Nanoplasmon-संवर्धित बिखरने और कम आवर्धन माइक्रोस्कोप इमेजिंग का उपयोग करने के लिए ट्यूमर व्युत्पंन Exosomes परिमाणन

Bioengineering
 

Summary

रोगग्रस्त और घातक कोशिकाओं के लिए exosome-व्युत्पंन biomarkers के नैदानिक अनुवाद तेजी से और सटीक परिमाणन तरीकों की कमी से रुकावट है । यह रिपोर्ट कम-आवर्धन वाले डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोप छवियों के उपयोग का वर्णन करती है, जिससे कि छोटे वॉल्यूम सीरम या प्लाज्मा नमूनों में विशिष्ट exosome के उपप्रकारों की मात्रा निर्धारित की जा सके ।

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Wan, M., Amrollahi, P., Sun, D., Lyon, C., Hu, T. Y. Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes. J. Vis. Exp. (147), e59177, doi:10.3791/59177 (2019).

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Abstract

संक्रमित या घातक कोशिकाओं अक्सर अधिक exosomes स्राब, परिसंचरण में रोग से जुड़े exosomes के स्तर को ऊंचा करने के लिए अग्रणी । इन exosomes रोग निदान के लिए biomarkers के रूप में सेवा करने के लिए और रोग प्रगति और उपचार प्रतिक्रिया की निगरानी करने की क्षमता है. हालांकि, सबसे exosome विश्लेषण प्रक्रियाओं exosome अलगाव और शुद्धि कदम है, जो आम तौर पर समय लेने वाली और श्रम गहन, और इस तरह नैदानिक सेटिंग्स में सीमित उपयोगिता की आवश्यकता होती है । इस रिपोर्ट का वर्णन एक त्वरित प्रक्रिया अलग अलगाव और शुद्धि कदम की आवश्यकता के बिना exosomes की बाहरी झिल्ली पर विशिष्ट biomarkers का विश्लेषण करने के लिए । इस विधि में एक्सोकुछ-विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा एक स्लाइड की सतह पर exosomes पर कब्जा कर लिया है और फिर नैनोकणों के साथ संकरीकृत-एक रोग के लिए विशिष्ट conjugated एंटीबॉडी जांच । संकरण के बाद, लक्ष्य exosome आबादी की बहुतायत के लिए बाध्य नैनोकणों के कम आवर्धन डार्क फील्ड माइक्रोस्कोप (LMDFM) छवियों का विश्लेषण करके निर्धारित किया जाता है । इस दृष्टिकोण को आसानी से अनुसंधान और नैदानिक उपयोग के लिए अपनाया जा सकता है झिल्ली से जुड़े exosome biomarkers रोग से जुड़े विश्लेषण ।

Introduction

Exosomes सबसे अधिक प्रकार के सेल से जारी कर रहे है और सेल करने के लिए सेल संचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, विभिंन रोगों के साथ जुड़े pathophysiological प्रक्रियाओं सहित, क्योंकि वे विशिष्ट ऊतकों या कोशिका प्रकार के लिए घर हो सकता है, और न्यूक्लिक एसिड की एक किस्म शामिल , प्रोटीन, और लिपिड है कि मूल के अपने सेल को प्रतिबिंबित और उनके प्राप्तकर्ता कोशिकाओं1,2,3,4पर नियामक प्रभाव डालती कर सकते हैं । Exosomes अक्सर रोग राज्यों में ऊंचा स्तर पर स्रावित कर रहे हैं, दोनों आसंन और दूर की कोशिकाओं के साथ बातचीत कर सकते हैं, और परिसंचरण में अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता में पाए जाते है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सबसे अंय शरीर तरल पदार्थ, लार सहित, मूत्र, अग्नाशय और पित्त रस, और bronchoalveolar लेवेज द्रव5,6,7,8,9,10,11। यह बहुतायत और मानव शरीर के तरल पदार्थ में exosomes की स्थिरता, उनकी जानकारी संपंन प्रकृति के साथ युग्मित, उंहें रोग निदान और उपचार की निगरानी के लिए आदर्श biomarkers बनाता है ।

यह ट्यूमर से व्युत्पंन exosomes (TDEs) शामिल हैं, जो ट्यूमर विशिष्ट या चयनात्मक कारक है, जो रोग biomarkers, ट्यूमर से जुड़े उत्परिवर्ती alleles सहित के रूप में सेवा कर सकते हैं । TDEs ट्यूमर microenvironment के remodeling में भाग लेने के लिए ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस की सुविधा कर सकते हैं, और विरोधी को विनियमित-ट्यूमर प्रतिक्रियाओं12। वृद्धि tde स्राव सबसे कैंसर का एक आम फेनोटाइप है और ट्यूमर microenvironment के कई सुविधाओं, hypoxia, अम्लीय पीएच सहित, और सूजन, exosome स्राव को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है. आश्चर्य की बात है, कोशिकाओं है कि exosomes, कुल exosome स्तर में वृद्धि, ही, एक कैंसर biomarker के रूप में कार्य कर सकते है छिपाना की संख्या को देखते हुए । उदाहरण के लिए, एक ताजा अध्ययन में पाया गया कि पित्त रस में कुल EV एकाग्रता १००% सटीकता7के साथ आम पित्त नली स्टेनोसिस रोगियों में घातक और अघातक भेदभाव करता है । इसी तरह के परिणाम प्लाज्मा सहित अन्य शरीर के तरल पदार्थ का उपयोग कर अध्ययन के साथ पाया गया है । हालांकि, विषय भिन्नता के अधीन करने की क्षमता के कारण, और अन्य confounding कारकों, रोग biomarkers के रूप में exosomes की जांच सबसे अध्ययन biomarkers का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित किया है कि चुनिंदा TDEs के बजाय कुल exosome के साथ जुड़े रहे हैं संख्या.

नैदानिक अभ्यास में exosome biomarkers अनुवाद, तथापि, सबसे रिपोर्ट exosome परख दृष्टिकोण समय लेने वाली और श्रम गहन अलगाव प्रक्रियाओं 13की आवश्यकता के बाद से चुनौतीपूर्ण रहता है । वर्तमान में लोकप्रिय exosome अलगाव तरीकों ultracentrifugation, घनत्व gradients, आकार-अपवर्जन, सह वर्षण, आत्मीयता कब्जा, और microfluidic अलगाव दृष्टिकोण शामिल हैं । Ultracentrifugation "स्वर्ण मानक" विधि है, और सबसे अधिक exosome isolations के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन इस प्रक्रिया में समय लेने वाली है और exosome के नुकसान और exosome झिल्ली क्लस्टरिंग में परिणाम है, और exosome के नमूनों कि दूषित कर रहे हैं का उत्पादन प्रोटीन, लाइपोप्रोटीन और अन्य कारक जो बाद के विश्लेषणों को प्रभावित कर सकते हैं14. अधिकांश exosome अलगाव तरीकों, ultracentrifugation सहित, सूक्ष्म vesicles (100-1000 एनएम) और अपोप्तोटिक निकायों (100-5000 एनएम) से exosomes (30-150 एनएम) अलग नहीं कर सकते हैं, जो विभिंन तंत्र के माध्यम से उठता है और विभिंन कार्यों, आकार के कारण इन समूहों के बीच ओवरलैप, और exosome की आबादी की विविधता15. नए तरीकों को संवेदनशीलता और exosome की प्रतिलिपि बनाने की प्रक्रिया में सुधार करने के लिए की जरूरत है एक्साकुछ की वसूली में सुधार के द्वारा assays हैं, जबकि exosome क्षति और संदूषण को कम करने, हालांकि किसी भी assays हैं इस तरह के तरीकों के आधार पर भी उन्हें रेंडर करने के लिए अनुकूलित किया जा करने की आवश्यकता होगी नैदानिक सेटिंग्स में आवेदन करने के लिए अनुवाद के लिए उपयुक्त है ।

हाल के कई अध्ययनों से शरीर के तरल पदार्थ से सीधे exosomes पर कब्जा करने और विश्लेषण करने के लिए एकीकृत प्लेटफार्मों को रोजगार का प्रस्ताव किया है । इन पद्धतियों microfluidic, electrokinetic, आत्मीयता पर कब्जा, और exosome अलगाव के लिए विभिन्न अन्य तरीकों, और इलेक्ट्रोकेमिस्ट्री, सतह plasmon गूंज, और अन्य तरीकों पर कब्जा कर लिया exosomes का पता लगाने के लिए रोजगार. यह स्पष्ट नहीं है कि कैसे व्यवहार्य इन तरीकों के कई नैदानिक सेटिंग्स में हो जाएगा, उनकी जटिलता, व्यय, कम throughput या अंय मुद्दों के कारण ।

हम एक तेजी से और कम खर्चीली परख है कि कुल exosomes और विशिष्ट exosome के के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित किया है, जैसे रोग से जुड़े exosomes, ऐसे TDEs, जो केवल नमूना की एक छोटी राशि की आवश्यकता है और जो एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह नैदानिक वातावरण के लिए उपयुक्त कार्यरत हैं । इस परख में, एक स्लाइड एंटीबॉडी के साथ लेपित है कि बांध या तो एक exosome-विशिष्ट या रोग विशिष्ट exosome सतह पर व्यक्त मार्कर के क्रम में सीधे लक्ष्य exosomes पर कब्जा करने के लिए छोटे मात्रा प्लाज्मा या सीरम नमूनों पर कुओं को लागू फिसलना. कब्जा कर लिया exosomes तो एक एंटीबॉडी के साथ संकरचित-conjugated नैनोकणों कि इन exosomes पर ब्याज की biomarker पहचानता है, जो या तो एक सामांय exosome मार्कर या ब्याज की एक exosome उपप्रकार के लिए एक विशेष कारक हो सकता है । इन नमूना कुओं की छवियां तो एक अंधेरे क्षेत्र माइक्रोस्कोप (dfm) का उपयोग कर कब्जा कर लिया है और प्रत्येक नमूना अच्छी तरह से6,16,17में कब्जा कर लिया ब्याज की exosomes करने के लिए बाध्य नैनोकणों से बिखरे हुए प्रकाश को मापने के लिए विश्लेषण किया । विशेष रूप से, इमेजिंग एक पूरे नमूना अच्छी तरह से कम वृद्धि DFM द्वारा (LMDFM) एक चयन उच्च इज़ाफ़ा DFM विश्लेषण के साथ सामना करना पड़ा पूर्वाग्रह से बचा जाता है जब उपयोगकर्ताओं को सीधे जो क्षेत्रों के बाद छवि विश्लेषण के लिए कब्जा करने के लिए चुनना होगा । LMDFM छवि विश्लेषण खरोंच और नमूना मलबे सहित सतह अनियमितताओं से प्रकाश बिखरने कलाकृतियों के अधीन है, लेकिन इस पृष्ठभूमि में हम NIH छवि विश्लेषण कार्यक्रम पर चलाने के लिए विकसित एक सरल शोर-कमी एल्गोरिथ्म का उपयोग कर कम किया जा सकता है, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) । यह एल्गोरिथ्म पहले एक इनपुट समोच्च थ्रेशोल्ड लागू करता है जो बाद के विश्लेषण के लिए छवि के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए अच्छी तरह से नमूना की सीमाओं का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । इस क्षेत्र को समोच्च क्षेत्र द्वारा परिभाषित किया जाता है तो छवि के लाल, नीले और हरे रंग के चैनल में मौजूद अलग संकेत करने के लिए विभाजित है और ब्लू चैनल के लिए लाल चैनल से घटाया है सतह कलाकृतियों और nanorod से असमान प्रकाश से उत्पन्न होने वाले संकेत को दूर करने के लिए संकेत.

यह आलेख वर्णन करता है कि कैसे इस परख का उपयोग करने के लिए तेजी से या तो कुल या विशिष्ट exosome प्लाज्मा या सीरम नमूनों में स्तर की मात्रा बढ़ाता है ।

Protocol

1. नैनोआर्टिकल जांच की तैयारी

नोट: यह परख Functionalized सोने Nanorods (औरु; 25 एनएम व्यास x ७१ एनएम लंबाई) कि covalently neutravidin पॉलिमर (ए वी) के साथ संयुग्मित कर रहे है और एक सतह plasmon अनुनाद पीक कि एक लाल (६४१ एनएम पीक) DFM पर बिखरने संकेत पैदा किया है इस्तेमाल रोशनी.

  1. औंर-ए-ए-(२.५६ x 1011 कणों) के ४० μl धोने के साथ तीन बार २०० ΜL pbs के साथ (पीएच ७.०) और आकांक्षा (८,५०० x जी 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर), एक अंतिम अपकेंद्रण और आकांक्षा कदम के बाद जो aunr-ए वी गोली निलंबित कर दिया है ४० μL PBS में ।
  2. इस औंर-AV निलंबन को 10 μL biotinylated एंटीबॉडी (०.५ मिलीग्राम/मिलीलीटर) के साथ मिलाएं जो एक्स्फोकुछ उपप्रकार की सतह पर एक प्रतिजन के लिए विशिष्ट है और १५० μL PBS और फिर 2 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण एक मिक्सर का उपयोग करने के लिए neutravidin-biotin पूरा पहुंचने के लिए बाध्यकारी अनुमति ।
  3. परिणामी एंटीबॉडी-संयुग्मित औंर (Aunrs-IgG) को धोने से तीन बार और आकांक्षा (६,५०० x g पर 10 मिनट के लिए 4 ° c), और फिर उन्हें २०० ΜL pbs में निलंबित और 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर जब तक उपयोग.
    नोट: बाँझ तकनीक और कम भंडारण समय के संदूषण और AuNR-IgG की गिरावट से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. उनके संयुग्मन के 24 घंटे के भीतर एंटीबॉडी-संयुग्मित औरु का उपयोग करना सबसे अच्छा है ।

2. EV कैप्चर स्लाइड्स की तैयारी

  1. पतला चयनित exosome पर कब्जा एंटीबॉडी के लिए ०.०२५ मिलीग्राम/एमएल और एक बहु-कूप प्रोटीन एक/जी स्लाइड पर इस कमजोर पड़ने के 1 μL/अच्छी तरह से जोड़ने के लिए और फिर एक humidified चैंबर में 1 ज के लिए ३७ स्लाइड ।
  2. महाप्राण कुओं को हटाने के लिए अनबाउंड एंटीबॉडी, और धोने कुओं के अलावा और आकांक्षा के द्वारा तीन बार 1 μL/PBS की, तो 1 μL के साथ एक अच्छी तरह से लोड अवरुद्ध बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) और 2 ज के लिए स्लाइड सेते में ३७ ° c किसी भी शेष प्रोटीन बाध्यकारी साइटों ताला ।
  3. महाप्राण कुओं अवरुद्ध बफर को हटाने के लिए, इसके अलावा और PBS के 1 μL/well की आकांक्षा द्वारा कुओं धोने तीन बार, और exosome कब्जा और विश्लेषण के लिए तुरंत अवरुद्ध स्लाइड का उपयोग करें ।

3. मानक वक्र तैयारी

  1. सटीक एक विशिष्ट exosome उपप्रकार के निरपेक्ष या सापेक्ष बहुतायत मात्रा, उपयोगकर्ता एक शुद्ध exosome आबादी है कि समान रूप से ब्याज की exosome सतह biomarker व्यक्त के साथ एक मानक वक्र उत्पंन करना चाहिए । यह अध्ययन एक मेटास्टेसिस-एसोसिएटेड झिल्ली प्रोटीन, ephrin A2 रिसेप्टर व्यक्त exosomes की बहुतायत का विश्लेषण करती है, जो अग्नाशय के कैंसर के स्तर के साथ एक रिपोर्ट संबंध है और6,18रोग का निदान ।
    नोट: मानव अग्नाशय के कैंसर सेल लाइन PANC-1 और उसके exosomes इस प्रोटीन और इस सेल लाइन से अलग exosomes व्यक्त करने के लिए exosomes की संख्या मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र उत्पंन इस्तेमाल किया गया है कि जटिल exosome में इस प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जाना जाता है नमूने.
  2. सीरम में ३७ डिग्री सेल्सियस-मुक्त संस्कृति मीडिया में ४८ घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाओं को मीडिया में exosome संचय की अनुमति है, तो निलंबन संस्कृतियों या आसंन सेल संस्कृतियों से संस्कृति मीडिया की प्रत्यक्ष आकांक्षा के अपकेंद्रण द्वारा सेल संस्कृति supernatants अलग ।
  3. २००० x g पर एकत्रित मीडिया को मलबे को हटाने और supernatant पुनर्प्राप्त करने के लिए 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें ।
  4. उपयुक्त क्षमता के एक ०.४५ μm कम प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर इकाई के माध्यम से स्पष्ट संस्कृति supernatant फ़िल्टर (एक २५० मिलीलीटर पॉलीथीरसल्फॉन वैक्यूम छानने का काम इकाई उदा) ।
  5. एक २५० μl अंतिम मात्रा करने के लिए एक १००,००० नाममात्र आणविक वजन सीमा फिल्टर प्रणाली का उपयोग ३२०० एक्स जी पर अपकेंद्रण द्वारा जिसके परिणामस्वरूप छानना ध्यान लगाओ । इस फिल्टर से बनाए रखा मात्रा इकट्ठा, तो २०० μL PBS के साथ फिल्टर धोने, और एकत्र exosome नमूना मात्रा के साथ इस धोने मात्रा गठबंधन.
  6. ४५ मिनट के लिए २१,००० एक्स जी पर इस नमूने को अपकेंद्रित्र और ध्यान से supernatant ठीक, किसी भी उपजी सामग्री इकट्ठा करने के लिए नहीं ध्यान रख रही है ।
  7. अपकेंद्रित्र बरामद supernatant पर १००,००० एक्स जी 3 घंटे के लिए exosomes वेग के लिए । Supernatant दूर महाप्राण और १०० μL PBS में exosome गोली इकट्ठा ।
  8. लंबी अवधि के भंडारण के लिए 24 घंटे के भीतर या-८० डिग्री सेल्सियस पर इस्तेमाल किया अगर 4 डिग्री सेल्सियस पर परिणामी exosome निलंबन की दुकान ।
    नोट: exosome नमूने फ्रीज-thaw के चक्र को दोहराने के लिए विषय नहीं है ।
  9. एक्सोकुछ के प्रत्यक्ष मापन द्वारा मिश्रण के बाद exosome के एक aliquot परिमानांकन संख्या (उदा., नैनोलेख ट्रैकिंग विश्लेषण या स्वरित्र प्रतिरोधी नाड़ी संवेदन द्वारा या माइक्रो-bicinchoninic द्वारा एक्सोकुछ lysates के प्रोटीन एकाग्रता को मापने के द्वारा एसिड परख, या एक समकक्ष विधि, लगभग exosome मात्रा के लिए एक साधन के रूप में)16,19
  10. एक्सोकुछ निलंबन के धारावाहिक dilutions का एक सेट उत्पन्न करने के लिए nanoparticle संकेत की तुलना करने के लिए इनपुट exosome संख्या या प्रोटीन सामग्री के लिए अनुमति देते हैं ।
  11. प्रत्येक exosome के प्रत्येक मानक के 1 μL हस्तांतरण परख थाली पर अपनी नकल कुओं में से प्रत्येक के लिए ।
    नोट: मानक घटता के लिए नैनोकणों संकेत और exosome एकाग्रता के बीच सहसंबंध रेखा की ढलान की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (1) परख प्रदर्शन का मूल्यांकन और (2) प्रायोगिक नमूनों में लक्ष्य exosomes के सापेक्ष एकाग्रता का निर्धारण ।

4. प्रसंस्करण मानव प्लाज्मा या सीरम नमूने

  1. मानक तरीकों से प्लाज्मा या सीरम नमूने लीजिए और exosome विश्लेषण के लिए आवश्यक जब तक-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । एक कमरे के तापमान पानी स्नान में तेजी से नमूने पिघलना । एक बार फिर से सजातीय निलंबन को बढ़ावा देने के लिए समांगी के नमूनों को मिलाना ।
    नोट: सीरम और प्लाज्मा नमूनों से परिणाम बराबर नहीं हो सकता है, के बाद से वहाँ थक्के प्रतिक्रिया के दौरान exosomes की एक महत्वपूर्ण रिहाई है ।
  2. प्रोटीन समुच्चय और अन्य मलबे को अवक्षेप करने के लिए 15 मिनट के लिए ५०० x जी पर प्लाज्मा या सीरम नमूने एक ताजा ट्यूब के लिए प्लाज्मा या सीरम नमूना का एक aliquot स्थानांतरण और PBS जोड़ने के लिए एक 1:1 कमजोर पड़ने पैदा । मिश्रण कोमल vortexing या inversion, के रूप में उपयुक्त द्वारा पतला नमूना । प्रत्येक प्लाज्मा के 1 μL स्थानांतरण या सीरम निलंबन परख थाली पर अपनी नकल कुओं में से प्रत्येक के लिए ।

5. exosome पर कब्जा और पता लगाने

  1. एक अवरुद्ध ईवी कब्जा स्लाइड के 1 μL/अच्छी तरह से exosome नमूने के साथ लोड, 8 नमूने प्रति प्रतिकृति का उपयोग कर, और एक humidified चैंबर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्लाइड सेबेट । सभी नमूना कुओं को महाप्राण दें और फिर कुओं को धोने के लिए 1 μL/अच्छी तरह से पीबीएस जोड़ें और लोडेड एक्सोसोकुछ नमूने से अनबाउंड exosomes और अन्य संदूषकों को निकालें ।
  2. पहले से तैयार AuNR-IgG निलंबन के 1 μL/well के साथ लोड नमूना कुओं (ऊपर अनुभाग 1 देखें) और एक humidified चैंबर में ३७ ° c पर 2 ज के लिए स्लाइड सेते. Nanoparticle समाधान महाप्राण और pbs में स्लाइड धो ०.०१% tween के साथ पूरक-20 (pbst) 10 मिनट के लिए एक मिक्सर का उपयोग कर, तो महाप्राण और 10 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी के साथ सभी नमूना कुओं धो एक घूर्णन मिक्सर का उपयोग कर, और हवा सूखी बाद lmdfm कल्पना के लिए ।
    नोट: अंतर-परख गुणांक (cvs) भिन्नता के एक ही नमूने के आठ प्रतिकृति से मूल्यांकन कर रहे हैं । नमूनों कि प्रदर्शन CVs > 20% गैर जानकारीपूर्ण माना जाता है और दोहराया जाना चाहिए, अगर वहां पर्याप्त नमूना है ।

6. DFM छवि पर कब्जा

  1. एक अंधेरे क्षेत्र संघनित्र (१.२ < NA < १.४) और एक 4x उद्देश्य एक 1/220 एस जोखिम समय को रोजगार के साथ सुसज्जित एक डिजिटल कैमरा का उपयोग करते हुए लगातार प्रकाश व्यवस्था के तहत exosome प्रमात्रीकरण के लिए छवियों पर कब्जा ।
  2. छवि कैप्चर सॉफ़्टवेयर खोलें ।
    नोट: हम NIS-तत्वों माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) प्रोटोकॉल के लिए नीचे वर्णित है, लेकिन यह एक और सॉफ्टवेयर है कि अपनी छवि पर कब्जा मापदंडों मैच कर सकते है का उपयोग करने के लिए संभव है । NIS-तत्व Viewer इमेजिंग सॉफ्टवेयर छवि फ़ाइलें और डेटा सेट है कि विश्लेषण, दृश्य और संग्रह उपकरण है देखने के लिए एक मुक्त स्वसंपूर्ण कार्यक्रम है । नीचे दिए गए पैरामीटर भी autofocus के साथ एक खुर्दबीन के लिए कर रहे है और एक स्वचालित चरण है कि कई छवियों को स्वचालित रूप से कब्जा कर लिया और एक एकल छवि में सिले अनुमति देता है ।
  3. स्लाइड को माइक्रोस्कोप अवस्था पर उल्टा रखें, स्लाइड की स्थिति को समायोजित करें और स्लाइड के पीछे विसर्जन तेल की एक छोटी-सी बूंद लगाएं, जहां संघनित्र लेंस स्लाइड संपर्क करें ।
  4. सॉफ्टवेयर इंटरफेस में लाइव बटन पर क्लिक करें, और छवि संतृप्त नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए एक उच्च एकाग्रता मानक अच्छी तरह के खिलाफ जोखिम समय को समायोजित ।
  5. खोलें प्राप्त करें टैब से बड़ी छवि विंडो स्कैन करें और सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस पैरामीटर निम्नानुसार सेट: मैक्रो छवि ऑप्टिकल conf = वर्तमान; उद्देश्य: 2:10x, स्कैनिंग ऑप्टिकल conf = वर्तमान, उद्देश्य: 2:10x; सिलाई = 20% ओवरलैप; के माध्यम से सिलाई = इष्टतम पथ ।
  6. चुनें बड़ी छवि बनाएं, मंच आंदोलन के दौरान बंद सक्रिय शटर, प्रत्येक पर कब्जा करने से पहले प्रतीक्षा: 20 ms, प्रारंभ में मैंयुअल रूप से ध्यान केंद्रितहै, और हर 20 क्षेत्र में कदम दर कदम ध्यान केंद्रित का उपयोग करें। इन सेटिंग को स्कैन किए गए चित्रों के साथ सहेजा जाएगा ।
  7. लक्ष्य स्कैन फ़ील्ड की बाईं शीर्ष सही नीचे की सीमा को परिभाषित करने के लिए माइक्रोस्कोप चरण ले जाएँ । मॉनिटर पर एक स्पष्ट छवि को प्राप्त करने और ध्यान केंद्रित छवि में किसी भी प्रकाश अनियमितताओं को कम करने के लिए आवश्यक के रूप में संघनित्र सेटिंग्स और पर्यावरण प्रकाश को समायोजित करने के लिए फोकस समायोजित करें ।
  8. सॉफ़्टवेयर में छवि आउटपुट फ़ाइल का नाम है । स्कैन बटन क्लिक करें और माइक्रोस्कोप स्कैन और बनाने के लिए और पूरे स्लाइड की एक सिले छवि को बचाने के लिए अनुमति देते हैं ।
  9. छवि कब्जा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रहे है और यह ImageJ में DSM प्लगइन पर बाद में विश्लेषण के लिए 1/8 पैमाने पर बचाने के साथ बचाया छवि खोलो ।

7. DFM छवि विश्लेषण

  1. ImageJ प्रोग्राम (https://imagej.nih.gov/ij/) डाउनलोड करें । Https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually पर सूचीबद्ध निर्देशों का उपयोग कर ImageJ में DSM एल्गोरिथ्म प्लगइन स्थापित करें ।
  2. ImageJ सॉफ़्टवेयर खोलें, उसके बाद निम्न इनपुट पैरामीटर DSM एल्गोरिथ्म में सेट करें: समोच्च सीमा (सीटी) = २५३.०२०, प्रकार = लाल, केंद्र स्केल (S) = ०.८, कम (Lt)/उच्च (Ht) परिमाणीकरण सीमा = 0/62 ।
  3. सहेजी गई छवि को अनुभाग ६.८ से ImageJ के साथ खोलें । चुनें DSM Plugins टैब से स्कैन बटन, तो कॉलम और पंक्तियों की संख्या को परिभाषित खोला छवि के अनुसार । कार्यक्रम का पता लगाने क्षेत्रों और विश्लेषण के तितर बितर तीव्रता नैनोकणों के अनुसार क्षेत्रों में स्वचालित रूप से पहचान कर सकते हैं । Dsm स्कैन विंडो में निंन इनपुट पैरामीटर्स सेट करें: आकार बदलें = 25, स्थान व्यास (पिक्सेल में) = १९० – २००, व्यास श्रेणी = ३२, वृद्धि व्यास (पिक्सल में) = 8, DSM विंयास-कम सीमा = 0, उच्च सीमा = ६२, आसंन दूरी = १००, घटाना पूर्वाग्रह = 0 ।
    नोट: इस प्रकार के तितर बितर तीव्रता के परिणाम के लिए स्लाइड पर बाध्य exosomes की मात्रा को प्रतिबिंबित ।

Representative Results

बहु-कूप प्रोटीन A/G लेपित स्लाइड् स (चित्र 1a) Anti-EphA2 एंटीबॉडी के साथ कार्यबद्ध थे और तब विशेष रूप से अग्नाशय के कैंसर (1 μl/well) और बिना रोगियों के सीरम नमूनों से EphA2-धनात्मक exosomes कैप्चर करने के लिए प्रयुक्त एक एंटी-CD9 एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित सोने nanorods के साथ (चित्र 1b) । इन नैनोकणों से बिखरे प्रकाश की dfm छवियों imagej सॉफ्टवेयर में DSM प्लगइन का उपयोग करने के लिए बाध्य epha-2 एक अच्छी तरह से में सकारात्मक exosomes बताना का विश्लेषण किया गया । DSM एल्गोरिथ्म स्वचालित रूप से अच्छी तरह से एक नमूना की सीमा को परिभाषित करता है, कलाकृतियों से शोर फिल्टर, प्रत्येक अच्छी तरह से बिखरे हुए संकेत की गणना करता है, और इस जानकारी outputs (चित्रा 2). DSM एल्गोरिथ्म दृढ़ता से नमूना में खरोंच या मलबे मौजूद से प्रकाश बिखरने कलाकृतियों attenuates और संवेदनशीलता और नैनोकण का पता लगाने की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की क्षमता में सुधार करता है और स्वचालित रूप से उच्च-थ्रूपुट के लिए स्लाइड छवियों के एक बैच प्रक्रिया कर सकते हैं उपयोग. इस एल्गोरिथ्म छवि पृष्ठभूमि घटाना करने के लिए उपयोगकर्ता द्वारा ImageJ आज्ञाओं और मापदंडों इनपुट का उपयोग करता है, प्रत्येक अच्छी तरह से बिखरने संकेत की गणना, और एक डेटा और छवि फ़ाइल (चित्रा 3) उत्पादन । ब्याज के क्षेत्रों को कैप्चर छवि में उच्च तीव्रता अच्छी तरह से सीमाओं ImageJ मैक्रो प्रोग्राम के समोच्च थ्रेशोल्ड समारोह का उपयोग करके परिभाषित कर रहे हैं । छवि विश्लेषण एक पूर्वनिर्धारित समोच्च सीमा और छवि मापदंडों का उपयोग करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से नैनोकणों बिखरने की तीव्रता की गणना ।

के रूप में हमारे पिछले काम में रिपोर्ट (liang एट अल6के अनुपूरक जानकारी), panc से अलग exosomes-1 कोशिका संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पश्चिमी धब्बा द्वारा विशेषता संस्कृतियों आकार रेंज का प्रदर्शन, आकारिकी, और प्रोटीन मार्कर अभिव्यक्ति एक उच्च शुद्धता exosome नमूना के साथ संगत । PANC-1 exosomes, हमारे पिछले काम के रूप में एक ही प्रक्रिया के साथ तैयार किया, यहां इस्तेमाल के लिए exosorquantification के लिए हमारे nPES परख मांय थे । यह परख एक विरोधी EphA2 एंटीबॉडी के लिए कुल exosome आबादी से exosomes की एक बड़ी आबादी पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया और एक एंटीबॉडी जनरल exosome प्रोटीन CD9 के खिलाफ कब्जा कर लिया exosomes का पता लगाने के लिए । परिणाम serially पतला PANC-1 exosome नमूनों का उपयोग कर प्राप्त, प्रोटीन की सांद्रता के साथ ०.२४ से १.२ μg/ बहिर्काय प्रोटीन सांद्रता (चित्र 4B) ।

इस विधि के संभावित आवेदन प्रदर्शन करने के लिए, के साथ और अग्नाशय के कैंसर के बिना रोगियों से सीरम नमूने कैंसर से संबंधित biomarker EphA2 व्यक्त सीरम exosomes की बहुतायत का पता लगाने के लिए विश्लेषण किया गया, एक विरोधी EphA2 एंटीबॉडी का उपयोग सीधे एक विरोधी CD9 एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित सीरम और नैनोकणों से लक्ष्य exosomes पर कब्जा करने के लिए बाध्य exosomes का पता लगाने । इस विश्लेषण से पता चला है कि अग्नाशय के कैंसर के रोगियों से सीरम नमूनों EphA2 + exosomes के काफी उच्च स्तर था (चित्रा 5) उनके नियंत्रण से ।

Figure 1
चित्रा 1: exosome परिमाणीकरण योजना । () इस परख में प्रयुक्त बहु-कूप प्रोटीन ए/जी स्लीव्स (१९२ वेल्स) की योजनाबद्ध । () लक्ष्य exosomes सीधे नमूने से, सीरम और प्लाज्मा सहित कैप्चर एंटीबॉडी (जैसे विरोधी EphA2 एंटीबॉडी) पर सतह स्थिरीकरण द्वारा कब्जा कर रहे है स्लाइड करने के लिए बाध्य, और फिर सोने के साथ संयुग्मित nanorods एक का पता लगाने के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी (उदा. anti-CD9 एंटीबॉडी) DFM छवि विश्लेषण द्वारा विश्लेषण से पहले । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: exosome मात्रा LMDFM छवियों के लिए DSM एल्गोरिथ्म लागू करने से । कम इज़ाफ़ा छवियों DSM एल्गोरिथ्म के साथ संसाधित कर रहे है पृष्ठभूमि संकेत और संकेत कलाकृतियों कि खरोंच से पैदा कर सकते है को खत्म करने के लिए, voids, मलबे, और असमान नमूना रोशनी मिश्रण सोने nanorod संकेत, की मजबूत पहचान की अनुमति है जो बहिर्कुछ एकाग्रता के साथ संबद्ध । यह आंकड़ा सूर्य से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है, डी एट अल. शोर में कमी करने के लिए विधि नैनोकणों प्रकाश बिखरने कम आवर्धन अंधेरे क्षेत्र माइक्रोस्कोप दूर क्षेत्र छवियों में । विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान । ८८ (24), 12001-12005 (२०१६) । कॉपीराइट (२०१६) अमेरिकन केमिकल सोसायटी । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: DSM है एल्गोरिथ्म कमानों और outputs के योजनाबद्ध । इंगित चरण ImageJ से मूल आदेश का उपयोग करें और सभी इनपुट पैरामीटर्स ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस के माध्यम से प्रयोगों की आवश्यकताओं के अनुसार चयनित हैं । यह आंकड़ा सूर्य से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है, डी एट अल. शोर में कमी करने के लिए विधि नैनोकणों प्रकाश बिखरने कम आवर्धन अंधेरे क्षेत्र माइक्रोस्कोप दूर क्षेत्र छवियों में । विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान । ८८ (24), 12001-12005 (२०१६) । कॉपीराइट (२०१६) अमेरिकन केमिकल सोसायटी । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि nPES LMDFM छवियों और DSM उत्पादन डेटा । (A) एक npes परख के lmdfm छवि panc-1 exosomes की एकाग्रता ढाल का विश्लेषण और () इस स्लाइड से ऑप्टिकल सिग्नल और exosome एकाग्रता का रैखिक सहसंबंध (बाएं से दाएं: ०.२४, ०.३५६, ०.५३, ०.८०, १.२० Μg/μl प्रत्येक स्तंभ के लिए क्रमशः) । डेटा एक पियरसन सहसंबंध गुणांक R2 = ०.९९ के साथ माध्य ± SE, n = 6, के रूप में प्रस्तुत कर रहे है और प्रत्येक एकाग्रता की प्रतिकृति के लिए भिंनता के गुणांक ०.२ < । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: EphA2 के LMDFM संकेत+ exosomes के साथ और अग्नाशय के कैंसर के बिना रोगियों से सीरम में अलग है । एक विरोधी EphA2 कब्जा एंटीबॉडी (कैंसर से जुड़े) और एक विरोधी CD9 का पता लगाने एंटीबॉडी (जनरल exosome मार्कर) के साथ रोगियों के सीरम नमूनों में EphA2 + exosomes की एकाग्रता में एक महत्वपूर्ण अंतर का प्रदर्शन किया nPES द्वारा विश्लेषित सीरम नमूने के साथ और अग्नाशय के कैंसर के बिना (N = 7/ परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे है ± SE. * *p = ०.००२ द्वारा मान-Whitney U-टेस्ट (दो तरफा) । यह संख्या [Sun, D. एट अल. शोर में कमी विधि नैनोकणों प्रकाश बिखरने कम आवर्धन अंधेरे क्षेत्र माइक्रोस्कोप सुदूर क्षेत्र छवियों में करने के लिए संशोधित किया गया है । विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान । ८८ (24), 12001-12005 (२०१६)] । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

Exosomes बाहरी endosomes का एक विशेष सबसेट है कि बहुत्वीय निकायों का उत्पादन, के विनियमित invaginations से पैदा होता है कि इंट्राएल्युनियल पुटिकाओं की एक बड़ी संख्या है कि प्लाज्मा झिल्ली के साथ संलयन गुजरना परिपक्व जारी extracellular अंतरिक्ष में exosomes । इस बायोजेनेसिस मार्ग के कारण, exosomes झिल्ली के साथ जुड़े कारकों को ले जा सकता है कि शामिल या endosome झिल्ली के साथ फ्यूज, और साथ ही cytosolic घटकों के कई विभिंन प्रकार, और इस तरह प्रोटीन, डीएनए के कारगुजारियों शामिल और विभिन्न आरएनए उपप्रकार (एमआरएनएएस, माइक्रोनास, लंबे गैर कोडिंग rnas) कि20मूल के अपने सेल के फेनोटाइप को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । चूंकि exosomes सबसे अगर नहीं सभी प्रकार के सेल द्वारा स्रावित कर रहे हैं, रोगग्रस्त या घातक कोशिकाओं से वृद्धि हुई स्राव प्रदर्शन कर सकते हैं, और ज्यादातर शरीर के तरल पदार्थ में संचित, exosomes एक होनहार ंयूनतम के रूप में व्यापक और व्यवस्थित जांच का विषय है आक्रामक करने के लिए विशिष्ट रोग की स्थिति का पता लगाने और21उपचार के लिए उनकी प्रतिक्रियाओं की निगरानी का मतलब है ।

Exosome अलगाव है, जो सबसे वर्तमान exosome विश्लेषण के लिए आवश्यक है, एक लंबा और श्रम गहन प्रक्रिया है, exosome के नैदानिक अनुवाद सीमित संभावित चिकित्सा प्रासंगिकता के साथ biomarkers जुड़े । कई आम अलगाव की विधियां (ultracentrifugation, आकार-अपवर्जन, वर्षण, आदि) अक्सर exosomes (30-100 एनएम) माइक्रो-vesicles (100-1000 एनएम) और अपोप्तोटिक निकायों (100-5000 एनएम) से अपने आकार पर्वतमाला में overlaps के कारण या पर्याप्त अंतर नहीं है भौतिक गुण या exosome अखंडता15नुकसान हो सकता है । नए तरीकों के विकास के तहत कर रहे है कि और अधिक तेजी से exosome विश्लेषण की अनुमति हो सकती है, लेकिन यह स्पष्ट नहीं है कि यह कैसे संभव नैदानिक कारण सेटिंग्स में इन प्लेटफार्मों के कई को लागू करने के लिए हो सकता है ।

इस रिपोर्ट में, हम एक उपंयास दृष्टिकोण है कि नैनोकणों की अनुमति देता है वर्तमान उच्च throughput exosome कम इज़ाफ़ा डार्क फील्ड माइक्रोस्कोप छवियों का उपयोग प्रमात्रीकरण प्रस्तुत करते हैं । इस विधि exosome शुद्धि, महंगा समर्पित उपकरण, या उपंयास तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है और इस प्रकार सबसे अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग्स में तेजी से अनुवाद करने के लिए उत्तरदायी होना चाहिए. हमारे परख ठीक एक लक्ष्य exosome एक विशिष्ट biomarker असर जनसंख्या की एकाग्रता की मात्रा को लागू किया जा सकता है जब परख परिणाम एक मानक वक्र की तुलना में कर रहे हैं, के बाद से हमारे परिणाम प्रदर्शन वहां एक मजबूत रैखिक सहसंबंध है (R2 = ०.९९) ऑप्टिकल प्रतिक्रिया और exosome एकाग्रता के बीच । इस दृष्टिकोण की वास्तविक दुनिया की क्षमता प्रदर्शित करने के लिए, हम डेटा उपलब्ध कराई है, जहां हम इस विधि के साथ और बिना रोगियों से प्राप्त सीरम नमूनों में अग्नाशय के कैंसर के साथ जुड़े एक exosome biomarker की एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए अग्नाशय के कैंसर ।

LMDFM में, पूरा नमूना अच्छी तरह से चयन उच्च-आवर्धन DFM विश्लेषण, जहां उपयोगकर्ताओं को सीधे नमूना फ़ील्ड चुनने के लिए बाद में छवि विश्लेषण के लिए कब्जा करना चाहिए में पाया पूर्वाग्रह से बचने के लिए imaged है, लेकिन सतह से प्रकाश बिखरने कलाकृतियों के अधीन है खरोंच और नमूना मलबे सहित अनियमितताओं, । इस पृष्ठभूमि के लिए लक्ष्य exosome का पता लगाने के लिए कम किया जा सकता है-व्युत्पन्न हमारे DSM शोर कमी एल्गोरिथ्म का उपयोग संकेत है कि NIH छवि विश्लेषण कार्यक्रम, ImageJ पर चलाता है, लेकिन देखभाल अभी भी ऐसी कलाकृतियों जो की गतिशील रेंज को कम कर सकते हैं शुरू करने से बचने के लिए लिया जाना चाहिए परख ।

इस परख में प्रयुक्त सामग्री:

1 μL/well होल्डिंग मल्टी-वेल सुपरप्रोटीन ए/जी स्लाइड् स को आर्रॉयटी कारपोरेशन (AGMSM192BC) से खरीदा गया था । Nanopartz (C12 -650-TN-डीह-50-1, ६.४ x 1012/एमएल) से नैनोकणों प्राप्त किया गया । DFM छवियां एक Nikon DiR2 डिजिटल एक Nikon तिवारी के साथ संलग्न कैमरे के साथ कब्जा कर लिया गया-सूक्ष्मदर्शी ग्रहण, लगातार प्रकाश व्यवस्था और एक 1/220 एस जोखिम समय के साथ । इस स्टडी में इस्तेमाल होने वाली पैनसी-1 सेल लाइन को अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन से खरीदा गया था ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

काम मुख्य रूप से एनआईएच (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 और R21Al126361-01), एरिज़ोना जैव चिकित्सा अनुसंधान आयोग (ABRC) युवा अन्वेषक पुरस्कार द्वारा प्रदान की अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf Repeater stream Fisher Scientific 05-401-040
Eppendorf Research plus Eppendorf 3120000011 0.1 – 2.5 µL, dark gray
Functionalized Gold Nanorods Nanopartz C12-25-650-TN-DIH-50-1 In vitro neutravidin polymer functionalization
HulaMixer Sample Mixer Thermo Fisher Scientific 15920D
Incu-shaker 10L Benchmark Scientific H1010
Inverted Research Microscope Nikon Ti-DH With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage
NIS-Elements Nikon Microscope imaging software
Phosphate Buffered Saline (1X) GE Healthcare Life Sciences SH30256.02 HyClone
Protein A/G Treated Glass Substrate Slides Arrayit Corp. AGMSM192BC Premium microarray substrate
Q500 Sonicator Qsonica, LLC Q500-110 With standard probe (#4220)
Superblock blocking buffer Thermo Scientific
TWEEN 20 Sigma Life Sciences 9005-64-5

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References

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