Reconhecimento da seqüência do ADN pelo primase do ADN usando o perfilamento da primase da elevado-produção

Biochemistry

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Summary

Experimentos de Microarray de ligação proteica (PBM) combinados com ensaios bioquímicos ligam as propriedades vinculativas e catalíticas da primase do DNA, uma enzima que sintetiza os primers de RNA no DNA do modelo. Este método, designado como o perfilamento do primase da elevado-taxa de transferência (HTPP), pode ser usado para revelar testes padrões DNA-Binding de uma variedade de enzimas.

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Ilic, S., Cohen, S., Afek, A., Gordan, R., Lukatsky, D. B., Akabayov, B. DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling. J. Vis. Exp. (152), e59737, doi:10.3791/59737 (2019).

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Abstract

O primase do ADN sintetiza os primers curtos do RNA que iniciam a síntese do ADN de fragmentos de Okazaki na costa retardamento pela polimerase do ADN durante a replicação do ADN. A ligação de procarióticas dnaG-como primases ao ADN ocorre em uma seqüência específica do reconhecimento do trinucleotide. É um passo crucial na formação de fragmentos de Okazaki. As ferramentas bioquímicas convencionais que são usadas para determinar a seqüência do reconhecimento do ADN do primase do ADN fornecem somente a informação limitada. Usando um ensaio de ligação baseado em microarray de alta taxa de transferência e análises bioquímicas consecutivas, foi demonstrado que 1) o contexto de ligação específico (seqüências de flanqueamento do local de reconhecimento) influencia a força de ligação da primase do DNA ao seu modelo DNA, e 2) o emperramento mais forte do primase ao ADN rende uns primers mais longos do RNA, indicando o processivity mais elevado da enzima. Este método combina o ensaio da atividade de PBM e de primase e é designado como o perfilamento do primase da elevado-produção (HTPP), e permite a caracterização do reconhecimento de seqüência específico pelo primase do ADN no tempo e na escalabilidade sem precedentes.

Introduction

O HTPP faz uso da tecnologia de Microarray de ligação ao DNA combinada com a análise bioquímica (Figura 1) para identificar estatisticamente as características específicas dos modelos de DNA que afetam a atividade enzimática da PRIMASE do DNA. Portanto, a HTPP fornece uma plataforma tecnológica que facilita um salto de conhecimento no campo. As ferramentas clássicas usadas para determinar os locais do reconhecimento do primase não têm a habilidade de render a quantidade maciça de dados, visto que HTPP faz.

A PBM é uma técnica rotineiramente utilizada para determinar as preferências vinculativas dos fatores de transcrição ao DNA1,2; Entretanto, não é apropriado para a deteção da ligação fraca/transiente das proteínas ao ADN. Ao contrário do universal PBM que fornece informações sobre a especificidade de ligação de proteínas média para todas as seqüências possíveis consistindo de oito pares de base, HTPP é baseado na biblioteca de modelos de DNA single-encalhado compreendendo elementos de seqüência única. Tais elementos de sequência de DNA envolvem dezenas de milhares de sequências genómicas curtas (poucas dezenas de BP), bem como sequências de DNA computacionalmente projetadas enriquecidas em determinados elementos de seqüência repetitiva de DNA presentes no genoma, que possuem diferentes conteúdos médios de GC . Essa abordagem de alta taxa de transferência permite a determinação de, de forma sistemática, quantitativa e orientada por hipóteses, as propriedades relacionadas à seqüência que são importantes para a vinculação de primase e sua atividade enzimática3. Em particular, a ligação importante entre as preferências de encadernação do primase-DNA, (modulada por sequências de DNA flanqueando sítios de ligação de Tri-nucleotídeo específicos) e a processividade de primase foi identificada para este sistema enzimático4.

A nova tecnologia foi aplicada para rever a nossa compreensão de sítios de reconhecimento de primase, mesmo para a primase de DNA T7 que tem sido extensivamente estudada5. Especificamente, o reexame de conceitos clássicos, tais como sítios de reconhecimento de DNA da primase de DNA T7 (que foram determinados há quase quatro décadas atrás 6) usando microarray de ligação de DNA de proteína (PBM) levou a uma visão sem precedentes sobre as características relacionadas com a seqüência de flanquear esses sites de reconhecimento3. Esperava-se que as sequências flanqueando o local de reconhecimento Tri-nucleotídeo de T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') será aleatório. Em vez disso, descobrimos que sequências de flanqueamento ricas em TG aumentam as chances de a primase do DNA T7 sintetizar primers de RNA mais longos, indicando um aumento na processividade.

Outros métodos que podem ser usados para estudar Propriedades de ligação de DNA de proteínas in vitro incluem o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA)7, DNase I footprinting8, ressonância de superfície-Plasmon (SPR)9, e blotting do sudoeste 10. These são, entretanto, métodos Low-Throughput somente aplicáveis a investigar um número pequeno de seqüências do ADN. Além disso, a precisão e a sensibilidade de algumas dessas técnicas (por exemplo, EMSA) é baixa. Por outro lado, a seleção in vitro11 é uma técnica que, da mesma forma que a PBM, pode ser utilizada para a identificação de numerosas sequências vinculativas. No entanto, as sequências de baixa afinidade geralmente são excluídas na maioria das aplicações de seleção in vitro; Portanto, essa abordagem não é adequada para a obtenção de dados de vinculação comparativa para todas as seqüências disponíveis. O PBM universal1,2é usado principalmente para caracterizar as especificidades vinculativas dos fatores de transcrição de procariontes e eucariontes, bem como fatores específicos (por exemplo, presença de certos ligantes, cofatores, etc.) que podem afetam essa interação12.

HTPP expande a aplicação de PBM às enzimas de processamento do ADN combinando o poder estatístico sem precedentes da elevado-produção com a elevada precisão para fornecer a informação no contexto obrigatório da seqüência. Tais dados ainda não foram obtidos para primases e enzimas relacionadas (que têm ligação fraca/transitória ao DNA) devido a limitações técnicas acima mencionadas de outras técnicas disponíveis.

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Protocol

1. projeto do microarray

Nota: as sondas de DNA representam sequências 36-nucleotídicas personalizadas, consistindo no local de reconhecimento para a primase de DNA T7 (GTC) localizada entre duas regiões de flanqueamento variáveis, seguidas por uma sequência de 24 nucleotídeo constante presa a uma lâmina de vidro3. Utilizou-se um formato de Microarray de 4 x 180.000, que permitiu detectar cada sequência de DNA em seis repetições, distribuídas aleatoriamente no slide.

  1. Projeto da biblioteca do ADN para primases com seqüências conhecidas do Recognition
    1. Certifique-se de que cada sequência é composta por 60 nucleotídeos. Mantenha os primeiros 24 nucleotídeos constantes (para ser anexado à corrediça de vidro). As regiões variáveis devem ter a seguinte forma geral: (N)16GTC (n)17; onde N representa qualquer nucleotídeo desejado.
    2. Projete a região flanqueando para abordar uma pergunta científica específica (um exemplo do projeto é apresentado no seguinte texto). As regiões flanqueando podem ser projetadas conter características específicas tais como os elementos da repetição ou a simetria específica.
      Nota: criamos oito categorias de diferentes sequências de flanqueamento compostas por dois ou três nucleotídeos específicos: T e G (grupo 1); T e C (grupo 2); C e A (grupo 3); A e G (grupo 4); G, C e T (grupo 5); C, T e A (Grupo 6); G, A e T (Grupo 7); G, A e C (Grupo 8). 2.000 sequências diferentes foram projetadas para cada grupo. Cada grupo possuía subgrupos de sequências com diferentes tipos e diferentes números de repetições de sequência.
    3. Inclua um conjunto de seqüências de controle negativo (faltando o site de vinculação específica)4. A presença de tais sequências permite validar a ocorrência de vinculação específica no experimento.
  2. Projeto da biblioteca do ADN para primases com seqüências desconhecidas do recognition
    1. Se a sequência de reconhecimento for desconhecida, crie a biblioteca de DNA selecionando as sequências (com ou sem características específicas mencionadas anteriormente) do genoma do organismo desejado (bactérias, fungos, etc.).
  3. Projeto da corrediça do microarray
    1. Compre slides personalizados (por exemplo, 4x180K, AMADID #78366) de um fornecedor comercial (para obter mais detalhes, consulte a tabela de materiais). Ordene cada sequência em seis repetições, onde cada repetição deve ser anexada a um ponto selecionado aleatoriamente no slide.

2. experimento de ligação de DNA primase

Nota: no dia anterior (ou pelo menos 2 h antes) o PBM, prepare a solução de bloqueio [2% w/v leite desnatado em tampão fosfato salina (PBS)] e mexa-o em um agitador magnético. Antes de usar, filtre a solução com um filtro de 0,45 μM. Para detectar a ligação do primase às vertentes do ADN, diversas etapas devem ser executadas na seguinte ordem.

  1. Procedimento de bloqueio
    1. Pre-molhe a corrediça do microarray em um frasco de Coplin com 0, 1% v/v Triton X-100 em PBS (5 minutos em 125 RPM em um rotator do laboratório).
    2. Lave brevemente a corrediça da junta (também referida como lamínula) com água e etanol e seque utilizando ar comprimido.
    3. Monte a parte inferior da câmara da hibridação de aço (câmara de PBM) com a corrediça da gaxeta que enfrenta acima (etiqueta comercial que enfrenta acima). Para obter mais detalhes sobre a montagem, consulte a tabela de materiais.
    4. Pipet solução de bloqueio (2% w/v leite desnatado em PBS) em cada câmara.
    5. Remova a corrediça do microarray do frasco de Coplin, a seguir seque o lado do não-ADN (o ADN deve estar no mesmo lado que a etiqueta da companhia) e bordas usando uma limpeza fina. Coloc lentamente o microarray na corrediça da gaxeta, evitando bolhas (etiqueta da companhia que enfrenta para baixo). Imediatamente montar e apertar o aparelho de câmara de hibridização de aço. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente (RT).
    6. Encha um prato de coloração (o prato "PBS") com 800 mL de PBS fresco. Encha um segundo prato de coloração (o prato "WASH") com 800 mL de recém-preparados 0,5% v/v Tween-20 em PBS.
    7. Desaparafuse a câmara de PBM e retire o "sanduíche" do microarray slide-COVERSLIP, tomando o cuidado para não quebrar o selo. Desmonte-o debaixo d' água no prato WASH colocando fórceps entre a corrediça e a lamínula.
    8. Agite a corrediça do microarray subaquática e transfira rapidamente a um frasco de Coplin.
    9. Lave uma vez com 0,1% v/v Tween-20 em PBS (5 min a 125 RPM em um rotador de laboratório).
    10. Lave uma vez com 0, 1% v/v Triton X-100 em PBS (2 min a 125 RPM em um rotador de laboratório).
    11. Transfira rapidamente o slide para um frasco de Coplin contendo PBS.
  2. Ligação de proteínas
    1. Monte a câmara de PBM como descrito previamente (etapas 2.1.2 – 2.1.3).
    2. Mistura de ligação à proteína de pipeta contendo 5 μm T7 de DNA primase, 30 mm Tris-HCl pH 7,5, 6,5 mm MgCl2, 30 mm K-glutamato, 6 mm ditiotreitol (DTT), 65 μm de ribonucleosídeo trifosfato (rntp), 2% p/v leite desnatado, 100 ng/μL de albumina sérica bovina (BSA), 50 ng/μl DNA de testes de salmão, e 0, 2% v/v Triton X-100 (TX-100) em cada câmara da corrediça da junta (sem tocar nos lados de borracha e sem introduzir bolhas).
    3. Enxague brevemente a lâmina do microarray mergulhando-a no prato PBS, que remove o excesso de detergente da superfície das lâminas. Limpe as superfícies não-DNA do slide com uma limpeza fina.
    4. Abaixe lentamente a corrediça do microarray (virada para baixo) na corrediça da gaxeta, sendo cuidadoso impedir o escapamento de uma câmara a outra. Imediatamente montar e apertar o aparelho de câmara PBM sem introduzir bolhas. Se as bolhas se formam, elas podem ser removidas tocando suavemente a câmara de aço contra uma superfície dura.
    5. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente (RT).
  3. Acessório para anticorpos fluorescentes
    1. Desaparafuse a câmara de PBM e retire o "sanduíche" do microarray slide-COVERSLIP, tomando o cuidado para não quebrar o selo. Desmontar debaixo d' água no prato WASH usando fórceps. Agite a corrediça subaquática e transfira rapidamente a um frasco de Coplin que contem PBS.
    2. Monte a câmara de PBM com a corrediça da gaxeta como descrita previamente (etapas 2.1.2 – 2.1.3).
    3. Adicionar Alexa 488-conjugado anti-seu anticorpo (10 ng/μL em tampão de ligação) para o slide da junta.
    4. Enxágüe a corrediça momentaneamente mergulhando a no prato de PBS como antes, a seguir remova a corrediça de PBS lentamente, limpe a superfície do não-ADN e coloc a que enfrenta para baixo na corrediça da gaxeta.
    5. Incubar 30 min na RT no escuro (a sonda de fluorescência é sensível à luz) para reduzir o branqueamento de fotografias.
    6. Desmontar a câmara de PBM e a lamínula como antes, removendo a lamínula subaquática no prato WASH.
    7. Enxague os slides brevemente, mergulhando-os no prato PBS. Seque as lâminas com ar comprimido. Armazene no escuro em uma caixa de slide até que esteja pronto para digitalizar.
  4. Digitalizando o slide do microarray
    1. Escaneie a microplaqueta usando o varredor do microarray (refira a tabela dos materiais) com excitação de 495 nanômetro e emissão de 519 nanômetro e colete a intensidade mediana da fluorescência.

3. análise de dados de Microarray

Nota: todo o processamento de dados foi realizado usando scripts escritos personalizados no MATLAB.

  1. Execute o processamento de dados PBM inicial usando o valor de p do teste da soma do Rank de Wilcoxon como descrito previamente4.
  2. Use o valor mediano da intensidade de ligação para cada sequência de DNA para análise posterior.
  3. Em seguida, utilizando os valores de p ANOVA unidirecional, comparar significância estatística das diferenças observadas nas intensidades de ligação do primase-DNA obtidas para diferentes grupos de sondas de DNA, como explicado acima na seção de design da biblioteca de DNA3.

4. síntese de RNA dirigida por modelo catalisada por T7 DNA primase

  1. Preparação do gel de poliacrilamida desnaturante
    1. Para preparar 100 mL de mistura de gel, combine 62,5 mL de 40% acrilamida-bisacrilamida (19:1), 42 g de ureia, 1,1 g de base de tris (2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol), 0,55 g de ácido bórico, e 0,4 mL de 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) solução.
    2. Divida a mistura em alíquotas de 14 mL (a quantidade necessária para um gel de 16,5 cm x 26 cm x 0, 3 cm) e mantenha-as protegidas da luz a 4 ° c por até 1 mês.
    3. Para preparar um gel de poliacrilamida desnaturante, acrescente 4 μL de TEMED e 40 μL de persulfato de amónio a 10% a 14 mL da mistura previamente preparada, conjurá-lo e deixá-lo polimerizar durante pelo menos 2 h na RT. O gel pode ser mantido por um dia a 4 ° c.
  2. Preparação da amostra
    Nota: manter os reagentes, a mistura de reacção e as amostras no gelo.
    1. Para preparar a mistura de reação necessária para dez reações combinar 11 μL de 5x buffer de atividade (200 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 50 mM dithiothreitol, 250 mM glutamato de potássio, 50 mM MgCl2), 5,5 μl de 2,5 mm mistura de nucleotídeo tri-fosfato (ntps), e 5,5 μL de ribonucleotídeo radiolabeled [por exemplo, ATP, (α-32P) 3000 CI/mmol].
      Nota: todos os montantes foram aumentados em 10% devido a possíveis erros de pipetagem. Os ribonucleotídeos radiolabeled devem ser diluídos de acordo com a força do sinal radioativo (a diluição inicial é geralmente 1:10 ou mais).
    2. Transfira 2 μL da mistura de reacção para dez tubos de PCR.
    3. Adicionar 1 μL de modelo de ADN de 100 μM ao tubo de PCR correspondente e girar para baixo.
    4. Adicionar 2 μL de 16 μM T7 de DNA primase, girar para baixo, misturar suavemente, e girar para baixo novamente.
    5. Incubar a reacção em RT durante 20 min.
    6. Pare a reacção adicionando 5 μL de solução de têmpera (95% de formamida, 20 mM de EDTA, 0, 5% p/v de xileno cianol e bromofenol azul), misture e gire para baixo.
  3. Separação de produtos do RNA pela electroforese através do gel desnaturando do poliacrilamida e da deteção subseqüente do sinal
    1. Pré-executar o gel para 1 h (10 mA, 600 V) em 1x tampão TBE (90 mM TRIS-borato, 2 mM EDTA).
    2. Carregar até 2 μL de cada amostra e realizar eletroforese (20 mA, 1100 V) em tampão TBE 1x (90 mM TRIS-borato, 2 mM EDTA).
    3. Seque o gel para 2 h a 80 ° c um vácuo.
    4. Expor a placa da imagem latente do fósforo ao gel radioativo por algumas horas à noite, dependendo da força do sinal radioativo.
    5. Registre o sinal (luminescência fotoestimulada) usando o phosphorimager (veja a tabela de materiais).

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Representative Results

Este avanço tecnológico para mapear os sítios de encadernação primase permite a obtenção de propriedades de ligação de DNA que são difíceis, se não impossíveis, de observar usando ferramentas clássicas. Mais importante, HTPP permite a revisitação da compreensão tradicional de sítios de encadernação primase. Especificamente, o HTPP revela especificidades vinculativas, além das conhecidas sequências de reconhecimento 5 '-GTC-3 ', o que leva a alterações nas atividades funcionais da primase do DNA T7. A saber, dois grupos de sequências foram identificados: seqüências de DNA de ligação forte que continham T/G nos flancos e seqüências de ligação fraca que continham a/G nos flancos (todas as timminas nos moldes de ligação forte foram substituídas por adeninas). Nenhuma ligação de primase a modelos de DNA que estavam faltando 5 '-GTC-3 ' dentro de sua seqüência foi detectada.

Os locais do reconhecimento do ADN do primase que continham características específicas, tais como flancos T/G-ricos, o primase-ADN aumentado que ligam até 10 vezes, e surprisingly igualmente aumentaram o comprimento do RNA recentemente dado forma (até threefold) (Figura 2 na publicação precedente 3). importante, htpp permitiu-nos observar e quantificar a variabilidade no comprimento da primeira demão em relação à seqüência do molde do ADN.

Figure 1
Figura 1: representação esquemática do perfilamento de primase de alta produtividade (HTPP). (A) alâmina foi incubada com a primase em tampão de atividade (40 mm Tris-HCl, pH 7,5; 10 mm MgCl2, 50 mm K-glutamato, 10 mm DTT, 100 μm rntps). Em seguida, Alexa 488 conjugated anti-seu anticorpo fluorescente foi introduzido para rotular a proteína. Após a etapa de lavagem suave, o slide foi digitalizado usando o scanner de Microarray. A afinidade de ligação foi determinada de acordo com o sinal da fluorescência mediana e as seqüências do ADN foram divididas em grupos conformemente. (B) foram realizados ensaios bioquímicos para correlacionar os resultados de ligação ao DNA obtidos do experimento de Microarray, com as propriedades funcionais da PRIMASE do DNA T7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: comparação da atividade catalítica da primase do DNA T7 em dois grupos de modelos de DNA (ligação forte com T/g nos flancos e ligação fraca com a/g nos flancos) obtidos da PBM. (A) formação de primer de RNA catalisada pela PRIMASE do DNA T7. As reações continham oligonucleotídeos com a seqüência de reconhecimento da primase (faixas numeradas), 32P-α-ATP, ATP, CTP, UTP e GTP na mistura de reação padrão. Um grupo de oligonucleotídeos do ADN (azul escuro) conteve T/G nos flancos, visto que todas as thymines foram substituídas com os adeninas no segundo grupo (azul claro). Após a incubação, os produtos de RNA radioativo foram separados por eletroforese através de um gel de poliacrilamida 25% contendo 7M de ureia e visualizado por autoradiografia. (B) comprimento relativo (número de ribonucleotídeos que constituem cada primer de RNA é desconhecido) e quantidade de PRIMERS de RNA sintetizados por T7 DNA primase em dois grupos de modelos de DNA (painel A). As parcelas mostram que os primers de RNA mais longos são sintetizados (aumento da processividade) em modelos de DNA que primase vincula com maior afinidade (que contêm T/G nos flancos) em comparação com os modelos que estão vinculados com menor afinidade (que contêm a/G nos flancos). (C) quantificação da quantidade de PRIMERS de RNA sintetizados em dois grupos de modelos de DNA. Os resultados demonstram uma correlação entre a afinidade DNA-Binding e a quantidade de RNA sintetizado pela primase do ADN T7. UA (unidade arbitrária) é a medida da intensidade do sinal radioativo que se correlaciona diretamente com as quantidades de primers sintetizados do RNA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O método de PBM tem sido amplamente utilizado para investigar as propriedades vinculativas dos fatores de transcrição e também pode ser aplicado a enzimas de processamento de DNA, como a primase do DNA, que se ligam ao DNA com baixa afinidade. No entanto, certas modificações dos procedimentos experimentais são necessárias. A experimentação do microarray envolve diversas etapas: projeto da biblioteca do ADN, preparação da microplaqueta, emperramento do alvo da proteína, rotulagem fluorescente, e exploração. As etapas de lavagem suaves são críticas, desde que as lavagens longas com soluções que contêm detergentes causam a dissociação da proteína do molde do ADN devido ao modo fraco/transiente de emperramento. Outras etapas críticas incluem condições vinculativas (por exemplo, composição de buffer, cofatores) e tempos de incubação que precisam ser otimizados para cada enzima específica.

Os resultados obtidos de Microarray precisam ser validados em ensaios bioquímicos. Os ensaios bioquímicos também fornecem insights sobre características interessantes de enzimas de processamento de DNA, como a correlação entre afinidade de ligação de DNA e atividade enzimática/processividade. HTPP permitiu-nos observar o efeito da ligação do ADN em propriedades funcionais da primase do ADN T7. Por exemplo, observou-se que se a primase apresenta maior afinidade de ligação para o modelo de DNA, ele catalisa a formação de primers de RNA mais longos (aumento da processividade).

No geral, o método apresentado neste artigo é rápido, confiável e oferece a oportunidade de testar simultaneamente Propriedades de ligação em dezenas de milhares de sequências de DNA diversas em um único experimento de maneira orientada por hipóteses. A adição de outras proteínas ou cofactores metálicos à mistura de reacção oferece a possibilidade de investigar o seu efeito sobre as propriedades de ligação de ADN de primases de forma rápida e de alta taxa de transferência. Por outro lado, a aplicação deste método é limitada pelo preço relativamente alto de lâminas de Microarray e as precauções de segurança necessárias ao manusear material radioativo para ensaios de atividade de primase.

É importante notar que diferentes primases exigem modificações de ambas as condições de ligação de Microarray e condições de buffer para ensaios de atividade. Por exemplo, a primase do Mycobacterium tuberculosis requer a substituição do magnésio pelo manganês divalente no tampão de reação. Cofactores metálicos inadequados ou buffers de reacção inadequados podem levar a uma atividade de primase fraca ou a uma afinidade de ligação ao ADN diminuída.

Como mencionado previamente, os primases ligam aos moldes do ADN com afinidade fraca; Conseqüentemente, as etapas de lavagem delicadas são exigidas durante a experimentação obrigatória do Microarray. Se não, serão lavados para fora da corrediça do microarray, conduzindo à perda do sinal florescente em cima da adição de anticorpo cDNAs etiquetado.

Para resumir, as propriedades de ligação do ADN de muitos primases procarióticas (que incluem a seqüência do reconhecimento do ADN do trinucleotide) são compreendidas ainda mal, na maior parte devido às limitações técnicas de métodos atualmente disponíveis. HTPP representa uma plataforma rápida e eficiente para a descoberta dos locais de reconhecimento de DNA ou investigações de outros fatores relacionados ao modelo (i.e., composição global de nucleotídeo, conteúdo de GC, presença de elementos repetitivos de seqüência de DNA e sua simetria) que afetam a afinidade de ligação e a atividade de enzimas de ligação de ssDNA. Além disso, as aplicações futuras podem ser direcionadas para os efeitos de diferentes proteínas ou cofatores na afinidade de ligação de DNA, padrões de reconhecimento, ou atividade funcional de primases e outras enzimas de processamento de DNA.

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Disclosures

Os autores não declaram conflito de interesses.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pela ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (subvenção n º 1023/18).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution Merck 1006401000
95% formamide Sigma-Aldrich F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody Qiagen 35310
Ammonuium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol Perkin Elmer NEG003H250UC
Boric acid, granular Glentham Life Sciences GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 10735094001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-25G
DNA microarray Agilent 4x180K (AMADID #78366)
https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Acros Organics AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack Thermo Scientific 12869995 If several slides are used
Lab rotator Thermo Scientific 88880025
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63064-500G
Microarray Hybridization Chamber Agilent G2534A https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A) Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Potassium glutamate Alfa Aesar A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) New England BioLabs N0466S
Salmon testes DNA Sigma-Aldrich D1626-1G
Skim milk powder Sigma-Aldrich 70166-500G
Staining dish Thermo Scientific 12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma-Aldrich 93362-500G
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
Urea Sigma-Aldrich U6504-1KG
Xylene cyanol Alfa Aesar B21530

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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