الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ترتبط تجارب البروتين المجهري الملزم (PBM) المقترنة باختبارات الكيمياء الحيوية بالخصائص الملزمة والمحفزة للحمض النووي البدائي ، وهو انزيم يجمع الإشعال الريبي علي الحمض النووي. ويمكن استخدام هذه الطريقة ، التي تم تعيينها كتنميط بدائي عالي الانتاجيه (HTPP) ، للكشف عن أنماط ربط الحمض النووي لمجموعه متنوعة من الانزيمات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ilic, S., Cohen, S., Afek, A., Gordan, R., Lukatsky, D. B., Akabayov, B. DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling. J. Vis. Exp. (152), e59737, doi:10.3791/59737 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الحمض النووي البدائي توليف الإشعال RNA قصيرة التي تبدا تخليق الحمض النووي من شظايا Okazaki علي حبلا متخلفه من قبل الحمض النووي البوليميريز خلال النسخ المتماثل DNA. والربط بين البدائيات ذات النواة الحقيقية الشبيهة بالحمض النووي في الدنا يحدث عند تسلسل معين للاعتراف بالكروموسومات الثلاثية. وهي خطوه محوريه في تشكيل شظايا اوكازاكي. الاداات البيوكيميائية التقليدية التي تستخدم لتحديد تسلسل التعرف علي الحمض النووي من الحمض النووي البدائي توفر فقط معلومات محدوده. باستخدام المقايسة الدقيقة العالية الانتاجيه المستندة إلى ميكروصفيف والتحليلات البيوكيميائية المتتابعة ، فقد تبين ان 1) السياق ملزمه محدده (الربط متواليات من موقع الاعتراف) يؤثر علي قوه ملزمه من الحمض النووي البدائي إلى قالبه الحمض النووي ، و 2) اقوي ملزمه من البدائية إلى الحمض النووي غله أطول الجيش النيبالي العالي الإشعال ، مشيرا إلى ارتفاع المستقيم من الانزيم. ويجمع هذا الأسلوب بين الفحص الدقيق والنشاط البدائي ويتم تعيينه كتصنيف بدائي عالي الانتاجيه (HTPP) ، ويسمح بتوصيف التعرف علي تسلسل محدد بواسطة الحمض النووي البدائي في وقت وقابليه غير مسبوقين.

Introduction

HTPP يجعل استخدام الحمض النووي ربط التكنولوجيا الدقيقة مع التحليل البيوكيميائي (الشكل 1) لتحديد إحصائيا ميزات محدده من قوالب الحمض النووي التي تؤثر علي النشاط الانزيمي من الحمض النووي البدائي. ولذلك ، يوفر HTPP منصة التكنولوجية التي تسهل قفزه المعرفة في الميدان. الاداات الكلاسيكية المستخدمة لتحديد مواقع التعرف علي البدائية لا تملك القدرة علي الغلة كميه هائله من البيانات ، في حين HTPP لا.

PBM هي تقنيه تستخدم بشكل روتيني لتحديد التفضيلات الملزمة لعوامل النسخ إلى الحمض النووي1,2; ومع ذلك ، فانه ليس مناسبا للكشف عن ضعف/عابره ملزمه من البروتينات إلى الحمض النووي. علي عكس PBM العالمية التي توفر معلومات حول متوسط البروتين ربط الخصوصية لجميع تسلسل ممكن تتكون من ثمانيه أزواج الاساسيه ، ويستند HTPP علي مكتبه قوالب الحمض النووي واحده تقطعت بها السبل تتالف من عناصر تسلسل فريدة من نوعها. وتشمل هذه العناصر تسلسل الحمض النووي عشرات آلاف قصيرة (بضع عشرات من bp) متواليات الجينوم ، فضلا عن التصميم المحوسب متواليات الحمض النووي المخصب في بعض عناصر التسلسل المتكرر الحمض النووي الموجودة في الجينوم ، والتي تمتلك مختلف المحتوي GC متوسط . ويسمح هذا النهج العالي الانتاجيه بتحديد الخصائص المرتبطة بالتسلسل التي تعتبر مهمة للربط البدائي ونشاطه الانزيمي3، بطريقه منهجيه وكميه وقائمه علي الفرضيات. علي وجه الخصوص ، تم تحديد الصلة الهامه بين التفضيلات الملزمة للحمض النووي البدائي ، (التضمين بواسطة تسلسل الحمض النووي الذي يحيط بمواقع ربط ثلاثي النوكليوتيد المحددة) والمستقيم البدائي لهذا النظام الانزيمي4.

تم تطبيق التكنولوجيا الجديدة لأعاده النظر في فهمنا لمواقع التعرف علي البدائية حتى بالنسبة T7 الحمض النووي البدائية التي تم دراستها علي نطاق واسع5. وعلي وجه التحديد ، أدت أعاده النظر في المفاهيم الكلاسيكية ، مثل مواقع التعرف علي الحمض النووي T7 الحمض النووي البدائي (التي تم تحديدها قبل أربعه عقود تقريبا 6) باستخدام البروتين الحمض النووي ملزمه ميكروصفيف (PBM) إلى رؤية غير مسبوقة في الميزات المتعلقة التسلسل [فلكينغ] من هذا تمييز موقعات3. وكان من المتوقع ان التسلسل الذي يحيط بموقع الاعتراف ثلاثي النوكليوتيد من T7 DNA بريتاز (5 '-GTC-3 ') سيكون عشوائيا. بدلا من ذلك ، وجدنا ان المتواليات الغنية TG التي تزيد من فرص T7 الحمض النووي البدائية لتوليف الإشعال الجيش الملكي النيبالي أطول تشير إلى زيادة في processivity.

وتشمل الطرق الأخرى التي يمكن استخدامها لدراسة خصائص ربط الحمض النووي من البروتينات في المختبر اختبار تحول الحركة الكهربية (EMSA)7، dnase انا الطباعة علي الاقدام8، السطح-PLASMON الرنين (موارد الاستخدام الخاصة)9، وجنوب غرب التنقيط 10. ومع ذلك ، فان أساليب الانتاجيه المنخفضة تنطبق فقط علي التحقيق في عدد صغير من تسلسل الحمض النووي. الاضافه إلى ذلك ، فان دقه وحساسية بعض هذه التقنيات (مثل EMSA) منخفضه. من ناحية أخرى ، في المختبر الاختيار11 هو الأسلوب الذي ، بالمثل لل PBM ، يمكن استخدامها لتحديد العديد من تسلسل ملزمه. ومع ذلك ، عاده ما تستبعد تسلسلات تقارب منخفضه في معظم تطبيقات الاختيار في المختبر. ولذلك ، فان هذا النهج غير مناسب للحصول علي بيانات الربط المقارن لجميع التسلسلات المتاحة. ويستخدم العالمية PBM1,2 أساسا لتوصيف الخصائص الملزمة لعوامل النسخ من النوى البدائية والنواة وكذلك عوامل محدده (علي سبيل المثال ، وجود بعض ligands ، والعوامل المختلطة ، وما إلى ذلك) التي قد تؤثر علي هذا التفاعل12.

HTPP يوسع تطبيق PBM لانزيمات معالجه الحمض النووي من خلال الجمع بين الطاقة الاحصائيه عاليه الانتاجيه غير مسبوقة مع دقه عاليه لتوفير معلومات حول سياق تسلسل الربط. ولم يتم بعد الحصول علي هذه البيانات بالنسبة للبدائيات والانزيمات ذات الصلة (التي لها ارتباط ضعيف/عابر بالحمض النووي) بسبب القيود التقنية المذكورة أعلاه للتقنيات المتاحة الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم ميكروصفيف

ملاحظه: تحقيقات الحمض النووي تمثل متواليات 36 المخصصة-النيوكليوتيد ، التي تتكون من موقع التعرف علي T7 DNA البدائية (GTC) الواقعة بين منطقتين متغيرتين التطويق ، تليها تسلسل ثابت 24-النيوكليوتيد المربوطة إلى شريحة زجاجيه3. استخدمنا 4 x 180,000 شكل ميكروصفيف ، والتي مكنت من اكتشاف كل تسلسل الحمض النووي في ست نسخ متماثلة ، وزعت عشوائيا علي الشريحة.

  1. تصميم مكتبه الحمض النووي للحصول علي البدائية مع تسلسلات التعرف المعروفة
    1. تاكد من ان كل تسلسل يتكون من 60 نوكليوديس. الحفاظ علي أول 24 نوكليوديس ثابت (ليتم إرفاقها إلى الشريحة الزجاجية). وينبغي ان يكون للمناطق المتغيرة الشكل العام التالي: (N)16GTC (n)17؛ حيث N يمثل اي نوكليوتيد المطلوب.
    2. تصميم منطقه التطويق لمعالجه مساله علميه محدده (ويرد مثال علي التصميم في النص التالي). قد تصمم المناطق التي يحيط بها لاحتواء ميزات محدده مثل عناصر التكرار أو تماثل محدد.
      ملاحظه: لقد انشانا ثماني فئات من تسلسل المختلفة التي تتالف من اثنين أو ثلاثه نوكليوديس محدده: T و G (المجموعة 1) ؛ T و C (المجموعة 2) ؛ جيم والف (المجموعة 3) ؛ الف وزاي (المجموعة 4) ؛ زاي وجيم وراء (المجموعة 5) ؛ جيم وراء والف (المجموعة 6) ؛ زاي ، الف وراء (المجموعة 7) ؛ زاي والف وجيم (المجموعة 8). 2,000 تم تصميم تسلسلات مختلفه لكل مجموعه. تلقي كل مجموعه مجموعات فرعيه من تسلسل مع أنواع مختلفه وأرقام مختلفه من تسلسل يكرر.
    3. تضمين مجموعه من تسلسلات التحكم السالبة (التي تفتقر إلى موقع الربط المحدد)4. وجود مثل هذه التسلسلات يسمح للتحقق من حدوث ربط محدده في التجربة.
  2. تصميم مكتبه الحمض النووي للحصول علي البدائية مع تسلسلات التعرف غير معروف
    1. إذا كان تسلسل التعرف غير معروف ، قم بإنشاء مكتبه الحمض النووي عن طريق تحديد التسلسل (مع أو بدون ميزات محدده المذكورة سابقا) من جينوم الكائن المطلوب (البكتيريا والفطريات ، وما إلى ذلك).
  3. تصميم شريحة ميكروصفيف
    1. شراء الشرائح المخصصة (علي سبيل المثال ، 4x180K ، AMADID #78366) من مورد تجاري (لمزيد من التفاصيل انظر جدول المواد). ترتيب كل تسلسل في سته نسخ متماثلة ، حيث يجب إرفاق كل نسخ متماثل إلى بقعه محدده عشوائيا علي الشريحة.

2. تجربه ربط الحمض النووي البدائي

ملاحظه: في اليوم السابق (أو علي الأقل 2 ح قبل) PBM ، واعداد حل الحجب [2 ٪ الحليب الخالي من الدسم في الفوسفات العازلة المالحة (تلفزيوني)] ويحرك علي الركاب المغناطيسي. قبل الاستخدام ، تصفيه الحل مع فلتر 0.45 μM. للكشف عن الربط البدائي لخيوط الحمض النووي ، يجب تنفيذ عده خطوات بالترتيب التالي.

  1. إجراءات الحجب
    1. قبل الرطب الشريحة ميكرواري في جره coplin مع 0.01 ٪ v/v تريتون X-100 في الاذاعه التلفزيونية (5 دقيقه في 125 دوره في الدقيقة علي الدوار المختبر).
    2. لفتره وجيزة غسل الشريحة طوقا (يشار اليها أيضا باسم coverslip) مع الماء والايثانول والجافة باستخدام الهواء المضغوط.
    3. تجميع الجزء السفلي من الصلب غرفه التهجين (غرفه PBM) مع الشريحة طوقا مواجهه (التسمية التجارية التي تواجه حتى). لمزيد من التفاصيل حول التجميع ، راجع جدول المواد.
    4. Pipet الحل الحجب (2 ٪ الحليب الخالي من الدسم w/v في الاذاعه التلفزيونية) في كل غرفه.
    5. أزاله شريحة ميكرواري من جره coplin ، ثم تجف الجانب غير الحمض النووي (يجب ان يكون الحمض النووي علي نفس الجانب كتسميه الشركة) وحواف باستخدام مسح غرامه. وضع ببطء ميكروصفيف علي الشريحة طوقا ، وتجنب فقاعات (تسميه الشركة التي تواجه أسفل). علي الفور تجميع وتشديد الصلب التهجين جهاز الغرفة. احتضان لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة (RT).
    6. ملء طبق واحد تلطيخ ("الصحن التلفزيوني") مع 800 مل من تلفزيوني الطازجة. ملء صحن تلطيخ الثانية ("غسل" طبق) مع 800 مل من الطازجة المعدة 0.5 ٪ v/v توين-20 في الاذاعه التلفزيونية.
    7. فك الغرفة PBM وأزاله ميكروصفيف الشريحة-coverslip "ساندويتش" ، مع الحرص علي عدم كسر الختم. تفكيكه تحت الماء في صحن غسل عن طريق وضع ملقط بين الشريحة والمشبك.
    8. يهز شريحة ميكروصفيف تحت الماء ونقل بسرعة إلى جره Coplin.
    9. يغسل مره واحده مع 0.1 ٪ v/v توين-20 في الاذاعه التلفزيونية (5 دقيقه في 125 دوره في الدقيقة علي الدوار المختبر).
    10. يغسل مره واحده مع 0.01 ٪ v/v تريتون X-100 في الاذاعه التلفزيونية (2 دقيقه في 125 دوره في الدقيقة علي الدوار المختبر).
    11. بسرعة نقل الشريحة إلى جره Coplin التي تحتوي علي الخدمات التلفزيونية.
  2. بروتين ملزم
    1. تجميع غرفه PBM كما سبق وصفها (الخطوات 2-1-2 – 2-1-3).
    2. خليط البروتين الماصة الملزمة التي تحتوي علي 5 μM T7 DNA البدائية ، 30 مم تريس-HCl pH 7.5 ، 6.5 mm mgcl2، 30 ملم ك-الغلوتامات ، 6 ملم ديثيوثريتول (dtt) ، 65 μM ريبونكليوسيد ثلاثي الفوسفات (rntp) ، 2 ٪ ث/v الحليب الخالي من الدسم ، 100 ng/μl البقري مصل الدم الزلال (جيش الصرب البوسني) ، 50 ng/μl سمك السلمون الخصيتين الحمض النووي ، و 0.02 ٪ v/v تريتون X-100 (TX-100) في كل غرفه من الشريحة طوقا (دون لمس الجانبين المطاط ودون إدخال فقاعات).
    3. شطف الشريحة ميكروصفيف لفتره وجيزة عن طريق غمس في صحن تلفزيوني ، الذي يزيل المنظفات الزائدة من سطح الشرائح. مسح الأسطح غير الحمض النووي من الشريحة مع مسح غرامه.
    4. خفض ببطء شريحة ميكرواري (التي تواجه أسفل) علي الشريحة طوقا ، ويجري الحذر لمنع تسرب من غرفه واحده إلى أخرى. تجميع وتشديد علي الفور جهاز غرفه PBM دون إدخال فقاعات. إذا فقاعات الشكل ، يمكن ازالتها عن طريق التنصت بلطف غرفه الصلب ضد سطح صلب.
    5. احتضان لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT).
  3. مرفق المضادات الفلورية
    1. فك الغرفة PBM وأزاله ميكروصفيف الشريحة-coverslip "ساندويتش" ، مع الحرص علي عدم كسر الختم. تفكيك تحت الماء في صحن غسل باستخدام ملقط. هز الشريحة تحت الماء ونقل بسرعة إلى جره Coplin التي تحتوي علي تلفزيوني.
    2. تجميع غرفه PBM مع الشريحة طوقا كما هو موضح سابقا (الخطوات 2-1-2-2-1-3).
    3. أضافه اليكسا 488-مترافق المضادة لجسمه (10 نانوغرام/μL في العازلة ملزمه) إلى الشريحة طوقا.
    4. شطف الشريحة لفتره وجيزة عن طريق غمس في صحن تلفزيوني كما كان من قبل ، ثم أزاله الشريحة من تلفزيوني ببطء ، ومسح سطح غير الحمض النووي ووضعه التي تواجه أسفل علي الشريحة طوقا.
    5. احتضان 30 دقيقه في RT في الظلام (المسبار مضان خفيفه الحساسية) للحد من الصور التبييض.
    6. تفكيك غرفه PBM و كوفيرسليب كما كان من قبل ، وأزاله كوفيرسليب تحت الماء في صحن غسل.
    7. شطف الشرائح لفتره وجيزة عن طريق غمس لهم في صحن تلفزيوني. جفف الشرائح بالهواء المضغوط. يخزن في الظلام في مربع شرائح حتى يصبح جاهزا للمسح الضوئي.
  4. مسح شريحة ميكروصفيف
    1. مسح رقاقه باستخدام الماسح الضوئي ميكرواري (الرجوع إلى جدول المواد) مع الاثاره من 495 نانومتر والانبعاثات من 519 nm وجمع كثافة الفلورية وسيط.

3. تحليل البيانات ميكروصفيف

ملاحظه: تم تنفيذ كافة معالجه البيانات باستخدام البرامج النصية المخصصة المكتوبة في MATLAB.

  1. تنفيذ معالجه البيانات الاوليه PBM باستخدام ويلكوكسون رتبه مجموع اختبار p-القيمة كما هو موضح سابقا4.
  2. استخدم القيمة الوسيطة لكثافة الربط لكل تسلسل DNA لمزيد من التحليل.
  3. وبعد ذلك ، وباستخدام قيم ANOVA باتجاه واحد ، قارن الدلالة الاحصائيه للاختلافات الملحوظة في كثافة الحمض النووي التي تم الحصول عليها لمجموعات مختلفه من مجسات الحمض النووي ، كما هو موضح أعلاه في القسم3من تصميم مكتبه الحمض النووي.

4. قالب الموجهة الحمض النووي الريبي التوليف يحفزها T7 DNA البدائية

  1. تحضير هلام بولياكريلاميد
    1. لاعداد 100 مل من خليط هلام ، الجمع بين 62.5 مل من 40 ٪ اكريلاميد-بيساكرياميد (19:1) ، 42 غرام من اليوريا ، 1.1 غرام من قاعده تريس (2-امينو-2-(هيدروكسي ميثيل)-1 ، 3-propanediol) ، 0.55 غرام من حمض البوريك ، و 0.4 mL من 0.5 M ايثيلنديدياتيتاياستيك حمض (أدتا) الحل.
    2. يقسم الخليط إلى 14 مل من الالكوبوتس (الكمية اللازمة لهلام واحد من 16.5 سم × 26 سم × 0.03 سم) ويحفظها محمية من الضوء عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى شهر واحد.
    3. لاعداد هلام بولياكريلاميد واحده ، أضافه 4 μl من temed و 40 μl من 10 ٪ ث/v فوق كبريتات الأمونيوم إلى 14 مل من الخليط المعد مسبقا ، يلقي عليه ، وترك الأمر لتتبلمر علي الأقل 2 ح في RT. ويمكن الحفاظ علي هلام لمده يوم واحد في 4 درجه مئوية.
  2. اعداد العينات
    ملاحظه: الحفاظ علي الكواشف ، وخليط التفاعل ، والعينات علي الجليد.
    1. لاعداد خليط التفاعل المطلوب لعشره ردود الفعل الجمع بين 11 μL من 5x النشاط العازلة (200 mM تريس-HCl ، pH = 7.5 ؛ 50 mM dithiothreitol ، 250 mM البوتاسيوم الغلوتامات ، 50 mM MgCl2) ، 5.5 μl من 2.5 mm مزيج من النيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (ntps) ، و 5.5 μl من ريبونكليوتيد الشعاعي [علي سبيل المثال ، ATP ، (α-32P) 3000 Ci/ملمول].
      ملاحظه: تم زيادة كافة المبالغ بنسبه 10% بسبب الأخطاء الممكنة لضبط الأنابيب. وينبغي ان تضعف الريبية الشعاعية الاشعاعيه وفقا لقوه الاشاره المشعة (عاده ما يكون التخفيف الاولي 1:10 أو أكثر).
    2. نقل 2 μL من خليط التفاعل إلى 10 أنابيب PCR.
    3. أضافه 1 μL من 100 μM قالب الحمض النووي إلى أنبوب PCR المقابلة وتدور أسفل.
    4. أضافه 2 μL من 16 μM T7 DNA البدائية ، وتدور ، وتخلط بلطف ، وتدور مره أخرى.
    5. احتضان رد الفعل في RT لمده 20 دقيقه.
    6. وقف رد الفعل عن طريق أضافه 5 μL من محلول التبريد (95 ٪ فوراميد ، 20 مم أدتا ، 0.05 ٪ ث/الخامس زيلين والأزرق بروموفينول) ، مزيج ، وتدور أسفل.
  3. الفصل بين منتجات الحمض الريبي النيبالي عن طريق الكهربائي من خلال النحت هلام بولياكريلاميد والكشف عن الإشارات اللاحقة
    1. قبل تشغيل هلام لمده 1 ساعة (10 مللي أمبير ، 600 V) في 1x العازلة TBE (90 mM تريس-borate ، 2 مم أدتا).
    2. تحميل ما يصل إلى 2 μL من كل عينه وأداء الكهربائي (20 مللي أمبير ، 1100 V) في 1x العازلة TBE (90 mM تريس-borate ، 2 مم أدتا).
    3. تجفيف هلام لمده 2 ح في 80 درجه مئوية تحت فراغ.
    4. فضح لوحه التصوير الفوسفور إلى هلام المشعة لبضع ساعات إلى الليل ، اعتمادا علي قوه الاشاره المشعة.
    5. تسجيل الاشاره (التلالؤ الضوئي) باستخدام الفوسفارفوتوير (انظر جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذا التقدم التكنولوجي لرسم خرائط المواقع ملزمه البدائية يسمح الحصول علي خصائص ربط الحمض النووي التي يصعب ، ان لم يكن من المستحيل ، لمراقبه استخدام الاداات الكلاسيكية. والاهم من ذلك ، تمكن HTPP من أعاده الفهم التقليدي لمواقع ربط البدائية. علي وجه التحديد ، HTPP يكشف عن خصوصيات ملزمه بالاضافه إلى المعروفة 5 '-GTC-3 ' تسلسل الاعتراف ، مما يؤدي إلى تغييرات في الانشطه الوظيفية لل T7 DNA البدائية. وتحديدا ، تم التعرف علي مجموعتين من المتواليات: تسلسل الحمض النووي القوي الملزم الذي يحتوي علي T/G في الاجنحه والمتواليات الضعيفة الملزمة التي تحتوي علي A/G في الاجنحه (تم استبدال جميع ألغام في القوالب القوية الربط باللحمية). لم يتم الكشف عن اي ربط بدائي لقوالب الحمض النووي التي كانت مفقوده 5 '-GTC-3 ' ضمن تسلسلها.

وقد زادت مواقع التعرف علي الدنا البدائية التي احتوت علي ميزات محدده ، مثل الاجنحه الغنية بالحمض النووي ، والتي تصل إلى 10 اضعاف ، وزادت من المستغرب أيضا طول الحمض النووي الريبي المشكل حديثا (حتى ثلاثه اضعاف) (الشكل 2 في المنشور السابق 3). الأهم من ذلك ، htpp سمح لنا لمراقبه وقياس التغير في طول التمهيدي فيما يتعلق بتسلسل قالب الحمض النووي.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتنميط البدائية عاليه الانتاجيه (HTPP). (ا) حضنت الشريحة مع البدائية في النشاط العازلة (40 mm تريس-HCl ، pH 7.5 ؛ 10 مم mgcl2، 50 mm ك-الغلوتامات ، 10 مم Dtt ، 100 μM rntps). المقبل, اليكسا 488-مترافق المضادة للجسم الفلورية الفلورسنت وقدم لتسميه البروتين. بعد خطوه غسل خفيفه ، تم مسح الشريحة باستخدام الماسح الضوئي ميكروصفيف. وتم تحديد التقارب الملزم وفقا للاشاره المتوسطة الفلورية وانقسمت متواليات الحمض النووي إلى مجموعات وفقا لذلك. (ب) أجريت اختبارات بيوكيميائية لربط نتائج ربط الحمض النووي التي تم الحصول عليها من تجربه ميكروصفيف ، مع خصائص وظيفية من T7 dna البدائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقارنه النشاط الحفاز لT7 الحمض النووي البدائي علي مجموعتين من قوالب الحمض النووي (ملزمه قويه مع T/g في الاجنحه والتجليد الضعيف مع A/g في الاجنحه) التي تم الحصول عليها من PBM. (ا) تشكيل الحمض النووي الريبي الذي يحفزه T7 DNA البدائي. وتضمنت ردود الفعل قله عدد الكريات البدائية مع تسلسل الاعتراف بريتاز (الممرات مرقمه) ، 32P-α-ATP ، ATP ، CTP ، UTP ، و gtp في خليط التفاعل القياسي. مجموعه واحده من الحمض النووي قله كريات الدنيا (الأزرق الداكن) الواردة T/G في الاجنحه ، في حين تم استبدال جميع ألغام مع اللحمية في المجموعة الثانية (الضوء الأزرق). بعد الحضانة ، تم فصل منتجات RNA المشعة بواسطة الكهربائي من خلال هلام بولياكرياميد 25 ٪ التي تحتوي علي اليوريا 7M وتصور من قبل اوتوديغرافي. (ب) الطول النسبي (عدد المركبات الريبية النووية التي تشكل كل منها غير معروف) وكميه الإشعال rna التي تم توليفها بواسطة T7 dna البدائية علي مجموعتين من قوالب الحمض النووي (اللوحة A). تظهر المؤامرات ان يتم توليفها الإشعال RNA أطول (زيادة processivity) علي قوالب الحمض النووي ان البدائية يربط مع تقارب اعلي (التي تحتوي علي T/G في الاجنحه) بالمقارنة مع القوالب التي ترتبط مع تقارب اقل (التي تحتوي علي A/G في الاجنحه). (ج) القياس الكمي لكميه الإشعال المركب RNA علي مجموعتين من قوالب الحمض النووي. وتبين النتائج وجود ارتباط بين التقارب الذي يربط بين الحمض النووي ومقدار الحمض النووي الريبي المركب بواسطة T7 DNA البدائي. [أو] (وحده اعتباطية) المقياس الشدة من اشاره إشعاعيه اي يرتبط مباشره مع الكمية من يصنع [رنا] إشعال. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدمت طريقه PBM علي نطاق واسع للتحقيق في خصائص ملزمه لعوامل النسخ ويمكن أيضا ان تطبق علي انزيمات معالجه الحمض النووي ، مثل الحمض النووي البدائي ، التي ترتبط الحمض النووي مع تقارب منخفضه. غير انه يلزم إدخال بعض التعديلات علي الإجراءات التجريبية. وتشمل تجربه ميكروصفيف عده خطوات: تصميم مكتبه الحمض النووي ، واعداد رقاقه ، وربط الهدف البروتين ، ووضع العلامات الفلورسنت ، والمسح الضوئي. خطوات الغسيل الخفيفة حرجه ، لان الغسيل الطويل مع المحاليل التي تحتوي علي المنظفات يسبب تفكك البروتين من قالب الحمض النووي بسبب ضعف/عابره وضع الربط. وتشمل الخطوات الهامه الأخرى الشروط الملزمة (مثل تكوين العازلة ، والعوامل المختلطة) وأوقات الحضانة التي تحتاج إلى ان تكون الأمثل لكل انزيم محدد.

النتائج التي تم الحصول عليها من ميكروصفيف تحتاج إلى التحقق من صحتها في الاختبارات البيوكيميائية. كما توفر اختبارات الكيمياء الحيوية نظره ثاقبه علي الميزات المثيرة للاهتمام لانزيمات معالجه الحمض النووي مثل الارتباط بين تقارب الحمض النووي الملزم والنشاط الانزيمي/التنظير. HTPP مكننا من مراقبه تاثير الحمض النووي ملزمه علي الخصائص الوظيفية لل T7 الحمض النووي البدائي. فعلي سبيل المثال ، لوحظ انه إذا كانت البدائية تظهر تقاربا ملزما اعلي لقالب الحمض النووي ، فانها تحفز تشكيل الإشعال RNA الأطول (زيادة التماثل).

بشكل عام ، الطريقة المعروضة في هذه المقالة سريعة وموثوق بها ، وتوفر الفرصة لاختبار خصائص الربط في وقت واحد علي عشرات آلاف من متواليات الحمض النووي المختلفة في تجربه واحده بطريقه تستند إلى فرضيه. أضافه البروتينات الأخرى أو العوامل المعدنية المساعد لخليط التفاعل يوفر امكانيه التحقيق تاثيرها علي خصائص ربط الحمض النووي من البدائية بطريقه سريعة وعاليه الانتاجيه. ومن ناحية أخرى ، فان تطبيق هذه الطريقة محدود بالسعر المرتفع نسبيا للشرائح الميكروصفيف واحتياطات السلامة المطلوبة عند مناوله المواد المشعة لاختبارات النشاط البدائي.

من المهم ان نلاحظ ان البدائيات المختلفة تتطلب تعديل كل من شروط الربط ميكرواري والظروف العازلة لاختبارات النشاط. علي سبيل المثال ، البدائية من المتفطره السل يتطلب استبدال المغنيسيوم مع المنغنيز ثنائي التكافؤ في العازلة رد فعل. قد تؤدي العوامل المعدنية غير الملائمة أو المخازن المؤقتة للتفاعل غير الملائم إلى نشاط بدائي ضعيف أو تقارب ربط الحمض النووي.

كما ذكر سابقا ، البدائية ربط قوالب الحمض النووي مع تقارب ضعيفه. ولذلك ، مطلوب خطوات غسل لطيف اثناء اختبار ربط ميكروصفيف. خلاف ذلك ، سيتم غسلها من الشريحة ميكرواري ، مما يؤدي إلى فقدان اشاره فلورسنت عند أضافه الأجسام المضادة المسمية فلوريسسينتلي.

وتلخيصا لذلك ، لا تزال خصائص ربط الحمض النووي للعديد من البدائيات الاحاديه النواة (بما في ذلك تسلسل التعرف علي الحمض النووي الثلاثي النوى) غير مفهومه بشكل سيئ ، ويرجع ذلك في معظمه إلى القيود التقنية للأساليب المتاحة حاليا. HTPP يمثل منصة سريعة وفعاله لاكتشاف مواقع التعرف علي الحمض النووي أو التحقيقات من العوامل الأخرى ذات الصلة بالقالب (اي تكوين النيوكليوتيد الشامل ، GC المحتوي ، وجود عناصر تسلسل الحمض النووي المتكررة وتماثلها) التي تؤثر علي التقارب الملزم ونشاط انزيمات ssDNA الملزمة. الاضافه إلى ذلك ، قد توجه التطبيقات في المستقبل نحو اثار البروتينات المختلفة أو العوامل المختلطة علي تقارب الحمض النووي الربط ، وأنماط الاعتراف ، أو النشاط الوظيفي من البدائية وغيرها من الانزيمات معالجه الحمض النووي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد حظي هذا البحث بدعم مؤسسه العلوم الاسرائيليه (المنحة رقم 1023/18).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution Merck 1006401000
95% formamide Sigma-Aldrich F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody Qiagen 35310
Ammonuium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol Perkin Elmer NEG003H250UC
Boric acid, granular Glentham Life Sciences GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 10735094001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-25G
DNA microarray Agilent 4x180K (AMADID #78366)
https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Acros Organics AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack Thermo Scientific 12869995 If several slides are used
Lab rotator Thermo Scientific 88880025
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63064-500G
Microarray Hybridization Chamber Agilent G2534A https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A) Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Potassium glutamate Alfa Aesar A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) New England BioLabs N0466S
Salmon testes DNA Sigma-Aldrich D1626-1G
Skim milk powder Sigma-Aldrich 70166-500G
Staining dish Thermo Scientific 12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma-Aldrich 93362-500G
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
Urea Sigma-Aldrich U6504-1KG
Xylene cyanol Alfa Aesar B21530

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
  2. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4, (3), 393-411 (2009).
  3. Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
  4. Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111, (48), 17140-17145 (2014).
  5. Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274, (50), 35889-35898 (1999).
  6. Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78, (1), 205-209 (1981).
  7. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9, (23), 6505-6525 (1981).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, (9), 3157-3170 (1978).
  9. Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19, (10), 2788 (1991).
  10. Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8, (1), 1-20 (1980).
  11. Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9, (7), 2944-2949 (1989).
  12. Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics