iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

Bioengineering
 

Summary

이 방법은 표준화된 미세 유체 플랫폼에서 40개의 교류 3D 마이크로혈관으로서 iPSC 유래 내피 세포의 배양을 기술한다. 이 플랫폼은 확장 가능하고 처리량이 높은 방식으로 혈관 신생 콩나물의 해부학 및 안정화를 포함하여 3D로 그라데이션 구동 혈관 신생 발아를 연구 할 수 있습니다.

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van Duinen, V., Stam, W., Borgdorff, V., Reijerkerk, A., Orlova, V., Vulto, P., Hankemeier, T., van Zonneveld, A. J. Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (153), e59678, doi:10.3791/59678 (2019).

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Abstract

혈관 질환의 전 임상 약물 연구는 높은 처리량 스크리닝으로 수정 할 수있는 혈관 구조의 체외 모델이 필요합니다. 그러나, 충분한 처리량을 가진 시험관내 검열 모형은 생체외에서 생체외에 사실 인정의 번역을 방해하는 한정된 생리학적 관련성이 있습니다. 다른 한편으로는, 미세 유체 세포 배양 플랫폼은 시험관에서 비교할 수없는 생리적 관련성을 보였지만 종종 필요한 처리량, 확장성 및 표준화가 부족합니다. 우리는 관류 및 그라데이션을 포함하여 생리학적 관련 세포 미세 환경에서 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC-EC)에서 파생 된 내피 세포의 혈관 신생을 연구하는 강력한 플랫폼을 보여줍니다. iPSC-EC는 패턴콜라겐-1 스캐폴드에 대해 40개의 교전된 3D 마이크로혈관으로 배양된다. 혈관 신생 요인의 구배를 적용하면 혈관 신생의 중요한 특징을 연구 할 수 있습니다. 형광 추적염료를 가진 관류는 혈관신생 콩나물의 안모증 도중 그리고 후에 투과성의 연구할 수 있습니다. 결론적으로, 이 방법은 iPSC 유래 EC의 실현 가능성을 표준화되고 확장 가능한 3D 혈관조인성 분석법으로 보여주며, 이 에 통합될 수 있는 견고성과 확장성을 겸비한 플랫폼에서 생리학적 관련 배양 조건을 결합한 분석 약물 스크리닝 인프라.

Introduction

시험관 내 모델은 혈관 질환의 새로운 약물 표적의 발견 및 검증에 근본적인 역할을 합니다. 그러나, 충분한 처리량을 가진 시험관내 검열 모형은 생체외에서 생체외에 사실 인정의 번역을 방해하는 한정된 생리학적 관련성1이있습니다. 따라서, 전임상 혈관 약물 연구를 진행하기 위해서는, 높은 처리량의 스크리닝과 생리학적으로 관련된 3D 세포 마이크로 환경을 결합하는 혈관내 모델의 개선이 필요하다.

지난 10 년 이내에, 혈관 내 체외 모델의 생리적 관련성을 증가시키기 위해 상당한 진전이 이루어졌다. 조직 배양 플라스틱과 같은 평평한 표면에 내피 세포를 배양하는 대신, 내피 세포는 피브린 및 콜라겐겔2와같은 3D 스캐폴드에 내장될 수 있다. 이러한 행렬 내에서, 내피 세포는 매트릭스 분해 및 루멘 형성과 관련된 보다 생리학적으로 관련된 표현형을 보여준다. 그러나, 이들 모델은 세포 미세환경으로부터의 중요한 단서로서 혈관신생 발아 중에 발생하는 많은 과정의 서브세트만을 입증한다.

미세 유체 세포 배양 플랫폼은 혈관 내 체외 모델의 생리적 관련성을 더욱 증가시키기에 유일하게 적합하다. 예를 들어, 내피 세포는 전단 스트레스에 노출될 수 있으며, 이는 혈관 구조에 중요한 생체 역학 적 자극입니다. 또한, 미세 유체 학적 내에서 유체를 공간적으로 제어 할 수있는 가능성은 생체 분자 그라데이션3,4,5,6의형성을 허용합니다. 이러한 그라데이션은 혈관신생 동안 형성 및 패터닝 동안 생체 내에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 미세 유체 세포 배양 플랫폼은 전통적인 2D 및 3D 세포 배양 방법에 비해 비교할 수없는 생리학적 관련성을 보였지만, 종종 약물 스크리닝에 필요한 처리량, 확장성 및 표준화가 부족합니다. 7. 또한, 이러한 플랫폼의 대부분은 상업적으로 사용할 수 없습니다 및 최종 사용자가 사용하기 전에 자신의 장치를 microfabricate 필요8. 이것은 제조 장치 및 기술 지식을 필요로 할뿐만 아니라 품질 관리 수준을 제한하고 재현성에 부정적인 영향을 미칩니다9.

현재까지, 1차 인간 내피 세포는 시험관내 혈관신생을 모델링하기 위해 가장 널리 사용되는 세포 공급원으로 남아있다 10. 그러나, 1 차적인 인간 세포는 검열 접근에 있는 그들의 일상적인 신청을 방해하는 제한의 수있습니다. 첫째, 1 차적인 세포 파생배양을 확장하고 확장하는 제한적인 가능성이 있습니다. 따라서 대규모 실험의 경우 다른 기증자의 배치를 사용해야 하므로 게놈 차이와 배치 간 변형이 발생합니다. 둘째, 몇 개의 대고 후에, 1차 내피 세포는 일반적으로 시험관 내 배양 시 관련 성질을상실한다11,12.

인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)에서 파생된 내피 세포는 유망한 대안입니다: 그(것)들은 1 차적인 세포를 닮습니다, 그러나 또한 정확한 게놈 편집을 할 수 있는 더 안정된 유전자형을 가진. 더욱이, iPSCs는 자가 갱신할 수 있고 따라서 iPSC 유래 세포가 시험관 내 스크리닝모델(13)내의 사용을 위한 1차 세포에 대한 매력적인 대안이 되도록 거의 무제한으로 확장될 수 있다.

여기서, 우리는 표준화된 고처리량 미세유체 세포 배양 플랫폼에서 내피 세포를 배양할 수 있는 3D 마이크로혈관으로 배양하는 방법을 설명한다. 관류는 장치를 로커 플랫폼에 배치하여 적용되어 강력한 작동을 보장하고 분석의 확장성을 높입니다. 미세 혈관이 지속적으로 관질되고 혈관 신생 인자의 구배에 노출됨에 따라 혈관 신생 발아는 보다 생리학적 관련이있는 세포 미세 환경에서 연구됩니다. 프로토콜은 (1 차) 내피 세포의 많은 다른 소스와 호환되는 동안14,15,우리는이 분석의 표준화를 증가시키고 통합을 용이하게하기 위해 인간 iPSC 파생 된 EC를 사용하는 데 초점을 맞추십시오. 혈관 약물 연구 내에서.

Protocol

1. 장치 준비

  1. 미세 유체 384 웰 플레이트를 멸균 층류 후드로 옮김.
  2. 뚜껑을 제거하고 멀티채널 또는 반복 피펫을 사용하여 40개의 관측웰(도 1b,well B2)에 각각 50 μL의 물 또는 인산완충식염수(PBS)를 첨가한다.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 실온(RT)에서 멸균 배양 캐비닛에 뚜껑이 있는 접시를 그대로 둡니다.

2. 젤 및 코팅 준비

  1. 10 μg/mL 피브로넥틴(FN) 코팅 용액 2.5 mL을 준비합니다. 덜베코 의 PBS (dPBS, 칼슘 및 마그네슘 무료)의 2.5 mL에 1 mg / mL 섬유넥틴 스톡 용액 의 25 μL을 희석. 용액을 사용 후 37°C의 수조에 놓습니다.
  2. 콜라겐-1 용액 100 μL을 준비합니다. NaHCO 3(37 g/L)의 10 μL에 HEPES(1M)의 10 μL을 넣고 파이펫팅하여 섞습니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 80 μL의 콜라겐-1(5 mg/mL)을 추가하여 중화 콜라겐-1 농도4 mg/mL을 생성합니다. 파이펫을 사용하여 조심스럽게 혼합하고 거품의 형성을 피하십시오.
  3. 콜라겐-1 용액 1.5 μL(4 mg/mL)을 각 미세 유체 단위의 겔 입구에 추가합니다(그림1b,잘 B1). 겔이 채널에 진입하기 위해 젤방울이 각 우물의 중간에 놓여 있는지 확인합니다(그림 2a참조).
    참고: 위상가이드는 인접 채널의 충진을 방지하고 겔 패터닝을 가능하게 합니다. 올바른 겔 로딩은 '관찰 창'(well B2)을 통해 반월상 연골 형성을 관찰하거나 플레이트를 거꾸로 뒤집어 서 밝은 시야 현미경으로 확인할 수 있습니다. 겔이 채널을 완전히 채우지 않은 경우, 1 μL의 액적을 추가로 첨가할 수 있다.
  4. 교원-1을 중합하기 위해 10 분 동안 인큐베이터 (37 °C, 5 % CO2)에미세 유체 플레이트를 놓습니다.
    참고: 중합의 타이밍은 매우 중요합니다. 미세 유체학에 사용되는 낮은 부피로 인해 15 분 의 배양 후에 증발이 이미 관찰 될 수 있어 겔 붕괴 또는 수축을 초래합니다.
  5. 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 멸균 층류 흐르기로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김.
  6. 모든 미세 유체 단위의 상단 관류 채널의 출구 웰에 10 μg/mL FN 코팅 용액 50 μL을 추가합니다(그림1b,Well A3). 기포를 트래핑하지 않고 우물의 정확한 충진을 위해 웰의 측면에 파이펫 팁을 누릅니다(그림 2b참조). 채널이 채워져야하고, 액체는 콘센트를 잘 채우지 않고 콘센트 (잘 C1)에 고정해야합니다.
  7. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에적어도 2일 동안 놓습니다.
    참고: 이 프로토콜은 코팅 혼합물과 함께 콜라겐-1 겔이 인큐베이터에서 적어도 5일 동안 안정적이기 때문에 여기서 일시 중지될 수 있다. 코팅 혼합물을 새로 고치는 경우 더 긴 기간이 가능할 수 있지만 테스트되지 않았습니다. 중요한 것은 FN 코팅의 수준이며, 이것은 콜라겐-1 겔의 탈수를 방지합니다.

3. 세포 시딩 / 미세 혈관 배양

  1. 5 mL의 태아 송아지 세럼과 2.5 mL의 펜/스트렙을 기저 내피 세포 배양 배지 500 mL에 넣고 0.22 μm 크기의 병 상판 필터를 사용하여 필터를 살균합니다. 이 매체는 이제 기저 매체라고합니다.
  2. 혈관 성장 배지 준비: 50 μg/mL 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 3 μL과 2 μg/mL의 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 기초 배지 의 5 mL에 추가합니다.
  3. 냉동 iPSC-EC를 37°C수조에서 빠르게 해동하고 15 mL 튜브로 옮기고 기저 배지 10 mL로 희석합니다.
  4. 셀을 계산합니다.
    참고: 단일 바이알에는 0.5 mL에 1백만 개의 세포가 포함되어 있으며 생존율은 >90%입니다.
  5. 100 x g에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리. 세포 펠릿을 방해하지 않고 흡기 상월체를 방해하지 않고 기저 배지에서 재중단하여 2 x 107 세포 / mL의 농도를 산출합니다.
  6. 인큐베이터에서 미세 유체 384 웰 플레이트를 멸균 층류 흐름 후드로 옮김을 전달합니다.
  7. 관류 입구 (well A1)로부터의 흡인 FN 코팅 용액. 입구 웰 (잘 A1)에 기저 매체 25 μL을 추가합니다.
  8. 모든 상부 관류 입구에 세포 현탁액 1 μL 방울을 잘 추가합니다(그림 1b,잘 A1). 물방울은 몇 초 안에 평평해져야 합니다(이 '패시브 펌핑' 방법의 그림은 그림 3a, b 참조).
    참고: 시딩이 균일한지 현미경으로 확인합니다. 그렇지 않은 경우 콘센트에 1 μL을 더 추가하고 물방울이 평평해질 때까지 기다립니다.
  9. 37 °C, 5 %CO2에서1 시간 동안 미세 유체 웰 플레이트를 배양합니다. 그 후, 세포는 부착해야합니다. 그렇지 않은 경우, 또 다른 30 분 기다립니다.
  10. 상단 관류 웰에서 기저 배지를 제거합니다(그림 1b,잘 A3). 상단 관류 입구 및 출구에 따뜻한 용기 배양 배지를 추가합니다(그림 1b,우물 A1 및 A3). 플레이트를 로커 플랫폼(7° 각도, 8분 흔들 간격으로 설정)에 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에놓습니다.
  11. 세포 생존가능성을 확인하기 위해 1일차와 2일 후 시드를 자동화한 스테이지로 브라이트필드 현미경을 사용하여 플레이트를 이미지화합니다. 2 일 후, 동면 단층은 콜라겐-1 스캐폴드에 대해 형성되어야합니다.
    참고: 채널이 동등하게 동류로 나타나지 않는 경우, 마이크로 혈관은 추가 24 시간 동안 배양 될 수있다.

4. 팁 및 줄기 세포 형성을 포함한 혈관 신생 발아 연구

  1. VEGF(50 μg/mL 스톡) 4.5 μL, 4.5 μL의 포르볼 12-마이리스테이트-13-아세테이트(PMA) (2 μg/mL 스톡) 및 2.25 μL의 스핑고신-1-인산염(mphate)으로 기저 배지를 보충하여 혈관신생 발아 배지의 4.5 mL를 준비합니다.
  2. 8.5 mL의 용기 성장 배지(30 ng/mL VEGF 및 20 ng/mL bFGF로 보충된 기저 배지)를 준비합니다.
  3. 웰로부터 배지를 흡인하고 상부 관류 입구 및 출구 웰 및 겔 입구 및 출구 웰에 50 μL의 신선한 용기 배양 배지를 첨가한다(도1b,우물 A1, A3, B1 및 B3).
  4. 각 하부 관류 채널 입구 및 출구 웰에 혈관 신생 물자 혼합물 50 μL을 추가합니다(그림 1b,우물 C1 및 C3).
  5. 혈관신생 성장 인자의 구배를 형성하기 위해 장치를 로커 플랫폼의 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에다시 놓습니다.
  6. 영상 1일 및 2일 후, 자동화된 단계로 밝은 시야 현미경을 사용하여 혈관신생 성장 인자를 첨가한다.
    참고: 해부학을 연구하기 위해 마이크로 혈관을 계속 배양 (섹션 5로 이동) 또는 수정 및 수정 및 2 일째와 6 일째에 발아 길이와 형태를 정량화하기 위해 마이크로 혈관을 얼룩 (섹션 6로 이동).

5. 해부학 및 새싹 안정화 연구

  1. 자동화 된 단계와 밝은 필드 현미경을 사용하여 이미지.
  2. 1 μL의 형광 표지 알부민 (0.5 mg / mL)을 상단 관류 입구(그림 1b,well A1)에 넣고 50 μL 파이펫을 사용하여 혼합하십시오.
  3. 37°C에서 자동 단계 및 인큐베이터를 사용하여 플레이트를 형광 현미경으로 옮김. 10x 객관적이고 정확한 노출 설정(예: 테트라메틸라호다민 [TRITC]-채널, 20ms 노출)에서 현미경을 설정합니다. 10 분 동안 매 분마다 시간 경과 이미지를 획득합니다.
  4. 현미경에서 플레이트를 제거하고 멸균 층류 후드로 플레이트를 옮김을 옮김.
  5. 웰로부터 모든 배지를 제거하고 해당 웰에서 혈관 배양 배지 및 혈관 신생 발아 배지를 모두 대체합니다(단계 4.3 및 4.4 참조).
  6. 혈관 신생 발아를 계속하기 위해 장치를 인큐베이터 (37 °C, 5 %CO2)에다시 놓습니다.
  7. 6일째에 투과성을 연구하기 위해 5.1-5.6단계를 반복한다.

6. 고정, 염색 및 이미징

  1. 모든 우물에서 모든 문화 미디어를 흡인합니다.
    참고: 미세 유체 채널의 잔류 배지 또는 액체는 1−2 μL의 낮은 부피로 인해 고정에 영향을 미치지 않습니다.
  2. 모든 관류입구(그림 1b,A1 및 C1) 및 출구 웰(그림1b,A3 및 C3)에 PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA)의 25 μL을 추가합니다. RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
  3. 우물에서 PFA를 흡인합니다. 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)의 50 μL로 모든 관류 입구와 콘센트를 두 번 세척합니다. 우물에서 흡인 HBSS.
  4. 모든 관류 유입구 및 배출구에 0.2% 요오닉 계면활성제 50 μL을 첨가하여 RT에서 10분 동안 투과해한다.
  5. 우물에서 난오 계면 활성제를 흡인합니다. 모든 관류 유입구 및 출구 웰에 50 μL의 HBSS를 추가하여 관류 채널을 두 번 세척합니다. 우물에서 흡인 HBSS.
  6. HBSS에서 페할로이드(1:200)를 사용하여 Hoechst (1:2,000) 및 F-액틴을 사용하여 핵을 염색합니다. 40 단위에 대해 2.2 mL을 준비하고 각 관류 입구 및 출구에 25 μL을 추가하십시오. 플레이트를 약간의 각도로 놓고 RT에서 적어도 30 분 동안 배양하십시오.
  7. 모든 관류 입구와 콘센트에서 HBSS 50 μL로 두 번 씻으소서.
  8. 자동 단계와 형광 현미경을 사용하여 직접 이미지 또는 나중에 사용하기 위해 4 °C에서 빛으로부터 보호 플레이트를 저장합니다.

Representative Results

미세 유체 3D 세포 배양 플랫폼은 40 개의 교전 미세 유체 단위(그림 1a, b)로구성되어 있으며, 이는 패턴 콜라겐-1 겔에 대해 교석 성 미세 혈관의 혈관 신생 발아를 연구하는 데 사용됩니다(그림 1c). 이들 마이크로혈관은 지속적으로 관질되고 혈관신생 성장 인자의 구배에 노출된다(도3a-d). 혈관신생 콩나물은 그라데이션 노출 후 2일 또는 그라데이션 노출 후 5일 이상 배양하여 해부학 및 새싹 안정화를 연구할 수 있다(타임라인, 도 1d참조).

수동 펌핑 방법을 사용하여 iPSC-EC를 시드하는 것은 균질한 시드 밀도를 초래한다(도 4a, b). 연속 관류 하에서 배양은 세포가 완전히 미세 유체 채널의 둘레를 일렬로 세우고 패턴 콜라겐-1 젤에 대한 결합 단층의 형성과 함께 2 일 만에 결합 된 마이크로 혈관을 초래했다.

혈관신생 인자의 구배에 노출되면 패턴이 있는 콜라겐-1 겔 내의 미세혈관의 방향성 혈관신생발아(도 5a-g)를초래하였다. 명확한 팁 세포 형성 및 콜라겐-1 겔내의 침입은 혈관신생 구배를 첨가한 후 24시간 동안 보였으며, 루멘 형성을 포함하는 줄기 세포는 48시간 후에보였다(도 5a).

고정 및 염색 후, 모세관 네트워크는 F-액틴을 염색하기 위해 남근을 사용하여 가시화될 수 있고 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색할 수있다(도 5b,c). 이들 콩나물은 정량화될 수 있다(예를 들어, 형상 및 길이14). 성장 인자를 첨가하지 않고 콜라겐-1 겔에 침입하지 않아야합니다(그림 5d). 공초점 이미징을 사용하여 새싹 직경을 확인하고 루멘 형성을 확인하였다(도5e-g).

새싹은 그라데이션 방향으로 계속 성장하고 혈관 신생 성장 인자를 첨가 한 후 3-4 일 이내에 반대 관류 채널에 도달합니다. 이것은 혈관 네트워크의 리모델링을 초래하고, 혈관 신생 콩나물의 수의 명확한 감소와 함께(도 6a). 루멘 형성은 형광표지된 거대분자(예를 들어, 알부민 또는 덱스트랜스)를 가진 혈관 네트워크의 관류에 의해 평가되었다. 매균 전후 0.5 mg/mL 라벨이 붙은 알부민으로 마이크로혈관을 침범한 결과, 10분 후 새싹 투과성의 뚜렷한 차이가나타났습니다(그림 6b-e),이는 모세혈관이 해부학 후 안정화되고 성숙되었음을 시사한다.

Figure 1
도 1: iPSC 유래 마이크로혈관에 대한 미세유체 세포 배양 프로토콜. (a)미세유체 세포 배양 장치의 바닥은 384 웰 플레이트 아래에 통합된 40개의 미세 유체 단위를 표시하는 것으로 나타났다. 더 큰 뷰는 40개의 미세 유체 단위 중 하나를 표시합니다. (b)각 미세 유체 단위는 3 개의 입구 웰과 3 개의 콘센트 웰이있는 9 개의 우물 아래에 배치됩니다. 미세 유체 채널은 중앙 채널 ('젤 채널')에서 하이드로 겔의 패터닝을 가능하게하는 능선 ('위상 가이드')에 의해 분리되며 인접 채널 ('관류 채널')과 여전히 접촉합니다. (c)패턴콜라겐-1 매트릭스를 통해 구배 구동 혈관신생 발아를 연구하는데 사용되는 미세유체 장치 내에서 공질된 마이크로혈관을 배양하는 방법. (d)혈관 신생 발아 및 / 또는 해부학을 연구하기위한 타임 라인. 이 그림은 반 두이넨 외14에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 젤 및 매체에 대한 로딩 절차. (a)정확하고 잘못된 겔 증착의 예. 올바른 파일링은 중간 채널에서 패턴화된 콜라겐-1 겔을 초래하며, 이는 이후에 중합된다. (b)우물의 정확하고 잘못된 충진의 예. 우물은 미세 유체 채널 내에서 기포 트랩을 방지하기 위해 1−4의 순서로 채워집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 연속 적인 정수압 구동 흐름 및 그라데이션 안정화. (a)웰 간의 정수압 차이로 인해 수동 레벨링과 미세 유체 채널 내의 흐름이 발생합니다. (b)장치를 7° 및 8분 주기 시간으로 설정된 로커 플랫폼에 놓면 미세 유체 채널 내에서 연속적이고 양방향 관류가 발생합니다. (c)그라데이션은 웰 내에 두 개의 서로 다른 농도를 도입하여 형성되며, 이는 수동 평준화에 의해 지속적으로 새로 고쳐집니다. (d)플루오레세인 이소티오차네이트(FITC)-덱스렌을 이용한 그라데이션 시각화. 양방향 흐름은 3일까지 그라데이션을 안정화시다. 배율 막대 = 200 μm. 이 그림은 반 두이넨 외14에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 셀 시딩을 위한 패시브 펌핑 방법. (a)패시브 펌핑은 표면 장력의 차이에 의해 야기되는 압력 차이에 의해 구동된다. 이로 인해 액적(높은 내부 압력)에서 저수지(낮은 내부 압력)로 의 흐름이 발생합니다. (b)미세 유체 채널(파란색 윤곽선)의 입구(흰색 윤곽선) 위에 놓이는 액적(회색 윤곽선)의 시간 경과. 추가직후(도 4b, i),입구 의 상부에 있는 물방울이 수축(도4b, ii: 1s 첨가 후; iv: 추가 후 2 s), 출구쪽으로 흐르는 결과. 이것은 물방울 반월 상 연골이 입구에 의해 고정될 때까지 계속됩니다(도 4b, iv). 배율 표시줄 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: iPSC-EC 마이크로혈관의 견고한 3D 발아. (a)시간이 지남에 따라 iPSC-EC의 발아. 마이크로혈관은 48시간(오른쪽)으로 성장한 다음 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P 및 2 ng/mL PMA를 함유하는 혈관신생 칵테일로 자극하였다. 콜라겐-1 스캐폴드(가운데)를 침범하는 첫 번째 팁 세포는 노출 후 24시간 동안 볼 수 있다. 첫 번째 루멘은 노출 후 48시간(화살표)이 표시되고 팁 셀은 그라데이션 방향으로 더 이동합니다. (b)VEGF, S1P 및 PMA를 2일 동안 자극하고 F-액틴(yellow) 및 핵(blue)에 대해 염색한 15개의 마이크로혈관의 어레이. 스케일 바 = 200 μm.(c)자극된 마이크로혈관(양성 대조군). (d)자극되지 않은 마이크로 혈관 (음성 제어). (e)겔 내의 단일 모세관의 최대 투영. (f)동일(g)하지만중간에 초점을 맞춘 것입니다. 점선은 패널 g. 스케일 바(a-d: 200 μm; e-g: 20 μm)에서 직교 뷰의 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 해부학 전후의 혈관신생 새싹 투과성의 시각화. (a)기저 채널이있는 해부학은 혈관 신생 콩나물의 가지 치기 및 성숙을 유발합니다. 혈관 신생 성장 인자를 가진 자극 후 2, 4, 6 및 7 일에서 모세 혈관 침대의 클로즈업. (b)혈관신생 성장인자를 첨가한 후 2일 후에 혈관신생 콩나물을. 혈관 신생 콩나물은 겔 내에서 형성되지만 아직 바닥 관류 채널에 연결되지 않았습니다. (c)0.5 mg/mL 알부민-알렉사 555 용액을 가진 마이크로 용기의 관류. 0 및 10 분에서 얻은 형광 영상(d,e)패널 b 및 c에서와 동일하지만, 자극 7 일 후에. 새싹채소는 다른 쪽에 연결되고 기저 관류 채널에서 동시 미세 혈관을 형성한다. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

문제 원인 솔루션
콜라겐-1이 채널을 완전히 입력하거나 채우지 않습니다. 콜라겐-1 방울은 입구 위에 놓이지 않습니다. 젤 채널에서 입구 위에 물방울을 조심스럽게 놓습니다.
콜라겐-1의 부피가 너무 낮습니다. 1.5 μL의 젤을 사용하여 채널을 완전히 채웁니다.
콜라겐-1은 너무 점성이 있습니다. 콜라겐-1의 또 다른 배치를 사용
콜라겐-1이 관류 채널로 유입 콜라겐-1은 겔 채널 입구로 직접 파이펫을 삽입합니다. 젤 채널에서 입구 위에 물방울을 조심스럽게 놓습니다.
콜라겐-1은 명확하지 않습니다 / 섬유 형성 콜라겐-1이 제대로 저장되지 않음 콜라겐-1을 4 °C에서 보관하고 동결하지 마십시오.
NaHCO3 및 HEPES는 콜라겐-1을 첨가하기 전에 잘 혼합되지 않습니다. 콜라겐-1을 첨가하기 전에 파이펫팅하여 NaHCO3와 HEPES를 조심스럽게 섞습니다.
패시브 펌핑 방법을 사용하여 액적이 수축되지 않음 물방울이 우물의 측면에 밀착됩니다. 물방울을 흡입하고 입구 위에 새 물방울을 추가합니다.
콘센트가 최소 20 μL 이상의 매체로 채워져 있는지 확인하십시오.
발아현상이 관찰되지 않습니다. 성장 인자가 추가되지 않거나 aliquots가 제대로 저장되지 않습니다. 신선한 혈관 신생 발아 매체를 준비
기포 블록 관류/ 그라데이션 형성 P20 또는 P200 파이펫을 사용하여 기포 제거
웰 간의 체적 차이 선형 그라데이션을 형성하려면 모든 웰의 볼륨이 같아야 합니다.
실행 불가능한 세포 로커 플랫폼/로커 플랫폼에 배치되지 않은 플레이트 로커 플랫폼이 켜지고 올바른 사이클 시간/각도(8분/7°)가 있는지 확인합니다.
기포의 존재로 인해 관류가 불가능합니다. P20 또는 P200 파이펫을 사용하여 기포 제거
루멘이 형성되지 않고 세포가 단일 세포로 마이그레이션됩니다. 단층이 형성되기 전에 혈관 형성 발아 혼합물을 첨가했습니다. 혈관 신생 성장 인자를 추가하기 전에 추가로 24 시간 기다립니다.
발아 밀도의 주요 변화 시딩 후 세포 밀도의 차이 세포 밀도가 미세 유체 단위 간에 균질하고 비교 가능한지 확인합니다. 필요한 경우 셀 서스펜션의 또 다른 액적 추가

표 1: 일반적인 오류 문제 해결.

Discussion

이 방법은 견고하고 확장 가능한 미세 유체 세포 배양 플랫폼 내에서 40개의 투과성 내피 미세 혈관의 배양을 설명합니다. 기존의 2D 및 3D 세포 배양 방법에 비해, 이 방법은 그라데이션및 연속 관류를 포함하는 생리학적 관련 세포 미세 환경이 스크리닝을 위한 적절한 처리량과 3D 세포 배양과 결합될 수 있는 방법을 보여줍니다. 목적.

비교 가능한 미세 유체 성 검사에 비해 주요 장점 중 하나는이 방법은 관류펌프에 의존하지 않고 로커 플랫폼을 사용하여 모든 미세 유체 단위에서 동시에 지속적인 관류를 유도한다는 것입니다. 이렇게 하면 로커 플랫폼에 플레이트를 쌓을 수 있습니다. 중요한 것은, 모든 미세 유체 단위는 개별적으로 주소 지정 가능한 상태로 유지되며, 이를 통해 이 방법은 투여 량-응답 곡선의 생성을 포함하여 약물 스크리닝 내에서 구현될 수 있습니다. 또한 펌프가 없으면 이미징 및 중간 교체가 훨씬 간단하며(교차) 오염 위험이 적습니다.

이 방법의 또 다른 장점은 표준화된 사전 제조 된 플랫폼을 사용하는 반면, 유사한 미세 유체 세포 배양 플랫폼은 최종 사용자에 의해 제작되어야한다는 것입니다. 이 가용성은 표준화로 이끌어 내는 그밖 학술 및 약학 연구 단 중 이 분석의 채택을 용이하게 합니다. 또한, 미세 유체 프로토타입과 달리 384웰 플레이트 인터페이스는 현재 실험실 장비(예: 지피레이터, 플레이트 핸들러 및 다중 채널 파이펫)와의 호환성을 보장하여 현재 스크리닝 인프라 내에서 통합을 용이하게 합니다. .

이 분석 을 수행 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 콜라겐-1 젤은 젤 채널을 완전히 채워야 합니다. 겔 로딩 동안, 이 충전물은 관찰창(그림 2a)을통해 미세 유체 채널을 검사하거나 플레이트를 거꾸로 뒤집어 관찰할 수 있습니다(그림 1a와같이). 채우는 동안 콜라겐 젤은 인접한 관류 채널로 흐르지 않고 중앙 채널에 남아 있어야합니다. 우리는 콜라겐-1 젤의 품질이 적절한 분석 성능을 위해 중요하다는 것을 발견했습니다. 점도가 너무 높은 콜라겐-1 배치는 젤 채널의 불완전한 충진으로 이어질 것입니다. 37°C에서 중합10분 후, 겔은 균일하고 명확해야 한다. 콜라겐-1이 제대로 저장되지 않으면(예: 냉장고의 온도 변동으로 인해) 콜라겐은 명확하게 보이는 섬유 형성으로 채널 내에서 중합됩니다. 이것은 혈관 신생 인자를 첨가하지 않고 젤에 EC를 침범 할 수 있지만 적절한 루멘 발달없이 발생할 수 있습니다.

세포가 시드되면, fibronectin 코팅 용액은 코팅 용액으로 채워진 미세 유체 채널만 남기고 우물에서 제거됩니다. 미세 유체 채널에서 코팅 용액의 흡인은 겔 중단 또는 젤 흡인을 일으킬 수 있습니다. 셀 서스펜션은 이 코팅 용액을 교체/대체해야 합니다. 이는 셀 서스펜션이 수동 펌핑 방법을 사용하여 시드될 때 가장 효과적입니다.

마이크로 혈관이 젤에 대해 안정적인 단층을 형성함에 따라, 이러한 작은 차이는 합류에 도달하는 데 필요한 다른 시간만 을 초래합니다. 따라서, 분석 시작점은 배양 시간이 아닌 합류에 의해 결정된다. 필요한 경우, 겔에 대하여 명확한 단층이 형성될 때까지 배양 시간을 연장할 수 있다.

우물 내에서 기포는 우물의 잘못된 충진에 의해 포획될 수 있습니다(그림 2b참조). 이러한 기포는 장치가 로커 플랫폼에 배치된 경우에도 매체의 흐름을 제한하고 마이크로 용기의 붕괴와 부적절한 그라데이션 형성을 초래합니다. 우물의 측면 벽에 파이펫 팁을 누르면 완전히 우물을 채우는 성공을 증가시킬 것이다. 기포가 우물 내에 갇혀있는 경우 멸균 피펫 팁을 유리 바닥에 부드럽게 삽입하여 제거 할 수 있습니다. 기포는 미세 유체 채널 내에서도 발생할 수 있습니다. 매폐가 우물에서 제거되면 30 분 후에 미세 유체 채널에서 매체의 증발이 눈에 띄게됩니다 (채널 내의 마이크로 리터 부피로 인해). 따라서, 배지 변화는 바람직하게는 가능한 한 빨리 수행된다. 증발 배지가 있는 채널에 배지를 추가하면 기포가 미세 유체 채널 내에 포동포동하게 됩니다. 미세 유체 채널 내의 이러한 기포는 P20 파이펫을 입구 또는 출구에 직접 배치하고 반대쪽 우물에서 미세 유체를 통해 매체를 강제로 제거 할 수 있습니다. 기포를 성공적으로 제거하면 다른 우물의 부피가 작지만 눈에 띄게 감소합니다. 표 1에는 일반적인 오류와 문제 해결 방법을 나열합니다.

로커 플랫폼은 순차적 시간 간격으로 사용자를 이미지로 제한하기 때문에 연속 이미징이 필요한 경우 펌프의 부족이 제한됩니다. 또한,이 플랫폼에서 매체의 관류는 전단 응력의 낮은 수준의 양방향 흐름으로 구성되어 있으며, 생체 내 혈관 구조는 전단 응력의 높은 수준으로 단방향 흐름에 노출됩니다. 우리는 혈관 신생 발아와 관련하여 양방향 흐름의 부정적인 영향을 관찰하지 않지만, 흐름은 중요한 생체 역학 자극이며 바람직하게는 제어됩니다. 그러나 시판되는 펌프 셋업이 있지만 384웰 플레이트와의 인터페이싱은 여전히 까다롭고 펌프 설정은 이 분석의 확장성을 심각하게 저해합니다.

혈관 신생 발아를 연구하기 위해 iPSC-EC를 사용할 수있는 가능성은 질병 모델링 및 약물 연구에서 새로운 기회를 열어줍니다. 1차 ECs와 는 달리, 이들 세포는 안정적인 유전자형을 가진 거의 무한한 양으로 생성될 수 있고 게놈 편집 기술을 사용하여, 세포는 유전자 녹아웃 및 노크인을 포함하는 생성될 수 있다. 그러나 iPSC와 EC를 구별하는 프로토콜은 비교적 새로운 프로토콜이므로 기본 EC를 가장 잘 반영하는 iPSC-EC와 EC의 하위 유형이 생성될 수 있는 것이 무엇인지는 아직 불분명합니다. 또한 관련성에 대한 의문은 여전히 남아 있습니다. 예를 들면, iPSC-EC는 아직도 내피 세포를 위해 전형적인 가소성을 전시합니까? 그리고 iPSC 유래 세포는 어느 정도까지 그들의 세포 미세 환경에 반응하고 상호 작용합니까? 여기에 제시된 표준화된 플랫폼은 iPSC 유래 EC의 사용을 시험관 내에서 더욱 검증하기 위해 이러한 질문 중 일부에 답하는 데 사용될 수 있습니다.

이 분석에 대한 가장 똑바른 미래 방향은 pericytes 및 대식세포와 같은 혈관 신생 동안 중요한 역할을하는 다른 세포 유형의 통합이 될 것입니다. 이것은 새싹 사이 건대 증 또는 모세 혈관 형성 후에 pericytes의 준수 도중 대식세포의 역할을 공부하는 기능을 촉진할 것입니다. 또한, 세포외 기질(예를 들어, 혈관과 결합될 수 있는 근위수관 및 소장과 같은 뉴런 및 다양한 상피 구조의 배양을 보여주었다)에 대하여 다양한 다른 세포 유형을 배양할 수 있다. 이 방법을 사용하여 생성 된 침대. 마지막으로, 그들의 정의된 조성물이 분석의 표준화를 더욱 증가시키고 세포 매트릭스 상호작용에 영향을 미치는 강성 및 결합 동기의 튜닝을 허용하기 때문에 합성 하이드로겔에서 혈관신생 발아를 연구하는 것이 흥미로바일 것이다.

결론적으로, 이 방법은 iPSC 유래 EC의 실현 가능성을 표준화되고 확장 가능한 3D 혈관조인성 분석법으로 보여주며, 이 에 통합될 수 있는 견고성과 확장성을 겸비한 플랫폼에서 생리학적 관련 배양 조건을 결합한 분석 약물 스크리닝 인프라.

Disclosures

P. 불토와 T. 한케마이어는 미메타스 BV의 주주입니다. V. 보그도르프와 A. 레이저케르크는 엔카디아 BV의 직원이다. V. 반 두이넨, W. 스탬, V. V. 올로바와 A.J. 반 조네벨드는 공개가 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 네덜란드 보건 연구 개발 기구 (ZonMw)와 네덜란드 심장 재단 CVON 컨소시엄 보조금의 '미어 케니스 만난 마인더 디에렌'프로그램 (프로젝트 번호 114022501)에서 연구 보조금에 의해 부분적으로 지원됩니다 다시.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2-10 μL Electronic repeater pipette Sigma Z654566-1EA
1 M HEPES Gibco 15630-056
3-lane OrganoPlate Mimetas 4003-400B
4% PFA in PBS Alfa Aesar J61899
Basal culture medium NCardia
Collagen-1 Cultrex 3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL VWR 613-2071
dPBS Gibco 14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte VWR 613-2890
Fibronectin Sigma-Aldrich F4759-1MG 1 mg/mL in milliQ water
HBSS Gibco 14025-050
Hoechst Molecular Probes H3569 10 mg/mL solution in water
iPSC-derived endothelial cells NCardia
NaHCO3 Sigma S5761 37 g/L in milliQ water
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini Mimetas Rocker platform used to provide flow
Pen/Strep Sigma P4333
Phalloidin Sigma P1951 1 mg/mL in DMSO
PMA Focus-Biomolecules 10-2165 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO
S1P Ecehelon Biosciences S-2000 1 mM in methanol containing 1% acetic acid
TRITC-albumin Invitrogen A34786
VEGF Peprotech 450-32-10 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA

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References

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