Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu opsonophagocytic öldürme tahlil yeteneği yanıt ve farklı tedaviler ve/veya koşullar üzerinde temel bakterileri öldürmek için fagositik bağışıklık hücrelerinin karşılaştırmak için kullanılınır. Klasik, bu tahlil bir bakteri bağlar olarak karşı kaldırdı antikorlar efektör fonksiyonları değerlendirmek için altın standart olarak hizmet vermektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (146), e59400, doi:10.3791/59400 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bir anahtar için ev sahibi bakteriyel kolonizasyon bağışıklık yanıtının fagositoz yönüdür. Bir opsonophagocytic öldürme tahlil (OPKA) Fagositlerlerce bakteriyel birimleriyle işbirliği kültürlü olan deneysel bir işlemdir. Bağışıklık hücreleri phagocytose ve bakteri kültürleri bir tamamlayıcı bağlı şekilde öldürmek. İmmün aracılı hücre öldürme verimliliğini bir dizi faktöre bağlıdır ve ne kadar farklı bakteriyel belirlemek için kullanılan kültürler karşılaştırmak direnç hücre ölümü ile ilgili olarak. Bu şekilde, potansiyel bağışıklık tabanlı tedavi etkinliğinin belirli bakteri suşları ve/veya serotipleri karşı tespit edilebilir. Bu protokol için temel kültür koşulları ve tedavi koşulları ve HL-60 bağışıklık hücreleri ile ortak kültür sonra bakteri hücre canlılığı belirlemek için sayma hücre kullanır bir basitleştirilmiş OPKA açıklar. Bu yöntem başarılı bir şekilde birkaç farklı pnömokok serotipleri, kapsül ve acapsular suşları ve diğer bakteriyel türler ile kullanıldığında vardır. (Bu tahlil antikor tedavisi opsonins olarak sınırlı değildir) bu OPKA Protokolü avantajları sadeliği çok yönlülük şunlardır ve zaman ve temel deneysel grupları değerlendirmek için reaktif indirilmesi.

Introduction

Tahlil (OPKA) öldürme opsonophagocytic bağışıklık yanıtı ve fonksiyon sonraki değişiklikler değişiklikler bakteriyel yapısı veya işlev bağlamak için önemli bir araçtır. Bu nedenle, bu sık sık antikor tedavisi, aşı adaylar, enzim optimizasyonu, vb bağışıklık tabanlı etkinliğini belirlemek için tamamlayıcı bir tahlil olarak kullanılır. İçinde vivo deneyleri etkili temizleme veya koruma bir bakteriyel enfeksiyon modeli belirlemek gerekli olmakla birlikte, OPKA bakteriyel hücre ölümü bağışıklık katkısı en temel bileşenleri değerlendirmek için kullanılabilir: bakteri, bağışıklık hücreleri ve deneysel tedaviler. Önceki çalışmalarda OPKAs değiştiren ve bakteri ve serotipleri, Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3de dahil olmak üzere çeşitli için kullanılan göstermiştir. Ayrıca, bu en iyi duruma getirilmiş deneyleri bakteri Kompleman aracılı bağışıklık hücreleri4 ve antikor tedavileri geliştirmek için daha erişilebilir kılan bir enzim da dahil olmak üzere farklı deneysel tedaviler değerlendirmek için kullanılabilir opsonizasyonla5. Klasik, OPKA tahlil başarıyla temel ve klinik araştırmada kullanılmıştır ayarları korumak için güçlü bir göstergesi olarak indüklenen patojen özel antikorlar6,7,8tarafından,9 .

Bağışıklık hücreleri türleri opsonophagocytic öldürme değerlendirilmesi için kullanılan. Bir sık kullanılan fagositik nüfus HL-60 insan lösemik hücre çizgidir. Bu hücre kültürünü Inaktif promiyelosit kültür olarak tutulabilir; Ancak, onlar farklı ilaç tedavisi10,11ile çeşitli aktif Birleşik Devletleri içine farklı. Tedavisi HL60 n, N-dimethylformamide içine güçlü fagositik aktivite11ile aktif nötrofil hücre ayırır. HL-60 hücreleri optimize edilmiştir ve bu fagositoz deneyleri10için sık sık kullanılır, diğer birincil polimorfonükleer lökosit12deneme bağışıklık kolu olarak kullanılabilir.

Ayrıca, bu deneyleri Basitleştirilmiş13 olabilir veya test edilecek bakterilerin birden çok antibiyotik dirençli suşların bakmak için14 multiplexed. Çoğaltılmış yöntemi daha verimli bir şekilde bakteriyel koloni başına bir agar plaka15oracıkta birimleri (CFUs) oluşturan güvenebilirsiniz yazılım geliştirme yoluyla uygun hale getirilmiştir. Burada, bir bakteriyel zorlanma, HL-60 hücreleri, bebeği tavşan tamamlayıcı ve kan Ağar kaplamalar kullanarak akıcı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemle, birden fazla tedavi hızlı bir şekilde nasıl bakteriyel enfeksiyon doğuştan gelen bağışıklık yanıtı modülasyonlu üzerinde belirli araştırma soruları gidermek tespit edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kültür, farklılaşma ve HL-60 hücre doğrulama

  1. HL-60 hücre kültür medya 500 mL RPMI L-glutamin ve 50 mL ısı inaktive fetal sığır serum ile oluşan hazırlayın. Bu HL-60 hücrelere farklılaşma etkileyebilir gibi antibiyotikler eklemeyin.
  2. HL-60 hücrelerinin yayılma/bakım için kültür 5 x 106 hücre HL-60 hücre kültür medya 75 cm2 ' deki 10 ml şişe 37 ° C ve % 5 CO2Bacalı. Geçiş hücreleri 3−4 günde optimum hücre konsantrasyonları korumak için.
    Not: Hücre konsantrasyonu 5 x 106/mL aşmaması gerekir.
  3. HL-60 hücrelerinin çalışma stokları aliquoting yaklaşık 1 x 106 hücre/mL % 10 Dimetil sülfoksit (DMSO) ile HL60 kültür medya tarafından 1 mL kriyojenik tüpler içine oluşturur.
    Not: Çalışan hisse senetleri-80 ° C'de depolanmış olabilir Ana stok-120 ° C'de muhafaza edilmelidir
  4. HL-60 hücreleri kodlamayla 1.5 x 107 hücrelerde 15 mL %0,6 N, N-dimethylformamide (DMF) ile HL-60 hücre kültür medya tarafından 37 ° C ve % 5 CO2 filtre şapkalı steril 75 cm2 şişe'de 3 gün önce OPKA için ayırt etmek.
  5. HL-60 hücreleri başarıyla ayrıştırılan ve canlılık ve hücre yüzey işaretleyicileri kurulan Akış Sitometresi protokolleri16,17göre test ederek OPKA tahlil kullanımına uygun doğrulamak, 18,19. Farklılaşma sonra HL-60 hücre hasat ve CD71, CD35, annexin V ve propidium iyodür için yaklaşık 1 x 104 hücreleri ile fluorescently Birleşik antikorlar/lekeleri leke.
    Not: Farklılaşmış hücreler-meli var olmak ≥65% uygun, ≥55% CD35+ve ≤20% CD71aracılığıyla belirlenen + kurulan doğrulama protokolleri14 (şekil 1).

2. OPKA arabellekleri ve Kimyasalları hazırlanması

  1. Steril opsonizasyonla arabelleği B (OBB) 50 mL steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 42,5 mL Ca2 +/Mg2 +, ısı inaktive fetal sığır serum 5 mL ve 2.5 mL % 0.1 ile steril jelatin karıştırarak hazırlayın. 4 ° C'de mağaza
  2. Bebeği tavşan tamamlayıcı almak ve-80 ° C'de depolamak
  3. Elde etmek veya bakteriyel kültür Tabaklar (yani, 15 x 100 mm%2 5 koyun kan agar tabaklar) hazırlamak.

3. bakteriyel hisse senedi örnekleri hazırlanması

  1. Test edilecek bakteriyel strain(s) bir hisse senedi alın.
    Not: Bu iletişim kuralı için serotip 3 pnömokok (WU2, Dr. Moon Nahm tarafından cömertçe karşılanmıştır) kullanılır.
  2. Yaklaşık olarak 37 ° C'de s 2−4 için (yani, Todd-Hewitt suyu + %0.5 Maya özü bu WU2 zorlanma için) uygun bir suyu bakteriyel zorlanma büyümek
    Not: Optik yoğunluk 600 nm (OD600) kültür 0.6 ve 0.8 arasında olmalıdır.
  3. Santrifüjü 6.000 x g 2 min için de tarafından bakteri cips ve uygun suyu % 15 gliserol 10−30 mL hücrelerde resuspend. Aliquot steril 1,5 mL santrifüj tüpleri ve-80 ° C'de mağaza içine bakteri kültürü (aliquot başına 500 µL)
  4. Bakteriyel bir 37 ° C su banyosu stokta bir şişe dışarı çözülme. Bakteri hücreleri cips ve OBB 500 µL steril koşullar altında resuspend.
  5. OBB (yani, hiçbir seyreltme 10 µL, 10 µL 1:10, 1: 100, vb 10 µL) bakteriyel stokunun farklı dilutions hazırlayın. OPKA tahlil (Bölüm 4-6, dahil HL-60/tamamlayıcı ortak kültür) tedavi edilmezse bakteri stokunun çeşitli dilutions kullanarak aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. Plakayı gecede 30 ° C'de (hiçbir CO2) kültür.
    Not: Sıcaklığı 30 ° C WU2 aşırı büyüme önlemek özeldir; diğer suşların/serotipleri 37 ° C'de en iyi şekilde ulaşması
  6. Colonies için her seyreltme tedavi edilmezse bakteri stokunun HL-60 hücreleri ve tamamlayıcı ile birlikte kültürlü saymak. Belirlemek hangi seyreltme bakterilerin sayılabilir koloniler (yaklaşık 80−120 CFUs tedavi edilmezse bakteri HL-60 hücrelerle birlikte kültürlü için) en iyi sayısını verir. Bu seyreltme için gelecekteki OPKAs bakteriyel bu hisse senedi içeren dikkat edin.

4. bakteriyel tedavi ve kültür

  1. 3.3. adımda hazırlanan bakteriyel stokunun bir tüp çözülme. Bakteri (6.000 x g için 2 dk) cips ve hücre Pelet 3.6. adımda belirlenen en uygun seyreltme, OBB içinde resuspend.
  2. Resuspended bakteriyel seyreltme iyi bir yuvarlak alt 96-şey hücre kültür plaka başına 10 µL pipet.
  3. Uygun antikor veya uyuşturucu tedavi 20 µL yinelenen deneysel her kuyuya ekleyin.
    Not: Bu iletişim kuralı, farelerde oluşturulan bir serotip özgü antikor tedavisi X eklenir ve serotip 3 polisakkarit kapsülü aşağılamak için bilinen bir glikozid hidrolaz enzim tedavisi olarak Y (Şekil 2)4,20eklenir. Denetim kuyular için PBS veya OBB, x 1 tedavi kuyular için kullanılan arabellek bağlı olarak kullanın.
  4. Oda sıcaklığında 1 h için yaklaşık 90 devirde örnek plaka sallamak. Bu koşullara bağlı olarak en uygun sıcaklık veya test edilen tedavilerin sallayarak koşulları ayarlayın.

5. HL-60 bakteriyel ortak kültür

  1. HL-60 hücreleri DMF ile üç gün önceden (bkz. Adım 1.4) 15 mL konik tüpler içine kabul edilir HL-60 farklılaşmış hücre hasat tarafından hazırlayın. Hücreler (500 x g, 3 dk) cips, süpernatant atmak ve en az 10 mL 1 x PBS yıkayın.
  2. Yıkanmış hücreler (500 x g, 3 dk) cips, süpernatant atmak ve OBB hücrelerde resuspend (1 mL OBB ile başlatmak ve 1 x 107/mL Hücre sayımı sonra son bir konsantrasyon için ayarlayabilirsiniz).
  3. Bebeği tavşan tamamlayıcı (steril, su katılmamış bebeği tavşan serum, Yaş 3−4 hafta) 1:5 son seste ekleyin.
    Not: HL-60-tamamlayıcı karışımı son konsantrasyonu 1 x 107/mL olmalıdır. Tamamlayıcı bağımlılık sınama olumlu sonuçlanırsa, ısı inaktive tamamlayıcı ile etkin HL-60 hücreleri içeren ikinci bir çözüm kullanılabilir (tamamlayıcı inaktive olur bir su banyosunda kuluçka > için en az 30 dk. 55 ° C).
  4. 1 h bakteri kültürü tam (4.4) adımdır sonra yinelenen kuyular iki grup (yani, kullanım sadece 20 µL pipetting hata için hesap için orijinal 30 µL ortak kültür) için her örnek (yani, her 30 µL örneği de iki yeni kuyu içine 10 µL) bölün : bir set HL-60-tamamlayıcı ile birlikte kültürlü olacak ve bir bakteri yalnızca yer alacak. 50 µL wells deneysel her dizi için (Kimden adım 5.3) HL-60-tamamlayıcı karışımı ekleyin (temsilci seçilen + HL-60); OBB yalnız 50 µL bakteri sadece (temsilci seçilen -HL-60) kuyu için ekleyin.
    Not: Bu örnekte, yaklaşık 800 bakteriyel CFUs 5 x 105/50 µL HL-60 hücrelerle ilk ortak kültürü için kullanılır. Bu çeşitlilik enfeksiyon çok yüksek veya çok düşük son koloni numaraları tarafından belirtildiği şekilde ise, ilk bakteriyel seyreltme HL-60 hücre sayısı olarak ayarlayın.
  5. 96-şey plaka için 1 h (hiçbir CO2) 37 ° C'de sallamak.

6. örnek kaplama ve gecede kuluçka

  1. Her örnek en az 50 µL hacmi böylece her şey 1:5 ile OBB, oranında seyreltin.
  2. Doğrudan üzerine örnekleri arasında yeterli boşluk sağlanması bakteriyel kültür plaka, belirlenmiş bir alanda her örneğinin 50 µL pipet. 15 x 100 mm için2 yuvarlak Ağar Kaplamalar, damlalıklı yaklaşık 4 örnekleri üzerine bir tabak.
  3. Kapak ve örnekleri, oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika kurumasını bekleyin.
  4. Kaplamalar ve kültür gecede 30 ° C'de (hiçbir CO2) tersine çevirin. Alternatif olarak, tabak anoksik koşulların Bakteriyel büyüme etkiler olup olmadığını sınamak için anaerobik kavanoz veya denetime Morfoloji için kültür.
  5. Gecede kültür sonra her belirlenen örnek alanı kolonilerde saymak. Her sette karşılık gelen denetim ve/veya HL-60 cep ortak kültür almazsınız örnekleri canlı hücre sayısı karşılaştırarak veri analiz (gösterge % %0 100 hücre kurtulma hücre öldürme).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Doğrulama HL-60 farklılaşma OPKA başlamadan önce gerçekleştirilmelidir. Bu hücre dışı ifade CD11b, CD35, CD71 ve annexin V (şekil 1) belirlemek için Akış Sitometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Propidium iyodür bir canlılık marker olarak da kullanılabilir. DMF ile 3 gün sonra tedavi altına, CD35 ifade artırılmalıdır (tüm hücreleri ≥55%) ve CD71 ifade düşmüştür (tüm hücreleri ≤20%). Annexin V + ve propidium iyodür (PI +) hücreleri birlikte yüzdesi olmalıdır < % 35 yeterli sağlamak için hücre canlılığı. Bu yüzdeleri minimum gereksinimleri karşılamıyorsa, kültür koşulları tartışmaya açıklandığı gibi ayarlanmalıdır.

6.5 adımından elde CFUs sayıda bakteri hücre sağkalım farklı grupların Şekil 2' de gösterildiği gibi tedavi edilmemiş kontrol grubu (% 100 hücre hayatta kalma) göre karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, hiçbir tedavi alınan, ancak HL-60 ile birlikte kültürlü kuyulardan elde edilen ortalama sayıları tedavi ve HL-60, % 100 hücre yaşama gösterge olacağını hiçbir ortak kültür veya 0 alınan hücrelerin sayısında nispeten yakın olmalıdır % hücre ölümü. Etkili bir tedavi ile kolonileri numaralarını HL-60 ortak kültür ve hiçbir HL-60 hücre (Şekil 2 ve şekil 3) arasında daha farklı olmalıdır. HL-60 ve hiçbir HL-60 kümeleri arasındaki büyük farklar daha verimli fagositoz işaret etmektedir. Ancak, tedavi aslında HL-60 hücrelerle birlikte kültürlü değil küme bakteriyel hücre büyümesini artırabilir. Bu farklılığı tedavi ve tedavi edilmezse örnekleri olması gerekmektedir. Bakteriyel seyreltme değilse (Adım 3.6) en iyi duruma getirilmiş veya koloni büyüme dikkatle (adım 6.5 veya bkz: tartışma) kaplama sonra gözlenir değil, aşırı büyüme kolonileri kolonileri (şekil 4) doğru sayma engelleyebilir.

Figure 1
Resim 1 : HL-60 hücre farklılaşması Akış Sitometresi ile doğrulanmasını. Farklılaştırılmış HL-60 hücreleri, yıkanmış ve 1 x 105 hücre/mL PBS resuspended hasat. Hücreleri sonra bölünmemeli 12 kuyu (100 µL/de) bir 96-şey plaka içine. Hücreleri sonra fluorescently konjuge anti-CD35, anti-CD71, annexin V ve propidium iyodür ile lekeli. Günahı hücre veya hücreleri fluorescently konjuge izotip antikorları ile lekeli denetimleri kullanılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Tedavi Y geliştirir HL-60-aracılı hücre öldürme bakteri. S. pneumoniae örnekleri tedavi ile tedavi X (antikor) veya tedavi Y (enzim). OPKA protokole göre gerçekleştirilmiş ve bakteriyel CFUs yinelenen sayıldı. HL-60 hücrelerle tedavi değil örnekleri bir denetimi (% 100 hücre hayatta kalma) olarak kullanılmıştır. Karşılık gelen olmayan-HL-60-tedavi gruplarına göre HL-60 tedavi gruplarında bakteriyel CFUs ortalama yüzde gösterilmiştir. Çubuklar standart hata gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : OPKA ve gecede kültür sonra bakteriyel CFUs. Bakteriyel örnekleri tedavi ve (A) Co kültürlü veya (B) HL-60 için 1 h 37 ° C'de hücreler Örnekleri protokole göre seyreltilmiş ve kan tabak 30 ° C'de (hiçbir CO2) gecede agar üzerinde kaplama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Bakteriyel CFU büyüme. Bakteriyel örnekleri tedavi edildi ve OPKA gerçekleştirildi. Örnekleri seyreltilmiş ve kan Ağar kaplamalar 37 ° C'de (hiçbir CO2) gecede üzerinde kaplama. Büyüme kolonileri gösterildiği koloni sayıların doğru değerlendirme belirlenemiyor. Countability kolonileri korumak için gelecekteki tabak düşürdü için 30 ° C (hiçbir CO2) bakteri büyüme, inkübasyon sıcaklığı 37 ° C (hiçbir CO2) liderliğindeki gibi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OPKAs antikor aracılı bağışıklık yanıtı aşılar6,8tarafından indüklenen değerlendirmede önemli roller hizmet. Adaptasyon koşullarında test edilecek bu Basitleştirilmiş OPKA ana önemi nedir (antikorlar, enzim tedavisi, vs.). Bu tahlil opsonins (yani, antikorlar) katkısını fagositoz içinde test etmek için kullanılan bu anlamda, bu da normalde fagositik yolları inhibe virülans faktörleri (yani kapsüler polisakkaritler) aşmak için yollar değerlendirmek için kullanılabilir. Genellikle bir çoğaltılmış OPKA potansiyel olarak kullanılan adımları sayısını en aza indirme deneysel sonuçlar etkileyebilir ve sorun giderme ve kullanılabilir veri elde etmek için en iyi duruma getirme miktarını azaltır teknik hatalar için şansını en aza indirir. Bu protokol çeşitleri için tedavi koşulları için uygun olarak, büyük bir çok yönlülük için sağlar.

Tahlil HL-60 kültürünü ve bakteriyel stokları kurulması yoluyla önceden kurulması OPKA işlemi sırasında yabancı optimizasyonu adımları önlemek önemlidir. Zaman tüm reaktifler emin olmak için ayrılmış olmalı ve hücre tipleri hazır ve fonksiyonel deneme önce gerçekleştirilir. Bu adımlar DMF belirli konsantrasyonları HL-60 hücreleri (yaklaşık bir hafta) etkili bir şekilde ayırt etmek doğrulamak ve geçen madde içermeyen ve en iyi duruma getirilmiş bakteriyel stok oluşturma HL-60 hücre kültürünü kültür (yaklaşık iki hafta), yayma içerir dilutions (yaklaşık iki hafta).

Bu protokol bazı adımlar sayılabilir kolonileri ve yeterli veri elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu iletişim kuralı HL-60 hücre kültüründe muhafaza ve farklı bir insan hücre satırı ile nispeten daha az sayıda merdiven kullanma kolaylığı nedeniyle fagositler olarak kullanır. İnsan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) de kullanılabilir; Ancak, bu hücreler elde etmek ve onların kullanım koşullarını optimize etmek daha zor olabilir. HL-60 hücreleri fagositler bakteri karşı olarak çalışması için ayrıştırılan gerekir. Farklılaşma DMF ile 3 gün tedavi sonra doğrulamak için Akış Sitometresi herhangi bir OPKA denemesi yapılır önce CD11b ve CD35 ifade hücreleri çoğunluğu üzerinde 1.5. adımda anlatıldığı gibi test etmek için kullanılmalıdır. (Tercihen V ve propidium iyodür boyama annexin ile) hücre canlılığı da doğrulanması gerekir. Çok sayıda hücre ölü, eğer apoptotik, ya da Akış Sitometresi, DMF RPMI medya değiştirilebilir % 0.6 ile 3 gün farklılaşma ile gözlemlediği gibi farklılaşmamış (% 0,4 −0. %8 DMF, 2−6 gün kültür zaman) hücre canlılığı ve ayırt etme belirteçleri olana geliştirilmiş. HL-60 işlevi etkili bakteri öldürmek için kritik olduğu gibi bu farklılaşma OPKA ilk optimizasyon olmalıdır. HL-60 farklılaşma her OPKA deneme önce doğrulama tavsiye ediyoruz.

Bakteriyel CFUs (Adım 3.6) başlangıçta 96-şey plaka (Adım 4.2) reçete sayısı da önemlidir: çok fazla hücreleri dağıtımı (adım 6.5) zor ve yanlış sayım yapacak ve HL-60 ortak kültür, gözlenen hücre ölümü ise azalabilir çok az sayıda hücre dağıtımı arasındaki çoğaltmaları miktarını artırabilir ve herhangi bir sayılabilir kolonileri HL-60 ortak kültür sonra gösterilmeyebilir. Hisse senedi seyreltme en iyi duruma getirme Bu nedenle önemlidir ve HL-60/tamamlayıcı ortak kültür dahil olmak üzere tam protokolü ile test edilmelidir.

Tamamlayıcı önemi de bu protokolü ile iki örnekleri kümesi ekleyerek test edilebilir: bir aktif bebek tavşan tamamlayıcı ve ısı inaktive tamamlayıcı biriyle. Bir salt bakteri küme hala % 100 hücre hayatta kalma temel olarak dahil edilecek olsa HL-60 hücreleri her iki seti ile birlikte kültürlü olmalıdır.

Bazı bakteri serotipleri için koloni morfolojisi Hücre sayımı veya görünürlük sorunlu kalmasına neden olabilir. Mukoid türü gibi 3 Streptococcus pneumoniae, örneğin serotipleri, kolayca sarmak ve CFU sayar azaltmak. Kapsül, büyüme tedavi grubunda engelledi ama daha çok sayıda daha küçük koloniler sayılması gibi etkiler tedavi test ederken bu özellikle sorunlu olabilir. Bu tutarsızlık önlemek için hücre büyümesini kontrol çok önemlidir. 30 ° C'de kaplama kolonileri kültür gecede büyük olasılıkla geliştirilmiş Bakteriyel büyüme izlemek için izin verir ve tüm kolonileri ayırt, sayılabilir boyutları ulaştığınızda plakaları kaldırılabilir. Ayrıca, farklı Ağar kaplamalar bireysel kolonileri görünürlüğünü artırmak için kullanılabilir. Bu şekilde, bu iletişim kuralı koşulları optimize etmek için küçük değişiklikler böylece bakteri suşları veya çeşitli tedavi seçenekleri bir dizi için hesap için kullanılabilir olarak avantajlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) bizim laboratuvar deneyleri OPKA kurulmasında çok değerli onun yardım için teşekkür. Bu eser FYA için Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 1R01AI123383-01A1 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V (APC conjugated) BioLegend 640919
anti-CD35, human (PE conjugated) BioLegend 333405
anti-CD71, human (PE conjugated) BioLegend 334105
bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) 
blood agar plates Hardy Diagnostic A10
Fetal Clone serum HyClone SH30080.03
glycerol Sigma G9012-1L
HL-60 cells ATCC CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated) BioLegend 400907
N,N-dimethylformamide (DMF) Fisher Chemical UN2265
propidium iodide Sigma P4864
RPMI media with L-glutamine Corning 10-040-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4, (4), 415-422 (1997).
  2. Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9, (3), 480-487 (2013).
  3. Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155, (6), 2094-2097 (1996).
  4. Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. (2018).
  5. Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
  6. Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77, (4), 1502-1513 (2009).
  7. Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23, (11), 1407-1416 (2016).
  8. Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36, (5), 606-614 (2018).
  9. Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, (24), 2209-2218 (2013).
  10. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12, (1), 19-27 (2005).
  11. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75, (5), 2458-2462 (1978).
  12. Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16, (6), 806-810 (2009).
  13. Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
  14. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19, (6), 835-841 (2012).
  15. Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77, (8), 790-797 (2010).
  16. Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
  17. Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
  18. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
  19. Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7, (2), 171-177 (1986).
  20. Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28, (2), 90-99 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics