Tredimensjonale mønstre av konstruert biofilm med en gjør-det-selv-Bioprinter

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikkelen beskriver en metode for å transformere en lavprisalternativ kommersiell 3D-skriver til en bakteriell 3D-skriver som kan forenkle utskrift av mønstrede biofilm. Alle nødvendige aspekter ved utarbeidelse av bioprinter og bio-blekk er beskrevet, samt verifikasjon metoder for å vurdere dannelsen av biofilm.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Spiesz, E. M., Yu, K., Lehner, B. A., Schmieden, D. T., Aubin-Tam, M. E., Meyer, A. S. Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter. J. Vis. Exp. (147), e59477, doi:10.3791/59477 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biofilm er aggregater av bakterier innebygd i en selv-produsert romlig-mønstret ekstracellulære matrise. Bakterier i en biofilm utvikle forbedret antibiotikaresistens, som utgjør potensielle helsemessige farer, men kan også være gunstig for miljø applikasjoner som rensing av drikkevann. Den videre utviklingen av anti-bakterielle legemiddel-og biofilm-inspirerte anvendelser vil kreve utvikling av reproduserbar, engineerable metoder for biofilm skapelse. Nylig er en ny metode for biofilm forberedelser ved hjelp av en modifisert tredimensjonal (3D) skriver med en bakteriell blekk er utviklet. Denne artikkelen beskriver fremgangsmåten som er nødvendig for å bygge denne effektive, rimelige 3D-bioprinter som tilbyr flere applikasjoner i bacterially materialbehandling. Protokollen begynner med en tilpasset kommersiell 3D-skriver der Ekstruder er erstattet med en bio-blekk dispenser koblet til et sprøyte pumpesystem som muliggjør en kontrollerbar, kontinuerlig strøm av bio-blekk. For å utvikle en bio-blekk egnet for biofilm utskrift, konstruert Escherichia coli bakterier ble suspendert i en løsning av alginat, slik at de stivner i kontakt med en overflate som inneholder kalsium. Inkluderingen av en induser kjemisk innen utskrift underlaget driver uttrykk for biofilm proteiner innenfor den trykte bio-blekk. Denne metoden muliggjør 3D-utskrift av ulike romlige mønstre som består av diskrete lag med trykte biofilm. Slike romlig-kontrollerte biofilm kan tjene som modellsystemer og kan finne programmer i flere felt som har en omfattende innvirkning på samfunnet, inkludert antibiotikaresistens forebygging eller drikkevann rensing, blant andre.

Introduction

Det er i dag et økende behov for å utvikle miljøvennlige, bærekraftige løsninger for produksjon av romlig-mønstrede materialer, på grunn av det voksende antall markeder for slikt materiale1. Denne artikkelen presenterer en enkel, økonomisk metode for produksjon av slike materialer, og derfor tilbyr et stort spekter av fremtidige applikasjoner. Metoden som presenteres her tillater tredimensjonal (3D) utskrift av romlig-mønstret strukturer ved hjelp av en bio-blekk som inneholder levende bakterier. Bakterier fortsatt levedyktig innenfor trykte strukturer i over en uke, slik at bakteriene til å utføre naturlige eller konstruerte metabolske aktiviteter. Trykte bakterier kan dermed produsere og sette inn ønskede komponenter i den trykte strukturen, for eksempel å skape en funksjonell tverrbundet biofilm2.

Tradisjonelle metoder for produksjon av avanserte materialer involverer høy energi utgifter (f. eks, høye temperaturer og/eller trykk) og kan produsere store mengder kjemisk avfall, ofte giftige stoffer som krever kostnads omfattende utnyttelse3 ,4. I kontrast, flere bakterielle arter er i stand til å produsere materialer som kan lett brukes i ulike bransjer. Disse materialene omfatter polymerer som polyhydroxyalkanoates (PHA)5 eller Poly (glykolid-co-laktid) (PGLA)6, bakteriell cellulose7, bakterielle betong materialer8, BioMimetic kompositter9, amyloid-baserte lim10, eller bio-baserte elektriske brytere11, blant andre. Dessuten, bakteriell produksjon av verdifulle materialer vanligvis finner sted på nær omgivelsestemperaturer og trykk og i vandige miljøer, uten å kreve eller produsere giftige forbindelser. Mens produsere materialer med bakterier har blitt demonstrert i litteraturen og noen industrielle anvendelser har allerede dukket opp12,13, en pålitelig metode for romlig mønstre av slikt materiale er fortsatt en utfordring.

Denne artikkelen demonstrerer en rett fram metode for å konvertere en lavprisalternativ kommersiell 3D-skriver til en 3D-bakteriell skriver. Protokollen viser hvordan man forbereder en bio-blekk som inneholder og opprettholde den levende bakterier, samt hvordan å forberede underlag som 3D-utskrift kan utføres. Denne metoden er hensiktsmessig å bruke med en rekke naturlige og konstruerte bakterielle stammer i stand til å produsere materialer. Disse bakteriene kan være romlig fordelt i en 3D trykt struktur og likevel fortsette sin metabolske aktivitet, noe som vil resultere i en romlig fordeling av de ønskede materialer produsert av bakterier.

Denne utskriftsmetoden muliggjør additiv produksjon av biofilm, aggregater av bakterier omgitt av en selv-produsert ekstracellulære matrise. Biofilm er heterogene 3D-nettverk der proteiner, polymerer, bakterielle celler, oksygen og næringsstoffer er alle romlig strukturert14. Selv i form av en biofilm, bakterier viser en økt antibiotikaresistens og strukturell robusthet, noe som gjør dem vanskelige å utrydde fra overflater, inkludert medisinske katetre og implantater. Nøkkelen til biofilm egenskaper, og også den største utfordringen til biofilm forskning, synes å være heterogenitet av biofilm15,16,17. Produksjon av romlig modell biofilm er av spesiell interesse som det ville tillate enten reprodusere eller tuning den romlige mønstre av biofilm komponenter, hjelpe forståelsen av stabile deponering av biofilm på nesten alle overflater i Natur.

Denne artikkelen presenterer en metode for produksjon av biofilm ved hjelp av 3D-trykte hydrogeler inneholder konstruert E. coli bakterier som produserer biofilm proteiner i nærvær av en induser, samt metoder for verifisering av biofilm formasjon2 . De store ekstracellulære Matrix komponenter av disse biofilm er curli amyloid fibre18 som inneholder selv-monterte CsgA proteiner. Når konstruert E. coli bakterier er indusert å uttrykke CsgA proteiner, danner de en stabil modell biofilm som beskytter cellene mot å bli vasket ut av utskriftsflaten. En slik 3D trykt biofilm kan være romlig kontrollert og kan tjene som et nyttig forskningsverktøy for etterforskningen av multiscale biofilm struktur-funksjon mekanikk eller materiomics19. Disse skreddersydde biofilm vil hjelpe forståelsen av prinsippene for biofilm dannelse og deres mekaniske egenskaper, slik at videre forskning på mekanismer for antibiotikaresistens blant andre applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. konvertering av en kommersiell 3D-skriver til en 3D-bioprinter

  1. Fjern Ekstruder og ovnen til en kommersiell 3D-skriver (tabell over materialer) fra skriverens ramme, og trekk ut ledningene som kontrollerer disse elementene fra hoved kretskortet (figur 1a). Siden sensoren som styrer skriverens driftstemperatur, må være funksjonell for å kommunisere med skriverprogramvaren, fjerner du fra programvare for utskrift algoritmen som forsinker utskriften, til den operative temperaturen er nådd.
  2. Koble en pipette tupp (200 μL spiss) via silisium slange (innvendig diameter på 1 mm) til en 5 mL sprøyte som er lastet inn i en sprøyte pumpe. Monter pipette spissen på 3D-skriveren Ekstruder hodet som en erstatning for den opprinnelige Ekstruder (figur 1B).
  3. Hvis det skal brukes mer enn én type bio-blekk, monterer du flere rørsystemer og pipette spissen (e) på skriveren.

2. substrat forberedelse til 3D-utskrift

  1. Tilsett 4 mL 5 M CaCl2 oppløsning til 400 ml 1% w/v agar oppløst i Luria-Bertani BULJONG (LB) medium, supplert med egnede antibiotika og induktorer (her 34 μg/ml kloramfenikol og 0,5% rhamnose).
  2. Dispensere 20 mL av LB-agar løsning i hver 150 mm x 15 mm Petri parabolen. Tørk 30 min ved romtemperatur med lokket halvveis åpent.
    Merk: protokollen kan stanses midlertidig her ved å lagre disse trykk underlaget ved 4 ° c i opptil flere dager.

3. forberedelse av bio-blekk

  1. Forbered en natrium alginat løsning (3% w/v), og varm til kokepunktet tre ganger for å sterilisere oppløsningen. Oppbevares ved 4 ° c til den brukes.
  2. Grow E. COLI MG1655 Pro ΔcsgA ompR234 (E. coli ΔcsgA) bakterier bærer plasmider pSB1C3-Green fluorescerende protein (GFP) (konstituerende GFP uttrykk)2 eller pSB1C3-GFP-CsgA (konstituerende GFP uttrykk, rhamnose-induserbart CsgA over natten ved 37 ° c med risting ved 250 RPM i 50 mL LB som inneholder 34 μg/mL kloramfenikol og 0,5% rhamnose.
  3. Sentrifuger celle kulturen i 5 min ved 3 220 x g til pellet bakteriene. Fjern supernatanten.
  4. Re-suspendere bakterier pellet i 10 mL LB medium og tilsett 10 mL natrium alginat (3% w/v).

4.3D utskrift prosess

  1. Installer og åpne programvaren for 3D-utskrift (innholdsfortegnelsen) på en datamaskin. Koble 3D-skriveren til datamaskinen. Flytt skrivehodet til startposisjonen ved å klikke på Hjem-knappen for X-, Y-og Z-aksene.
  2. For hver utskrift plasserer du et klargjort utskrifts substrat på et bestemt sted på utskrifts sengen.
  3. Kalibrer høyden på skrivehodet i Z-aksen.
    1. Hev skrivehodet til en høyde på 22 mm under manuell kontroll, slik at det ikke vil kollidere med kanten av Petri parabolen når du flytter til ønsket posisjon. Plasser skrivehode overtop på platen, og Flytt den ned til pipette spissen kontakter utskriftsflaten. Tildel denne Z-akse-posisjonen som Z1 (høyden på utskriftsflaten).
    2. Hev skrivehodet, og Flytt det utenfor plate området med manuell kontroll i X-, Y-og Z-aksene. Hvis arbeids avstanden mellom skrivehodet og plateoverflaten er definert som Z2, skriver du inn Z1 + Z2 i utskriftsprogrammet som Z-verdien under utskrift.
  4. Programmere utskrifts formen med en selv utviklet punkt-for-punkt-koordinat bestemt metode i henhold til ønsket bane.
    1. Hvis ønsket bane er en rett linje, definerer du bare start-og sluttpunktene. Hvis du inkluderer flere punkter på buede linjer, vil det føre til jevnere kurver. Flytt skrivehodet manuelt til hvert punkt sekvensielt, og Registrer koordinatene for disse punktene i rekkefølge. Skriv inn alle disse koordinatene i tillegg til flytte hastigheten på skrivehodet for hvert utskrevne segment i G-Code-editoren.
  5. Før og etter utskrift løfter du skrivehodet til en avstand som er høyere enn platekanten (20 mm), og beveger seg rett ut av plate området. Lagre dette programmet som en G-kode fil og Last direkte for bruk i etterfølgende utskrifter, mens re-måle Z aksen høyden for hver nye utskrift substrat.
    Merk: se tabell 1 for eksempel G-kode for å skrive ut et kvadrat.
  6. Last inn den forhåndsprogrammerte G-kode filen. Åpne G-code editor i programvaren, og programmet i kommandoene for å skrive ut ønsket form. På hver kommandolinje kan posisjonen til skrivehodet endres i X-, Y-og/eller Z-aksen. Angi Z-verdien under alle utskriftstrinn som Z1 + Z2 (høyde på utskriftsflaten + arbeidsavstand).
    Merk: flytte hastigheten er også justerbar; 9 000 mm/min er en egnet verdi for typiske utskrifts rater.
  7. Legg den flytende bio-blekket i sprøyten (e), og Monter dem i sprøyte pumpen (e) på 3D-bioprinter.
  8. Skriv ut bio-blekket på utskrifts underlaget ved å klikke på Skriv ut -knappen.
  9. Under utskrift kontrollerer du skrivehode bevegelsen fullstendig av programvaren. Start sprøyte pumpen manuelt før skrivehodet kommer i kontakt med utskriftsflaten.
    Merk: koordineringen av sprøyten pumpen og skriveren er empirisk bestemmes avhengig av ekstrudering hastighet, hastigheten som skrivehodet beveger seg til første utskrifts punkt, og den opprinnelige posisjonen til skrivehodet. Hvis den første skrivehodeposisjonen er 20 mm, med en hastighet på skrivehodet på 9 000 mm/min og en ekstrudering hastighet på 0,1 mL/h, starter du sprøyte pumpen umiddelbart etter at utskriften er startet. Hvis ekstrudering hastigheten endres fra 0,1 mL/t til 0,3 mL/h, vent deretter 2 − 3 s for å starte sprøyte pumpen etter at utskriften er startet.
  10. Stopp sprøyte pumpen så snart skrivehodet kommer til det siste utskrifts punktet. Stanse sprøyten pumpen før skrivehodet heiser opp på slutten av utskriftsprosessen, ellers overflødig bio-blekk vil falle på utskriften underlaget og redusere utskriftsoppløsning.
  11. For bygging av 3D-strukturer, kontrollere alle bevegelser av skrivehodet i G-kode editor. Skriv inn utskrifts høyden for det første laget. Øk Z-verdien i G-koden med 0,2 millimeter for det andre laget for å øke utskrifts høyden. Deretter øker Z-verdien av 0,1 millimeter når du flytter til et høyere lag. Ikke Beveg platen under utskriftsprosessen.
  12. For å måle bredden og høyden på den trykte hydrogel, bruk en stål linjal plassert under eller ved siden av prøven.

5. økende og teste effektiviteten av biofilm produksjon av E. coli

  1. Ruge de trykte prøvene ved romtemperatur i 3 − 6 dager for å tillate produksjon av biofilm komponenter (curli fibre). Bilde platene ved hjelp av et kamera eller fluorescerende skanner.
  2. For å oppløse den alginat matrise, tilsett 20 mL av 0,5 M natrium citrate løsning (pH = 7 justert med NaOH) til utskrift underlag, og ruge for 2 t med 30 RPM risting ved romtemperatur. Kast væsken og bildet platene igjen for å sammenligne med bildene av platene før citrate behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det første trinnet for vellykket 3D-utskrift av biofilm er å konvertere en kommersiell 3D-skriver til en bioprinter. Denne konverteringen oppnås ved å fjerne Ekstruder og varmeren av skriveren, designet for utskrift med en polymer blekk, og erstatte disse med komponenter som passer for utskrift bio-blekk som inneholder levende bakterier (figur 1a). Ekstruder erstattes av en pipette (eller tips, hvis flere bio-blekk vil bli brukt i utskriftsprosessen) koblet til et rørsystem som er tilkoblet en sprøyte pumpe (figur 1B). Den vellykkede konverteringen av trykkeriet til en bioprinter kan vurderes basert på evnen til å overføre ønsket bio-blekk (er) fra sprøyte pumpen gjennom rørsystemet og pipette spissen (e) på en utskriftsflate uten å lekke eller varme opp Bio-blekk. Hvis slangen buler på grunn av strømmen av bio-blekk under utskrift, kan det bli erstattet av slange med tykkere vegger. Det bør bemerkes at denne utskriften teknikken skal kunne arbeide med alle typer kommersiell 3D-skriver som slange kan festes til skrivehodet.

3D-bioprinter kan skape bakterie-innkapsle hydrogeler i en rekke todimensjonale (2D) og 3D-former (figur 2). Kalsium ioner i utskrift underlaget induserer herding (Chelation av kalsium ioner med alginat kar bok syl grupper) av bio-blekk ved utskrift, konvertere væsken bio-blekk i en solid hydrogel. Oppløsningen av bioprinting vil avhenge av ekstrudering hastighet, størrelsen på pipette spissen, hastigheten på skrivehodet, volumet og konsentrasjonen av CaCl2 løsning lagt til agar løsning, den flate av utskriftsoverflaten, og viskositet av det bio-blekket som brukes. Konsentrasjonen av CaCl2 -løsningen har stor innflytelse på hydrogel skarphet. Fire forskjellige konsentrasjoner av CaCl2 (0,1 m, 0,2 m, 1 M og 5 m) ble samplet, og bare 5 m CaCl2 -løsning resulterte i hydrogel som ikke ble uskarpe etter utskrift. Derfor ble 5 M valgt som den optimale konsentrasjonen av CaCl2 -løsningen.

I en tidligere versjon av denne protokollen, CaCl2 løsningen ble brukt på overflaten av agar plate i stedet for blandet inn i agar løsningen før helle agar plate. Når du bruker denne versjonen, har volumet av CaCl2 -løsningen en kritisk påvirkning på utskriftskvaliteten og oppløsningen. Ved bruk av en 150 x 15 mm Petri parabol, bruk av et volum av kalsiumklorid oppløsning på mer enn 100 μL (eller 30 μL for en 90-mm Petri parabol) resulterer i for mye væske som gjenstår på utskrift overflaten. Denne væsken kan spres ujevnt når platen beveges, noe som kan endre arbeids avstanden og føre til blokkering av pipette spissen. For mye volum av CaCl2 kan også føre til at trykte hydrogeler flyter og glir over løsningen, og endrer formen og plasseringen av den trykte hydrogel. Hvis volumet av kalsiumklorid oppløsning er for liten, noen regioner av platen kan ikke motta CaCl2 løsning og vil ha dårlig hydrogel herding. I denne forbedrede protokollen, legge til CaCl2 -løsning direkte i agar løsningen før helle agar plate resulterte i betydelig mindre fuktighet på overflaten av utskrift underlaget i forhold til overflate-anvendt metode, noe som resulterer i dramatisk forbedret utskriftsoppløsning.

Bevegelsen for ekstrudering og skrivehode er gjensidig avhengig og kan justeres på en koordinert måte for å endre utskriftsoppløsningen. For eksempel, hvis skriveren er operert med ekstrudering hastighet mellom 0,1 ml/t og 0,5 ml/t med en konstant skrivehode bevegelse hastighet på 300 mm/min, diameteren på den trykte hydrogel øker med økningen i ekstrudering hastighet2,20. Ved ekstrudering hastigheter over 0,5 mL/h, de ytre kantene av de utskrevne linjene av hydrogel endres fra rette, parallelle linjer til bølgete linjer, og linjebredden øker også. Hastigheten på skrivehodet har også en påvirkning på utskriftsoppløsningen. Med en konstant ekstrudering hastighet på 0,3 mL/h, øke hastigheten på skrivehodet fra 300 mm/min til 500 mm/min resultater i bredden av den trykte hydrogel blir smalere, reduseres fra 1,8 mm til 0,9 mm. Hvis skrivehodet beveger hastigheten er over 500 mm/min, vil gel linjen lett bli usammenhengende. For en 200 μL dråpespiss og den bio-blekket som brukes i den aktuelle studien, er flere kombinasjoner av utskriftsoppløsningen betraktet som optimale (tabell 2). Ved pumpehastighet 0,3 mL/h, bevegelseshastighet 500 mm/min, og arbeidsavstand 0,2 mm, er trykt hydrogel produsert med en bredde på ca 0,9 mm.

En avgjørende prestasjon av bakteriell 3D utskrift metoden er dens evne til å skape konstruert biofilm. For å skape en konstruert og romlig biofilm, bør bakteriene ikke bare overleve 3D-prosessen, men bør også produsere biofilm komponenter samtidig som de gjenstår innenfor det utskrevne mønsteret. Den konstruerte e. coli bakterier som brukes i denne protokollen, e. coli ΔcsgA bakterier BÆRER plasmider PSB1C3-GFP-CsgA, aktivere kontrollerbar uttrykk for curli proteiner. Bruken av en csgA-knockout-belastning sikrer at csgA-proteinet bare uttrykkes når det er indusert fra en plasmider med rhamnose. Bakteriene eksporterer indusert CsgA protein under enheter, som deretter selv montere21 på CsgB proteiner på bakteriell ytre membran22 til å danne curli fibre. Disse amyloid-lignende fibre er de viktigste proteinaktige komponenter av biofilm ekstracellulære matrise: et tilkoblet nettverk av proteiner og polymerer der bakteriene er innebygd. Den trykte alginat matrise av bio-blekk med 3D-trykk gir fysisk støtte og struktur til bakteriene under curli produksjonsprosess. Bruken av konstituerende GFP-uttrykk muliggjør visualisering og kvantifisering av trykte celler via fluorescens avbildning.

For å vurdere om dannelsen av biofilm var vellykket, alginat matrisen ble oppløst ved hjelp av en natrium citrate løsning, og formen på den trykte bio-blekk ble vurdert etter citrate behandling (Figur 3). I tilfelle av bio-blekk uten induserbart curli produksjon plasmider, trykt mønster ble fullstendig oppløst etter natrium citrate behandling, som betegner at ingen biofilm curli nettverket hadde dannet (figur 3a, B). Når det gjelder bakterier som inneholder induserbart curli produksjons plasmider, ble gelen ikke oppløst etter natrium citrate behandling (figur 3c, D). Dette resultatet indikerer at de trykte bakteriene var i stand til å danne et curli nettverk omfattende nok til å stabilisere den trykte mønster av bakterier2.

For å konstruere flere lag strukturer ble flere lag trykt (Figur 4) ved å justere utskrifts høyden og print banen i G-code editor. Hvis du øker antallet utskrevne lag i et utvalg, skyldes det at bredden og høyden på de trykte strukturene øker trinnvis (figur 5)2,20, men selv 5-lags trykte strukturer kan opprettes med en oppløsning av millimeter til sub-millimeter. Når E. coli konstruert for å inducibly produsere curli proteiner ble trykt i flerlags strukturer, ikke natrium citrate behandling ikke oppløse prøvene, mens multi-Layer strukturer som inneholder ikke-curli-produserende E. coli ble oppløst i natrium citrate oppløsning (figur 6). Dette eksperimentet viser at utviklet biofilm kan lages i flerlags, tredimensjonale trykte strukturer, så vel som i ett-lags trykte strukturer.

Figure 1
Figur 1: bilder som viser konverteringen av en kommersiell 3D-skriver til en 3D-bioprinter. (A) komponentene i 3D-bioprinter etter konvertering fra en kommersiell 3D-skriver. (B) den bio-Ink Ekstruder dannet av et rørsystem festet til en pipette spissen. Ytterligere utskrift tips kan legges i det andre skrivehodet hullet eller ved å legge til flere hull til skrivehodet, for bruk i utskrift flere typer bio-blekk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eksempler på 3D bioprinted mønstre som inneholder E. coli PSB1C3-GFP-CsgA. Disse bildene ble tatt to dager etter utskrift. Denne utskriftsoppløsningen ble oppnådd med pumpehastighet 0,3 mL/h, bevegelseshastighet på skrivehodet 300 mm/min, og arbeidsavstand 0,2 mm. G-kodene for utskrift av disse figurene finnes kanskje i tilleggsfilene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: en metode for å verifisere om biofilm komponenter har blitt produsert av E. coli bakterier i et trykt mønster. Når trykt E. coli inneholdt en plasmider som ikke kodes for curli induksjon, det trykte mønsteret ble fullstendig oppløst av natrium citrate behandling (a og B). Når E. coli inneholder en plasmider koding induserbart curli proteiner ble brukt, den trykte biofilm var motstandsdyktig mot natrium citrate behandling (C og D). Programmerings prosessen og forklaringer av G-koden for å skrive ut dette kvadratiske mønsteret er gitt i tabell 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: topp visning (A) og sidevisning (B) av flerlags trykte strukturer som inneholder E. coli pSB1C3-GFP-CsgA. Dette eksemplet ble skrevet ut med pumpehastighet 0,3 mL/h, skrivehode bevegelseshastighet 200 mm/min, og arbeidsavstand 0,2 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: linjebredden og-høyden på utskrevne hydrogeler som inneholder forskjellige antall utskrevne lag. Målingene ble utført på prøvene trykt med pumpehastighet 0,3 mL/h, skrivehode bevegelseshastighet 500 mm/min, og arbeidsavstand 0,2 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: en metode for å verifisere om biofilm komponenter har blitt produsert av E. coli bakterier i flere lag trykte strukturer. Konstruert E. coli ble trykt inn i 1-, 3-, eller 5-lags hydrogeler og inkubert i 6 dager. Når den trykte E. coli inneholdt en plasmider som ikke kodes for curli induksjon, ble det trykte mønsteret fullstendig oppløst av natrium citrate behandling (a og B). Når den trykte E. coli inneholdt en plasmider koding induserbart curli proteiner, den trykte biofilm var motstandsdyktig mot natrium citrate behandling (C og D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

G-kode-kommandoer Oppgaver
G1 Z20 F9000 Løft Z-aksen til en høyde på 20 mm med en 9 000 mm/min bevegelseshastighet.
G1 X95 Y65 F9000 Flytt til startpunktet for den første linjen med en 9 000 mm/min bevegelseshastighet.
G1 Z6 F9000 Beveg nedover i Z-retning til en riktig (her Z = 6 mm) utskrifts avstand.
G1 X95 Y105 F300 Sluttpunkt for første linje og startpunkt for den andre linjen.
G1 X135 Y105 Endepunkt for den andre linjen og startpunktet for den tredje linjen.
G1 X135 Y65 Endepunkt for tredje linje og startpunkt for den fjerde linjen.
G1 X95 Y65 Sluttpunkt for den fjerde linjen og startpunktet for den første linjen. en firkant dannes.
G1 Z20 F9000 Løft Z-aksen til en høyde på 20 mm ved 9 000 mm/min.
G1 X55 Y40 F9000 Flytt til en koordinat (55, 40) utenfor området Petri.

Tabell 1: programmerings prosess og forklaringer av G-kode for utskrift av et kvadrat.

Ekstrudering hastighet (mL/h) Bevegelseshastighet på skrivehodet (mm/min) Gel bredde (mm)
0,1 for alle 100 for alle 1,6 ± 0,1
0,1 for alle 200 for alle 1,1 ± 0,1
0,1 for alle 300 for alle 1,0 ± 0,1
0,3 for alle 300 for alle 1,8 ± 0,1
0,3 for alle 400 for alle 1,2 ± 0,1
0,3 for alle 500 for alle 0,9 ± 0,1
0,5 for alle 200 for alle 2,2 ± 0,2
0,5 for alle 1 200 for alle 1,2 ± 0,2
0,7 for alle 200 for alle 2,8 ± 0,1
0,7 for alle 1 200 for alle 1,3 ± 0,1

Tabell 2: de optimale utskriftsparametrene for hydrogeler med høy oppløsning. Fem poeng ble målt for hver tilstand. Gjennomsnittsverdien og standardavviket vises i tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som presenteres her for 3D-utskrift av konstruerte biofilm har to kritiske trinn. Først er utarbeidelse av agar utskrift overflaten, som er den mest kritiske faktoren for å produsere en bestemt utskriftsoppløsning. Det er viktig å sørge for at utskriftsflaten er flat og at pipette spissen på skrivehodet er plassert i riktig høyde fra overflaten. Hvis overflaten ikke er flat, vil arbeids avstanden endres under utskriftsprosessen. Hvis arbeids avstanden er mindre enn 0,1 mm, kan CaCl2 -løsningen gå inn i pipette spissen og forårsake hydrogel dannelse, slik at pipette spissen blir tilstoppet. Hvis arbeids avstanden er mer enn 0,3 mm, kan ikke gelen skrives ut kontinuerlig. Den optimale arbeids avstanden i denne studien er 0,2 mm. gode tilnærminger for å forberede flatt agar utskrift flater er å bruke større diameter Petri retter (150-mm-diameter Petri parabolen snarere enn en 90-mm-diameter plate), plassere platene på et flatt bord, helle agar løsning med rask og jevn hastighet, og unngå å flytte agar plate under herding sin.

Det andre kritiske trinnet er valget av ønskede utskrifts parametre, inkludert pumpehastighet, viskositet av bio-blekk som brukes, og skrivehodet hastighet, som bestemmer den resulterende utskriftsoppløsning. For å velge disse parametrene på en effektiv måte, kan brukeren prøve flere ekstreme verdier for skrivehodet hastighet med en konstant ekstrudering rate, og bemerker bredden av den trykte hydrogel for hvert sett med betingelser. Deretter gjentar dette eksperimentet med 4 andre ekstrudering priser. Deretter tar du de fem kombinasjonene som produserte den beste utskriftsoppløsningen for programmet, og varierer både utskriftsparametrene (pumpe-og skrivehode hastigheter) i mindre og mindre trinn til den ønskede oppløsningen er oppnådd.

Tykkelsen på de utskrevne linjene har en innvirkning på evnen til de trykte konstruerte bakteriene til å danne stabile biofilm. Under optimale utskriftsforhold (pumpehastighet 0,3 mL/h, skrivehodet hastighet 300 mm/min, og arbeidsavstand 0,2 mm), vil utskrevne linjer av bio-blekk produsere stabile biofilm etter 3-6 dager med inkubasjons ved romtemperatur. Hvis linjene blir tykkere, for eksempel ved å øke pumpehastigheten, kan de midterste regionene på hver linje ikke bli indusert tilstrekkelig til å produsere citrate-stabile biofilm.

Når du skriver ut et multi-lags bio-Ink-hydrogel, blir hvert trykt lag styrket ved å kontakte kalsium-ioner som har spredt seg til forrige trykte lag. Siden ca2 + konsentrasjon i utskriften underlaget er høy, ca2 + ioner kan raskt diffus opp gjennom de lavere lag. Derfor kan de øvre lagene skrives ut umiddelbart etter at de forrige lagene er skrevet ut, ganske enkelt ved å justere utskrifts høyden i G-code editor. I tillegg bør utskrifts avstanden for det øvre laget begrenses til bare 0,1 − 0,2 mm høyere enn utskrifts avstanden for det forrige laget. Hvis den ekstra utskrifts avstanden er mindre enn 0,1 mm, vil spissen dra over det første laget og redusere oppløsningen på den trykte hydrogel. Hvis den ekstra utskrifts avstanden er større enn 0,2 mm, vil bio-blekket danne dråper væske under ekstrudering, slik at den trykte hydrogel blir usammenhengende.

Den nåværende bioprinting tilnærmingen gjør det mulig å produsere reproduserbar, romlig konstruert biofilm, egnet for bruk i studiet av biofilm mekaniske egenskaper eller biologisk resistens av biofilm bakterier til ulike faktorer, inkludert antibiotika, overflateaktive midler, etc. Denne funksjonen sikrer en direkte brukervennlighet av den foreslåtte metoden. Utvikling av høyere presisjon gjør-det-selv-bioprinters (DIY) vil sannsynligvis være mulig ved å opprettholde utskrifts arbeidsavstand, men senke pumpehastigheten og den bevegelige hastigheten på trykkhodet, eller ved å prøve forskjellige Ekstruder geometri og Bio-Ink kjemikalier. Med fremtidige forbedringer av utskriftsoppløsningen kan flere programmer aktiveres, for eksempel vevs teknikk eller legemiddellevering. 3D bioprinting tilnærmingen som beskrives her bør også kunne utvides til å skrive ut flere typer bakteriearter som er biokompatible med vår alginat bio-blekk. Den nåværende protokollen gir tilstrekkelig sterilitet ved gjentatte ganger kokende bio-blekk under forberedelse, ved hjelp av sterile sprøyter og utskrifts tips, og bruk av antibiotika i både bio-blekk og utskrift plate. Fremtidige eksperimenter med ville-type bakterier kan kreve ekstra steriliserings tiltak som å erstatte eller desinfisere slangesystemet mellom trykk.

Til forfatternes beste kunnskap, den presenterte metoden (opprinnelig utviklet i Lehner et al.20) er det første publiserte eksempel på en additiv produksjons stil for 3D-utskrift av bakterier. I den første delen av denne protokollen, er denne generelle metoden beskrevet i detalj for 3D-utskrift av bakterier, som er brukt til produksjon av konstruert biofilm2. Flere fremtidige anvendelser av 3D-trykt biofilm er mulig ved hjelp av denne metoden. I naturen har flere bakterielle systemer utviklet seg som skaper ulike typer biofilm, hvorav i denne artikkelen et enkelt system ble utforsket. Flere andre systemer kan enkelt undersøkes ved å lage 3D-trykte biofilm med andre bakterielle systemer, for eksempel Bacillus subtilis eller Acetobacter xylinum. Alternative metoder23,24 har også blitt utviklet for romlige mønstre av bakterier med høy oppløsning ved hjelp av optiske signaler. Disse tilnærmingene krever dyrere, komplisert utstyr for å oppnå dem i forhold til denne skriveren, og er bare egnet for mønstre av genetisk modifiserte bakterier.

Muligheten til å romlig mønster 3D-trykt biofilm med denne metoden kan tillate etablering av konstruerte biofilm som reproduserer den romlige heterogenitet av naturlig biofilm25. På grunn av den svært detaljerte arrangement av protein og polymer fibre i en biofilm, bakterier i en biofilm tilstand oppnå en mye høyere motstand mot kjemiske og fysiske stimuli, for eksempel en økt motstand mot antibiotika i forhold til samme bakterier i en planktoniske tilstand. Videre bakterier i en biofilm viser en økt motstand mot væske strømning, noe som gjør vedlikehold og sterilitet av implanterbare medisinsk utstyr mye vanskeligere26. Trykt konstruert biofilm som forsøker å reprodusere den spesifikke romlige distribusjoner av biofilm komponenter er kraftige verktøy for å studere mekanismer der bakterier i en biofilm oppnå motstand fenotyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en AOARD stipend (nr. FA2386-18-1-4059), Nederland organisasjon for Scientific Research (NWO/OCW) som en del av grenser nanovitenskap programmet, og de avanserte materialer NWO-NSFC program (nr. 729.001.016). Forfatterne anerkjenner laboratorie hjelp av Ramon Van der Valk og Roland Kieffer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer CoLiDo 3D-P Kit
3D printing software CoLiDo Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar Sigma-Aldrich 05040
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C7902
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Chloramphenicol Sigma-Aldrich 3886.1
LB broth powder Sigma-Aldrich L3022
Orbital shaker VWR 89032-092 Model 3500
Petri dish VWR 25384-326 150 x 15 mm
Rhamnose Sigma-Aldrich 83650
Silicon tubing VWR  DENE 3100103/25
Syringe pump ProSense B.V.  NE-300
Sodium alginate Sigma-Aldrich W201502
Sodium citrate monobasic Sigma-Aldrich 71498
Sodium hydrooxide VWR 28244.295

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (47), 14444-14451 (2015).
  2. Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7, (5), 1328-1337 (2018).
  3. Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354, (6308), 107-110 (2016).
  4. Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8, (1), 287 (2017).
  5. Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
  6. Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34, (4), 435-440 (2016).
  7. Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7, (1), 11860 (2017).
  8. Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56, (1/2), (2011).
  9. Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1, (8), 559-564 (2016).
  10. Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9, (10), 858-866 (2014).
  11. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13, (5), 515-523 (2014).
  12. Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
  13. Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18, (9), 423-430 (2010).
  14. Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4, (5), (2013).
  15. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15, (2), 167-193 (2002).
  16. Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7, (1), 1-7 (2015).
  17. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6, (3), 199-210 (2008).
  18. Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49, (9), 875-884 (2005).
  19. Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
  20. Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6, (7), 1124-1130 (2017).
  21. Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282, (6), 3713-3719 (2007).
  22. Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 , (13), 6562-6566 (1996).
  23. Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7, (5), 1195-1200 (2018).
  24. Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (14), 3698-3703 (2018).
  25. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6, (3), 199-210 (2008).
  26. Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics