Трехмерная паттерна инженерных биопленок с сделай-сам Биопринтер

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

В этой статье описывается метод превращения недорогого коммерческого 3D-принтера в бактериальный 3D-принтер, который может облегчить печать узорчатых биопленок. Описаны все необходимые аспекты подготовки биопроинтера и био-чернил, а также методы верификации для оценки формирования биопленок.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Spiesz, E. M., Yu, K., Lehner, B. A., Schmieden, D. T., Aubin-Tam, M. E., Meyer, A. S. Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter. J. Vis. Exp. (147), e59477, doi:10.3791/59477 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Биопленки представляют собой агрегаты бактерий, встроенных в самопроизводно-узорный внеклеточный матрикс. Бактерии внутри биопленки развивают повышенную устойчивость к антибиотикам, которая создает потенциальную опасность для здоровья, но также может быть полезной для экологических применений, таких как очистка питьевой воды. Дальнейшее развитие антибактериальных терапевтических и биопленки-вдохновил приложений потребует разработки воспроизводимых, инженерный методы для создания биопленки. Недавно был разработан новый метод приготовления биопленки с использованием модифицированного трёхмерного (3D) принтера с бактериальной краской. В этой статье описываются шаги, необходимые для создания этой эффективной, недорогой 3D биофинтер, который предлагает несколько применений в бактериально-индуцированной обработки материалов. Протокол начинается с адаптированного коммерческого 3D принтера, в котором экструдер был заменен на био-чернила распылитель подключен к системе шприца насос позволяет управляемый, непрерывный поток био-чернил. Для разработки био-чернил подходит для биопленки печати, инженерии кишечной палочки бактерии были приостановлены в растворе альгината, так что они затвердевают в контакте с поверхностью, содержащей кальций. Включение индуктор химического вещества в печать субстрата диски выражения биопленки белков в печатных био-чернил. Этот метод позволяет 3D печать различных пространственных паттернов, состоящих из дискретных слоев печатных биопленок. Такие территориально контролируемые биопленки могут служить в качестве модельных систем и могут находить применение в различных областях, которые оказывают широкомасштабное воздействие на общество, включая профилактику устойчивости к антибиотикам или очистку питьевой воды, в частности.

Introduction

В настоящее время растет потребность в разработке экологически чистых, устойчивых решений для производства материалов с территориально-узором, в связи с расширением числа рынков для таких материалов1. Эта статья представляет простой, экономичный метод для производства таких материалов и, следовательно, предлагает широкий спектр будущих приложений. Представленный здесь метод позволяет трехмерную (3D) печать пространно-узорных конструкций с использованием био-чернил, содержащей живые бактерии. Бактерии остаются жизнеспособными в печатных структурах в течение более одной недели, что позволяет бактериям выполнять естественные или инженерные метаболические действия. Печатные бактерии могут тем самым производить и депозит желаемых компонентов в рамках печатной структуры, например, создание функциональных кросс-связанной биопленки2.

Традиционные методы производства передовых материалов связаны с высокими энергетическими расходами (например, высокими температурами и/или давлением) и могут производить большое количество химических отходов, часто токсичных веществ, которые требуют широкого использования с высокой стоимостью3 ,4. В отличие от этого, несколько бактериальных видов способны производить материалы, которые могут быть легко применимы в различных отраслях промышленности. К ним относятся полимеры, такие как полигидрокяльканоаты (ГФА)5 или поли (гликолиде-Co-lactide) (плгла)6, Бактериальная целлюлоза7, бактериальные бетонные материалы8, Биомиметические композиты9, Амилоид основе клеи10, или био основе электрических переключателей11, среди других. Кроме того, бактериальное производство ценных материалов, как правило, происходит при близкой температуре и давлении и в окружающих средах, без необходимости или производства токсичных соединений. В то время как производство материалов с бактериями было продемонстрировано в литературе и некоторые промышленные приложения уже появились12,13, надежный метод для пространственного паттерна таких материалов остается проблемой.

Эта статья демонстрирует прямой метод превращения недорогого коммерческого 3D-принтера в 3D-бактериальный принтер. Протокол показывает, как подготовить био-чернила, содержащие и поддержания живых бактерий, а также как подготовить субстраты, на которых 3D печать может быть выполнена. Этот метод подходит для использования с различными природными и инженерии бактериальных штаммов, способных производить материалы. Эти бактерии могут быть территориально распределены в 3D печатной структуры и по-прежнему продолжать свою метаболическую активность, что приведет к пространственному распределению желаемых материалов, производимых бактериями.

Этот метод печати позволяет аддитивное производство биопленок, агрегатов бактерий, окруженных самодпроизводной внеклеточной матрицей. Биопленки являются неоднородными 3D-сетями, в которых белки, полимеры, бактериальные клетки, кислород и питательные вещества являются территориально структурированными14. В виде биопленки бактерии проявляют повышенную устойчивость к антибиотикам и структурную устойчивость, что затрудняет их ликвидацию на поверхностях, включая медицинские катетеры и имплантаты. Ключом к свойствам биопленки, а также крупнейший вызов биопленки исследования, кажется, гетерогенность биопленок15,16,17. Особый интерес представляет производство биопленок, контролируемых в рамках территориально-пространственной модели, поскольку это позволит либо воспроизводить, либо настраивать пространственные структуры компонентов биопленки, способствуя пониманию стабильного осаждения биопленок практически на любой поверхности в Природа.

Эта статья представляет собой метод для производства биопленок с использованием 3D-печатных гидрогелей, содержащих модифицированные бактерии E. coli , которые производят протеины биопленки в присутствии индуктор, а также методы верификации формирования биопленки2 . Основные внеклеточные матрицы компоненты этих биопленок являются curli амилоидных волокон18 , которые содержат самособранном CGA белков. При инженерии E. coli бактерии индуцируется, чтобы выразить белки КПГА, они образуют стабильную модель биопленки, которая защищает клетки от смывается поверхности печати. Такая трехмерная биопленка может быть территориально контролируемой и может послужить полезным исследовательским инструментом для исследования структуры многомасштабной биопленки-механики функций или материаломики19. Эти индивидуальные биопленки помогут пониманию принципов формирования биопленки и их механических свойств, что позволит дополнительно исследовать механизмы устойчивости к антибиотикам среди других применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Преобразование коммерческого 3D-принтера в 3D-биоинтер

  1. Удалите экструдер и нагреватель коммерческого 3D-принтера (таблица материалов) из рамы принтера и отключите проводки, контролирующие эти элементы, от основной печатной платы (рис. 1a). Поскольку датчик, контролирующая оперативную температуру принтера, должен быть функциональным для связи с программным обеспечением принтера, удалите из печатного программного обеспечения алгоритм, который задерживает печать до достижения операционной температуры.
  2. Подключите наконечник пипетки (200 мкл наконечник) через кремниевых труб (внутренний диаметр 1 мм) до 5 мл шприца загружен в шприц насоса. Держатель пипетки наконечник на 3D-принтер экструдер голову в качестве замены для оригинального экструдера (рис. 1B).
  3. Если более чем один тип био-чернил будет использоваться, смонтировать дополнительные трубы системы (ы) и пипетки отзыв (ы) к принтеру.

2. субстрат для подготовки 3D-печати

  1. Добавить 4 мл 5 м КАГЛ2 раствор до 400 мл 1% w/v агар растворенного в Лурии-Бертани БУЛЬОН (lb), дополненный соответствующими антибиотиками и индукторы (здесь 34 мкг/мл хлорамфеникола и 0,5% rhamnose).
  2. Обойтись 20 мл раствора LB-агар в каждую 150 мм х 15 мм чашку Петри. Высушите 30 мин при комнатной температуре с крышкой наполовину открытой.
    Примечание: протокол может быть приостановлен здесь, сохраняя эти печатные подложки при температуре 4 ° c на протяжении нескольких дней.

3. Био-чернила подготовки

  1. Подготовьте раствор альгината натрия (3% w/v) и нагрейте до точки кипения три раза, чтобы стерилизовать раствор. Хранить при температуре 4 ° c до использования.
  2. Выращиваем e. COLI MG1655 Pro Δксга ompR234 (e. coli δксга) бактерии, несущие плазмид pSB1C3-Green ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ белок (GFP) (экспрессия GFP)2 или PSB1C3-GFP-КПГА выражение) на ночь в 37 ° c с встряхивания на 250 оборотов в минуту в 50 мл LB среды, содержащей 34 мкг/мл хлорамфеникола и 0,5% rhamnose.
  3. Центрифуга клеточной культуры в течение 5 минут на 3 220 х г , чтобы гранулы бактерий. Удалите супернатант.
  4. Re-приостановить гранулы бактерии в 10 мл LB среды и добавить 10 мл альгината натрия (3% w/v).

4. процесс 3D печати

  1. Установите и откройте программное обеспечение 3D-печати (таблица материалов) на компьютере. Подключите 3D-принтер к компьютеру. Переместите печатающая головка к его домашнему положению, щелкнув домашнюю кнопку для оси X, Y и Z.
  2. Для каждой печати поместите подготовленную печать подложки на определенном месте на печатной кровати.
  3. Калибровка высоты печатающей головки в оси Z.
    1. Поднять печатающей головки на высоту 22 мм под ручное управление, так что он не будет сталкиваться с краем чашки Петри при перемещении в нужное положение. Расположить печатающая головка поверх пластины и переместить ее вниз до тех пор, пока кончик пипетки не свяжется с поверхностью печати. Назначить эту Z-ось позиции как Z1 (высота поверхности печати).
    2. Поднимите печатающая головка и переместите ее за пределы области пластины ручным управлением в X, Y и Z-топорами. Если рабочее расстояние между печатающей головкой и поверхностью пластины определено как Z2, введите Z1 + Z2 в программу печати в качестве Z-значения во время печати.
  4. Программируйте форму печатания самостоятельно разработанной точеческой координацией, определяемую по желаемой траектории.
    1. Если желаемая траектория представляет собой прямую линию, определите только точки старта и конца. Включение дополнительных точек на изогнутых линиях приведет к более гладким изгибу. Перемещение печатающей головки вручную в каждую точку последовательно, и записывать координаты этих точек в порядке. Ввод всех этих координат, а также печатающая головка скорость перемещения для каждого печатного сегмента в G-код редактора.
  5. Как до, так и после печати, поднимите печатающая головка на расстояние выше кромки пластины (20 мм) и двигайтесь прямо из области пластины. Сохраните эту программу как файл G-код и загрузите непосредственно для использования в последующих принтах, при повторном измерении высоты оси Z для каждого нового печатного подложки.
    Примечание: см. таблицу 1 для примера G-код для печати квадрата.
  6. Загрузите предварительно запрограммированный файл G-Code. Откройте редактор G-кода в программном обеспечении, и программа в командах для печати желаемой формы. На каждой командной строке позиция печатающей головки может быть изменена в оси X, Y и/или Z. Ввод значения Z во время всех этапов печати как Z1 + Z2 (высота поверхности печати + рабочее расстояние).
    Примечание: скорость движения также регулируется; 9 000 мм/мин является подходящим значением для типичных ставок печати.
  7. Загрузите жидкость био-чернил в шприц (ы), и смонтировать их в шприц насоса (ы) 3D биоинтер.
  8. Печать био-чернил на печать подложки, нажав на кнопку печати .
  9. Во время печати, управление печатающей головки движение полностью программным обеспечением. Вручную запустите шприц-насос, прежде чем печатающая головка соприкасается с поверхностью печати.
    Примечание: координация шприца насоса и принтера эмпирически определяется в зависимости от скорости экструзии, скорость, с которой печатающая головка перемещается в первую точку печати, и исходное положение печатающей головки. Если исходная позиция печатающей головки составляет 20 мм, с помощью печатающей головки 9 000 мм/мин и экструзионной скоростью 0,1 мл/ч, начинайте насос-шприц сразу после начала печати. Если экструзионные скорости меняются с 0,1 мл/ч до 0,3 мл/ч, то подождите 2 − 3 с, чтобы запустить шприц-насос после начала печати.
  10. Остановите шприц-насос, как только в последней точке печати прибудет печатающая головка. Остановка насоса шприца перед печатающей головкой поднимает в конце процесса печати, в противном случае избыток био-чернил упадет на печать подложки и уменьшить разрешение печати.
  11. Для построения 3D конструкций, контролировать все движения печатающей головки в G-код редактора. Введите печать в высоту первого слоя. Увеличьте значение Z-значения в G-коде на 0,2 миллиметров для второго слоя, чтобы увеличить высоту печати. После этого увеличьте Z-значение на 0,1 миллиметров при перемещении на более высокий слой. Не перемещаем пластинку во время процесса печати.
  12. Для измерения ширины и высоты печатного гидрогеля используйте стальной правитель, помещенный под или рядом с образцом.

5. выращивание и тестирование эффективности производства биопленки E. coli

  1. Инкубировать напечатанные образцы при комнатной температуре в течение 3 − 6 дней, чтобы позволить производство компонентов биопленки (волокна curli). Изображение пластин с помощью камеры или флуоресцентного сканера.
  2. Чтобы растворить альгинат матрицы, добавить 20 мл 0,5 M раствор цитрат натрия (рН = 7 скорректированы с NaOH) на печатные субстраты, и инкубировать для 2 ч с 30 об/мин встряхивания при комнатной температуре. Выбросьте жидкость и изображения пластин снова сравнить с изображениями пластин до цитрата лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Первым шагом для успешной 3D-печати биопленок является преобразование коммерческого 3D-принтера в биоинтер. Это преобразование достигается путем удаления экструдера и нагревателя принтера, предназначенные для печати с полимерных чернил, и заменив их компонентами, подходящими для печати био-чернил, содержащих живые бактерии (рис. 1A). Экструдер заменяется наконечника пипетки (или советы, если несколько био-чернила будут использоваться в процессе печати) прилагается к системе труб подключен к шприца насоса (рис. 1B). Успешное преобразование коммерческого принтера в биоинтер можно оценить на основе способности передавать желаемые био-чернила (ы) из шприца насоса через систему труб и пипетки отзыв (ы) на печатной поверхности без утечки или нагрева Био-чернил. Если трубы выпуклостей из-за потока био-чернил во время печати, он может быть заменен на трубы с толстыми стенами. Следует отметить, что этот метод печати должен быть в состоянии работать с любым типом коммерческого 3D принтера, для которого трубопровод может быть прикреплен к печатающей головки.

3D-биоинтер может создавать гидрогели для инкапсуяции бактерий в различных двумерных (2D) и 3D формах (рис. 2). Ионы кальция в полиграфической подложке индуцируют затвердевания (комплексообразования ионов кальция с альгината карбоксилических групп) био-чернил при печати, превращая жидкость био-чернил в твердый Гидрогель. Разрешение биопечати будет зависеть от скорости экструзии, размера наконечника пипетки, скорости печатающей головки, объема и концентрации раствора Cal2 , добавленного в раствор агара, плоскости поверхности печати и вязкости используемых био-чернил. Концентрация раствора Cal2 имеет большое влияние на резкость гидрогеля. Четыре различных концентрации КАГЛ2 (0,1 м, 0,2 м, 1 м и 5 м) были пробы, и только 5 m Cal2 раствор привел к гидрогель, который не стал размытым после печати. Таким образом, 5 M был выбран в качестве оптимальной концентрации решения Cal2 .

В более ранней версии этого протокола раствор КАГЛ2 применялся на поверхности агаровой пластины, а не смешивал с раствором агара перед заливкой агаровой пластины. При использовании этой версии, объем решения Cal2 имеет решающее влияние на качество печати и разрешение. При использовании 150 х 15 мм чашки Петри, применяя объем раствора хлорида кальция более 100 мкл (или 30 мкл для 90-мм чашки Петри) приводит к слишком много жидкости, оставшиеся на поверхности печати. Эта жидкость может распространяться неравномерно, когда пластина перемещается, которые могут изменить рабочее расстояние и привести к блокировке наконечника пипетки. Слишком большой объем КАГЛ2 также может привести к тому, что печатные гидрогели плавают и скользят через раствор, изменяя форму и положение печатного гидрогеля. Если объем раствора хлорида кальция слишком мал, то некоторые регионы пластины могут не получить раствор Cal2 и будут иметь плохую затвердевания гидрогеля. В этом усовершенственном протоколе Добавление раствора КАГЛ2 непосредственно в раствор агара до заливки агаровой пластины привело к значительно меньшей влажности на поверхности печатного субстрата по сравнению с поверхностным методом, что привело к значительно улучшилось разрешение печати.

Скорость экструзии и печатающей головки являются взаимозависимыми и могут быть скоординированы таким образом, чтобы изменить разрешение печати. Например, если принтер работает с экструзионной скоростью между 0,1 мл/ч и 0,5 мл/ч при постоянной скорости печатающей головки 300 мм/мин, диаметр печатного гидрогеля возрастает с увеличением скорости экструзии2,20. При экструзии более 0,5 мл/ч внешние края печатных линий гидрогеля изменяются от прямых, параллельных линий до волнистых линий, а ширина линии также увеличивается. Скорость печатающей головки также влияет на разрешение печати. При постоянной экструзионной скорости 0,3 мл/ч увеличение скорости печатающей головки от 300 мм/мин до 500 мм/мин приводит к тому, что ширина печатного гидрогеля становится более узкой и уменьшается с 1,8 мм до 0,9 мм. Если печатающая головка двигается более 500 мм/мин, то гелевая линия легко становится прерывистою. Для наконечника пипетки 200 мкл и био-чернил, используемых в текущем исследовании, несколько комбинаций печатного разрешения считаются оптимальными (Таблица 2). При насосной скорости 0,3 мл/ч, печатающая головка скорость движения 500 мм/мин, и рабочее расстояние 0,2 мм, печатный Гидрогель производится с шириной около 0,9 мм.

Одним из важнейших достижений бактериального метода 3D-печати является его способность создавать модифицированные биопленки. Для создания Модифицированной и территориально контролируемой биопленки бактерии должны не только выживать в процессе 3D-печати, но и производить компоненты биопленки, оставаясь при этом в печатной структуре. Разработанные бактерии e. coli , используемые в этом протоколе, e. coli δксга бактерии, несущие ПЛАЗМИД pSB1C3-GFP-КПГА, позволяют контролируемым выражению белков curli. Использование штамма « сбга-нокаут» гарантирует, что белок КПГА будет выражен только тогда, когда он будет индуцированный из плазмида с помощью рхамноса. Бактерии экспортируют индуцированные белковые подразделения КПГА, которые затем самостоятельно собирают21 на белки кпгб на бактериальной внешней мембране22 , образуя волокна Керли. Эти амилоидные, как волокна являются основными протеинковых компонентов биопленки внеклеточной матрицы: подключенные сети белков и полимеров, в которых бактерии встроены. Напечатанная альгината матрица 3D-печати био-чернил придает физическую поддержку и структуру бактерий во время процесса производства curli. Использование в качестве учредительных выражений GFP позволяет визуализировать и количественно определять количество печатных клеток с помощью флуоресцентной визуализации.

Для того, чтобы оценить, было ли формирование биопленки успешным, альгината матрица была распущена с помощью раствора цитрата натрия, и форма печатных био-чернил была оценена после лечения цитрата (рис. 3). В случае био-чернил без индаструал curli производства плазмида, печатный образец был полностью распущен после лечения цитрата натрия, означающий, что нет сети биопленки curli сформировали (Рисунок 3A, B). В случае бактерий, содержащих индуцичный curli производства плазмида, гель не растворился после лечения цитрата натрия (рис. 3C, D). Этот результат показывает, что печатные бактерии смогли сформировать сеть curli достаточно обширной, чтобы стабилизировать печатный образец бактерий2.

Для построения многослойных конструкций были напечатаны дополнительные слои (рис.4) путем корректировки высоты печати и траектории печати в редакторе G-Code. Увеличение количества печатных слоев в образце привело к увеличению ширины и высоты печатных конструкций постепенно (Диаграмма 5)2,20, но даже 5-слойные печатные структуры могут быть созданы с разрешением миллиметров до суб-миллиметров. Когда e. coli инженерии к промышленно производить curli белки были напечатаны в многослойные структуры, лечение цитрат натрия не растворить образцы, в то время как многослойные структуры, содержащие non-curli-производство кишечной палочки были растворенного в растворе цитрата натрия (Рисунок 6). Этот эксперимент показывает, что проектированные биопленки могут создаваться в многослойных трёхмерных печатных конструкциях, а также в однослойных печатных конструкциях.

Figure 1
Рисунок 1: фотографии, показывающие преобразование коммерческого 3D-принтера в 3D-биоинтер. A) компоненты 3D-биоинтера после конвертации из коммерческого 3D-принтера. (B) экструдер био-чернил, сформированная системой труб, прикрепленной к пипетке. Дополнительные советы печати могут быть добавлены во второй отверстие печатающей головки или путем добавления дополнительных отверстий для печатающей головки, для использования в печати несколько типов био-чернил. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: примеры 3D биопитированных моделей, содержащих E. coli PSB1C3-Гфф-КПГА. Эти снимки были сделаны через два дня после печати. Эта печать разрешение было получено с скоростью перекачки 0,3 mL/h, печатающая головка скорость движения 300 mm/min, и рабочее расстояние 0,2 mm. G-коды для печати этих форм могут быть найдены в дополнительных файлах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: метод проверки того, были ли компоненты биопленки произведены бактериями E. coli в рамках печатного образца. При печати E. coli содержится плазмида, которая не кодировать для curli индукции, печатный образец был полностью распущен лечения цитрата натрия (а и б). Когда E. coli , содержащая плазмид кодирующих индуцировать curli белков был использован, печатные биопленки был устойчив к лечению цитрата натрия (C и D). Процесс программирования и объяснения G-кодекса для печати этого квадратного шаблона приведены в таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: вид сверху (A) и боковой вид (B) многослойных печатных конструкций, содержащих E. coli pSB1C3-GFP-КПГА. Этот образец был напечатан с насосной скоростью 0,3 мл/ч, печатающая головка скорость движения 200 мм/мин, и рабочее расстояние 0,2 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: ширина линии и высота печатных гидрогелей, содержащих различное количество печатных слоев. Измерения проводились на образцах, напечатанных с скоростью откачки 0,3 мл/ч, печатающая головка скорость движения 500 мм/мин, и рабочее расстояние 0,2 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: метод проверки того, были ли компоненты биопленки произведены бактериями E. coli в рамках многослойных печатных конструкций. Проектированная кишечная палочка была напечатана в 1-, 3-или 5-слойные гидрогели и инкубирована в течение 6 дней. Когда печатная E. coli содержала плазмид, которая не кодировать для индукции curli, печатный узор был полностью распущен лечением цитрата натрия (a и B). Когда печатная кишечная палочка содержала плазмид, кодирующий индусные белки, печатная биопленка была устойчива к лечению цитрата натрия (C и D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Команды G-кода Задачи
G1 Z20 F9000 Поднимите Z-ось на высоту 20 мм с движущейся скоростью 9 000 мм/мин.
G1 АВТОБУС X95 Y65 F9000 Перемещение к исходной точке первой линии с движущейся скоростью 9 000 мм/мин.
G1 Z6 F9000 Перемещение вниз в Z-направлении в надлежащее (здесь Z = 6 мм) расстояние печати.
G1 АВТОБУС X95 Y105 F300 Конечный пункт первой строки и отправная точка второй строки.
G1 X135 Y105 Конечный пункт второй линии и отправная точка третьей строки.
G1 X135 Y65 Конечный пункт третьей линии и отправная точка четвертой строки.
G1 АВТОБУС X95 Y65 Конечной точкой четвертой строки и отправной точкой первой строки; образуется квадрат.
G1 Z20 F9000 Поднимите Z-ось на высоту 20 мм на 9 000 мм/мин.
G1 X55 Y40 F9000 Перемещение к координатам (55, 40) за пределами диапазона Петри.

Таблица 1: процесс программирования и объяснения G-кода для печати квадрата.

Скорость экструзии (mL/h) Печатающая головка скорость (мм/мин) Гель ширина (мм)
0,1 100 1,6 ± 0,1
0,1 200 1,1 ± 0,1
0,1 300 1,0 ± 0,1
0,3 300 1,8 ± 0,1
0,3 400 1,2 ± 0,1
0,3 500 0,9 ± 0,1
0,5 200 2,2 ± 0,2
0,5 1 200 1,2 ± 0,2
0,7 200 2,8 ± 0,1
0,7 1 200 1,3 ± 0,1

Таблица 2: оптимальные параметры печати для гидрогелей с высоким разрешением. Пять очков были измерены для каждого условия. Среднее значение и стандартное отклонение отображаются в таблице.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, представленный здесь для 3D-печати инженерных биопленок, имеет два критических шага. Во-первых, является подготовка поверхности агаровой печати, которая является наиболее важным фактором для производства конкретного разрешения печати. Важно обеспечить, чтобы поверхность печати была плоской и чтобы Пипетка на печатающей головки была расположена на правильной высоте от поверхности. Если поверхность не плоская, рабочее расстояние изменится во время процесса печати. Если рабочее расстояние меньше 0,1 мм, раствор КАГЛ2 может войти внутрь наконечника пипетки и вызвать образование гидрогеля, в результате чего кончик пипетки засориться. Если рабочее расстояние составляет более 0,3 мм, гель не может быть напечатан непрерывно. Оптимальное рабочее расстояние в данном исследовании составляет 0,2 мм. хорошие подходы для подготовки плоских поверхностей агар печати являются использование большего диаметра чашки Петри (150-мм-диаметр чашки Петри, а не 90-мм-диаметр пластины), поместите пластины на плоский стол, залить агар раствор с быстрой и даже скорость, и избежать перемещения агар пластины во время его затвердевания.

Вторым критическим шагом является выбор желаемых параметров печати, включая скорость перекачивания, вязкость используемой био-чернил и печатающая головка скорость, которые определяют результирующее разрешение печати. Для эффективного выбора этих параметров пользователь может попробовать несколько экстремальных значений для печатающей головки с постоянным экструзионной скоростью, отметив ширину печатного гидрогеля для каждого набора условий. Затем повторите этот эксперимент с 4 другими ставками экструзии. Далее, Возьмите пять комбинаций, которые произвели лучшее разрешение печати для приложения, и различаются как параметры печати (накачки и печатающей головки скорости) в меньших и меньших шагов, пока не получено желаемого разрешения.

Толщина печатных линий влияет на способность печатных инженерных бактерий формировать стабильные биопленки. При оптимальных условиях печати (скорость перекачки 0,3 мл/ч, печатающая головка скорость 300 мм/мин, и рабочее расстояние 0,2 мм), печатные линии био-чернил будет производить стабильные биопленки после 3-6 дней инкубации при комнатной температуре. Если линии становятся толще, например, путем увеличения скорости перекачки, то средние регионы каждой линии не могут быть достаточно индуцированные для производства цитрат-стабильных биопленок.

При печати многослойной био-чернил гидрогель, каждый печатный слой затвердевает при контакте ионов кальция, которые распространяются на предыдущий печатный слой. Поскольку концентрация CA2 + в печатной подложке высока, ионы Ca2 + могут быстро диффундировать через нижние слои. Поэтому верхние слои могут быть напечатаны сразу же после печати предыдущих слоев, просто регулируя высоту печати в редакторе G-кода. Кроме того, расстояние печати верхнего слоя должно быть ограничено только 0.1 − 0,2 мм выше, чем расстояние печати предыдущего слоя. Если добавленное расстояние печати меньше 0,1 мм, кончик будет тащить через первый слой и уменьшить разрешение печатного гидрогеля. Если добавленное расстояние печати больше, чем 0,2 мм, био-чернила образуют капли жидкости во время экструзии, вызывая разрывные гидрогель, чтобы стать прерывистыми.

Текущий метод биокорки позволяет производство воспроизводимых, территориально управляемых биопленок, пригодных для использования при изучении биопленки механических свойств или биологической устойчивости бактерий биопленки к различным факторам, включая антибиотики, сурфактанты и др. Эта возможность обеспечивает прямое удобство предлагаемого метода. Развитие высокой точности сделай сам (DIY) биопечати, вероятно, будет возможно путем поддержания печати рабочее расстояние, но снижение скорости накачки и движущейся скорости печатающей головки, или выборки различных экструдер геометрий и Био-чернила химические вещества. С будущими улучшениями к разрешению печатания, дополнительные применения можно включить как инженерство ткани или поставка снадобья. 3D биокорки подход, описанный здесь также должны быть в состоянии быть расширена на печать дополнительных типов бактерий видов, которые являются биосовместимыми с нашей альгината основе био-чернил. Текущий протокол обеспечивает достаточное стерильность путем многократного кипячения био-чернил во время приготовления, используя стерильные шприцы и печатные советы, и используя антибиотики как в био-чернил, так и в печатной пластине. Будущие эксперименты с использованием бактерий дикого типа могут потребовать дополнительных мер стерилизации, таких как замена или дезинфекция системы труб между принтами.

Для лучших знаний авторов, представленный метод (первоначально разработанный в Ленер et al.20) является первым опубликованным примером стиля аддитивного производства для 3D-печати бактерий. В первой части этого протокола, этот общий метод описан в деталях для 3D печати бактерий, который применяется к производству инженерных биопленок2. С помощью этого метода можно использовать несколько будущих применений 3D-печатных биопленок. В природе развились множественные бактериальные системы, которые создают различные типы биопленок, из которых в этой статье была изучена единая система. Несколько других систем могут быть легко изучены путем создания 3D-печатных биопленок с другими бактериальными системами, такими как Сенная палочка или Ацетабачные изделия ксилинум. Альтернативные методы23,24 были также разработаны для пространственного паттерна бактерий при высоком разрешении с помощью оптических сигналов. Эти подходы требуют более дорогостоящего, сложного оборудования для их достижения по сравнению с этим принтером, и подходят только для кучность генетически модифицированных бактерий.

Способность к пространственной структуре 3D-печатных биопленок с помощью этого метода позволяет создавать проектированные биопленки, воспроизводящие пространственную неоднородность естественных биопленок25. Из-за высокой детализации расположения белков и полимерных волокон внутри биопленки, бактерии в состоянии биопленки достигают гораздо более высокой устойчивости к химическим и физическим стимулам, таким как повышенная устойчивость к антибиотикам по сравнению с тем же бактерии в планктонической состоянии. Кроме того, бактерии в биопленку показывают повышенную устойчивость к потоку жидкости, что делает поддержание и стерильность имплантируемых медицинских устройств гораздо более трудным26. Печатные модифицированные биопленки, которые пытаются воспроизвести специфические пространственные распределения компонентов биопленки, являются мощными инструментами для изучения механизмов, посредством которых бактерии в биопленку достигают фенотипов резистентности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом АОАР (No. FA2386-18-1-4059), Нидерландская организация научных исследований (НВО/OCW) в рамках программы "границы нанонауки" и программы "передовые материалы NWO-НФК" (No 729.001.016). Авторы признают лабораторную помощь Рамона ван дер валка и Роланда Киффер.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer CoLiDo 3D-P Kit
3D printing software CoLiDo Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar Sigma-Aldrich 05040
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C7902
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Chloramphenicol Sigma-Aldrich 3886.1
LB broth powder Sigma-Aldrich L3022
Orbital shaker VWR 89032-092 Model 3500
Petri dish VWR 25384-326 150 x 15 mm
Rhamnose Sigma-Aldrich 83650
Silicon tubing VWR  DENE 3100103/25
Syringe pump ProSense B.V.  NE-300
Sodium alginate Sigma-Aldrich W201502
Sodium citrate monobasic Sigma-Aldrich 71498
Sodium hydrooxide VWR 28244.295

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (47), 14444-14451 (2015).
  2. Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7, (5), 1328-1337 (2018).
  3. Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354, (6308), 107-110 (2016).
  4. Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8, (1), 287 (2017).
  5. Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
  6. Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34, (4), 435-440 (2016).
  7. Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7, (1), 11860 (2017).
  8. Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56, (1/2), (2011).
  9. Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1, (8), 559-564 (2016).
  10. Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9, (10), 858-866 (2014).
  11. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13, (5), 515-523 (2014).
  12. Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
  13. Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18, (9), 423-430 (2010).
  14. Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4, (5), (2013).
  15. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15, (2), 167-193 (2002).
  16. Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7, (1), 1-7 (2015).
  17. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6, (3), 199-210 (2008).
  18. Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49, (9), 875-884 (2005).
  19. Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
  20. Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6, (7), 1124-1130 (2017).
  21. Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282, (6), 3713-3719 (2007).
  22. Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 , (13), 6562-6566 (1996).
  23. Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7, (5), 1195-1200 (2018).
  24. Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (14), 3698-3703 (2018).
  25. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6, (3), 199-210 (2008).
  26. Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics