Modelage tridimensionnel de biofilms d’ingénierie avec une Bioimprimeur de bricolage

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Bioengineering

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Summary

Cet article décrit une méthode de transformation d’une imprimante 3D commerciale à faible coût en une imprimante 3D bactérienne qui peut faciliter l’impression de biofilms à motifs. Tous les aspects nécessaires de la préparation du bioimprimeur et de la bio-encre sont décrits, ainsi que des méthodes de vérification pour évaluer la formation de biofilms.

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Spiesz, E. M., Yu, K., Lehner, B. A., Schmieden, D. T., Aubin-Tam, M. E., Meyer, A. S. Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter. J. Vis. Exp. (147), e59477, doi:10.3791/59477 (2019).

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Abstract

Les biofilms sont des agrégats de bactéries incorporées dans une matrice extracellulaire à motifs spatialement auto-produits. Les bactéries au sein d’un biofilm développent une résistance accrue aux antibiotiques, qui présente des dangers potentiels pour la santé, mais peuvent également être bénéfiques pour les applications environnementales telles que la purification de l’eau potable. Le développement ultérieur de thérapies antibactériennes et d’applications inspirées par le biofilm exigera le développement de méthodes reproductibles et ingéniables pour la création de biofilms. Récemment, une nouvelle méthode de préparation de biofilm utilisant une imprimante tridimensionnelle (3D) modifiée avec une encre bactérienne a été développée. Cet article décrit les étapes nécessaires à la construction de cette bio-imprimante 3D efficace et économique qui offre plusieurs applications dans le traitement des matériaux induits par les bactériotiques. Le protocole commence par une imprimante 3D commerciale adaptée dans laquelle l’extrudeuse a été remplacée par un distributeur d’encre bio relié à un système de pompe à seringue permettant un flux continu et contrôlable de bio-encre. Pour développer une bio-encre appropriée pour l’impression de biofilm, les bactéries d' Escherichia coli modifiées ont été suspendues dans une solution d’alginate, de sorte qu’elles solidifient en contact avec une surface contenant du calcium. L’inclusion d’un produit chimique inducteur dans le substrat d’impression entraîne l’expression de protéines de biofilm dans la bio-encre imprimée. Cette méthode permet l’impression 3D de divers modèles spatiaux composés de couches discrètes de biofilms imprimés. Ces biofilms contrôlés spatialement peuvent servir de systèmes modèles et peuvent trouver des applications dans de multiples domaines qui ont un impact large sur la société, y compris la prévention de la résistance aux antibiotiques ou la purification de l’eau potable, entre autres.

Introduction

Il est actuellement de plus en plus nécessaire de développer des solutions respectueuses de l’environnement et durables pour la production de matériaux à motifs spatiaux, en raison du nombre croissant de marchés pour ces matériaux1. Cet article présente une méthode simple et économique pour la production de ces matériaux et offre donc un large éventail d’applications futures. La méthode présentée ici permet l’impression tridimensionnelle (3D) de structures spatialement modelés à l’aide d’une bio-encre contenant des bactéries vivantes. Les bactéries demeurent viables dans les structures imprimées pendant plus d’une semaine, ce qui permet aux bactéries d’effectuer des activités métaboliques naturelles ou machinées. Les bactéries imprimées peuvent ainsi produire et déposer les composants souhaités dans la structure imprimée, par exemple en créant un biofilm réticulé fonctionnel2.

Les méthodes traditionnelles de production de matériaux de pointe impliquent des dépenses énergétiques élevées (par exemple, des températures et/ou des pressions élevées) et peuvent produire de grandes quantités de déchets chimiques, souvent des substances toxiques nécessitant une utilisation extensive des coûts3 ,4. En revanche, plusieurs espèces bactériennes sont en mesure de produire des matériaux qui peuvent être facilement applicables dans diverses industries. Ces matériaux comprennent des polymères tels que les polyhydroxyalcanoates (PHA)5 ou poly (glycolide-co-lactide) (PGLA)6, la cellulose bactérienne7, les matériaux de béton bactérien8, les composites biomimétiques9, adhésifs à base d’amyloïdes10, ou des commutateurs électriques à base de bio11, entre autres. En outre, la production bactérienne de matériaux de valeur se déroule généralement à des températures et des pressions proches de l’environnement et dans des environnements aqueux, sans nécessiter ni produire de composés toxiques. Alors que la production de matériaux avec des bactéries a été démontrée dans la littérature et certaines applications industrielles ont déjà émergé12,13, une méthode fiable pour la structuration spatiale de ces matériaux reste un défi.

Cet article illustre une méthode simple de conversion d’une imprimante 3D commerciale à faible coût en une imprimante bactérienne 3D. Le protocole montre comment préparer une bio-encre contenant et soutenant les bactéries vivantes, ainsi que la façon de préparer des substrats sur lesquels l’impression 3D peut être effectuée. Cette méthode est appropriée à utiliser avec une variété de souches bactériennes naturelles et modifiées capables de produire des matériaux. Ces bactéries peuvent être réparties spatialement dans une structure imprimée en 3D et continuer leur activité métabolique, ce qui entraînera une distribution spatiale des matériaux désirés produits par les bactéries.

Cette méthode d’impression permet la fabrication additive de biofilms, d’agrégats de bactéries entourés d’une matrice extracellulaire autoproduite. Les biofilms sont des réseaux 3D hétérogènes dans lesquels les protéines, les polymères, les cellules bactériennes, l’oxygène et les nutriments sont tous spatialement structurés14. Sous la forme d’un biofilm, les bactéries présentent une résistance accrue aux antibiotiques et une robustesse structurelle, ce qui les rend difficiles à éradiquer des surfaces, y compris les cathéters médicaux et les implants. La clé des propriétés du biofilm, et aussi le plus grand défi pour la recherche sur le biofilm, semble être l’hétérogénéité des biofilms15,16,17. La production de biofilms modèles contrôlés spatialement est d’un intérêt particulier car elle permettrait de reproduire ou de régler les schémas spatiaux des composantes du biofilm, facilitant ainsi la compréhension du dépôt stable de biofilms sur pratiquement n’importe quelle surface dans nature.

Cet article présente une méthode pour la production de biofilms à l’aide d’hydrogels imprimés en 3D contenant des bactéries E. coli d’ingénierie qui produisent des protéines de biofilm en présence d’un inducteur, ainsi que des méthodes de vérification de la formation de biofilm2 . Les principaux composants de la matrice extracellulaire de ces biofilms sont les fibres amyloïdes18 qui contiennent des protéines CSGA auto-assemblées. Lorsque les bactéries E. coli sont induites pour exprimer des protéines CSGA, elles forment un biofilm modèle stable qui protège les cellules contre leur lavage hors de la surface d’impression. Un tel biofilm imprimé en 3D peut être contrôlé spatialement et peut servir d’outil de recherche utile pour l’investigation de la mécanique à plusieurs échelles de la structure de biofilm ou de la matériomique19. Ces biofilms sur mesure aideront à comprendre les principes de la formation des biofilms et leurs propriétés mécaniques, permettant ainsi de poursuivre la recherche sur les mécanismes de résistance aux antibiotiques entre autres applications.

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Protocol

1. conversion d’une imprimante 3D commerciale en bioimprimante 3D

  1. Retirez l’extrudeuse et le radiateur d’une imprimante 3D commerciale (table des matières) du cadre de l’imprimante et débranchez le câblage contrôlant ces éléments de la carte de circuit principal (figure 1a). Étant donné que le capteur qui contrôle la température de fonctionnement de l’imprimante doit être fonctionnel pour communiquer avec le logiciel de l’imprimante, retirez du logiciel d’impression l’algorithme qui retarde l’impression jusqu’à ce que la température opérationnelle soit atteinte.
  2. Raccorder une pointe de pipette (200 μL de pointe) par tube de silicium (diamètre intérieur de 1 mm) à une seringue de 5 mL chargée dans une pompe à seringue. Montez l’embout de la pipette sur la tête de l’extrudeuse de l’imprimante 3D en remplacement de l’extrudeuse d’origine (figure 1b).
  3. Si vous utilisez plus d’un type de bio-encre, montez les systèmes de tuyauterie supplémentaires et les pointes de pipette sur l’imprimante.

2. préparation du substrat pour l’impression 3D

  1. Ajouter 4 mL de 5 M de solution CaCl2 à 400 ml d’agar 1% p/v dissous dans du bouillon de Luria-BERTANI (lb), additionné d’antibiotiques et d’inducteurs appropriés (ici 34 μg/ml de chloramphénicol et 0,5% de rhamnose).
  2. Verser 20 mL de la solution LB-agar dans chaque boîte de Petri de 150 mm x 15 mm. Sécher 30 min à température ambiante avec le couvercle demi-ouvert.
    Remarque: le protocole peut être suspendu ici en stockant ces substrats d’impression à 4 ° c pendant plusieurs jours.

