बैक्टीरियल रोगजनकों के खिलाफ Immunological प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए Opsonophagocytic हत्या परख

Immunology and Infection

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Summary

इस ऑप्सोनोफेगोसाइटिक हत्या परख के लिए भगोसाइटिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं की क्षमता की तुलना करने के लिए जवाब और विभिंन उपचार और/ Classically, इस परख opsonin के रूप में एक जीवाणु के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी के effector कार्यों का आकलन करने के लिए सोने के मानक के रूप में कार्य करता है ।

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Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (146), e59400, doi:10.3791/59400 (2019).

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Abstract

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के एक प्रमुख पहलू को मेजबान के बैक्टीरियल उपनिवेशन के लिए phagocytosis है । एक ऑप्सोनोफेगोसाइटिक हत्या परख (OPKA) एक प्रायोगिक प्रक्रिया है जिसमें भक्षकाणु कोशिकाओं बैक्टीरियल इकाइयों के साथ सह-सभ्य हैं । प्रतिरक्षा कोशिकाओं phagocytose और एक पूरक निर्भर तरीके से जीवाणु संस्कृतियों को मार डालेगा । प्रतिरक्षा-मध्यस्थता कोशिका हत्या की दक्षता कारकों की एक संख्या पर निर्भर है और कैसे विभिन्न बैक्टीरिया संस्कृतियों कोशिका मौत के प्रतिरोध के संबंध में तुलना निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तरह, संभावित प्रतिरक्षा आधारित चिकित्सा विज्ञान की प्रभावकारिता विशिष्ट बैक्टीरियल उपभेदों और/या serotypes के खिलाफ मूल्यांकन किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक सरलीकृत OPKA का वर्णन है कि बुनियादी संस्कृति की स्थिति और सेल को सह के बाद बैक्टीरियल सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए गिनती का इस्तेमाल-उपचार शर्तों और HL-६० प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ संस्कृति । इस विधि का सफलतापूर्वक विभिन्न न्यूमोकोकल सेरोटाइप, कैप्सूलर और अकास्लर उपभेदों, और अन्य जीवाणु प्रजातियों के साथ उपयोग किया गया है । इस OPKA प्रोटोकॉल के लाभ अपनी सादगी, बहुमुखी प्रतिभा है (के रूप में इस परख opsonins के रूप में एंटीबॉडी उपचार के लिए सीमित नहीं है), और समय और अभिकर्मकों के ंयूनतम करने के लिए बुनियादी प्रयोगात्मक समूहों का आकलन ।

Introduction

ऑप्सोनोफैगोसाइटिक हत्या परख (OPKA) बैक्टीरियल संरचना या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और समारोह में बाद में परिवर्तन के लिए समारोह में परिवर्तन को जोड़ने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । जैसे, यह अक्सर एक पूरक परख एंटीबॉडी उपचार, वैक्सीन उंमीदवारों, एंजाइम अनुकूलन, आदि के प्रतिरक्षा आधारित प्रभावकारिता निर्धारित करने के रूप में प्रयोग किया जाता है जबकि vivo assays में एक जीवाणु संक्रमण मॉडल में प्रभावी मंजूरी या सुरक्षा निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं, OPKA को सबसे बुनियादी घटकों में बैक्टीरियल कोशिका मौत के लिए प्रतिरक्षा योगदान का आकलन किया जा सकता है: बैक्टीरिया, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और प्रयोगात्मक उपचार. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि opkas और संशोधित किया जा सकता है बैक्टीरिया और serotypes की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया, streptococcus निमोनियासहित1, staphylococcus2, स्यूडोमोनस aeruginosa3। इसके अलावा, इन अनुकूलित assays के लिए एक एंजाइम की क्षमता के लिए और अधिक सुलभ करने के लिए पूरक-मध्यस्थता प्रतिरक्षा कोशिकाओं4 और एंटीबॉडी उपचार में सुधार करने के लिए बनाने के लिए सहित विभिन्न प्रायोगिक उपचार, का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता opsonization5. प्रतिष्ठित, opka परख सफलतापूर्वक रोगज़नक़ द्वारा प्रेरित सुरक्षा के लिए एक शक्तिशाली संकेतक के रूप में बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान सेटिंग्स में इस्तेमाल किया गया है विशिष्ट एंटीबॉडी6,7,8,9 .

प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार opsonophagocytic हत्या के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक आम तौर पर इस्तेमाल किया भक्षकाण्विक जनसंख्या HL-६० मानव ल्यूसेमिक सेल लाइन है । इस सेल लाइन संस्कृति में निष्क्रिय promyelocytes के रूप में रखा जा सकता है; हालांकि, वे विभिंन दवा उपचार10,11के माध्यम से विभिंन सक्रिय राज्यों में विभेदित किया जा सकता है । N के साथ HL60 के उपचार, N-dimethylformamide मजबूत भकोसिटिक गतिविधि11के साथ सक्रिय न्यूट्रोफिल में सेल लाइन differentiates. जबकि HL-६० कोशिकाओं को अनुकूलित किया गया है और अक्सर इन phagocytosis के लिए इस्तेमाल किया जाता है10assays, अंय प्राथमिक polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स प्रयोग12के प्रतिरक्षा हाथ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इसके अतिरिक्त, इन assays13 या बहुसंकेतित14 सरलीकृत किया जा सकता है बैक्टीरिया के कई एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों को देखने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए । बहुसंकेतित विधि को सॉफ्टवेयर के विकास के माध्यम से अधिक व्यवहार्य बनाया गया है जो एक आगर प्लेट15पर बैक्टीरिया कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयूएस) को कुशलतापूर्वक गिन सकता है । यहां, हम एक सुव्यवस्थित विधि का वर्णन एक जीवाणु तनाव का उपयोग कर, HL-६० कोशिकाओं, बेबी खरगोश पूरक, और रक्त आगर प्लेटें । इस विधि के साथ, कई उपचार जल्दी कैसे बैक्टीरियल संक्रमण के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया modulated किया जा सकता है पर विशिष्ट अनुसंधान सवाल पता करने के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है ।

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Protocol

1. संस्कृति, भेदभाव, और HL-६० कोशिकाओं का सत्यापन

  1. HL-६० सेल संस्कृति मीडिया एल glutamine और ५० मिलीलीटर हीट-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ ५०० एमएल RPMI से बना तैयार । के रूप में इस HL-६० कोशिकाओं के भेदभाव को प्रभावित कर सकते है एंटीबायोटिक दवाओं नहीं जोड़ें ।
  2. Hl-६० कक्षों के प्रसार/अनुरक्षण के लिए, संस्कृति 5 x 106 कक्ष ७५ सेमी2 में hl-६० सेल कल्चर मीडिया के 10 मिलीलीटर में ३७ ° c और 5% सह2पर बोतल है । प्रत्येक 3 − 4 दिन के लिए यात्रा कोशिकाओं को इष्टतम कोशिका सांद्रता बनाए रखने के लिए ।
    नोट: सेल एकाग्रता 5 x 106से अधिक नहीं होना चाहिए/
  3. 1 मिलीलीटर क्रायोजेनिक ट्यूबों में 10% डाइमेथिल सल्फोक्साइड (DMSO) के साथ HL60 culture मीडिया में लगभग 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल द्वारा HL-६० कोशिकाओं के कार्यशील स्टॉक्स जनरेट करें ।
    नोट: कार्य स्टॉक-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । मास्टर स्टॉक-१२० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए ।
  4. अंतर hl-६० कोशिकाओं द्वारा संवर्धन १.५ x 107 कोशिकाओं के साथ hl-६० सेल संस्कृति मीडिया के 15 मिलीलीटर में ०.६% एन, एन-dimethylformamide (dmf) ३७ डिग्री सेल्सियस पर और 5% सह2 में बाँझ फिल्टर-ढकी हुई ७५ सेमी2 बोतल है 3 दिन पहले के लिए opka.
  5. सत्यापित करें कि HL-६० कोशिकाओं को सफलतापूर्वक विभेदित किया गया है और जांच व्यवहार्यता और सेल सतह मार्कर के अनुसार परीक्षण द्वारा opka परख में उपयोग के लिए उपयुक्त है स्थापित प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल16,17, 18,19. भेदभाव के बाद, फसल HL-६० कोशिकाओं और दाग लगभग 1 एक्स 10 प्रतिदीप्-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ4 कोशिकाओं/CD71, CD35, एनेकिन वी, और propidium आयोडाइड के लिए दाग ।
    नोट: विभेदित कोशिकाओं ≥ ६५% व्यवहार्य, ≥ ५५% CD35+, और ≤ 20% CD71+ स्थापित सत्यापन प्रोटोकॉल14 के माध्यम से निर्धारित के रूप में होना चाहिए (चित्रा 1).

2. OPKA बफ़र्स और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. बाँझ opsonization बफर बी (OBB) के ५० मिलीलीटर तैयार बाँझ 1x फॉस्फेट के ४२.५ मिलीलीटर मिश्रण से-buffered खारा (पीबीएस) Ca के साथ2 +/Mg2 +, गर्मी अक्रियाशील भ्रूण गोजातीय सीरम की 5 मिलीलीटर, और ०.१% बाँझ जिलेटिन की २.५ मिलीलीटर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  2. -८० डिग्री सेल्सियस पर बेबी खरगोश पूरक और स्टोर प्राप्त करें ।
  3. बैक्टीरियल कल्चर प्लेट्स प्राप्त या तैयार करें (यानी, 15 x १०० mm2 5% भेड़ का रक्त आगर प्लेट्स) ।

3. बैक्टीरियल स्टॉक के नमूनों की तैयारी

  1. परीक्षण किया जा करने के लिए जीवाणु तनाव (ओं) का एक स्टॉक प्राप्त करें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, सीरोटाइप 3 स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिआ (WU2, उदारता से Dr चंद्रमा nahm) का उपयोग किया जाता है ।
  2. एक उपयुक्त शोरवा में बैक्टीरियल तनाव बढ़ने (यानी, टोड-हेविट शोरबा + ०.५% खमीर इस WU2 तनाव के लिए निकालने) के लिए लगभग 2 − 4 एच ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    नोट: संस्कृति के ६०० एनएम (OD६००) पर ऑप्टिकल घनत्व ०.६ और ०.८ के बीच होना चाहिए ।
  3. पैलेट 2 मिनट के लिए ६,००० x g में अपकेंद्रण द्वारा बैक्टीरिया और उपयुक्त शोरबठ में 15% ग्लिसरोल के 10 − 30 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनः भिजवाएं । बैक्टीरियल संस्कृति (५०० μL प्रति aliquot) बाँझ १.५ मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और स्टोर पर-८० डिग्री सेल्सियस में Aliquot ।
  4. एक ३७ ° c पानी स्नान में बैक्टीरियल स्टॉक की एक शीशी बाहर गल । जीवाणु कोशिकाओं और बाँझ शर्तों के तहत OBB के ५०० μl में resuspend गोली ।
  5. OBB में बैक्टीरियल शेयर की विभिन्न dilutions तैयार (यानी, कोई कमजोर पड़ने के 10 μl, 1:10 के 10 μl, 1:100 के 10 μl, आदि). OPKA परख प्रदर्शन (धारा 4-6, सहित HL-60/पूरक सह संस्कृति) के रूप में अनुपचारित जीवाणु स्टॉक के विभिंन dilutions का उपयोग कर नीचे वर्णित है । संस्कृति 30 डिग्री सेल्सियस (कोई सह2) पर रातोंरात प्लेटें ।
    नोट: तापमान 30 ° c अतिवृद्धि को रोकने के लिए WU2 के लिए विशिष्ट है; अंय उपभेदों/serotypes ३७ डिग्री सेल्सियस पर इष्टतम विकसित हो सकता है ।
  6. हल बैक्टीरियल स्टॉक सह के प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए कालोनियों गणना-HL-६० कोशिकाओं और पूरक के साथ सुसंस्कृत । यह निर्धारित करना कि कौन से बैक्टीरिया की कमी से गणनीय कालोनियां (लगभग 80 − 120 CFUs) हल किए गए बैक्टीरिया के लिए HL-६० कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत होती हैं । इस जीवाणु स्टॉक को शामिल करने वाले भविष्य के OPKAs के लिए यह कमजोर पड़ने पर ध्यान दें ।

4. बैक्टीरियल उपचार और संस्कृति

  1. ३.३ कदम में तैयार बैक्टीरियल स्टॉक की एक ट्यूब गल । गोली बैक्टीरिया (६,००० x 2 मिनट के लिए जी ) और resuspend सेल गोली OBB में इष्टतम कमजोर पड़ने पर कदम ३.६ में निर्धारित के रूप में ।
  2. एक गोल-नीचे ९६-well सेल संस्कृति प्लेट में अच्छी तरह से प्रति सस्पेंड बैक्टीरियल कमजोर पड़ने के पिपेट 10 μl ।
  3. डुप्लिकेट में प्रत्येक प्रयोगात्मक अच्छी तरह से उपयुक्त एंटीबॉडी या नशीली दवाओं के उपचार के 20 μL जोड़ें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, चूहों में उत्पन्न एक सीरोटाइप-विशिष्ट एंटीबॉडी उपचार एक्स के रूप में जोड़ा जाता है और एक ग्लाइकोसाइड हाइड्रोलसे एंजाइम सीरोटाइप नीचा करने के लिए जाना जाता 3 पॉलीसैकेराइड कैप्सूल उपचार के रूप में जोड़ा जाता है Y (चित्रा 2)4,20. नियंत्रण कुओं के लिए, 1x PBS या OBB, उपचार कुओं के लिए इस्तेमाल किया बफर पर निर्भर करता है का उपयोग करें ।
  4. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए लगभग ९० rpm पर नमूना प्लेट हिला । इष्टतम तापमान या उपचार की स्थिति मिलाते हुए परीक्षण किया जा रहा के आधार पर इन शर्तों को समायोजित करें ।

5. HL-६० बैक्टीरियल सह संस्कृति

  1. Hl-६० कोशिकाओं की कटाई द्वारा hl-६० विभेदित कोशिकाओं है कि तीन दिन पहले DMF के साथ इलाज किया जाता है तैयार (१.४ कदम देखें) 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में । गोली कोशिकाओं (५०० x जी, 3 मिनट), supernatant त्याग, और 1X pbs के कम से 10 मिलीलीटर के साथ धोने ।
  2. गोली धोया कोशिकाओं (५०० x जी, 3 मिनट), supernatant त्यागने, और OBB में कोशिकाओं resuspend (1 मिलीलीटर OBB के साथ शुरू और 1 x 107की एक अंतिम एकाग्रता के लिए समायोजित/
  3. एक 1:5 अंतिम मात्रा में बेबी खरगोश पूरक (बाँझ, unilluted बेबी खरगोश सीरम, आयु 3 − 4 सप्ताह) जोड़ें ।
    नोट: HL-६०-पूरक मिश्रण के अंतिम एकाग्रता 1 x 107/ यदि परीक्षण निर्भरता पूरक, एक दूसरे के साथ सक्रिय HL-६० कोशिकाओं गर्मी निष्क्रिय पूरक उपयोग किया जा सकता है युक्त समाधान (पूरक है निष्क्रिय किया जा सकता है एक पानी स्नान में > 55 डिग्री सेल्सियस पर कम से 30 मिनट के लिए) ।
  4. 1 ज बैक्टीरियल संस्कृति के बाद (चरण ४.४) पूरा हो गया है, प्रत्येक नमूना विभाजित (यानी, प्रत्येक 30 μL नमूना के 10 μL अच्छी तरह से दो नए कुओं में) दो समूहों के लिए डुप्लिकेट कुओं में (यानी, मूल 30 μL सह संस्कृति के केवल 20 μL का उपयोग करने के लिए खाते में त्रुटि पिख्ता) : एक सेट सह होगा-६०-पूरक के साथ सभ्य और एक बैक्टीरिया शामिल होंगे ही । HL-६०-पूरक मिश्रण के ५० μL जोड़ें (चरण ५.३ से) कुओं के प्रत्येक प्रयोगात्मक सेट करने के लिए (प्रत्यायोजित + HL-६०); केवल (प्रत्यायोजित-HL-६०) बैक्टीरिया के कुओं के लिए OBB अकेले के ५० μL जोड़ें ।
    नोट: इस उदाहरण के लिए, लगभग ८०० बैक्टीरियल CFUs 5 x 105/५० ΜL HL-६० कोशिकाओं के साथ प्रारंभिक सह-संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है । यदि संक्रमण की यह बहुलता बहुत अधिक है या अंतिम कॉलोनी संख्या से संकेत के रूप में बहुत कम है, प्रारंभिक बैक्टीरियल कमजोर पड़ने को समायोजित के रूप में HL-६० सेल गणना करने के लिए विरोध किया ।
  5. 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ९६-well थाली शेक (कोई सह2) ।

6. नमूना चढ़ाना और रातोंरात ऊष्मायन

  1. OBB के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 1:5, इतना है कि प्रत्येक नमूने के एक मात्रा कम ५० μL की है ।
  2. प्रत्येक नमूने के पिपेट ५० μL सीधे एक जीवाणु संस्कृति प्लेट के एक नामित क्षेत्र पर, नमूनों के बीच पर्याप्त अंतराल सुनिश्चित करने. 15 x १०० मिमी2 दौर आगर प्लेटों के लिए, एक थाली पर लगभग 4 नमूने पिपेट ।
  3. कवर और नमूने के लिए कमरे के तापमान पर लगभग 15 मिनट के लिए सूखी अनुमति देते हैं ।
  4. प्लेट और 30 डिग्री सेल्सियस (कोई सह2) पर रातोंरात संस्कृति पलटें । वैकल्पिक रूप से, anoxic शर्तों बैक्टीरियल विकास को प्रभावित या आकारिकी के लिए नियंत्रण करने के लिए परीक्षण करने के लिए अनएरोबिक जार में संस्कृति प्लेटें ।
  5. रातोंरात संस्कृति के बाद, प्रत्येक नामित नमूना क्षेत्र में कालोनियों गिनती । प्रत्येक सेट में लाइव कक्षों की संख्या की तुलना संगत नियंत्रण और/या नमूने जो HL-६० सेल सह-संस्कृति (१००% सेल उत्तरजीविता, 0% सेल की हत्या का संकेत) प्राप्त नहीं करते हैं, के द्वारा डेटा का विश्लेषण करें ।

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Representative Results

HL-६० विभेद का विधिमान्यकरण OPKA प्रारंभ करने से पहले किया जाना चाहिए । यह प्रवाह cytometry का उपयोग कर पूरा किया जा सकता CD11b, CD35, CD71 की extracellular अभिव्यक्ति का निर्धारण, और एनेकिन वी (चित्रा 1) । प्रोपिडियम आयोडाइड भी एक व्यवहार्यता मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । 3 दिनों के लिए DMF के साथ इलाज किया जा रहा है के बाद, CD35 की अभिव्यक्ति (सभी कोशिकाओं का ≥ ५५%) और CD71 की अभिव्यक्ति (सभी कोशिकाओं के ≤ 20%) कम किया जाना चाहिए बढ़ाया जाना चाहिए. पर्याप्त सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए एनेकिन वी + और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई +) कोशिकाओं का प्रतिशत एक साथ 35% < किया जाना चाहिए । यदि ये प्रतिशत न्यूनतम आवश्यकताओं को पूरा नहीं करते हैं, तो संस्कृति की स्थितियों को चर्चा में बताए अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए.

६.५ कदम से प्राप्त CFUs की संख्या को अनुपचारित नियंत्रण समूह की तुलना में विभिन्न समूहों के जीवाणु कोशिका अस्तित्व की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (१००% सेल अस्तित्व) के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है. उदाहरण के लिए, औसत कुओं से प्राप्त की गणना है कि कोई इलाज नहीं मिला लेकिन HL-६० के साथ सह-सभ्य होना चाहिए अपेक्षाकृत संख्या में कोशिकाओं है कि कोई इलाज नहीं मिला और कोई सह की संस्कृति HL-६०, जो १००% सेल अस्तित्व का संकेत होगा, या 0 % सेल ृ. एक प्रभावी उपचार के साथ, कालोनियों की संख्या HL-६० सह-संस्कृति और कोई HL-६० कोशिकाओं के बीच और अधिक अलग होना चाहिए (चित्रा 2 और चित्रा 3) । HL-६० और कोई HL-६० सेट के बीच बड़ा अंतर अधिक कुशल phagocytosis का संकेत कर रहे हैं । हालांकि, उपचार वास्तव में सेट है कि सह नहीं है में बैक्टीरियल कोशिका विकास में सुधार हो सकता है-६० कोशिकाओं के साथ सभ्य । इलाज और अनुपचारित नमूनों में यह अंतर नोट किया जाना चाहिए । यदि बैक्टीरियल कमजोर पड़ने (कदम ३.६) या कॉलोनी के विकास के अनुकूल नहीं है ध्यान से चढ़ाना के बाद मनाया (कदम ६.५ या चर्चा देखें), कालोनियों के अतिवृद्धि को कालोनियों की सटीक गिनती रोक सकता है (चित्रा 4) ।

Figure 1
चित्रा 1 : HL के सत्यापन-६० प्रवाह cytometry के माध्यम से सेल भेदभाव । विभेदित HL-६० कोशिकाओं को काटा गया, धोया गया, और 1 x 105 कोशिकाओं/ इसके बाद कोशिकाओं को ९६-कूप प्लेट में 12 कुओं (१०० μL/well) में aliquoted किया गया । कोशिकाओं तो प्रतिदीप् त संयुग्मित विरोधी CD35, विरोधी CD71, एनेकिन वी, और propidium आयोडाइड के साथ दाग थे । अनसना कोशिकाओं या कोशिकाओं के साथ दाग प्रतिदीप्ति संयुग्मित आइसोटाइप एंटीबॉडी नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : उपचार Y HL-६०-mediated कोशिका बैक्टीरिया की हत्या में सुधार । एस निमोनिया के नमूने उपचार एक्स (एंटीबॉडी) या उपचार वाई (एंजाइम) के साथ इलाज किया गया । OPKA प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया और बैक्टीरियल CFUs डुप्लिकेट में गिना गया था । नमूने कि HL-६० कोशिकाओं के साथ इलाज नहीं किया गया एक नियंत्रण (१००% सेल जीवन रक्षा) के रूप में इस्तेमाल किए गए थे । दिखाया गया है कि संगत गैर-HL-६०-व्यवहार समूहों की तुलना में HL-६० उपचारित समूहों में बैक्टीरियल CFUs का औसत प्रतिशत है । पट्टियां मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : बैक्टीरियल CFUs के बाद OPKA और रातोंरात संस्कृति । बैक्टीरियल नमूनों का उपचार किया गया और () के साथ (ख) ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए (बी) HL-६० कक्षों के साथ सह-सुसंस्कृत । नमूनों को प्रोटोकॉल के अनुसार पतला किया गया और 30 डिग्री सेल्सियस (कोई सह2) पर रातोंरात रक्त आगर प्लेटों पर चढ़ाया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : बैक्टीरियल CFU अतिवृद्धि । बैक्टीरियल नमूनों का इलाज किया गया था और OPKA प्रदर्शन किया गया था । नमूनों को पतला किया गया और ३७ डिग्री सेल्सियस (कोई सह2) पर रातोंरात रक्त आगर प्लेटों पर चढ़ाया गया । कालोनी संख्याओं का सही मूल्यांकन नहीं किया जा सकता क्योंकि कालोनियों का अतिवृद्धि दर्शाया गया है । ३७ डिग्री सेल्सियस (कोई सह2) के रूप में बैक्टीरियल अतिवृद्धि के लिए नेतृत्व, भविष्य प्लेटों के लिए ऊष्मायन तापमान कम करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस (कोई सह2) के लिए कालोनियों की गणनीयता बनाए रखने के लिए किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

Opkas एंटीबॉडी मध्यस्थता प्रतिरक्षा6,8टीकाकरण द्वारा प्रेरित प्रतिक्रियाओं का आकलन करने में आवश्यक भूमिकाओं की सेवा । इस सरलीकृत OPKA का मुख्य महत्व है (यानी, एंटीबॉडी, एंजाइम उपचार, आदि) का परीक्षण किया जा करने के लिए शर्तों में अनुकूलनशीलता है । इस अर्थ में, जबकि इस परख के लिए opsonins के योगदान का परीक्षण किया जा सकता है (यानी, एंटीबॉडी) भगोसाइटोसिस में, यह भी करने के तरीके का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है डाह कारकों पर काबू पाने (यानी, संपुटी पॉलिसैकेराइड) है कि आम तौर पर भँवर रास्ते रोकना । एक मल्टीप्लेक्स OPKA में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले चरणों की संख्या को कम करना संभवतः तकनीकी त्रुटियों के लिए संभावना को कम करता है जो प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं और उपयोगी डेटा प्राप्त करने के लिए समस्या निवारण और ऑप्टिमाइज़ेशन की मात्रा कम कर देता है. के रूप में इस प्रोटोकॉल के उपचार की स्थिति में बदलाव के लिए अनुकूल है, यह बहुमुखी प्रतिभा का एक बड़ा सौदा के लिए अनुमति देता है ।

पूर्व-HL-६० और बैक्टीरियल स्टॉक की स्थापना की संस्कृति के माध्यम से परख की स्थापना के लिए बाहरी अनुकूलन कदम जब opka प्रदर्शन को रोकने के महत्वपूर्ण है । समय यह सुनिश्चित करने के लिए समर्पित होना चाहिए कि प्रयोग किए जाने से पहले सभी अभिकर्मकों और कक्ष प्रकार तैयार और कार्यशील हैं । इन कदमों में शामिल है HL-६० सेल लाइन संस्कृति में (लगभग दो सप्ताह), मांयता है कि DMF के विशिष्ट सांद्रता प्रभावी ढंग से अंतर HL-६० कोशिकाओं (के बारे में एक सप्ताह), और स्थापित contaminant मुक्त और अनुकूलित जीवाणु स्टॉक dilutions (लगभग दो सप्ताह).

इस प्रोटोकॉल के कुछ कदम गणनीय कालोनियों और पर्याप्त डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस प्रोटोकॉल HL-६० कोशिकाओं के रूप में एक मानव कोशिका रेखा है कि संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है और अपेक्षाकृत कुछ कदम के साथ विभेदित का उपयोग करने की आसानी के कारण फ़ैगोसाइट का उपयोग करता है । मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) भी इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, इन कोशिकाओं को प्राप्त करने और उनके उपयोग के लिए शर्तों का अनुकूलन और अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है । HL-६० कोशिकाओं को बैक्टीरिया के खिलाफ फ़ैगोसाइट के रूप में कार्य करने के क्रम में विभेदित किया जाना चाहिए । DMF के साथ 3 दिन के उपचार के बाद भेदभाव की पुष्टि करने के लिए, प्रवाह cytometry CD11b और CD35 की अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं के बहुमत पर परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए पहले किसी भी OPKA का प्रयास किया है, के रूप में कदम १.५ में चर्चा की । कोशिका व्यवहार्यता का भी सत्यापन किया जाना चाहिए (अधिमानतः एनेकिन वी और प्रोपिडियम आयोडाइड अभिरंजक के साथ) । यदि कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या मर चुके हैं, apoptotic, या प्रवाह cytometry के साथ मनाया के रूप में अविभेदित, 3 दिन के साथ भेदभाव rpmi मीडिया में ०.६% dmf के साथ संशोधित किया जा सकता है (0.4% − 0.8% dmf, 2 − 6 दिन संस्कृति समय) जब तक सेल व्यवहार्यता और भेदभाव मार्कर रहे है सुधार. इस भिंनता OPKA के पहले अनुकूलन के रूप में HL-६० समारोह प्रभावी बैक्टीरियल हत्या के लिए महत्वपूर्ण है होना चाहिए । हम हर OPKA प्रयोग से पहले HL-६० भेदभाव मांय करने की सलाह देते हैं ।

जीवाणु CFUs (चरण ३.६) की संख्या शुरू में ९६-well थाली में तिरस्कृत (कदम ४.२) भी महत्वपूर्ण है: वितरण भी कई कोशिकाओं मुश्किल और गलत गिनती कर देगा (कदम ६.५) और सेल मौत HL से मनाया-६० सह संस्कृति कम हो सकती है, जबकि बहुत कम कक्षों को वितरण करने से डुप्लिकेट के बीच विचलन की मात्रा बढ़ सकती है और HL-६० सह-संस्कृति के बाद कोई भी गणनीय कालोनियां नहीं दिखा सकती हैं । शेयर कमजोर पड़ने का अनुकूलन इसलिए महत्वपूर्ण है, और पूर्ण प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए, सहित HL-60/

पूरक के महत्व को भी नमूने के दो सेट सहित द्वारा इस प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण किया जा सकता है: सक्रिय बेबी खरगोश के पूरक और गर्मी के साथ एक-निष्क्रिय पूरक के साथ एक. HL-६० कोशिकाओं को दोनों सेट के साथ सह-सभ्य होना चाहिए, हालांकि एक बैक्टीरिया केवल सेट अभी भी एक १००% सेल अस्तित्व आधार रेखा के रूप में शामिल किया जाना चाहिए ।

कुछ बैक्टीरियल serotypes के लिए, कालोनियों के आकारिकी सेल गिनती या दृश्यता समस्याग्रस्त बना सकते हैं । उदाहरण के लिए, प्रकार 3 स्ट्रेप्टोकोकस निमोनियाके रूप में mucoid सीरोटाइप, आसानी से अधिक हो जाना और cfu गिनती को कम कर सकते हैं । यह विशेष रूप से समस्याग्रस्त जब उपचार है कि कैप्सूल को प्रभावित परीक्षण साबित हो सकता है, अतिवृद्धि के रूप में इलाज के समूह में रोका जाएगा, लेकिन छोटी कालोनियों की अधिक से अधिक संख्या गिना जाएगा । इस विसंगति को रोकने के लिए सेल के विकास पर नियंत्रण महत्वपूर्ण है । 30 डिग्री सेल्सियस पर चढ़ाया कालोनियों Culturing रातोंरात की संभावना बैक्टीरियल विकास की निगरानी में सुधार के लिए अनुमति देगा और प्लेटें हटाया जा सकता है जब सभी कालोनियों, अप्रिय गणनीय आकार तक पहुंच सकते हैं । इसके अलावा, अलग कॉलोनियों की दृश्यता में सुधार के लिए आगर प्लेटों का इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तरह, इस प्रोटोकॉल के रूप में छोटे परिवर्तन की स्थिति को अनुकूलित करने के लिए बैक्टीरियल उपभेदों या विभिंन उपचार के विकल्प के एक नंबर के लिए खाते में इस्तेमाल किया जा सकता है लाभप्रद है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ चांद Nahm (अलबामा बर्मिंघम के विश्वविद्यालय) हमारी प्रयोगशाला में OPKA assays की स्थापना में उनकी अमूल्य सहायता के लिए धंयवाद । इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा सहायता प्रदान की गई थी, जो FYA के लिए 1R01AI123383-01A1 है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V (APC conjugated) BioLegend 640919
anti-CD35, human (PE conjugated) BioLegend 333405
anti-CD71, human (PE conjugated) BioLegend 334105
bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) 
blood agar plates Hardy Diagnostic A10
Fetal Clone serum HyClone SH30080.03
glycerol Sigma G9012-1L
HL-60 cells ATCC CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated) BioLegend 400907
N,N-dimethylformamide (DMF) Fisher Chemical UN2265
propidium iodide Sigma P4864
RPMI media with L-glutamine Corning 10-040-CV

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References

  1. Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4, (4), 415-422 (1997).
  2. Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9, (3), 480-487 (2013).
  3. Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155, (6), 2094-2097 (1996).
  4. Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. (2018).
  5. Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
  6. Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77, (4), 1502-1513 (2009).
  7. Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23, (11), 1407-1416 (2016).
  8. Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36, (5), 606-614 (2018).
  9. Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, (24), 2209-2218 (2013).
  10. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12, (1), 19-27 (2005).
  11. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75, (5), 2458-2462 (1978).
  12. Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16, (6), 806-810 (2009).
  13. Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
  14. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19, (6), 835-841 (2012).
  15. Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77, (8), 790-797 (2010).
  16. Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
  17. Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
  18. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
  19. Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7, (2), 171-177 (1986).
  20. Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28, (2), 90-99 (2018).

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