Verwendung von Nanoplasmon-Enhanced Scattering und Low-Magnification Microscope Imaging zur Quantifizierung von Tumor-Derivate-Exosomen

Bioengineering
 

Summary

Die klinische Übersetzung von exosominierten Biomarkern für kranke und bösartige Zellen wird durch das Fehlen schneller und präziser Quantifizierungsmethoden behindert. Dieser Bericht beschreibt den Einsatz von Mikroskop-Bildern mit geringer Vergrößerung im Dunkelfeld, um bestimmte exotische Subtypen in kleinen Volume-Serum-oder Plasmaproben zu quantifizieren.

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Wan, M., Amrollahi, P., Sun, D., Lyon, C., Hu, T. Y. Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes. J. Vis. Exp. (147), e59177, doi:10.3791/59177 (2019).

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Abstract

Infizierte oder bösartige Zellen scheiden häufig weitere Exosome aus, was zu einem erhöhten Gehalt an krankheitsbedingten Exosomen im Kreislauf führt. Diese Exosomen haben das Potenzial, als Biomarker für die Krankheitsdiagnose zu dienen und den Verlauf und die Behandlung von Krankheiten zu überwachen. Die meisten exotischen Analyseverfahren erfordern jedoch exotische Isolations-und Reinigungsschritte, die in der Regel zeit-und arbeitsintensiv sind und daher in klinischen Umgebungen von begrenztem Nutzen sind. Dieser Bericht beschreibt ein schnelles Verfahren zur Analyse bestimmter Biomarker an der äußeren Membran von Exosomen, ohne dass separate Isolations-und Reinigungsschritte erforderlich sind. Bei dieser Methode werden Exosomen auf der Oberfläche eines Dias von exosomspezifischen Antikörpern erfasst und dann mit nanopartikulierten Antikörper-Sonden, die für eine Krankheit spezifisch sind, hybridiert. Nach der Hybridisierung wird die Fülle der zielexotischen Population durch die Analyse von Bildern des gebundenen Nanopartikels mit geringer Vergrößerung des Dunkelfeldes (LMDFM) bestimmt. Dieser Ansatz lässt sich für die Forschung und den klinischen Einsatz leicht anwenden, um membranassoziierte Exosomenbiomarker im Zusammenhang mit Krankheiten zu analysieren.

Introduction

Exosome werden von den meisten Zelltypen freigesetzt und spielen eine Schlüsselrolle in der Zellkommunikation, einschließlich pathophysiologischer Prozesse, die mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden, da sie für bestimmte Gewebe oder Zelltypen beheimatet sein können und eine Vielzahl von Nukleinsäuren enthalten. Proteine und Lipide, die ihre Ursprungszelle reflektieren und regulatorische Auswirkungen auf ihre Empfängerzellen 1,2,3,4 ausüben können. Exosome werden oft in höheren Lagen in Krankheitszuständen ausgeschieden, können sowohl mit benachbarten als auch mit entfernten Zellen interagieren und werden bei relativ hoher Konzentration im Kreislauf sowie bei den meisten anderen Körperflüssigkeiten, einschließlich Speichel, Urin, Bauchspeicheldrüse und Galle gefunden. Saft und Bronchoalveolare Lavageflüssigkeit5,6, 7, 8, 9,10, 11. Diese Fülle und Stabilität von Exosomen in menschlichen Körperflüssigkeiten, gepaart mit ihrer informationsreichen Natur, macht sie zu idealen Biomarkern für die Krankheitsdiagnose und Behandlungsüberwachung.

Dazu gehören tumorabgeleitete Exosomen (TDEs), die tumorspezifische oder selektive Faktoren enthalten, die als Krankheitserreger dienen können, darunter tumorassoziierte Mutantenallele. TDEs können an der Umgestaltung der Tumormikroumgebung teilnehmen, um die Tumorentwicklung und Metastasen zu erleichtern, und die Anti-Tumor-Reaktionen zu regulieren 12. Die erhöhte TDE-Sekretion ist ein häufiges Phenotyp der meisten Krebserkrankungen und mehrere Merkmale der Tumor-Mikroumgebung, einschließlich Hypoxie, saurer pH-Wert und Entzündungen, sind dafür bekannt, exosome secretion zu fördern. Überraschenderweise kann sich angesichts der Anzahl der Zellen, die Exosome abscheiden, ein Anstieg des Gesamt-Exosomensäveaus als Biomarker für Krebs selbst fungieren. So hat eine aktuelle Studie herausgefunden, dass die gesamte EV-Konzentration im Gallensaft bösartig und nicht bösartig bei den gängigen Gallengang Stenose-Patienten mit 100% Genauigkeitunterscheidet. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Studien mit anderen Körperflüssigkeiten, darunter Plasma, gefunden. Aufgrund des Potenzials für Subjektvarianten und anderer verwirrender Faktoren haben sich die meisten Studien, die Exosome als Biomarker von Krankheiten untersuchen, auf die Erkennung von Biomarkern konzentriert, die selektiv mit TDEs in Verbindung gebracht werden, anstatt mit totalen Exosomenfaktoren. Zahlen.

Die Umsetzung exotischer Biomarker in die klinische Praxis ist jedoch nach wie vor eine Herausforderung, da die meisten berichteten exotischen Assay-Ansätze zeitaufwändige und arbeitsintensive Isolationsverfahren 13 erfordern. Zur Zeit sind die populären exotischen Isolationsmethoden Ultrazentrifugation, Dichtegradienten, Größenausschluss, Co-Niederschlag, Affinitätsaufnahme und mikrofluidische Isolationsansätze. Ultrazentrifugation ist die "Goldstandard"-Methode, und wird am häufigsten für exotische Isolationen verwendet, aber diese Prozedur ist zeitaufwendig und führt zu exotischen Schäden und exotischen Membranhäuschen, und produziert exotische Proben, die mit Proteine, Lipoproteine und andere Faktoren, die die nachfolgenden Analysen beeinflussen können14. Die meisten exotischen Methoden, einschließlich der Ultrakentrifugation, können die Exosomen (30 – 150 nm) nicht von Mikrovesikeln (100 – 1000 nm) und apoptotischen Körpern (100 – 5000 nm) trennen, die durch unterschiedliche Mechanismen entstehen und aufgrund der Größe unterschiedliche Funktionen haben. Überschneidungen zwischen diesen Gruppen,und die Vielfalt der exotischen Populationen 15. Neue Ansätze sind notwendig, um die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit exotischer Assays zu verbessern, indem die exosomische Erholung verbessert wird und gleichzeitig exosomische Schäden und Verunreinigungen verringert werden, obwohl alle auf solchen Methoden basierenden Assays ebenfalls optimiert werden müssen, um sie zu erhalten. Für die Übersetzung in Anwendungen in klinischen Umgebungen geeignet.

Mehrere aktuelle Studien haben vorgeschlagen, integrierte Plattformen zu nutzen, um Exosomen direkt aus Körperflüssigkeiten zu erfassen und zu analysieren. Diese Methoden verwenden mikrofluidische, elektrokinetische, Affinitätsaufnahme und verschiedene andere Methoden zur Exosomenisolierung und Elektrochemie, Oberflächenplasmonresonanz und andere Methoden, um gefangene Exosome zu erkennen. Es ist nicht klar, wie machbar viele dieser Ansätze in klinischen Umgebungen sein werden, aufgrund ihrer Komplexität, Kosten, Tiefststände oder anderer Probleme.

Wir haben einen schnellen und kostengünstigen Test entwickelt, der für die sensible und spezifische Quantifizierung von Gesamtexosomen und spezifischen exotischen Subtypen, einschließlich krankheitsbedingter Exosomen, wie TDEs, verwendet werden kann, die nur eine geringe Anzahl von Proben erfordern und die Mit einem schlanken Workflow, der für klinische Umgebungen geeignet ist. In diesem Test wird eine Folie mit Antikörpern beschichtet, die entweder einen exosomartigen oder krankheitsspezifischen Marker binden, der auf der exotischen Oberfläche ausgedrückt wird, um Zielexosomen, die in kleinen Plasma-oder Serumproben enthalten sind, die auf Brunnen auf dem schlittern. Gefangene Exosome werden dann mit einem antikörperkonjugierten Nanopartikel hybridiert, der den Biomarker erkennt, der auf diesen Exosomen von Interesse ist, der entweder ein allgemeiner exotischer Marker oder ein spezifischer Faktor für eine exotische Unterart von Interesse sein kann. Die Bilder dieser Probenbrunnen werden dann mit Hilfe eines Dunkelfeldmikroskops (DFM) erfasst und analysiert, um das Licht zu messen, das von Nanopartikeln verstreut wird, die an Exosomen von Interesse gebunden sind, die in jeder Probeerfasstwerden, gut 6,16,17. Insbesondere verhindert die Abbildung einer ganzen Probe durch die Low-Vergrößerung DFM (LMDFM) eine Selektionsneigung, die bei DFM-Analysen mit hoher Vergrößerung auftritt, wenn der Anwender direkt wählen muss, welche Felder für die anschließende Bildanalyse erfasst werden sollen. Die LMDFM-Bildanalyse unterliegt leichten Streuungsartefakten aus Oberflächenunregelmäßigkeiten, einschließlich Kratzern und Probenschutt, aber dieser Hintergrund kann mit einem einfachen Geräuschminderungsalgorithmus reduziert werden, den wir entwickelt haben, um auf dem NIH-Bildanalyseprogramm zu arbeiten, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Dieser Algorithmus wendet zunächst eine Eingangskonturschwelle an, mit der die Grenzen des Musters gut erkannt werden, um den Bereich des Bildes für die spätere Analyse zu definieren. Die Region, die durch diese Konturregion definiert wird, wird dann aufgeteilt, um das Signal zu trennen, das in den roten, blauen und grünen Kanälen des Bildes vorhanden ist, und der blaue Kanal wird vom roten Kanal abgezogen, um das Signal zu entfernen, das aus Oberflächenartefakten und ungleichmäßiger Beleuchtung aus Nanorod entsteht. signal.

Dieser Artikel beschreibt, wie man diesen Test benutzt, um in Plasma-oder Serumproben schnell entweder vollständige oder spezifische Exosomen-Levels zu quantifizieren.

Protocol

1. Zubereitung von Nanopartikelsonden

NOTE: Dieser Test verwendet funktionalisierte Gold-Nanorods (AuNRs; 25 nm Durchmesser x 71 nm Länge), die mit Neutravidin-Polymeren (AV) kovalent zusammengeführt werden und einen Oberflächen-Plasmon-Resonanzgipfel haben, der ein rotes Streusignal auf DFM erzeugt (641 nm Spitze) beleuchtung.

  1. 40 μL AuNR-AV (2,56 x 10 11 Partikel ) dreimal mit 200 μL PBS (pH 7,0) durch Zentrifugation und Aspiration waschen (8.500 x g bei 4 ° C für 10 Minuten), gefolgt von einem abschließenden Zentrifugations-und Aspirationsschritt, nach dem das AuNR-AV-Pellet aufgehängt wird. In 40 μL PBS.
  2. Mischen Sie diese AuNR-AV-Federung mit 10 μL Biotinylierung Antikörper (0,5 mg/mL) spezifisch für ein Antigen auf der Oberfläche des exochen Subtyps von Interesse und 150 μL von PBS und mischen Sie dann bei 4 ° C für 2 h mit einem Mixer, um Neutravidin-Bioin-Bindung zu ermöglichen, um zu vollenden.
  3. Die daraus resultierenden antikörperkonjugierten AuNRs (AuNR-IgG) dreimal durch Zentrifugation und Aspiration waschen (6.500 x g bei 4 ° C für 10 Minuten), und dann in 200 μL PBS aussetzen und bis zum Einsatz bei 4 ° C lagern.
    Hinweis: Sterile Technik und kurze Lagerzeiten müssen verwendet werden, um Verunreinigungen und Degradierung des AuNR-IgG zu vermeiden. Am besten ist es, antikantikokonjugierte AuNRs innerhalb von 24 Stunden nach ihrer Konjugation zu verwenden.

2. Vorbereitung von EV-Auffangengleiten

  1. Dilute ausgewählte exotische Erfassung-Antikörper zu 0,25 mg/mL in PBS und fügen 1 μL/von dieser Verdünnung auf eine Multi-well-Protein A/G-Folie, und dann inkubieren Sie diese Folie bei 37 ° C für 1 h in einer befeuchteten Kammer, um Erfassung Antibody Bindung an Protein A/G immobilisiert auf Die Rutsche.
  2. Aspirate Brunnen, um ungebundene Antikörper zu entfernen, und waschen Brunnen dreimal durch die Zugabe und Aspiration von 1 μL/gut von PBS, dann laden Sie jeden Brunnen mit 1 μL Blockpuffer (siehe Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie die Rutsche für 2 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer zu b Sperren Sie alle verbleibenden Eiweißbindungsplätze.
  3. Aspirieren Sie Brunnen, um Blockpuffer zu entfernen, waschen Sie Brunnen dreimal durch die Zugabe und das Aspiration von 1 μL/well von PBS, und verwenden Sie sofort die blockierten Dias für exotische Erfassung und Analyse.

3. Standardkurvenvorbereitung

  1. Um die absolute oder relative Fülle eines bestimmten exotischen Subtyps genau zu quantifizieren, muss der Benutzer eine Standardkurve mit einer reinen exotischen Bevölkerung erzeugen, die den exotischen Oberflächenbiomarker von Interesse einheitlich ausdrückt. In dieser Studie wird die Fülle von Exosomen analysiert, die ein metasisisassoziiertes Membranprotein, den Ephrin A2-Rezeptor, ausdrücken, das eine gemeldete Beziehung zum Stadium der Bauchspeicheldrüsenkrebs und der Prognose6,18hat.
    Hinweis: Die menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinie PANC-1 und ihre Exosomen sind dafür bekannt, dieses Protein auszudrücken, und isolierte Exosomen aus dieser Zelllinie wurden verwendet, um eine Standardkurve zu erzeugen, um die Anzahl der Exosomen zu quantifizieren, die dieses Protein in komplexen Exosome ausdrücken. Proben.
  2. Kulturzellen für 48 Stunden bei 37 ° C in serumfreien Kulturmedien, um eine exoische Anhäufung in den Medien zu ermöglichen, dann isolieren Sie Zellkultur-Supernatanten durch Zentrifugation von Suspendierungskulturen oder direktes Streben von Kulturmedien aus anhaftenden Zellkulturen.
  3. Zentrifuge die gesammelten Medien bei 2000 x g für 30 min, um Schmutz zu entfernen und den Supernatant wiederherzustellen.
  4. Filtern Sie das geklärte Kultur supernatant durch eine 0,45 μm niedrige Proteinbindungsfiltereinheit mit entsprechender Kapazität (z.B. eine 250 ml Polyethersulfon-Vakuumfiltrationseinheit).
  5. Konzentrieren Sie das daraus resultierende Filtrat durch Zentrifugation auf 3200 x g mit einem 100.000 nominalen molekularen Gewichtsgrenzen-Filtersystem auf ein Endvolumen von 250 μL. Sammeln Sie das zurückbehaltene Volumen aus diesem Filter, waschen Sie dann den Filter mit 200 μL PBS und kombinieren Sie dieses Waschvolumen mit dem gesammelten exotischen Probenvolumen.
  6. Zentrifuge diese Probe bei 21.000 x g für 45 Minuten und vorsichtig wieder die Supernatant, wobei darauf zu achten, dass kein ausgehängtes Material zu sammeln.
  7. Zentrifuge die wiedergewonnene Supernatant auf 100.000 x g für 3 Stunden, um die Exosomen zu überstürzen. Den Supernatanten wegspinnen und das exotische Pellet in 100 μL PBS sammeln.
  8. Speichern Sie die daraus resultierenden exotischen Aufhängungen bei 4 ° C, wenn sie innerhalb von 24 Stunden oder bei-80 ° C für eine langfristige Lagerung verwendet werden.
    Hinweis: Geben Sie exomanen Proben nicht der Wiederholung von Gefrier-Taugezyklen.
  9. Quantifizieren Sie einen Aliquot der exotischen Aufhängung nach dem Mischen durch direkte Messung exotischer Zahlen (z.B. durch Nanopartikel-Tracking-Analyse oder tausenlose resistive Pulsmessung oder durch Messung der Proteinkonzentration exotischer Lysate durch mikrobiinchoninische Säurehatschay oder eine gleichwertige Methode,alsMittel zur Annäherung der exotischen Menge)16,19.
  10. Generieren Sie eine Reihe von seriellen Verdünnungen der exotischen Aufhängung, um den Vergleich von Nanopartikel-Signalen zu ermöglichen, um exosomere Anzahl oder Proteingehalt einzugeben.
  11. Übertragen Sie 1 μL jedes exotischen Standards auf jeden seiner Replikationsbrunnen auf der Assay-Platte.
    Hinweis: Standard-Kurven können verwendet werden, um die Neigung der Korrelationslinie zwischen Nanopartikel-Signal und exotischer Konzentration auf (1) zu berechnen, die Assay-Performance zu bewerten und (2) die relative Konzentration von Zielexosomen in experimentellen Proben zu bestimmen.

4. Verarbeitung von menschlichen Plasma-oder Serumproben

  1. Sammeln Sie Plasma-oder Serumproben nach Standardmethoden und lagern Sie bei-80 ° C, bis sie für eine exosomische Analyse benötigt werden. Schnell Tauben Proben in einem Raum Temperatur Wasserbad. Immer wieder vermischen die aufgetauten Proben durch Umkehrung, um eine homogene Aufhängung zu fördern.
    Hinweis: Die Ergebnisse von Serum-und Plasmaproben können nicht gleichwertig sein, da es während der Gerinnungsreaktion eine signifikante Freisetzung von Exosomen gibt.
  2. Zentrifugenplasma-oder Serumproben in 500 x g für 15 min, um Proteinaggregate und andere Trümmer zu verpuben. Übertragen Sie einen Aliquot der Plasma-oder Serumprobe auf ein frisches Rohr und fügen Sie PBS hinzu, um eine 1:1-Verdünnung zu erzeugen. Die verdünnte Probe gegebenenfalls durch sanftes Wirbeln oder Umkehrung vermischen. Übertragen Sie 1 μL jeder Plasma-oder Serumaufhängung auf jeden seiner Replikatbrunnen auf der Assay-Platte.

5. Exosome capture and detection

  1. Ladebrunnen eines blockierten EV-Auffangroutschs mit 1 μL/Wellt exotischer Probe, die 8 Replikate pro Probe verwendet, und die Folie über Nacht bei 4 ° C in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Aspirieren Sie alle Probenbrunnen und fügen Sie dann 1 μL/PBS hinzu, um Brunnen zu waschen und ungebundene Exosomen und andere Verunreinigungen aus der geladenen exotischen Probe zu entfernen.
  2. Lastprobenbrunnen mit 1 μL/Wells einer zuvor vorbereiteten AuNR-IgG-Federung (siehe Abschnitt 1 oben) und Inkubat der Rutsche für 2 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer. Aspirieren Sie die Nanopartikel-Lösung und waschen Sie die Folie in PBS mit einem Mixer um 10 Minuten um 0,01% Tween-20 (PBST), dann saugen und waschen Sie alle Probenbrunnen mit deionisiertem Wasser für 10 Minuten mit einem rotierenden Mixer und luftrockenen für nachfolgende LMDFM-Bilder.
    Hinweis: Inter-Assay-Koeffizienten von Variation (Lebensläufe) werden aus acht Replikaten derselben Probe bewertet. Proben, die Lebensläufe und gt;20% aufweisen, gelten als nicht informativ und sollten wiederholt werden, wenn genügend Muster vorhanden ist.

6. DFM Image Capture

  1. Mit einer Digitalkamera, die mit einem Dunkelfeldkondensator (1.2 < NA < 1,4) und einem 4x-Objektiv mit einer Ein-40s-Belichtungszeit ausgestattet ist, können Bilder zur Exothisierung unter konsistenter Beleuchtung erfasst werden.
  2. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware.
    Hinweis: Wir verwenden für das unten beschriebene Protokoll die Mikroskop-Bildgebungssoftware NIS-Elements (siehe Materialtabelle), aber es ist möglich, eine andere Software zu verwenden, die mit den Parameter der Bildaufnahme übereinstimmen kann. Die Software NIS-Elements Viewer ist ein kostenloses, eigenständiges Programm, um Bilddateien und Datensätze zu sehen, die Analyse-, Visualisierungs-und Archivierungswerkzeuge enthalten. Die folgenden Parameter sind auch für ein Mikroskop mit Autofokus und ein automatisiertes Stadium, das es ermöglicht, mehrere Bilder automatisch zu erfassen und in einem Bild zu nähen.
  3. Legen Sie die Folie auf die Mikroskop-Stufe, stellen Sie die Rutschposition ein und tragen Sie einen kleinen Tropfen Tauchöl auf die Rückseite der Folie auf, wo die Kondensatorlinse mit der Folie in Kontakt kommt.
  4. Klicken Sie auf den Live-Button in der Software-Schnittstelle und passen Sie die Belichtungszeit an einen hohen Konzentrationsstandard an, um sicherzustellen, dass das Bild nicht gesättigt ist.
  5. Öffnen Sie das Fenster "Scan-Großbildlscheibe" aus dem Reiter "Acquire " und setzen Sie die Parameter der Software-Schnittstelle wie folgt: Macro Image Optical conf = Strom; Ziel: 2:10x, Scanning Optical conf = current, Ziel: 2:10x; Nähen Überlappen = 20%; Nähen über = Optimaler Weg.
  6. Wählen Sie Großbild erstellen, aktiven Verschluss während der Bühnenbewegungschließen , vor jeder Aufnahme warten: 20 ms, konzentrieren Sie sich manuell beim Start, und verwenden Sie Schritt für Schritt Fokus alle 20 Felder. Diese Einstellung wird mit den gescannten Bildern gespeichert.
  7. Bewegen Sie das Mikroskop-Stadium, um die linke obere untere Grenze des Zielscan-Feldes zu definieren. Passen Sie den Fokus an, um ein klares Bild auf dem Monitor zu erreichen und die Kondensatoreinstellungen und die Umgebungsbeleuchtung anzupassen, um etwaige Lichtunregelmäßigkeiten im fokussierten Bild zu minimieren.
  8. Nennen Sie die Bildausgabedatei in der Software. Klicken Sie auf die Scan-Knopf und lassen Sie das Mikroskop scannen und speichern Sie ein genähtes Bild des gesamten Dias.
  9. Öffnen Sie das gespeicherte Bild mit der Bildaufzeichnungssoftware, die Sie verwenden, und speichern Sie es auf der Eing-8 für die anschließende Analyse auf dem DSM-Plugin in ImageJ.

7. DFM Bildanalyse

  1. Laden Sie das ImageJ-Programm (https://imagej.nih.gov/ij/) herunter. Installieren Sie das DSM-Algorithmus-Plugin in ImageJ mit den Anweisungen, die auf https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually aufgeführt sind.
  2. Öffnen Sie die ImageJ-Software und setzen Sie dann die folgenden Eingabeparameter innerhalb des DSM-Algorithmus : Contour-Schwelle (Ct) = 253.020, Typ = Rot, Center-Skala (S) = 0,8, Low (Lt)/High (Ht) Quantifizierungsgrenze = 0/62.
  3. Öffnen Sie das gespeicherte Bild aus Abschnitt 6.8 mit ImageJ. Wählen Sie den DSM-Scan-Button aus dem Registerkarte Plugins, dann legen Sie die Anzahl der Spalten und Zeilen nach dem geöffneten Bild fest. Das Programm kann die Erkennungsbereiche erkennen und die Streuungsintensität von Nanopartikeln in den entsprechenden Bereichen automatisch analysieren. Stellen Sie die folgenden Eingangsparameter im DSM-Scan-Fenster ein: Prozentsatz = 25, Spot Durchmesser (in Pixel) = 190 – 200, Durchmesser = 32, Unteruntermessern ( in Pixel) = 8, DSM-Konfiguration-Low Limit = 0, High Limit = 62, Adjacent Distance = 100, Subtract Bias = 0.
    Hinweis: Die Ergebnisse der Streuintensität von Nanopartikeln spiegeln die Menge der gebundenen Exosomen auf dem Dia wider.

Representative Results

Das Multi-well-Protein A/G-beschichtete Dias (Abbildung 1A) wurde mit Anti-EphA2-Antikörper funktionalisiert und dann zur gezielten Erfassung von EphA2-positiven Exosomen aus Serumproben von Patienten mit und ohne Bauchspeicheldrüsenkrebs (1 μL/well) eingesetzt und inkubiert Mit goldenen Nanoroden, die mit einem Anti-CD9-Antikörper konjugiert werden (Abbildung 1B). DFM-Lichtbilder, die aus diesen Nanopartikeln gestreut wurden, wurden mit dem DSM-Plugin in der ImageJ-Software analysiert, um die gebundenen EphA-2-positiven Exosomen in jedem Brunnen zu quantifizieren. Der DSM-Algorithmus definiert automatisch die Grenze eines Musterbrunnens, filtert das Rauschen von Artefakten, berechnet das verstreute Signal aus jedem Brunnen und gibt diese Informationen aus (Abbildung2). Der DSM-Algorithmus dämpft die in der Probe vorhandenen Lichtstreuungsgegenstände stark von Kratzern oder Schutt und verbessert die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der Nanopartikelerkennung und kann automatisch eine Reihe von Dia-Bildern für Hochdurchsatz verarbeiten. benutzen. Dieser Algorithmus verwendet ImageJ-Befehle und Parametereingabe des Benutzers, um den Bildhintergrund zu subtrahieren, das Streusignal aus jedem Brunnen zu berechnen und eine Daten-und Bilddatei auszugeben (Abbildung3). Die Interessensgebiete werden durch die hohen Intensitätsgrenzen im Erfassungsbild mit der Konturwellenfunktion des ImageJ-Makro-Programms definiert. Bildanalysen verwenden eine vordefinierte Konturschwelle und Bildparameter, um die Intensität der Nanopartikelstreuung für jeden Brunnen zu berechnen.

Wie in unserer bisherigen Arbeit berichtet (ergänzende Informationen von Liang etal. 6), Exponate isoliert von PANC-1-Zellkulturen, die durch Transmissionselektronenmikroskopie und Western Blot gekennzeichnet sind, zeigten die Größe, Morphologie und Proteinmarker Ausdruck im Einklang mit einer hohen Reinheit exosome Probe. Die PANC-1-Exosomen, die mit dem gleichen Verfahren wie unsere bisherige Arbeit vorbereitet wurden, wurden hier verwendet, um unseren nPES-Test für die Exosomenquantifizierung zu validieren. Dieser Test benutzte einen Anti-EphA2-Antikörper, um eine große Population von Exosomen aus der gesamten exotischen Population und einen Antikörper gegen das allgemeine Exosomenprotein CD9 zu erfassen, um gefangene Exosomen zu entdecken. Die Ergebnisse, die mit seriell verdünnten PANC-1-Exosomentproben mit Proteinkonzentrationen zwischen 0,24 und 1,2 μg/μL erzielt wurden, zeigten eine gute Reproduzierbarkeit in Replikationsbrunnen (Abbildung 4A) und eine starke lineare Korrelation zwischen der Streureaktion und Exosome Proteinkonzentration (Abbildung 4B).

Um die mögliche Anwendung dieser Methode zu demonstrieren, wurden Serumproben von Patienten mit und ohne Bauchspeicheldrüsenkrebs analysiert, um die Fülle von Serumexosomen zu erkennen, die den krebskranken Biomarker EphA2 mit einem Anti-EphA2-Antikörper gegen Die direkte Erfassung von Tarnexosomen aus Serum und Nanopartikeln, die mit einem Anti-CD9-Antikörper konjugiert werden, um gebundene Exosomen zu erkennen. Diese Analyse ergab, dass Serumproben der Bauchspeicheldrüsenkrebspatienten einen signifikant höheren Gehalt an EphA2+-Exosomen (Abbildung 5) hatten als ihre Kontrollen.

Figure 1
Abbildung 1: Exosome Quantifizierung Schema. A) Schematik des Multikuldieins A/G-Folien (192 Brunnen), das in diesem Test verwendet wird. (B) Zielexosomen werden direkt aus Proben, einschließlich Serum und Plasma, durch Oberflächenimmobilisierung auf dem an das Dia gebundenen Antikörper (z.B. Anti-EphA2-Antikörper) erfasst und dann mit goldenen Nanorods inkubiert, die mit einem Nachweis konjugiert werden. Antikörper (z.B. Anti-CD9-Antikörper) vor der Analyse durch DFM-Bildanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Exosomische Quantifizierung durch Anwendung des DSM-Algorithmus auf LMDFM-Bilder. Mit dem DSM-Algorithmus werden Bilder mit geringer Vergrößerung verarbeitet, um Hintergrundsignal-und Signalartefakte zu eliminieren, die sich aus Kratzern, Mischvöten, Schutt und ungleichmäßiger Probenbeleuchtung ergeben können, um eine robuste Erkennung von Goldnanorox-Signalen zu ermöglichen, die Korporiert mit exotischer Konzentration. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von Sun, D. et al. Noise Reduction Method für die Quantifizierung von Nanopartikel-Lichtschranken in der niedrigen Vergrößerung der Dunkelfeldmikroskop Far-Field Images angepasst. Analytische Chemie. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Befehle und Ausgänge des DSM-Algorithmus. Die angegebenen Schritte verwenden native Befehle von ImageJ und alle Eingabeparameter werden nach den Anforderungen von Experimenten über die grafische Benutzeroberfläche ausgewählt. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von Sun, D. et al. Noise Reduction Method für die Quantifizierung von Nanopartikel-Lichtschranken in der niedrigen Vergrößerung der Dunkelfeldmikroskop Far-Field Images angepasst. Analytische Chemie. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative nPES LMDFM-Bilder und DSM-Ausgabedaten. (A) LMDFM-Bild eines nPES-Assays, der einen Konzentrationsgradienten von PANC-1-Exosomen analysiertund (B) die lineare Korrelation des optischen Signals und die exotische Konzentration von diesem Dia (von links nach rechts: 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 μg/μL) jeweils für jede Spalte). Die Daten werden als Mean ± SE, n=6, mit einem Pearson-Korrelationskoeffizienten R2 = 0,99 und einem Variationskoeffizienten für die Replikate jeder Konzentration < 0,2 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: LMDFM-Signal von EphA2+ -Exosomen unterscheidet sich im Serum von Patienten mit und ohne Bauchspeicheldrüsenkrebs. Serumproben, die von nPES mit einem Antikörper mit Anti-EphA2-Erfassungs-Erkrankung (krebserregend) und einem Anti-CD9-Detektionsantikörper (allgemeiner Exosomenmarker) analysiert wurden, zeigten einen signifikanten Unterschied in der Konzentration von EphA2+-Exosomen bei Serumproben von Patienten mit und Ohne Bauchspeicheldrüsenkrebs (N = 7/Gruppe). Die Ergebnisse werden als Mean ± SE dargestellt. * * p = 0.002 von Mann-Whitney U-test (beidseitig). Diese Figur wurde von [Sun, D. et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Analytische Chemie. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Exosomen entstehen durch regulierte invaginisierender invaginierender der äußeren endosomischen Membran, die multivesiculäre Körper produzieren, eine spezialisierte Untergruppe von Endosomen, die eine große Anzahl von intraluminalen Bläschen enthalten, die sich mit der Plasmamembran vereinigen, um reifen zu lassen. Exkodem in den extrazellulären Raum. Aufgrund dieses Biogenese-Weges können Exosome membrangebundene Faktoren tragen, die mit Membranfraktionen in Verbindung gebracht werden, die mit der endosomischen Membran bestehen oder verschmelzen, sowie mehrere verschiedene Arten von zytosoolischen Komponenten, und somit Ladungen von Proteinen enthalten, DNA Und verschiedene RNA-Subtypen (mRNAs, microRNAs, lange nicht-kodierende RNAs), die den Phenotyp ihrer Ursprungszelle 20 reflektieren können. Da Exosomen von den meisten, wenn nicht sogar von allen Zelltypen ausgeschieden werden, eine erhöhte Sekretion von kranken oder bösartigen Zellen aufweisen und sich in den meisten Körperflüssigkeiten ansammeln, sind Exosomen Gegenstand umfassender und systematischer Untersuchungen als vielversprechende minimale invasive Mittel, um bestimmte Krankheitszustände zu erkennen und ihre Reaktionen auf die Behandlung21zu überwachen.

Exosomische Isolierung, die für die meisten aktuellen exotischen Analysen erforderlich ist, ist ein langwieriges und arbeitsintensives Verfahren, das die klinische Übersetzung von exosomassoziierten Biomarkern mit potenzieller medizinischer Relevanz einschränkt. Viele gängige Isolationsmethoden (Ultrazentrifugation, Größenausschluss, Niederschlag, etc.) unterscheiden Exosomen (30 – 100 nm) oft nicht ausreichend von Mikro-Vesikeln (100 – 1000 nm) und apoptotischen Körpern (100 – 5000 nm) aufgrund von Überlappungen in ihren Größenbereichen oder Leibestialt oder kann die exotische Integrität15beschädigen. Es sind neue Ansätze in der Entwicklung, die eine schnellere Exosomenanalyse ermöglichen könnten, aber es ist nicht klar, wie machbar es sein könnte, viele dieser Plattformen in klinischen Umgebungen durchzuführen.

In diesem Bericht stellen wir einen neuartigen Ansatz vor, der eine Nanopartikel-basierte Exozialquantifizierung mit Hilfe von Bildern mit geringer Vergrößerung des Dunkelfeldes ermöglicht. Diese Methode erfordert keine Exosomenreinigung, teure Spezialgeräte oder neuartiges technisches Know-how und sollte daher in den meisten forschenden und klinischen Umgebungen schnell übersetzt werden können. Unser Test kann angewendet werden, um die Konzentration einer zielexotischen Population mit einem bestimmten Biomarker genau zu quantifizieren, wenn die Untersuchungsergebnisse mit einer Standardkurve verglichen werden, da unsere Ergebnisse zeigen, dass es eine starke lineare Korrelation gibt (R2 = 0,99). Zwischen optischer Reaktion und exotischer Konzentration. Um das reale Potenzial dieses Ansatzes zu demonstrieren, haben wir Daten zur Verfügung gestellt, auf denen wir mit dieser Methode die Konzentration eines exotischen Biomarkers im Zusammenhang mit Bauchspeicheldrüsenkrebs in Serumproben quantifizieren, die von Patienten mit und ohne gewonnen wurden. Bauchspeicheldrüsenkrebs.

In LMDFM wird der gesamte Musterbrunnen abgebildet, um die Selektionsneigung zu vermeiden, die in hochvergrößernden DFM-Analysen zu finden ist, bei denen der Anwender die Musterfelder direkt auswählen muss, um sie für die anschließende Bildanalyse zu erfassen, aber von der Oberfläche aus leichten Streuungsartefakten unterworfen ist. Unregelmäßigkeiten, darunter Kratzer und Probenschrott. Dieser Hintergrund kann reduziert werden, um zielgerichtete exosom-abgeleitete Signale zu erkennen, indem wir unseren DSM-Geräuschminderungsalgorithmus verwenden, der auf dem NIH-Bildanalyseprogramm ImageJ läuft, aber es muss immer noch darauf geachtet werden, dass solche Artefakte nicht eingeführt werden, die den dynamischen Bereich der Die Ansagen.

Materialien, die in diesem Test verwendet werden:

Die SuperProtein A/G-Dias mit 1 μL/gut wurden von der Arrayit Corporation (AGMSM192BC) gekauft. Nanopartikel wurden von Nanopartz (C12-25-650-TN-DIH-50-1, 6.4 x 1012/mL) gewonnen. Die DFM-Bilder wurden mit einer Nikon DiR2 Digitalkamera aufgenommen, die an einem Nikon-Ti-Eclipse-Mikroskop befestigt ist, mit konsistenter Beleuchtung und einer Ein-14-Sichtungszeit. Die in dieser Studie verwendete Zelllinie PANC-1 wurde von der American Type Culture Collection erworben.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Unterstützt wurde die Arbeit in erster Linie durch Forschungsmittel des NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 und R21Al126361-01), der Arizona Biomedical Research Commission (ABRC), der Nachwuchsforschungshinweise der Arizona Biomedical Research Commission (ABRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf Repeater stream Fisher Scientific 05-401-040
Eppendorf Research plus Eppendorf 3120000011 0.1 – 2.5 µL, dark gray
Functionalized Gold Nanorods Nanopartz C12-25-650-TN-DIH-50-1 In vitro neutravidin polymer functionalization
HulaMixer Sample Mixer Thermo Fisher Scientific 15920D
Incu-shaker 10L Benchmark Scientific H1010
Inverted Research Microscope Nikon Ti-DH With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage
NIS-Elements Nikon Microscope imaging software
Phosphate Buffered Saline (1X) GE Healthcare Life Sciences SH30256.02 HyClone
Protein A/G Treated Glass Substrate Slides Arrayit Corp. AGMSM192BC Premium microarray substrate
Q500 Sonicator Qsonica, LLC Q500-110 With standard probe (#4220)
Superblock blocking buffer Thermo Scientific
TWEEN 20 Sigma Life Sciences 9005-64-5

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