ta bort 100 μL av mediet från varje brunn. Mängden restmedium i varje brunn är nu 100 μL.
  9. Tillsätt 100 μL seriellt utspädd effektor bil T celler eller andra kontrollceller (dvs. mock CAR T celler) för att uppnå de önskade E:T nyckeltal.
  10. Jämställ E-plattan i rumstemperatur i 30 minuter så att effektorcellerna kan sedimentera och sätt sedan tillbaka E-plattan i Xcelsitinstrumentet. Återuppta datainsamling.
  11. Om så önskas, vid viktiga tidpunkter Xcelys datainsamling kan pausas och plattan bort för att samla in små prover som skall analyseras av ortogonala analyser (dvs. mäta cytokin produktion av ELISA eller flödescytometri).
  12. I EGFR-GITR-CD3 bil T-cell experiment, åtgärd INFγ avkastning med en ELISA-Kit (följ tillverkarens instruktioner, se tabell över material).
    Anmärkning om användning av flytande cancer: för att testa nonadherent hematologiska cancerceller, innan du lägger celler brunnarna av E-plattan först belagda med en antikropp som är specifik för ett antigen som uttrycks på ytan av cancerceller. För Raji B cell line en tjudra reagens baserad på anti-CD40 används (se flytande tumör dödande assay kit i tabellen av material). Nedan är förfarandet för beläggning plattan:
  13. Späd den tjudra reagensen (anti-CD40) med tjudra buffert till en koncentration av 4 μg/mL.
  14. Arbeta inuti en vävnad kultur huva, tillsätt 50 μL av den utspädda tjudra reagens till varje brunn av E-plattan. Lämna E-plattan i rumstemperatur eller i en inkubator på 37 ° c i 3 timmar.
  15. Ta bort den tjudra reagensen och tvätta E-plattan minst 2x med tvättbuffert. Vid denna punkt, E-plattan är redo för sådd av Raji målceller (30 000 celler/brunn).
  16. Fortsätt med steg 4,1 (ovan) för att utföra resten av proceduren.

Representative Results

BIL lentivirus förberedelse och bil T-cells generation och potens bedömning
De titrar av bil lentivirus preparat bestämdes med hjälp av en kvantitativ RT-PCR Kit (se tabellen av material) enligt tillverkarens protokoll. Titreringsprotokollet extraherade viruset RNA först och sedan mätt lentiviral RNA kopia nummer, som indikerade mängden infektiösa virala partiklar. Den titer av virus som genereras från 1 150 mm skålen med hjälp av ovanstående protokoll vanligtvis varierar mellan 109-1010 viral kopior/ml. Figur 2A visar RT-PCR-cykelnumret kontra signalstyrkan från ett representativt kvantitativt PCR-resultat. När viruset kvaliteten var nöjd, när titern var större än 1 x 108 PFU/ml, det var fryst ner för efterföljande T-celltransduktion. Efter att bilen t-celler var sensorik med lentivirus, t-celler var odlade i ytterligare 12-14 dagar, bibehålla sin densitet runt 1 x 106 till 2 x 106 celler/ml. BIL T-cellerna kontrollerades sedan med anti-ScFv-specifik antikropp med hjälp av en flödescytometer före en nedströmsapplicering eller frysning. Ett bra representativt batchresultat visas i figur 2B. Med hjälp av en anti-ScFv antikropp, cirka 50% av de bil T celler färgade positiva (Q2 50,6% vs. T celler 1%), vilket indikerar uttrycket av bil i ca 50% av T-celler. Därefter, RTCA potens analysen utfördes för cytolys bestämning innan varje parti av bil T celler var fryst ner och redo för framtida tillämpning. En cykel av bilen T-cell design, generation, och bedömningsförfarande tog ungefär 1 månad.

Avlivning av Raji lymfom B-celler av CD22-CAR T-celler
Den anti-CD40 flytande tumör tjudra Kit (se tabellen av material) användes vid en koncentration av 4 μg/ml för att belägga en E-platta för 3 h vid 37 ° c. Efter tvättning av brunnar med tjudra buffert, B-cells lymfom celler lades till E-plattan vid en densitet av 30 000 celler/brunn. Efter att ha gjort att cellerna att bosätta sig i 30 min E-plattan placerades tillbaka inuti Xceldigt instrument, och impedans avläsningar inleddes omedelbart för att fånga cell kvarstad och proliferation. Följande dag lades antingen CD22-CAR T-celler, Mock CAR T-celler eller untransduced T-celler. I figur 3användes ett E:T-förhållande på 10:1 för alla celltyper. CD22-positiva Raji celler, behandlade med CD22-bil T-celler visade signifikant dödande (grön spår) jämfört med de negativa kontrollerna (untransduced T-celler och mock CAR T-celler).

Effektivt dödande av pankreascancer celler av CD47-bil T-celler
CD47 är en transmembranyta glykoprotein av immunglobulin superfamiljen. Som en integrin-associerat protein, det är mycket uttrycks i både hematologiska cancerformer (leukemi, lymfom, och multipelt myelom) och solida cancerformer (såsom äggstockscancer, småcellig lunginflammation, bukspottskörteln, glioblastom) och andra typer av cancer36,37. CD47 är också känd som en gör-inte-Eat-Me signal till makrofager, som har gjort det ett potentiellt terapeutiskt mål i vissa cancerformer. CD47-bil T-celler producerades och testades mot BxPC3 pankreascancer celler som uttrycker höga halter av CD4738,39. BxPC3 celler var seedade i E-plattan på dag 1 med en densitet på 10 000 celler/brunn. Real tidsövervakning visade att dessa celler nådde en sammanlänkning efter 16 timmar. Vid denna tidpunkt lades bil T-celler till i E:T-kvoten på 10:1 (figur 4a). Kontroll effektorceller som icke-transduced T-celler och mock CAR T-celler lades också till. Resultaten visar tydligt att CD47-CAR T-celler selektivt dödar målet BxPC3 cellerna29. Dessutom visar figur 4B att IMPEDANSSIGNALEN när CD47-Car T-celler läggs till en tom brunn är betydligt lägre än den impedanssignal som genereras av mål BxPC3 celler. Cell indexvärdet från brunnar med CD47-CAR T-celler ensamt nådde maximalt 0,14, vilket bara är något högre än signalen från enbart medium (0,02). Detta indikerar att i denna heterogena dödande analys, impedansen signalen härleds nästan uteslutande från målet cancerceller.

Costimulation av bil T-celler av GITR-domänen
När det uttrycks i en eGFR-gitr-CD3 bil, gitr Co-domänen rapporterades tidigare att öka dödandet av EGFR-positiva SKOV3 cancerceller men inte EGFR-negativa MCF-7 cancerceller30. För att bättre klargöra rollen för GITR-domänen, har bil konstruktioner som innehåller den fullständiga GITR-domänen, eller borttagna eller omarrangerade versioner av domänen, genererats och testats för möjligheten att coactivate bil T-celler (figur 5A). Data för xcellighet i figur 5B, C visar att gitr Co-domän förbättrar bil T cell avlivning av EGFR-positiva målceller över vad som observeras med den ursprungliga bilen konstruktionen som saknar gitr domänen. Dessutom avskaffade ta bort 10 aminosyror från GITR domänen (aminosyror 184-193) denna stimulerande aktivitet. Däremot, omdisponering av den relativa placeringen av GITR domän i bilen konstruktionen visade sig vara mindre skadligt för dess stimulerande förmåga. Användning av slutpunkts data, IFNγ-produktion som ett surrogat av T-cells aktivering visade också den stimulerande aktiviteten hos GITR-domänen (figur 5B). I motsats till slutpunkts data som bara är en "snap shot", lyser den kontinuerliga impedansprofilen för Xcelisterinstrumentet tydligt subtila skillnader i dödande kinetiken hos de olika behandlingarna (figur 5C). De resultat som erhålls här överensstämmer med dem i en in vivo-studie30.

Figure 1
Figur 1: den Xceltiga realtid cell Analysis (RTCA) systemet upptäcker avlivning av målceller av effektorceller. Det finns tre huvudsakliga conceptional steg för att mäta dödande aktivitet av bil T effektor celler mot mål cancerceller. Steg 1: frö målcellerna (dvs tumörceller) i brunnen av en E-platta. Cellerna fäster vid guld biosensor mikroelektroder och detta hindrar flödet av elektrisk ström mellan elektroderna. Detta impedansvärde mäts och ritas som en unitless parameter som kallas cell index. Cellindexvärdet ökar när cellerna växer och når en platå när cellerna närmar sig Confluence. Steg 2: effektorceller-nonadherent immunceller-tillsätts därefter. Eftersom dessa celler inte följer de guldfärgade mikroelektroderna, orsakar de inte direkt en impedansförändring. Steg 3: om effektor cellerna attackera målet cancerceller, förstörelsen av tumörcellerna återspeglas av en minskning i cell index över tiden. Denna cytolytisk aktivitet av effektorcellerna, eller styrkan av effektorcellerna, kan vara känsligt och exakt övervakas. Det kontinuerliga förvärvet av impedansdata från Xcelsissystemet möjliggör realtids dödande kinetisk analys för multipla förhållanden samtidigt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: titerbestämning av lentivirus och flödescytometri utvärdering av bilens T-celler. A) bestämning av lentivirala titer. De olika färg linjerna är representativa prover för cykel nummer kontra delta RN. låg cykel nummer indikerar en relativt stor mängd virus-RNA-mall som finns i proverna. Befter TRANSDUKTION har bil T-celler odlades och upprätthållits vid en densitet av mindre än 2 x 106 celler/ml och därefter utsatts för Flödesanalys. Y-axeln reflekterar färgning för T-celler, med positiva värden reflekterade i områdena Q1 och Q2. Båda proverna är 100% positiva för T-celler. Uttrycket av bil scFV bestäms med hjälp av en scFv-specifik AB (x-axel). Resultatet visar att mer än 50% av T-cellerna är scFv-positiva i CD22-CAR T-celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: att döda dynamiken i CD22-Car T-celler mot Raji Burkitt lymfom celler. Medan den röda kurvan är enbart Raji-cellerna, är den gröna kurvan de Raji-celler som behandlas med CD22-CAR T-celler. Den rosa och blå kurvor är håna bil T-cellbehandling och nontransduced T-cellbehandling, respektive. E:T-förhållandet är 10:1. Felstaplar är standardavvikelse. Tidsskalan ställs in med 2 tim intervall för enkel visning, även om det finns fler datapunkter tillgängliga. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: effekt av CD47-Car T-celler mot bukspottskörteln fasta tumörceller. (A) Pink är endast mål BxPC3 celler, medan rött är BXPC3 med CD47-bilar T-celler till. Grön är BxPC3 med tillägg av nontransduced T-celler, och blått är med mock CAR T-celler. E:T-förhållandet är 10:1. (B) i samma inställning är röd tom (saknar målceller) kontroll brunnar med CD47-Car T-celler bara och grönt är endast mediet. Felstaplar är standardavvikelse. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: GITR-domänen ökar cytotoxisk aktivitet mot EGFR-positiva tumörcellslinjer. A) olika bil konstruktioner. B) bar tomter med% cytolys för olika bil konstruktioner vid 4 h (vänster) och 24 h (mitten). IFNγ-produktion vid 24 h visas till höger. Ckontinuerlig avlivning av alla konstruktioner. Den svarta kurvan är tillväxtkurvan för BxPC3 äggstockscancer celler endast. Den gröna kurvan är målcellerna som endast behandlas med T-celler, den blå kurvan är målcellerna behandlade med mock CAR T-celler, den röda kurvan är målcellerna som behandlas med EGFR-GITR-CD3-bil T-celler, den rosa kurvan är målcellerna som behandlas med EGFR-ΔGITR-CD3-bil T-celler, och den bruna kurvan är målcellerna som behandlas med EGFR-CD3-GITR-bil T-celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Chimeric antigen receptorer är multidomänproteiner som består av en extracellulär enda kedja variabel fragment (scFv region), ett gångjärn region, en Transmembran region, och en cytoplasmiska domän består av TCR signalering domäner och ytterligare Co-domäner från receptorer såsom CD28 och OX4011,40. För att designa säkra, selektiva och effektiva bilar, är det viktigt att de olika permutationer i utformningen av bilarna är grundligt testade med in vitro potens analyser och, så småningom, djurmodeller. I denna studie, vi har tillhandahållit ett protokoll och ett arbetsflöde för hur en realtid in vitro potens analys kan informera utformningen av effektiva bilar.

Vid utformningen av någon typ av styrka assay, särskilt för tillverknings ändamål, är det viktigt att analysen vara känslig, robust, konsekvent, och så nära verkningsmekanismen som möjligt16,17,41. I realtid potens analysen beskrivs här är utformad för att mäta cytolytisk aktivitet av bilen T-cellen direkt snarare än att använda en surrogatmarkör som cytokin release. Viktigt är att analysen inte kräver några ytterligare komponenter såsom färgämnen eller reagenser än analys plattan (E-Plate) och de rekommenderade medierna för att bibehålla cellerna. Dessutom är analysen utsökt känslig och ger mycket reproducerbara data jämfört med andra etikettbaserade analyser42,43,44. Dessutom är Xcelys-analysen mottaglig för användning av mycket låga effekt-till-mål-förhållanden som är idealisk för bedömning av specifika cytolysis.

För att demonstrera flexibiliteten och nyttan av Xcellighet-systemet har vi fokuserat på två tumörtyper, nämligen tumörer av hematologiskt ursprung och solida tumörer. För att bedöma styrkan hos CD22-riktade bil T-celler, Raji celler (dvs. en B-cells lymfom cell linje) var bundna till E-plattor med en anti-CD40 antikropp. Den tjudra av Raji celler till botten av E-plattorna resulterar i en impedans signal som återspeglar livskraften och antalet Raji celler i brunnen. Efter tillsats av CD22-CAR T-celler, de Raji cellerna är selektivt dödas i en tid-och Effector-beroende sätt, som kulminerar i en tidsberoende minskning av impedansen signalen. Nedgång i impedansen innebär cytolys eller förlust av livskraft av Raji celler17. Denna selektiva tjudra tillvägagångssätt med hjälp av antikroppar kan utvidgas till andra flytande tumör cellinjer. En alternativ strategi för att använda tumör cellinjer av hematologiskt ursprung är att använda anhängare cancerceller som är konstruerade för att stabilt uttrycka tumören antigener, såsom CD19 uttrycks i HeLa celler. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att föräldrarnas HeLa celler är lätt tillgängliga och kan användas som en negativ kontroll för specificitet. Ett sådant tillvägagångssätt har redan validerats med CHO-CD22 vs. CHO celler och CHO-BCMAs vs. CHO celler29. Med hjälp av sådana olika metoder, bil T-cell design och effekt kan lätt testas. Den Xcelbalt analysen är till sin natur flexibel, och assay villkor kan justeras för att maximalt approximera fysiologiska förhållanden.

En stor fördel med styrkan analysen vi beskrev här är att det är en enkel funktionell analys och kan användas tillsammans med genteknik tekniker för att utforma optimala och effektiva bilar i en hög genomströmning mode. Som visades här för bil T-celler avsedda att rikta EGFR-positiva cancerceller, kan analysen användas för att utvärdera den relativa aktiviteten hos olika bil konstruktioner/mutanter. Till exempel, vi visade att när gitr domänen ligger uppströms CD3 domänen det visar mycket mer robust cytolytisk aktivitet än när det ligger nedströms av CD3 domänen.

Även om det inte korrelerar perfekt med in vivo bil T cell aktivitet, in vitro cytokin release har historiskt använts som ett mått på bil T cell potens. Även om den Xcelta-baserade potens-analysen som beskrivs här kan användas för att utvärdera cellbaserade terapier under tillverkningen eller innan den släpps för klinisk användning, hur väl dessa resultat korrelerar med in vivo-effekten har ännu inte Etablerade. In vivo effekt beror på en mängd faktorer och variabler som inte får rekapitueras inom en in vitro-analys. Sådana variabler inkluderar: homing av bilen T-celler till platsen för tumören, stimulering och aktivering av bilen T-cellen och dess förmåga att bestå inom patienten, och tumören mikromiljö. Med ytterligare förfining kan Xcelintelligens-analysen vara kapabel att modellera några av dessa komplexa processer in vitro.

Det protokoll som här gäller för de flesta anhängare cancer cellinjer och några av de flytande tumör cellinjer. Kliniska prover såsom primära cancerceller, emellertid, måste testas ytterligare och optimeras på grund av komplexiteten i tumörtyper och faser. Det är verkligen värt att notera att in vitro potens assay system som beskrivs här använder cancer cellinjer endast för att återspegla den potentiella aktiviteten av bil T-celler. Den verkliga tumör situationen inuti den mänskliga kroppen är mycket mer komplex, särskilt när en solid tumör är riktad, på grund av den dynamiska tumör miljö och utveckling. Därför kan potens utvärderingsresultat inte översätta mycket väl till den kliniska effekten av de testade bil T-cellerna.

Sammanfattnings, den presenterade impedansen-baserade Xcelssé plattform möjliggör etikettfri övervakning av cell avlivning under en längre tid, nämligen upp till 10 dagar. Denna kapacitet för en så lång tidsmässig skala för datainsamling skiljer tekniken från andra analyser som används för närvarande och som kräver att du ställer in flera experimentella replikat för tidspunkt insamling och mödosam prov manipulation. Dessutom förenklar det minimala signal bidraget från effektorens immunceller dataanalys. Programvaran kan bearbeta data automatiskt och generera användbara parametrar såsom andelen cytolys, KT50, etc. Tekniken har redan visat hög känslighet (med E:T-förhållanden så lågt som 1:20) och ett stort dynamiskt omfång (med E:T-förhållanden från 20:1 till 1:20), vilket inte är lätt att uppnå med andra analyser. Sammantaget bör genomförandet av denna teknik möjliggöra en mer exakt dataanalys på en högre genomströmning skala som kommer att förbättra utvecklingen av bil T-cell reagenser, främja området i en mycket högre takt.

Disclosures

Författarna bedriver forskning i bil T-cell utveckling och tillhörande potens analyser som är affärsintressen ProMab bio Technologies och ACEA Biosciences, respektive. Detta förändrar dock inte författarnas anslutning till Joves uppdrag att öka spridningen av vetenskaplig kunskap. Villkoren i denna publikation har granskats och godkänts av ProMab bio Technologies och ACEA Biosciences i enlighet med sin forskningspolitik.

Acknowledgments

Författarna tackar ProMab bio Technologies och ACEA Biosciences för att de tillhandahåller de reagenser och instrument som används i denna studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD Biolegend 420404
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit ACEA Biosciences 8100005
anti-human F(ab')2 Jackson Immunoresearch laboratories. 109-116-088
APC anti-CD3 Biolegend 317318
Assay medium RPMI1640 life technologies.Corp 11875-093
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 Stemcell technologies #07930
CAR-T cell medium from ProMab AIM-V+300IFU/ml IL-2 12055-091
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads Thermofisher 11131D
DMEM GElifesciences.com SH30243.02
FACS buffer Promab made
FBS Lonza.com 14-503F
HEK293FT Thermo Fisher R70007
INFg ELISA kit Thermo Fisher
Lentiviral Packaging Mix System Biosciences VP100
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) Takara 631235
Promab medium for target cells Varied with cell lines
Real time Cellular Analyer ACEA Biosciences
Thermal cycler Thermo Fisher
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) Transplus, Alstem V020
Transfection dilution solution, Opti-MEM Thermo Fisher
Transfection reagent, NanoFect reagent Alstem NF100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19, (1), 5-18 (2018).
  2. June, C. H., O’Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359, (6382), 1361-1365 (2018).
  3. FDA. FDA approval brings first gene therapy to the United States. Available from: https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm (2017).
  4. FDA. FDA approves CAR-T cell therapy to treat adults with certain types of large B-cell lymphoma. Available from: https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm (2017).
  5. Celgene. Celgene Corporation and bluebird bio Announce bb2121 Anti-BCMA CAR-T Cell Therapy Has Been Granted Breakthrough Therapy Designation from FDA and Prime Eligibility from EMA for Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. Available from: http://ir.celgene.com/releasedetail.cfm?releaseid=1049014 (2017).
  6. Liu, B., Song, Y., Liu, D. Clinical trials of CAR-T cells in China. Journal of Hematology & Oncology. 10, (1), 166 (2017).
  7. Fry, T. J., et al. CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy. Nature Medicine. 24, (1), 20-28 (2018).
  8. Yang, Y., Jacoby, E., Fry, T. J. Challenges and opportunities of allogeneic donor-derived CAR T cells. Current Opinion in Hematology. 22, (6), 509-515 (2015).
  9. Celyad. Celyad Announces FDA Acceptance of IND Application for CYAD-101, a First-in-Class Non-Gene Edited Allogeneic CAR-T Candidate. Available from: https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate (2017).
  10. Sheridan, C. Allogene and Celularity move CAR-T therapy off the shelf. Nature Biotechnology. 36, (5), 375-377 (2018).
  11. D’Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9, (3), 282 (2018).
  12. Xu, J., et al. Combination therapy: A feasibility strategy for CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors. Oncology Letters. 16, (2), 2063-2070 (2018).
  13. Xia, A. L., Wang, X. C., Lu, Y. J., Lu, X. J., Sun, B. Chimeric-antigen receptor T (CAR-T) cell therapy for solid tumors: challenges and opportunities. Oncotarget. 8, (52), 90521-90531 (2017).
  14. Yong, C. S. M., et al. CAR T-cell therapy of solid tumors. Immunology and Cell Biology. 95, (4), 356-363 (2017).
  15. Newick, K., O'Brien, S., Moon, E., Albelda, S. M. CAR T Cell Therapy for Solid Tumors. Annual Review of Medicine. 68, 139-152 (2017).
  16. de Wolf, C., van de Bovenkamp, M., Hoefnagel, M. Regulatory perspective on in vitro potency assays for human mesenchymal stromal cells used in immunotherapy. Cytotherapy. 19, (7), 784-797 (2017).
  17. Cerignoli, F., et al. In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis. PLOS ONE. (2018).
  18. Holden, H. T., Oldham, R. K., Ortaldo, J. R., Herberman, R. B. Standardization of the chromium-51 release, cell-mediated cytotoxicity assay: cryopreservation of mouse effector and target cells. Journal of the National Cancer Institute. 58, (3), 611-622 (1977).
  19. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLOS ONE. 10, (10), e0141074 (2015).
  20. Mukherjee, M., Mace, E. M., Carisey, A. F., Ahmed, N., Orange, J. S. Quantitative Imaging Approaches to Study the CAR Immunological Synapse. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25, (8), 1757-1768 (2017).
  21. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9, (6), 601-616 (2010).
  22. Nelson, D. L., Kurman, C. C., Serbousek, D. E. Chapter 7, Unit 7: 51Cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Current Protocols in Immunology. 27 (2001).
  23. Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292, (1-2), 195-205 (2004).
  24. Glamann, J., Hansen, A. J. Dynamic detection of natural killer cell-mediated cytotoxicity and cell adhesion by electrical impedance measurements. Assay and Drug Development Technologies. 4, (5), 555-563 (2006).
  25. Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay and Drug Development Technologies. 2, (4), 363-372 (2004).
  26. Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. Dynamic and label-free monitoring of natural killer cell cytotoxic activity using electronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 309, (1-2), 25-33 (2006).
  27. Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods in Molecular Biology. 740, 33-43 (2011).
  28. Lamarche, B. J., Xi, B., Cerignoli, F. Quantifying the Potency of Cancer Immunotherapies: Immune Cell-Mediated Killing Kinetics and Efficacy Analysis in Real-Time without the Use of Labels. Genetic Engineering & Biotechnology News (GEN). 36, (14), 18-19 (2016).
  29. Golubovskaya, V., et al. CD47-CAR-T Cells Effectively Kill Target Cancer Cells and Block Pancreatic Tumor Growth. Cancers. 9, (10), (2017).
  30. Golubovskaya, V. M., et al. GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer. Frontiers in Bioscience. 23, 2245-2254 (2018).
  31. Guedan, S., et al. Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation. JCI Insight. 3, (1), (2018).
  32. Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining optimal cytotoxic activity of human Her2neu specific CD8 T cells by comparing the Cr51 release assay to the xCELLigence system. Journal of Visualized Experiments. (66), e3683 (2012).
  33. Davenport, A. J., et al. CAR-T Cells Inflict Sequential Killing of Multiple Tumor Target Cells. Cancer Immunology Research. 3, (5), 483-494 (2015).
  34. Hegde, M., et al. Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Ralpha2 mitigate tumor antigen escape. The Journal of Clinical Investigation. 126, (8), 3036-3052 (2016).
  35. Jin, J., et al. Enhanced clinical-scale manufacturing of TCR transduced T-cells using closed culture system modules. Journal of Translational Medicine. 16, (1), 13 (2018).
  36. Weiskopf, K. Cancer immunotherapy targeting the CD47/SIRPalpha axis. European Journal of Cancer. 76, 100-109 (2017).
  37. Huang, Y., Ma, Y., Gao, P., Yao, Z. Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy. Journal of Thoracic Disease. 9, (2), E168-E174 (2017).
  38. Ma, S., Thorpe, P., Vitetta, E., Meyer, J. Combined targeting of exposed phosphatidylserine, CD47 and CD54 on human pancreatic tumor cells in a mouse xenograft model of human pancreatic cancer (P4455). The Journal of Immunology. 190, (1 Supplement), (2013).
  39. Yamamoto, K., et al. Emergence of CD47- high expression cells confers enhanced tumorigenicity upon KDM6B suppression in pancreatic cancer. Cancer Research. 76, (2 Supplement), (2016).
  40. Xu, D., et al. The development of CAR design for tumor CAR-T cell therapy. Oncotarget. 9, (17), 13991-14004 (2018).
  41. FDA. Guidance for Industry, Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products. (2017).
  42. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLOS ONE. 7, (10), e46536 (2012).
  43. Chiu, C. H., et al. Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12, (1), 149 (2017).
  44. Hillger, J. M., Lieuw, W. L., Heitman, L. H., IJzerman, A. P. Label-free technology and patient cells: from early drug development to precision medicine. Drug Discovery Today. 22, (12), 1808-1815 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics