Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

Immunology and Infection

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Summary

이 opsonophagocytic 죽이 분석 결과 응답 하 고 다른 치료 조건에 기반 하는 박테리아를 죽 일 phagocytic 면역 세포의 기능을 비교 하는 데 사용 됩니다. 고아 하 게,이 분석 결과 opsonin로 박테리아에 대하여 제기 하는 항 체의 효과 기 기능을 평가 하기 위한 황금 표준 역할을 합니다.

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Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (146), e59400, doi:10.3791/59400 (2019).

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Abstract

호스트의 세균성 식민지에 면역 반응의 중요 한 부분은 이다 식 균 작용. Opsonophagocytic 살해 분석 결과 (OPKA) phagocytic 세포는 세균 대 공동 교양 있는 실험적인 절차 이다.입니다. 면역 세포 phagocytose 하 고 보완 종속 방식에서 세균성 문화를 죽 일 것 이다. 중재 하는 면역 세포 살해의 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다 효율과 어떻게 다른 박테리아를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다 세포 죽음에 관하여 문화 비교. 이 방법에서는, 특정 세균성 긴장 또는 serotypes에 대 한 잠재적인 면역 기반 치료제의 효능을 평가 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 기본적인 문화 조건 및 셀 세 치료 조건 및 HL-60 면역 세포 공동 문화 후 세균 세포 생존 능력을 결정 하는 단순화 된 OPKA를 설명 합니다. 이 메서드는 다른 폐 렴 serotypes, capsular와 acapsular 긴장, 및 다른 세균 종 수와 성공적으로 이용 되어. 이 OPKA 프로토콜의 이점은 그것의 간명, 다양성 (로이 분석 결과 opsonins로 항 체 치료에 국한 되지 않습니다), 그리고 시간과 기본 실험 그룹을 평가 하기 위해 시 약의 최소화.

Introduction

Opsonophagocytic 분석 결과 (OPKA)를 죽이 세균성 구조 또는 기능 변경 이후의 변화 면역 반응 및 기능에 연결 하기 위한 중요 한 도구입니다. 이와 같이, 그것 자주 면역 기반 항 체 치료, 백신 후보자, 효소 최적화 등의 효능을 결정 하기 위해 분석 결과 보완으로 사용 됩니다. Vivo에서 분석 실험 공간이 세균 감염 모델에 보호를 결정 하는 데 필요한 반면는 OPKA 평가 세균성 세포 죽음에 면역 기여 가장 기본적인 구성 요소를 사용할 수 있습니다: 박테리아, 면역 세포, 및 실험 치료입니다. 이전 연구는 OPKAs 수정 하 고 다양 한 박테리아와 serotypes, 연쇄 상 구 균 균1,2 포도 상 구 균, 녹 농 균3를 포함 하 여 사용할 수 있습니다 나타났습니다. 또한, 이러한 최적화 된 분석 실험 박테리아를 더 개선 보완-중재 면역 세포4 및 항 체 치료에 액세스할 수 있도록 하는 효소의 기능을 포함 하 여 다른 실험적 치료를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. opsonization5. 고전적인, OPKA 분석 결과 성공적으로 사용 되었다 기초 및 임상 연구에서 병원 체 특정 항 체6,,78,9에 의해 유도 된 보호에 대 한 강력한 표시기로 설정 .

Opsonophagocytic 살해의 평가 대 한 면역 세포의 다른 종류를 사용할 수 있습니다. 1 일반적으로 사용 되 phagocytic 인구는 HL-60 인간 leukemic 세포 라인. 이 셀 라인 배양에서 사 promyelocytes로 유지 될 수 있다 그러나, 그들은 다른 약물 치료10,11을 통해 다양 한 활성화 상태에 분화 될 수 있다. HL60 n의 처리, N dimethylformamide 강한 phagocytic 활동11활성화 된 호 중구에 셀 라인을 차별화합니다. HL-60 셀 최적화 되어10이 먹어서 분석 실험 위해 자주 사용 하는 동안 다른 기본 polymorphonuclear 백혈구 면역 실험12팔으로 사용할 수 있습니다.

또한, 이러한 분석 실험 또는 단순화 된13 수 다중화14 테스트할 박테리아의 여러 항생제 내성 변종에 보고. 멀티플렉스 메서드는 더 효율적으로 한 접시15자리 당 단위 (CFUs)를 형성 하는 세균성 식민지를 셀 수 있는 소프트웨어의 개발을 통해 실현 하였습니다. 여기, 하나의 세균, HL-60 셀, 아기 토끼 보완, 긴장과 혈액 한 천 배지를 사용 하 여 효율적인된 방안을 설명 합니다. 이 방법으로 여러 치료 세균성 감염에 타고 난 면역 반응 수 변조 하는 방법에 대 한 특정 연구 질문을 해결 하기 위해 신속 하 게 평가 될 수 있다.

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Protocol

1. 문화, 차별화, 및 HL-60 셀의 유효성 검사

  1. 500 mL와 L-글루타민 및 50 mL 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 RPMI의 HL-60 세포 배양을 준비 합니다. HL-60 세포의 분화에 영향을 미칠 수 있습니다이 항생제를 추가 하지 마십시오.
  2. 전파/HL-60 세포의 유지 보수에 대 한 문화 5 x 106 셀 75 cm2 HL-60 세포 배양의 10 mL에 37 ° C, 5% CO2플라스 크 통풍. 최적의 세포 농도 유지 하기 위해 셀 3−4 일 마다 통로.
    참고: 세포 농도 5 x 106/mL을 넘지 말아야 한다.
  3. 1 mL 극저온 튜브 aliquoting 약 1 x 106 셀/mL 10% 디 메 틸 ⁚ (DMSO)와 HL60 배양에 의해 HL-60 셀의 일 주식을 생성 합니다.
    참고: 작업 주식-80 ° c.에 저장 될 수 있습니다. 마스터 주식-120 ° c.에 저장 한다
  4. OPKA 이전 3 일 동안 살 균 필터 출장 75 c m2 플라스 크에서 37 ° C, 5% CO2 에서 자란 1.5 0.6 %N, N-dimethylformamide (DMF) HL-60 세포 배양의 15 ml에서 107 셀 x 여 HL-60 세포 분화.
  5. HL-60 셀 성공적으로 분화는 OPKA 분석 결과에 사용할 적절 한 생존 및 설립된 흐름 cytometry 프로토콜16,17에 따르면 세포 표면 마커를 테스트 하 여 확인 18,19. 차별화, 후 HL-60 세포를 수확 하 고 CD71, CD35, annexin V, 및 propidium 요오드 화물에 대 한 약 1 × 104 셀 붙일 활용 된 항 체/얼룩 얼룩.
    참고: 차별화 된 셀 ≥65% 가능한, ≥55 %CD35 이어야 한다+, 및 ≤20 %CD71+ 통해 결정으로 설립 유효성 검사 프로토콜14 (그림 1).

2입니다. OPKA 버퍼 및 시 약의 준비

  1. 살 균 젤라틴와 Ca2 +/Mg2 +, 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청의 5 mL 2.5 mL 0.1%의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 살 균 1의 42.5 mL를 혼합 하 여 살 균 opsonization 버퍼 B (OBB) 50 mL를 준비 합니다. 4 ° c.에 게
  2. 아기 토끼를 보완 가져오고-80 ° c.에 저장
  3. 얻거나 세균성 문화 접시 (즉, 15 x 100 m m2 5% 양 혈액 한 천 배지)을 준비.

3입니다. 세균 재고 샘플의 준비

  1. 시험 될 세균성 strain(s)의 재고를 얻을.
    참고: 이 프로토콜, serotype 3 구 균 (WU2, 박사 문 남 아낌없이 제공) 사용 됩니다에 대 한.
  2. 약 2−4 h 37 ° c.에 대 한 적절 한 국물 (즉, 토 드-휴이 트 국물 + 0.5% 효 모 추출 물이 WU2 긴장에 대 한)에서 세균성 긴장을 성장
    참고: 광학 밀도 600 nm (OD600) 문화의 0.6과 0.8 사이 여야 합니다.
  3. 2 분 동안 6000 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 작은 하 고 적절 한 국물에 15% 글리세롤의 10−30 ml에서 셀 resuspend. 약 수 살 균 1.5 mL 원심 분리기 튜브와-80 ° c.에 게 세균성 문화 (약 수 당 500 µ L)
  4. 37 ° C 물 욕조에 세균 주식의 한 유리병 밖으로 해 동. 세균성 세포를 작은 하 고 메 마른 조건 하에서 OBB의 500 µ L에서 resuspend.
  5. OBB (즉, 아무 희석의 10 µ L, 1시 10분의 10 µ L, 10 µ L 1: 100, 등등)에서 세균의 다른 희석을 준비 합니다. 치료 되지 않는 세균의 다양 한 희석을 사용 하 여 아래 설명 된 대로 OPKA 분석 결과 (섹션 4-6, 포함 HL-60/보완 공동 문화)를 수행 합니다. 30 ° C (아무 CO2)에서 하룻밤 격판덮개 문화.
    참고: 온도 30 ° C는 자라 난;을 방지 하기 위해 WU2에 대 한 특정 다른 변종/serotypes 37 ° c.에서 최적의 성장 수 있습니다.
  6. 치료 세균성 주식 HL-60 세포와 보완 공동 경작의 각 희석에 대 한 식민지를 계산 합니다. 박테리아의 어떤 희석 생성 수 식민지 (약 치료 박테리아 공동 HL-60 세포 배양에 대 한 80−120 CFUs)의 최적의 수를 결정 합니다. 이 희석이 세균성 주식을 포함 하는 미래 OPKAs에 대 한 note

4. 세균 치료 및 문화

  1. 세균성 주식 단계 3.3에서에서 준비의 1 개의 관 동 펠 릿 박테리아 (6000 x g 2 분)과 최적의 희석 단계 3.6에서에서 결정에 셀 펠 릿 OBB에서 resuspend.
  2. 라운드-하단 96 잘 셀 문화 접시에 잘 당 resuspended 세균 희석의 10 µ L 플라스틱
  3. 중복에서 각 실험 잘에 적절 한 항 체 또는 약물 치료의 20 µ L를 추가 합니다.
    참고: 이 프로토콜에서 쥐에서 생성 serotype 특정 항 체 치료 X로 추가 됩니다 고 serotype 3 다 당 류 캡슐을 저하 알려진 glycoside 가수분해 효소 효소 치료로 Y (그림 2)4,20추가 됩니다. 제어 웰 스에 대 한 치료 우물 사용 되는 버퍼에 따라 PBS 또는 OBB, x 1을 사용 합니다.
  4. 실 온에서 1 시간에 약 90 rpm에서 샘플 접시를 흔들어. 이러한 조건에 따라 최적의 온도 또는 테스트 되 고 치료의 동요 상태를 조정 합니다.

5. HL-60 세균성 공동 문화

  1. HL-60 세포와 함께 처리 됩니다 DMF 3 일 이전 (단계 1.4 참조) 15 mL 원뿔 튜브에 HL-60 분화 세포를 수확 하 여 준비 합니다. 작은 셀 (500 x g, 3 분), 상쾌한, 삭제 및 1 x PBS의 적어도 10 mL로 씻어.
  2. 씻어 셀 (500 x g, 3 분) 펠 렛, 상쾌한, 폐기 및 OBB 셀 resuspend (1 mL OBB와 함께 시작 하 고 셀 계산 후 1 x 107/mL의 최종 농도 대 한 조정).
  3. 1:5 마지막 볼륨에 아기 토끼 보완 (살 균, undiluted 아기 토끼 혈 청, 나이 3−4 주)를 추가 합니다.
    참고: HL-60-보완 혼합물의 최종 농도 1 x 107/mL 이어야 한다. 경우 보완 종속성 테스트, 열 비활성화 보완 활성 HL-60 셀을 포함 하는 두 번째 솔루션을 사용할 수 있습니다 (보완에 물 욕조에 배양 하 여 비활성화 될 수 있습니다 > 적어도 30 분 동안 55 ° C).
  4. 1 h 세균성 문화 완료 (4.4 단계) 인 후에, 분할 각 샘플 (즉, 10 µ L의 두 개의 새로운 우물에 각 30 µ L 샘플) 두 그룹 (즉, 사용 20 µ L pipetting 오류에 대 한 계정이 원래 30 µ L 공동 문화)에 대 한 중복 웰 스 : 한 세트 HL-60-보완 공동 경작 되며 하나 박테리아만 포함 됩니다. 50 µ L을 우물의 각 실험 세트 (단계 5.3)에서 HL-60-보완 혼합물의 추가 (위임 + HL-60); 박테리아만 (위임된-HL-60)의 우물에 혼자 OBB의 50 µ L를 추가 합니다.
    참고: 이 예제에서는 약 800 세균 CFUs 5 x 105/50 µ L HL-60 셀 초기 공동 문화에 사용 됩니다. 감염의이 다양성은 너무 높거나 너무 낮은 최종 식민지 숫자에 표시 된 대로, HL-60 세포 수 반대로 초기 세균 희석을 조정 합니다.
  5. 1 h (아무 CO2) 37 ° C에서 96 잘 접시를 흔들어.

6. 샘플 도금 및 야간 보육

  1. 각 샘플에 적어도 50 µ L의 볼륨, OBB와 1:5 각 잘 희석.
  2. 50 µ L 세균성 문화 접시, 샘플 사이의 적절 한 간격이 확보의 지정 된 영역에 직접 각 샘플의 플라스틱 15 x 100 m m2 에 대 한 한 접시, 한 접시에 피펫으로 약 4 샘플 라운드.
  3. 커버 하 고 샘플을 실 온에서 약 15 분 동안 건조를 허용 합니다.
  4. 반전 접시와 문화 30 ° C (아무 CO2)에서 하룻밤. 또는, 접시 형태에 대 한 제어 또는 무산 소 조건 세균성 성장 영향을 주는지 여부를 테스트 하는 혐 기성 항아리에 문화.
  5. 야간 문화, 후 각 지정 된 샘플 지역에 식민지를 계산 합니다. 해당 컨트롤 및 HL-60 셀 공동 문화에 영향을 받지 않는 샘플 각 세트에서 라이브 셀의 수를 비교 하 여 데이터를 분석 (100% 세포 생존, 0%의 지표 세포 살해).

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Representative Results

HL-60 차별화의 유효성 검사는 OPKA를 시작 하기 전에 수행 되어야 합니다. 이 CD11b, CD35, CD71, 및 annexin V (그림 1)의 세포 외 식을 결정 하려면 cytometry 사용 하 여 수행할 수 있습니다. Propidium 요오드 화물은 또한 생존의 표식으로 사용할 수 있습니다. 치료를 받고 이후 DMF와 3 일, CD35의 식을 증가 한다 (모든 셀의 ≥55%) CD71의 표현을 감소 한다 (모든 셀의 ≤20%). Annexin V +와 함께 propidium 요오드 화물 (PI +) 세포의 비율 이어야 한다 < 충분 한 보장을 35% 세포 생존 능력. 이러한 비율 최소 요구 사항을 충족 하지 못하면, 토론에 설명 된 대로 문화 조건 조정 되어야 한다.

CFUs 단계 6.5에서에서 얻은 수 비교 그림 2와 같이 치료 제어 그룹 (100% 세포 생존)에 비해 다른 그룹의 세균 세포 생존을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 평균 계산 하는 치료를 받았지만 HL-60와 공동 경작 했다 우물에서 얻은 치료 및 HL-60, 100% 세포 생존을 나타내는 것이, 공동 문화 또는 0 셀 수에 상대적으로 가까운 이어야 한다 % 셀 죽음입니다. 효과적인 치료, 식민지의 숫자 HL-60 공동 문화 및 HL-60 셀 (그림 2그림 3) 사이 더 다른 있어야 합니다. HL-60과 아무 HL-60 세트 사이의 큰 차이점은 보다 효율적인 식 균 작용을 나타내는. 그러나, 치료 수 있습니다 실제로 HL-60 세포와 공동 경작은 세트에 세균성 세포 성장을 향상 시킬. 처리와 치료 샘플에서이 차이 지적 한다. 세균성 희석 하지 않으면 최적화 (단계 3.6) 또는 식민지 성장 (단계 6.5 또는 참조 토론) 도금 후 신중 하 게 관찰 하지, 식민지의 자라 난 식민지 (그림 4)의 정확한 계산 되지 않을 수 있습니다.

Figure 1
그림 1 : Cytometry 통해 HL-60 세포 분화의 유효성 검사. 차별화 된 HL-60 세포 수확, 세척, 되었고 1 x 105 셀/mL PBS에에서 resuspended. 셀 aliquoted 96 잘 접시에 12 우물 (100 µ L/잘)으로 그 때 되었다. 셀 다음 붙일 활용된 안티-CD35, 안티-CD71, annexin V와 propidium 요오드 화물 얼룩이 있었다. 흠 없는 셀 또는 셀 붙일 활용된 isotype 항 체로 얼룩진 컨트롤으로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 치료 Y 향상 HL-60-중재 셀 살인 박테리아의. S. 균 샘플 처리 X로 치료 했다 (항 체) 또는 Y (효소) 치료. OPKA 프로토콜에 따라 수행 하 고 세균 CFUs에 중복 계산 했다. HL-60 세포로 치료 하지 했다 샘플 컨트롤 (100% 세포 생존)으로 사용 되었다. 해당 비-HL-60-대우 그룹에 비해 HL-60 치료 그룹에서 세균성 CFUs의 평균 백분율은입니다. 표준 오류를 나타내는 막대입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : OPKA와 하룻밤 문화 후 세균 CFUs. 세균성 샘플 취급 되었고 (A) 없이 공동 경작 또는 1 h 37 ° c.에 대 한 (B) HL-60 셀 샘플은 프로토콜에 따라 희석 및 혈액 한 천 격판덮개 30 ° C (아무 CO2)에서 하룻밤에 도금 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 세균 CFU 자라 난. 세균 샘플은 취급 하 고 OPKA 수행 되었다. 샘플 희석 되었고 혈액 한 천 격판덮개 37 ° C (아무 CO2)에서 하룻밤에 도금. 식민지의 자라 난 같이 식민지 숫자의 정확한 평가 확인할 수 없습니다. 로 37 ° C (아무 CO2) 세균성 무성, 부 화 온도를 위한 미래 판 countability는 식민지를 유지 하기 위해 30 ° c (아무 CO2) 낮아졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

OPKAs 예방 접종6,8에 의해 유도 된 항 체 중재 면역 반응 평가에 필수적인 역할을 제공 합니다. 이 단순화 된 OPKA의 주요 중요성은 테스트할 조건에 (즉, 항 체, 효소 치료, 등.). 이런이 의미에서이 분석 결과에 먹어서, opsonins (즉, 항 체)의 기여를 테스트를 사용할 수 있는 동안 그것은 또한 사용할 수 있습니다 일반적으로 phagocytic 경로 억제 하는 독성 요소 (즉, capsular 류)을 극복 하는 방법을 평가 하. 잠재적으로 다중화 된 OPKA에 일반적으로 사용 되는 단계 수를 최소화 실험 결과 영향을 미칠 수 있는 문제 해결 및 사용 가능한 데이터를 얻기 위해 최적화의 양을 줄여 기술적 오류에 대 한 가능성을 최소화 합니다. 이 프로토콜은 유사 치료 조건에 적합, 그것은 많은 다양성에 대 한 허용.

HL-60의 문화 및 세균성 주식의 설립을 통해 분석 결과 미리 설정 하는 것이 수행 하는 OPKA 외부 최적화 단계를 방지 하기 위해 중요 합니다. 모든 시 약 만들기 위해 시간을 헌신 해야 합니다 및 세포 유형은 준비 하 고 실험 하기 전에 기능 수행 됩니다. 이러한 단계는 전파 HL-60 셀 라인 문화 (약 2 주), DMF의 특정 농도 효과적으로 HL-60 셀 (약 1 주일)을 차별화 하 고 오염 물질 및 최적화 된 세균성 주식 설정 포함 희석 (약 2 주)입니다.

이 프로토콜의 몇 가지 단계는 셀 수 있는 식민지 및 적절 한 데이터를 얻기 위해 중요 합니다. 이 프로토콜은 상대적으로 몇 가지 단계와 문화에서 유지 되 고 분화 될 수 있는 인간 세포 라인을 사용의 용이성으로 인해 식 세포로 HL-60 셀을 사용 합니다. 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)도 사용할 수 있습니다; 그러나,이 세포 및 그들의 사용에 대 한 조건 최적화 더 도전 수 있습니다. HL-60 세포 박테리아에 대해 식 세포로 작동 하기 위하여 분화 될 해야 합니다. DMF와 3 일간의 치료 후 차별화를 확인, cytometry 1.5 단계에서 설명한 대로 모든 OPKA를 시도 하기 전에 셀의 대다수에 CD11b와 CD35의 표현에 대 한 테스트를 사용 해야 합니다. 세포 생존 능력 (가령 annexin V 및 propidium 요오드 화물 얼룩) 또한 확인 한다. 경우 셀의 많은 죽은, apoptotic, 또는 undifferentiated cytometry, DMF RPMI 미디어에서 수정할 수 있습니다 0.6%로 3 일간 차별화와 관찰 (0.4% − 0.8 %DMF, 2−6 일 문화 시간)까지 세포 생존 및 분화 마커 개선. HL-60 기능은 효과적인 세균성 살해에 대 한 중요 한로이 차별화는 OPKA의 첫 번째 최적화 해야 합니다. HL-60 차별화 모든 OPKA 실험 하기 전에 유효성을 검사 하는 것이 좋습니다.

처음 96 잘 접시 (4.2 단계)에 적절 하 게 세균 CFUs (단계 3.6)의 수는 또한 중요 한: 어렵고 부정확 (단계 6.5)을 계산 하 게 됩니다 너무 많은 세포를 분배와 반면 HL-60 공동 문화에서 관찰 된 세포 죽음을 줄일 수 있습니다 너무 몇 셀 분배 편차 중복의 양을 증가 시킬 수 있습니다 그리고 어떤 셀 수 있는 식민지 HL-60 공동 문화 후 표시 되지 않을 수 있습니다. 재고 희석 최적화 따라서 중요 한 일 이며 HL-60/보완 공동 문화를 포함 한 전체 프로토콜 테스트 해야 합니다.

있으 나 보완의 중요성 샘플의 두 세트를 포함 하 여이 프로토콜 또한 테스트 될 수 있습니다: 활성 아기 토끼 보수와 열 비활성화 보완과 함께 하나 하나. HL-60 세포 박테리아 전용 세트 여전히 100% 세포 생존 기준선으로 포함 해야 하지만 두 세트와 함께 공동 경작 해야 한다.

일부 세균 serotypes에 대 한 식민지의 형태로 만들 수 있습니다 셀 계산 또는 표시 문제. Mucoid serotypes 유형 등 3 구 균, 예를 들어, 수 있다 쉽게 자라 다 고 CFU 카운트를 감소. 이 자라 난 대우 그룹에서 막을 것 이라고 하지만 작은 식민지의 더 많은 세 어질 것 이다 캡슐에 영향을 주는 치료를 테스트할 때 특히 문제가 될 증명할 수 있습니다. 이 불일치를 방지 하기 위해, 통제 세포 성장이 중요 합니다. 30 ° C에서 도금된 식민지를 경작 하룻밤 것입니다 가능성이 세균성 성장의 향상 된 모니터링에 대 한 허용 하 고 모든 식민지 구별할 수, 셀 수 있는 크기에 도달 하면 번호판을 제거할 수 있습니다. 또한, 다른 한 천 배지는 개별 식민지의 가시성을 개선 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이러한 방법으로,이 프로토콜은 유리 작은 변화 조건 최적화에 따라서 세균성 긴장 또는 다양 한 치료 옵션의 숫자에 대 한 계정에 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 우리의 실험실에서 OPKA 분석 실험에서 그의 귀중 한 원조에 대 한 박사 문 남 (알라바 마의 대학 버밍엄) 감사 합니다. 이 작품은 국가 학회 건강 그랜트 1R01AI123383-01A1 FYA에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V (APC conjugated) BioLegend 640919
anti-CD35, human (PE conjugated) BioLegend 333405
anti-CD71, human (PE conjugated) BioLegend 334105
bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) 
blood agar plates Hardy Diagnostic A10
Fetal Clone serum HyClone SH30080.03
glycerol Sigma G9012-1L
HL-60 cells ATCC CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated) BioLegend 400907
N,N-dimethylformamide (DMF) Fisher Chemical UN2265
propidium iodide Sigma P4864
RPMI media with L-glutamine Corning 10-040-CV

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References

  1. Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4, (4), 415-422 (1997).
  2. Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9, (3), 480-487 (2013).
  3. Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155, (6), 2094-2097 (1996).
  4. Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. (2018).
  5. Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
  6. Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77, (4), 1502-1513 (2009).
  7. Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23, (11), 1407-1416 (2016).
  8. Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36, (5), 606-614 (2018).
  9. Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, (24), 2209-2218 (2013).
  10. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12, (1), 19-27 (2005).
  11. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75, (5), 2458-2462 (1978).
  12. Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16, (6), 806-810 (2009).
  13. Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
  14. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19, (6), 835-841 (2012).
  15. Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77, (8), 790-797 (2010).
  16. Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
  17. Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
  18. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
  19. Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7, (2), 171-177 (1986).
  20. Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28, (2), 90-99 (2018).

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