3. préparation de la bio-encre

  1. Préparer une solution d’alginate de sodium (3% p/v) et chauffer au point d’ébullition trois fois pour stériliser la solution. Conserver à 4 ° c jusqu’à l’utilisation.
  2. Cultiver e. coli MG1655 Pro Δcsga ompR234 (e. coli δcsga) bactéries porteuses de plasmides pSB1C3-green fluorescent protein (GFP) (expression GFP constitutive)2 ou PSB1C3-GFP-CSGA (expression GFP constitutive, CSGA induisible par rhamnose l’expression) nuit à 37 ° c avec agitation à 250 tr/min dans 50 mL de milieu LB contenant 34 μg/mL de chloramphénicol et 0,5% de rhamnose.
  3. Centrifugez la culture cellulaire pendant 5 min à 3 220 x g pour pellets les bactéries. Enlevez le surnageant.
  4. Résuspendez le culot bactérien dans 10 mL de milieu LB et ajoutez 10 mL d’alginate de sodium (3% p/v).

4. processus d’impression 3D

  1. Installez et ouvrez le logiciel d’impression 3D (table des matières) sur un ordinateur. Connectez l’imprimante 3D à l’ordinateur. Déplacez la tête d’impression à sa position d’origine en cliquant sur le bouton d’accueil pour les axes X, Y et Z.
  2. Pour chaque impression, placez un substrat d’impression préparé sur un emplacement particulier sur le lit d’impression.
  3. Calibrer la hauteur de la tête d’impression dans l’axe Z.
    1. Soulever la tête d’impression à une hauteur de 22 mm sous contrôle manuel, de sorte qu’elle ne se heurte pas au bord de la boîte de Petri lors du déplacement à la position souhaitée. Positionnez la tête d’impression au-dessus de la plaque et déplacez-la jusqu’à ce que l’embout de la pipette contacte la surface d’impression. Affectez cette position de l’axe Z comme Z1 (la hauteur de la surface d’impression).
    2. Soulevez la tête d’impression et déplacez-la à l’extérieur de la zone de la plaque par commande manuelle dans les axes X, Y et Z. Si la distance de travail entre la tête d’impression et la surface de la plaque est définie comme Z2, entrez Z1 + Z2 dans le programme d’impression en tant que valeur Z pendant l’impression.
  4. Programmez la forme d’impression par une méthode de coordonnées point par point auto-développée selon la trajectoire souhaitée.
    1. Si la trajectoire souhaitée est une ligne droite, définissez uniquement les points de début et de fin. Y compris les points supplémentaires sur les lignes courbes se traduira par des courbes plus lisses. Déplacez la tête d’impression manuellement à chaque point séquentiellement, et enregistrez les coordonnées de ces points dans l’ordre. Entrez toutes ces coordonnées, ainsi que la vitesse de déplacement de la tête d’impression pour chaque segment imprimé dans l’éditeur de code G.
  5. Avant et après l’impression, soulevez la tête d’impression à une distance supérieure au bord de la plaque (20 mm) et sortez directement de la zone de la plaque. Enregistrez ce programme sous forme de fichier G-code et chargez-le directement pour une utilisation dans les impressions ultérieures, tout en remesurant la hauteur de l’axe Z pour chaque nouveau substrat d’impression.
    Remarque: Voir le tableau 1 pour un exemple de code G pour l’impression d’un carré.
  6. Chargez le fichier de code G préprogrammé. Ouvrez l’éditeur de code G dans le logiciel et programmez dans les commandes d’impression de la forme souhaitée. À chaque ligne de commande, la position de la tête d’impression peut être modifiée dans l’axe X, Y et/ou Z. Entrez la valeur Z pendant toutes les étapes d’impression comme Z1 + Z2 (hauteur de la surface d’impression + distance de travail).
    Remarque: la vitesse de déplacement est également réglable; 9 000 mm/min est une valeur appropriée pour les taux d’impression typiques.
  7. Chargez la bio-encre liquide dans la (les) seringue (s) et montez-les dans la (les) pompe (s) de seringue de la bioimprimante 3D.
  8. Imprimez la bio-encre sur le substrat d’impression en cliquant sur le bouton Imprimer .
  9. Pendant l’impression, contrôlez le mouvement de la tête d’impression entièrement par le logiciel. Démarrez manuellement la pompe de la seringue avant que la tête d’impression n’entre en contact avec la surface de l’imprimante.
    Remarque: la coordination de la pompe de la seringue et de l’imprimante est déterminée empiriquement en fonction de la vitesse d’extrusion, de la vitesse à laquelle la tête d’impression se déplace jusqu’au premier point, ainsi que de la position initiale de la tête de tête. Si la position initiale de la tête d’impression est de 20 mm, avec une vitesse de tête d’impression de 9 000 mm/min et une vitesse d’extrusion de 0,1 mL/h, démarrez la pompe de la seringue immédiatement après le démarrage de l’impression. Si la vitesse d’extrusion est changée de 0,1 mL/h à 0,3 mL/h, attendre 2 − 3 s pour démarrer la pompe de la seringue après le démarrage de l’impression.
  10. Arrêter la pompe de la seringue dès que la tête d’impression arrive au dernier point de l’imprimerie. Arrêtez la pompe de la seringue avant que la tête d’impression ne se lève à la fin du processus d’impression, sinon l’excès de bio-encre va tomber sur le substrat d’impression et réduire la résolution d’impression.
  11. Pour la construction de structures 3D, contrôlez tous les mouvements de la tête d’impression dans l’éditeur de code G. Saisissez la hauteur d’impression de la première couche. Augmentez la valeur Z dans le G-code par 0,2 millimètres pour la deuxième couche pour augmenter la hauteur d’impression. Par la suite, augmentez la valeur Z de 0,1 millimètres lors du déplacement vers une couche supérieure. Ne déplacez pas la plaque pendant le processus d’impression.
  12. Pour mesurer la largeur et la hauteur de l’hydrogel imprimé, utilisez une règle en acier placée sous ou à côté de l’échantillon.

5. cultiver et tester l’efficacité de la production de biofilms par E. coli

  1. Incuber les échantillons imprimés à température ambiante pendant 3 − 6 jours pour permettre la production de composants de biofilm (fibres de curli). Image des plaques à l’aide d’un appareil photo ou d’un scanner fluorescent.
  2. Pour dissoudre la matrice d’alginate, ajouter 20 mL de solution de citrate de sodium 0,5 M (pH = 7 ajustée avec NaOH) aux substrats d’impression et incuber pendant 2 h avec 30 tr/min en secouant à température ambiante. Jetez le liquide et l’image des plaques à nouveau pour comparer avec les images des plaques avant le traitement du citrate.

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Representative Results

La première étape pour l’impression 3D réussie des biofilms est la conversion d’une imprimante 3D commerciale en bioimprimeur. Cette conversion est obtenue en enlevant l’extrudeuse et le radiateur de l’imprimante, conçus pour l’impression avec une encre polymérique, et en les remplaçant par des composants appropriés pour l’impression de bio-encres contenant des bactéries vivantes (figure 1a). L’extrudeuse est remplacée par une pointe de pipette (ou des pointes, si plusieurs encres biologiques seront utilisées dans le processus d’impression) fixées à un système de tuyauterie relié à une pompe à seringue (figure 1b). La conversion réussie de l’imprimante commerciale en bioimprimeur peut être évaluée en fonction de la capacité de transférer les bio-encres souhaitées de la pompe de la seringue à travers le système de tubulure et les pointes de pipette sur une surface d’impression sans fuite ni chauffage du Bio-encre. Si le tuyau se gonflait en raison du flux de bio-encre pendant l’impression, il peut être remplacé par un tube avec des parois plus épaisses. Il convient de noter que cette technique d’impression devrait être capable de travailler avec n’importe quel type d’imprimante 3D commerciale pour laquelle le tube peut être attaché à la tête d’impression.

La bioimprimante 3D peut créer des hydrogels encapsulant des bactéries dans une variété de formes bidimensionnelles (2D) et 3D (figure 2). Les ions calciques dans le substrat d’impression induisent la solidification (chélation des ions calciques avec les groupes carboxyle d’alginate) de la bio-encre lors de l’impression, convertissant la bio-encre liquide en un hydrogel solide. La résolution de la bioimpression dépendra de la vitesse d’extrusion, de la taille de l’embout de la pipette, de la vitesse de la tête d’impression, du volume et de la concentration de la solution CaCl2 ajoutée à la solution d’agar, de la planéité de la surface d’impression et de la viscosité de la bio-encre utilisée. La concentration de la solution CaCl2 a une grande influence sur la netteté de l’hydrogel. Quatre concentrations différentes de CaCl2 (0,1 m, 0,2 m, 1 m et 5 m) ont été échantillonnées, et seulement 5 m de solution CaCl2 ont entraîné un hydrogel qui n’est pas devenu flou après l’impression. Par conséquent, 5 M a été choisie comme la concentration optimale de la solution CaCl2 .

Dans une version antérieure de ce protocole, la solution CaCl2 a été appliquée sur la surface de la plaque d’agar plutôt que mélangée dans la solution d’agar avant de verser la plaque de gélose. Lors de l’utilisation de cette version, le volume de la solution CaCl2 a une influence critique sur la qualité d’impression et la résolution. Lors de l’utilisation d’une boîte de Petri de 150 x 15 mm, l’application d’un volume de solution de chlorure de calcium de plus de 100 μL (ou 30 μL pour une boîte de Petri de 90 mm) entraîne une trop grande quantité de liquide restant sur la surface d’impression. Ce liquide peut se propager de manière inégale lorsque la plaque est déplacée, ce qui peut changer la distance de travail et provoquer un blocage de l’embout de la pipette. Trop de volume de CaCl2 peut également provoquer des hydrogels imprimés pour flotter et glisser à travers la solution, en changeant la forme et la position de l’hydrogel imprimé. Si le volume de solution de chlorure de calcium est trop petit, certaines régions de la plaque peuvent ne pas recevoir la solution CaCl2 et auront une faible solidification d’hydrogel. Dans ce protocole amélioré, l’ajout de la solution CaCl2 directement dans la solution de gélose avant le déversement de la plaque d’Agar a entraîné une humidité nettement moindre sur la surface du substrat d’impression par rapport à la méthode appliquée à la surface, ce qui a entraîné résolution d’impression nettement améliorée.

La vitesse d’extrusion et le mouvement de la tête d’impression sont interdépendants et peuvent être réglés de manière coordonnée pour modifier la résolution d’impression. Par exemple, si l’imprimante est utilisée avec une vitesse d’extrusion comprise entre 0,1 ml/h et 0,5 ml/h avec une vitesse de déplacement de la tête d’impression constante de 300 mm/min, le diamètre de l’hydrogel imprimé augmente avec l’augmentation de la vitesse d’extrusion2,20. À des vitesses d’extrusion supérieures à 0,5 mL/h, les bords extérieurs des lignes imprimées de l’hydrogel changent des lignes droites, parallèles aux lignes ondulées, et la largeur de ligne augmente également. La vitesse de la tête d’impression a également une influence sur la résolution. Avec une vitesse d’extrusion constante de 0,3 mL/h, l’augmentation de la vitesse de la tête d’impression de 300 mm/min à 500 mm/min résulte en la largeur de l’hydrogel imprimé devenant plus étroit, diminuant de 1,8 mm à 0,9 mm. Si la vitesse de déplacement de la tête d’impression est supérieure à 500 mm/min, la ligne de gel deviendra facilement discontinue. Pour une pointe de pipette de 200 μL et la bio-encre utilisée dans l’étude en cours, plusieurs combinaisons de la résolution d’impression sont considérées comme optimales (tableau 2). À la vitesse de pompage 0,3 mL/h, la vitesse de déplacement de la tête d’impression 500 mm/min, et la distance de travail 0,2 mm, l’hydrogel imprimé est produit avec une largeur d’environ 0,9 mm.

Une réalisation cruciale de la méthode d’impression 3D bactérienne est sa capacité à créer des biofilms d’ingénierie. Pour créer un biofilm conçu et contrôlé spatialement, les bactéries ne devraient pas seulement survivre au processus d’impression 3D, mais devraient également produire des composants de biofilm tout en restant dans le modèle imprimé. Les bactéries e. coli modifiées utilisées dans ce protocole, les bactéries δcsga e. coli porteuses du plasmide pSB1C3-GFP-CSGA, permettent une expression contrôlable des protéines curli. L’utilisation d’une souche CSGA-Knockout permet de s’assurer que la protéine CSGA n’est exprimée que lorsqu’elle est induite par un plasmide avec le rhamnose. Les bactéries exportent les sous-unités de protéine CsgA induites, qui s’assemblent alors21 sur des protéines CSGB sur la membrane externe bactérienne22 pour former des fibres de curli. Ces fibres amyloïdes sont les principales composantes protéiques de la matrice extracellulaire du biofilm: un réseau relié de protéines et de polymères dans lesquels les bactéries sont incorporées. La matrice d’alginate imprimée de la bio-encre d’impression 3D apporte un soutien physique et une structure aux bactéries pendant le processus de production du curli. L’utilisation de l’expression GFP constitutive permet la visualisation et la quantification des cellules imprimées par imagerie par fluorescence.

Afin d’évaluer si la formation de biofilm a été réussie, la matrice d’alginate a été dissoute à l’aide d’une solution de citrate de sodium, et la forme de la bio-encre imprimée a été évaluée après le traitement au citrate (figure 3). Dans le cas de la bio-encre sans le plasmide de production de curli inductible, le motif imprimé a été complètement dissous après le traitement au citrate de sodium, signifiant qu’aucun réseau de curli de biofilm n’avait été formé (figure 3A, B). Dans le cas des bactéries contenant le plasmide de production de curli inductible, le gel n’a pas été dissous après le traitement au citrate de sodium (figure 3C, D). Ce résultat indique que les bactéries imprimées ont pu former un réseau de curli suffisamment étendu pour stabiliser le modèle imprimé des bactéries2.

Pour construire des structures à plusieurs couches, des calques supplémentaires ont été imprimés (figure 4) en ajustant la hauteur d’impression et la trajectoire d’impression dans l’éditeur de code G. L’augmentation du nombre de couches imprimées dans un échantillon a provoqué la largeur et la hauteur des structures imprimées pour augmenter incrémentalement (figure 5)2,20, mais même les structures imprimées à 5 couches pourraient être créées avec une résolution millimètres à des sous-millimètres. Lorsque e. coli conçu pour inducibly produire des protéines de curli ont été imprimés dans des structures à plusieurs couches, le traitement au citrate de sodium n’a pas dissous les échantillons, alors que les structures multicouches contenant des E. coli produisant non curli ont été dissous dans une solution de citrate de sodium (figure 6). Cette expérience démontre que les biofilms d’ingénierie peuvent être créés dans des structures imprimées à plusieurs couches, en trois dimensions, ainsi que dans des structures imprimées à une seule couche.

Figure 1
Figure 1: photos montrant la conversion d’une imprimante 3D commerciale en une bioimprimante 3D. (A) les composants de la bioimprimante 3D après la conversion d’une imprimante 3D commerciale. Bl’extrudeuse à encre biologique formée par un système de tuyauterie attaché à une pointe de pipette. Des conseils d’impression supplémentaires peuvent être ajoutés dans le deuxième trou de la tête d’impression ou par l’ajout de trous supplémentaires à la tête d’impression, pour une utilisation dans l’impression de plusieurs types de bio-encre. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: exemples de motifs bioimprimés 3D contenant E. coli pSB1C3-GFP-CSGA. Ces images ont été prises deux jours après l’impression. Cette résolution d’impression a été obtenue avec la vitesse de pompage 0,3 mL/h, la vitesse de déplacement de la tête d’impression 300 mm/min et la distance de travail 0,2 mm. Les codes G pour l’impression de ces formes peuvent être trouvés dans les fichiers supplémentaires. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: méthode permettant de vérifier si les composants du biofilm ont été produits par des bactéries E. coli dans un modèle imprimé. Lorsque E. coli imprimé contenait un plasmide qui n’a pas encodé pour l’induction de curli, le motif imprimé a été complètement dissous par le traitement au citrate de sodium (a et B). Lorsque E. coli contenant un plasmide codant des protéines de curli inductibles a été utilisé, le biofilm imprimé était résistant au traitement au citrate de sodium (C et D). Le processus de programmation et les explications du G-code pour l’impression de ce motif carré sont fournis dans le tableau 1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: vue de dessus (A) et vue latérale (B) des structures imprimées à plusieurs couches contenant E. coli pSB1C3-GFP-CSGA. Cet échantillon a été imprimé avec la vitesse de pompage 0,3 mL/h, la vitesse de déplacement de la tête d’impression 200 mm/min, et la distance de travail 0,2 mm. veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: largeur et hauteur de la ligne des hydrogels imprimés contenant différents nombres de couches imprimées. Les mesures ont été effectuées sur des échantillons imprimés avec vitesse de pompage 0,3 mL/h, vitesse de déplacement de la tête d’impression 500 mm/min, et distance de travail 0,2 mm. veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6: méthode permettant de vérifier si les composants du biofilm ont été produits par des bactéries E. coli dans des structures imprimées à plusieurs couches. E. coli a été imprimé en hydrogels à 1, 3 ou 5 couches et incubé pendant 6 jours. Lorsque l' E. coli imprimée contenait un plasmide qui n’a pas encodé pour l’induction de curli, le motif imprimé a été complètement dissous par le traitement au citrate de sodium (a et B). Lorsque l' E. coli imprimée contenait un plasmide codant des protéines de curli inductibles, le biofilm imprimé était résistant au traitement au citrate de sodium (C et D). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Commandes de code G Tâches
G1 Z20 F9000 Soulevez l’axe Z à une hauteur de 20 mm avec une vitesse de déplacement de 9 000 mm/min.
G1 X95 Y65 F9000 Déplacez-vous au point de départ de la première ligne avec une vitesse de déplacement de 9 000 mm/min.
G1 Z6 F9000 Déplacez-vous vers le bas dans la direction Z jusqu’à une distance d’impression correcte (ici Z = 6 mm).
G1 X95 Y105 F300 Point de fin de la première ligne et point de départ de la deuxième ligne.
G1 X135 Y105 Point de fin de la deuxième ligne et point de départ de la troisième ligne.
G1 X135 Y65 Point de fin de la troisième ligne et point de départ de la quatrième ligne.
G1 X95 Y65 Point de fin de la quatrième ligne et point de départ de la première ligne; un carré est formé.
G1 Z20 F9000 Soulevez l’axe Z à une hauteur de 20 mm à 9 000 mm/min.
G1 X55 Y40 F9000 Déplacez-vous vers une coordonnée (55, 40) en dehors de la plage de la boîte de Petri.

Tableau 1: processus de programmation et explications du G-code pour l’impression d’un carré.

Vitesse d’extrusion (mL/h) Vitesse de déplacement de la tête d’impression (mm/min) Largeur de gel (mm)
0,1 100 1,6 ± 0,1
0,1 200 1,1 ± 0,1
0,1 300 1,0 ± 0,1
0,3 300 1,8 ± 0,1
0,3 400 1,2 ± 0,1
0,3 500 0,9 ± 0,1
0,5 200 2,2 ± 0,2
0,5 1 200 1,2 ± 0,2
0,7 200 2,8 ± 0,1
0,7 1 200 1,3 ± 0,1

Tableau 2: paramètres d’impression optimaux pour les hydrogels à haute résolution. Cinq points ont été mesurés pour chaque condition. La valeur moyenne et l’écart type sont indiqués dans le tableau.

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Discussion

Le protocole présenté ici pour l’impression 3D de biofilms d’ingénierie a deux étapes critiques. La première est la préparation de la surface d’impression de gélose, qui est le facteur le plus critique pour produire une résolution d’impression spécifique. Il est important de s’assurer que la surface d’impression est plane et que la pointe de la pipette sur la tête de tête est positionnée à la bonne hauteur de la surface. Si la surface n’est pas plane, la distance de travail changera pendant le processus d’impression. Si la distance de travail est inférieure à 0,1 mm, la solution CaCl2 pourrait pénétrer à l’intérieur de l’embout de la pipette et provoquer une formation d’hydrogel, provoquant l’obstruction de l’embout de la pipette. Si la distance de travail est supérieure à 0,3 mm, le gel ne peut pas être imprimé en continu. La distance de travail optimale dans cette étude est de 0,2 mm. de bonnes approches pour la préparation des surfaces d’impression à gélose plate sont d’utiliser des boîtes de Petri de plus grand diamètre (150-mm-diamètre de boîte de Petri plutôt que d’une plaque de 90-mm de diamètre), placez les plaques sur une table plate, versez la gélose solution rapide et uniforme, et évitez de déplacer la plaque de gélose pendant sa solidification.

La deuxième étape critique est la sélection des paramètres d’impression souhaités, y compris la vitesse de pompage, la viscosité de la bio-encre utilisée, et la vitesse de la tête d’impression, qui déterminent la résolution d’impression résultante. Pour sélectionner ces paramètres de manière efficace, l’utilisateur peut échantillonner plusieurs valeurs extrêmes pour la vitesse de la tête d’impression avec un taux d’extrusion constant, en notant la largeur de l’hydrogel imprimé pour chaque ensemble de conditions. Répétez ensuite cette expérience avec 4 autres taux d’extrusion. Ensuite, prenez les cinq combinaisons qui ont produit la meilleure résolution d’impression pour l’application, et variez les deux paramètres d’impression (vitesses de pompage et de tête d’impression) en petites et petites étapes jusqu’à ce que la résolution souhaitée soit obtenue.

L’épaisseur des lignes imprimées a un impact sur la capacité des bactéries d’ingénierie imprimées à former des biofilms stables. Dans des conditions d’impression optimales (vitesse de pompage 0,3 mL/h, vitesse de tête d’impression 300 mm/min, et distance de travail 0,2 mm), les lignes imprimées de bio-encre produiront des biofilms stables après 3-6 jours d’incubation à température ambiante. Si les lignes deviennent plus épaisses, par exemple en augmentant la vitesse de pompage, les régions intermédiaires de chaque ligne ne peuvent pas être induites suffisamment pour produire des biofilms stables au citrate.

Lors de l’impression d’un hydrogel multi-couches bio-encre, chaque couche imprimée est solidifiée en contactant les ions calciques qui se sont répandus dans la couche imprimée précédente. Comme la concentration de ca2 + dans le substrat d’impression est élevée, les ions ca2 + peuvent rapidement se propager à travers les couches inférieures. Par conséquent, les couches supérieures peuvent être imprimées immédiatement après l’impression des calques précédents, simplement en ajustant la hauteur d’impression dans l’éditeur de code G. En outre, la distance d’impression de la couche supérieure doit être limitée à seulement 0,1 − 0,2 mm de plus que la distance d’impression de la couche précédente. Si la distance d’impression ajoutée est inférieure à 0,1 mm, la pointe se fera glisser sur le premier calque et réduira la résolution de l’hydrogel imprimé. Si la distance d’impression ajoutée est supérieure à 0,2 mm, la bio-encre formera des gouttes de liquide pendant l’extrusion, provoquant l’hydrogel imprimé pour devenir discontinu.

L’approche de bioimpression actuelle permet la production de biofilms d’ingénierie reproductibles et spatialement contrôlés, utilisables dans l’étude des propriétés mécaniques du biofilm ou de la résistance biologique des bactéries biofilms à divers facteurs, y compris antibiotiques, tensioactifs, etc. Cette capacité assure une utilisabilité directe de la méthode proposée. Le développement de bioimprimantes de bricolage (DIY) de haute précision sera probablement possible en conservant la distance de travail d’impression, mais en réduisant la vitesse de pompage et la vitesse de déplacement de la tête d’impression, ou en échantillonnant différentes géométries d’extrudeuse et chimies bio-Ink. Avec les améliorations futures de la résolution d’impression, des applications supplémentaires peuvent être activées telles que l’ingénierie tissulaire ou la livraison de médicaments. L’approche de bioimpression 3D décrite ici devrait également pouvoir être élargie à l’impression d’autres types d’espèces de bactéries qui sont biocompatibles avec notre bio-encre à base d’alginate. Le protocole actuel fournit une stérilité suffisante en faisant bouillir à plusieurs reprises la bio-encre pendant la préparation, en utilisant des seringues stériles et des pointes d’impression, et en utilisant des antibiotiques dans la bio-encre et la plaque d’impression. Les expériences futures utilisant des bactéries de type sauvage peuvent nécessiter des mesures de stérilisation supplémentaires, telles que le remplacement ou la désinfection du système de tuyauterie entre les impressions.

Pour la meilleure connaissance des auteurs, la méthode présentée (développée à l’origine dans Lehner et al.20) est le premier exemple publié d’un style de fabrication additive pour l’impression 3D des bactéries. Dans la première partie de ce protocole, cette méthode générale est décrite en détail pour l’impression 3D des bactéries, qui est appliquée à la production de biofilms d’ingénierie2. Plusieurs applications futures de biofilms imprimés en 3D sont possibles à l’aide de cette méthode. Dans la nature, plusieurs systèmes bactériens ont évolué qui créent différents types de biofilms, dont dans cet article un système unique a été exploré. Plusieurs autres systèmes peuvent être facilement examinés en créant des biofilms imprimés en 3D avec d’autres systèmes bactériens, tels que Bacillus subtilis ou Acetobacter xylinum. Les méthodes alternatives23,24 ont également été développées pour la structuration spatiale des bactéries à haute résolution à l’aide de signaux optiques. Ces approches exigent des équipements plus coûteux et compliqués pour les atteindre par rapport à cette imprimante, et ne conviennent qu’à la structuration de bactéries génétiquement modifiées.

La capacité de reproduire spatialement des biofilms imprimés en 3D avec cette méthode peut permettre la création de biofilms d’ingénierie qui reproduisent l’hétérogénéité spatiale des biofilms naturels25. En raison de l’arrangement très détaillé des protéines et des fibres polymériques dans un biofilm, les bactéries dans un état de biofilm obtiennent une résistance beaucoup plus élevée aux stimuli chimiques et physiques, comme une résistance accrue aux antibiotiques par rapport à la même bactéries dans un État planctonique. En outre, les bactéries dans un biofilm montrent une résistance accrue à l’écoulement des fluides, rendant l’entretien et la stérilité des dispositifs médicaux implantables beaucoup plus difficiles26. Les biofilms d’ingénierie imprimés qui tentent de reproduire les distributions spatiales spécifiques des composants du biofilm sont des outils puissants pour étudier les mécanismes par lesquels les bactéries dans un biofilm atteignent des phénotypes de résistance.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été appuyé par une subvention AOARD (no. FA2386-18-1-4059), l’Organisation néerlandaise de recherche scientifique (NWO/OCW) dans le cadre du programme frontières des nanosciences, et le programme des matériaux avancés NWO-NSFC (no 729.001.016). Les auteurs reconnaissent l’assistance en laboratoire de Ramon van der Valk et Roland Kieffer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer CoLiDo 3D-P Kit
3D printing software CoLiDo Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar Sigma-Aldrich 05040
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C7902
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Chloramphenicol Sigma-Aldrich 3886.1
LB broth powder Sigma-Aldrich L3022
Orbital shaker VWR 89032-092 Model 3500
Petri dish VWR 25384-326 150 x 15 mm
Rhamnose Sigma-Aldrich 83650
Silicon tubing VWR  DENE 3100103/25
Syringe pump ProSense B.V.  NE-300
Sodium alginate Sigma-Aldrich W201502
Sodium citrate monobasic Sigma-Aldrich 71498
Sodium hydrooxide VWR 28244.295

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References

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