फ्लोरेसेंस मैक्रोस्कोपी का उपयोग कर बरकरार माउस खोपड़ी के माध्यम से Cerebrospinal द्रव परिवहन के विवो इमेजिंग में

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Neuroscience

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Summary

Transcranial ऑप्टिकल इमेजिंग एक बरकरार खोपड़ी के माध्यम से जीना चूहों के प्रांतस्था में मस्तिष्कमेरु द्रव परिवहन के व्यापक क्षेत्र इमेजिंग की अनुमति देता है.

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Sweeney, A. M., Plá, V., Du, T., Liu, G., Sun, Q., Peng, S., Plog, B. A., Kress, B. T., Wang, X., Mestre, H., Nedergaard, M. In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59774, doi:10.3791/59774 (2019).

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Abstract

कृन्तकों में सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (सीएसएफ) प्रवाह का काफी हद तक ट्रेसर्स के पूर्व विवो परिमाणीकरण का उपयोग करके अध्ययन किया गया है। दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) जैसी तकनीकों ने सीएसएफ प्रवाह के विवो परिमाणीकरण में सक्षम किया है, लेकिन वे क्रमशः कम इमेजिंग वॉल्यूम और कम स्थानिक संकल्प द्वारा सीमित हैं। हाल के काम में पाया गया है कि सीएसएफ pial और कृंतक प्रांतस्था की धमनियों मर्मज्ञ आसपास perivascular रिक्त स्थान के एक नेटवर्क के माध्यम से मस्तिष्क parenchyma में प्रवेश करती है. सीएसएफ का यह परिसंवहनी प्रवेश ग्लिम्फेटिक प्रणाली का एक प्राथमिक चालक है, जो विषाक्त चयापचय विलेय की निकासी में फंसा हुआ मार्ग है (जैसे, एमिलॉयड-जेड)। यहाँ, हम एक नया स्थूल इमेजिंग तकनीक है कि वास्तविक समय की अनुमति देता है वर्णन, जीवित चूहों की बरकरार खोपड़ी के माध्यम से फ्लोरोसेंट सीएसएफ अनुरेखक के mesoscopic इमेजिंग. यह न्यूनतम इनवेसिव विधि प्रयोगात्मक डिजाइन की एक भीड़ की सुविधा और सीएसएफ गतिशीलता के एकल या दोहराया परीक्षण सक्षम बनाता है. Macroscopes उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प है और उनके बड़े गैन्ट्री और काम दूरी इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं, जबकि व्यवहार उपकरणों पर कार्य प्रदर्शन. इस इमेजिंग दृष्टिकोण दो फोटोन इमेजिंग और फ्लोरोसेंट माप इस तकनीक से प्राप्त दृढ़ता से पूर्व vivo फ्लोरोसेंट और रेडियो लेबल ट्रेसर के परिमाण के साथ सहसंबंधित का उपयोग कर मान्य किया गया है. इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन कैसे transcranial स्थूल इमेजिंग लाइव चूहों में ग्लिम्फेटिक परिवहन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और अधिक महंगा इमेजिंग रूपरेखा के लिए एक सुलभ विकल्प की पेशकश की.

Introduction

Cerebrospinal तरल पदार्थ (सीएसएफ) मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी स्नान और homeostasis को बनाए रखने में शामिल है, पोषक तत्वों की आपूर्ति, और इंट्राक्रैनियल दबाव1को विनियमित. सबरैकनॉइड अंतरिक्ष में सीएसएफ कॉर्टिकल पायल धमनियों के आस-पास के परिसंवहनी रिक्त स्थान (पीवीएस) के नेटवर्क के माध्यम से मस्तिष्क में प्रवेश करता है और फिर प्रत् येक आर्टीरियोल्स2के साथ नीचे बहता है। एक बार पैरेन्काइमा में, सीएसएफ अंतरालीय तरल पदार्थ (आईएसएफ) के साथ आदान-प्रदान करता है, जिसमें एमिलॉयड-जेड (एजेड) और ताऊ प्रोटीन कम प्रतिरोध सफेद पदार्थ ट्रैक्ट और perivenous रिक्त स्थान2,3 के माध्यम से मस्तिष्क से बाहर हानिकारक चयापचयों को ले जाते हैं। . यह मार्ग एस्ट्रोग्लिल एक्वापोरिन-4 (AQP4) चैनलों पर निर्भर है और इसलिए इसे ग्लिल-लिम्काटिक (ग्लिम्फाटिक) प्रणाली4कहा गया है। न्यूरोपिल के अपशिष्ट उत्पादों को अंततः सीएसएफ-आईएसएफ से कपाल नसों के पास लसीका वाहिकाओं के माध्यम से और गर्भाशय ग्रीवा लिम्फ नोड्स5की ओर बाहर meninges में मंजूरी दे दी है। इस प्रणाली की विफलता अल्जाइमर रोग6,7,दर्दनाक मस्तिष्क की चोट3, और इस्कीमिक और हेमोरेजिक स्ट्रोक8जैसे कई न्यूरोलॉजिक रोगों में फंसाया गया है .

सीएसएफ परिवहन को सीस्टर्ना मैग्ना (सीएम)9,10 और ग्लिम्फेटिक अध्ययनों में ट्रेसरों द्वारा कल्पना की जा सकती है, मुख्य रूप से दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी4,11,12, 13, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई )14,15,16,17, और पूर्व विवो इमेजिंग3,6,11, 18 अनुरेखक गतिज का मूल्यांकन करने के लिए. दो-फोटोमाइक्रोकॉपी पीवीएस में सीएसएफ ट्रेसर की विस्तृत इमेजिंग और अपने उच्च स्थानिक संकल्प के कारण पैरेन्काइमा के लिए एक उपयुक्त तरीका है, हालांकि, यह देखने का एक संकीर्ण क्षेत्र है और एक आक्रामक कपाल खिड़की या खोपड़ी के thinning की आवश्यकता है। Ex vivo इमेजिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संयोजन में, एकल कोशिकाओं से पूरे मस्तिष्क19तक लेकर बहुस्तरीय विश्लेषण सक्षम बनाता है। तथापि, पोस्टमार्टम ऊतक का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक परफ्यूजन-निर्धारण की प्रक्रिया सीएसएफ प्रवाह दिशा में गहन परिवर्तन उत्पन्न करती है और पीवीएस को ध्वस्त कर देती है, वितरण और ट्रेसर12के स्थान को काफी बदल देती है। अंत में, जबकि एमआरआई पूरे murine और मानव मस्तिष्क भर में सीएसएफ प्रवाह को ट्रैक कर सकते हैं, यह perivascular प्रवाह के स्थानिक और लौकिक संकल्प का अभाव है.

एक नई तकनीक, ट्रांसक्रैनियल मैक्रोस्कोपिक इमेजिंग, जीवित चूहों के पूरे पृष्ठीय प्रांतस्था में perivascular सीएसएफ परिवहन के व्यापक क्षेत्र इमेजिंग सक्षम करने से इन सीमाओं में से कुछ हल करती है. इमेजिंग के इस प्रकार के एक multiband फिल्टर घन का उपयोग कर एक epifluorescent मैक्रोस्कोप के साथ किया जाता है, टूनाबल एलईडी प्रकाश स्रोत, और उच्च दक्षता CMOS कैमरा10. ये सेट-अप खोपड़ी की सतह के नीचे 1-2 मिमी तक पीवीएस को हल करने में सक्षम हैं और खोपड़ी को पूरीतरह से बरकरार रखते हुए कॉर्टिकल सतह के नीचे 5-6 मिमी तक फ्लोरोफोर्स का पता लगा सकते हैं। Multiband फिल्टर और एल ई डी है कि जल्दी से उत्तेजना तरंगदैर्ध्य धुन कर सकते हैं सीएसएफ एक ही प्रयोग में विभिन्न आणविक वजन और रासायनिक गुणों के अनुरेखक के साथ लेबल किया जा करने की अनुमति कई fluorophores के उपयोग को सक्षम.

इस प्रक्रिया को खोपड़ी का पर्दाफाश और इमेजिंग सत्र के दौरान सिर को स्थिर करने के लिए एक हल्के वजन सिर प्लेट जगह करने के लिए एक सरल, न्यूनतम इनवेसिव सर्जरी की आवश्यकता है। ट्रेसर खोपड़ी में ड्रिलिंग के बिना मुख्यमंत्री में वितरित किया जा सकता है या पिपेट या कैनुलास9,20के साथ cortical ऊतक मर्मज्ञ . दोनों मुख्यमंत्री cannulas और सिर प्लेटें सप्ताह के लिए कई दिनों के लिए स्थिर रहते हैं और शास्त्रीय अंत बिंदु दृश्य की तुलना में अधिक जटिल प्रयोगात्मक डिजाइन की सुविधा. इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कैसे transcranial स्थूल इमेजिंग anesthetized के मुख्यमंत्री में फ्लोरोसेंट सीएसएफ अनुरेखक के तीव्र या पुरानी इंजेक्शन के बाद ग्लिम्फेटिक प्रणाली समारोह का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है /

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Protocol

सभी प्रयोगों Rochester विश्वविद्यालय में पशु संसाधन पर विश्वविद्यालय समिति (UCAR, प्रोटोकॉल No. 2011-023) द्वारा अनुमोदित किया गया और प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए NIH गाइड के अनुसार प्रदर्शन किया.

1. cisterna मैग्ना कैनुला, सिर की थाली, और सिर धारक की तैयारी

  1. सर्जरी से पहले सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों और सिर प्लेटों बाँझ.
    नोट: फ्लोरोसेंट अनुरेखक सीधे सीएसएफ में एक cisterna मैग्ना कैनुलेशन के माध्यम से वितरित कर रहे हैं। इस प्रक्रिया पर विस्तृत निर्देशों के लिए, कृपया जेवियर एट अल9को देखें।
  2. संक्षेप में, एक सुई ड्राइवर का उपयोग कर, एक 30G x 12.7 मिमी (1/2 इंच) सुई की नोक तोड़, नीचे रास्ते के 3 डिग्री 4, और polyethylene के एक छोर में सुई के कुंद अंत जगह 10 (PE10) टबिंग (लगभग 45 सेमी लंबी). सुनिश्चित करें कि केवल बेवल PE10 ट्यूबिंग की सीमा से बाहर निकल रहा है.
  3. एक और 30G सुई के beveled अंत के 1 डिग्री 4 तोड़ और PE10 टयूबिंग के दूसरे छोर में शेष सुई के कुंद अंत जगह है, प्लास्टिक Luer-लॉक अभी भी संलग्न के साथ.
  4. बाँझ, कृत्रिम सीएसएफ (एसीएसएफ: 126 एमएम NaCl, 2.5 एमएम KCl, 1.25 एमएम NaH2पीओ4, 2 एम एम MgSO4, 2 एम एम Cacl2, 10 एमएम ग्लूकोज, और 26 एमएम NaHCO3) के साथ एक 100 डिग्री सेल्सियस ग्लास सिरिंज भरें।
  5. रेखा के अंत में सिरिंज संलग्न करें और इसे एसीएसएफ से भरें जब तक कि यह बेवल्ड सुई की नोक तक न पहुंच जाए। यह महत्वपूर्ण है कि सिरिंज एक सीएसएफ और हवा के साथ वापस भरा है, क्योंकि एक वायु स्तंभ चर जलसेक मात्रा के लिए अधिक प्रवण है।
  6. पुराने प्रयोगों के लिए, एक CSF से भरी लाइन छोड़ दें और चरण 1.7 छोड़ दें।
  7. तीव्र प्रयोगों के लिए, एक जलसेक पंप पर सिरिंज रखें और लगभग 5 मिमी हवा निकाल लें, जो मिश्रण को रोक देगा। बाद में, प्रयोग के लिए वांछित अनुरेखक (ओं) की कुल मात्रा को वापस लें (20% अतिरिक्त मृत अंतरिक्ष हानियों के कारण सिफारिश की जाती है)।
    नोट: PE10 टयूबिंग काफी लंबा होना चाहिए ताकि ट्रेसर लोड करते समय हवा का बुलबुला कांच सिरिंज के प्लास्टिक कफ में प्रवेश न करे। एक ठेठ प्रयोग के लिए, प्रोटोकॉल का उपयोग करता है 10 $L गोजातीय सीरम एल्बुमिन संयुग्मी एलेक्सा फ्लोर 647 (BSA-647) 0.5% पर aCSF में पतला.
  8. पुष्टि करें कि सिर की थाली सिर धारक में फिट बैठता है और यह माउस के लिए सही आकार का इस्तेमाल किया जा रहा है. यह सुनिश्चित करने के लिए परमाणु मार्कर हैं: खिड़की की ऊपरी सीमा इंटरोकुलर लाइन के साथ संरेखित होती है और पीछे की सीमा पश्चकपाल शिखर पर रोस्ट्रल गिर जाती है।
    नोट: स्टेनलेस स्टील सिर प्लेटें बाँझ और पुन: उपयोग किया जा सकता है। अधिकांश cyanoacrylate मिश्रण एक एसीटोन समाधान के साथ हटाया जा सकता है.

2. सर्जिकल प्रक्रिया

  1. माउस का वजन और एनेस्थेटाइज करें (उदा. केटामाइन/xylazine; 100 mg/kg ketamine, 10 mg/kg xylazine; i.p.).
  2. एक बार माउस अब एक पैर की अंगुली चुटकी का जवाब, बाँझ पानी के साथ गर्दन और सिर गीला और क्लिपर का उपयोग कर दाढ़ी. एक बार क्षेत्र मुंडा है, एक शराब झाड़ू के साथ क्षेत्र पोंछ फिर से किसी भी अवशिष्ट बालों को दूर करने के लिए.
    नोट: नाटकीय रूप से चीरा के बाद इमेजिंग विंडो में बालों की मात्रा कम कर देता है कतरन से पहले फर moistening.
  3. एक तापमान नियंत्रित पैड के शीर्ष पर एक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में माउस प्लेस और वे बाहर सूखी नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए माउस की आंखों के लिए पेट्रोलियम नेत्र मरहम लागू होते हैं।
  4. एक chlorhexidine झाड़ू के साथ उजागर त्वचा को साफ करें. 2 मिनट के बाद, एक शराब पोंछे के साथ chlorhexidine हटा दें. अंत में, एक आयोडीन समाधान है जो शुष्क करने के लिए छोड़ दिया जा सकता है लागू होते हैं।
  5. खोपड़ी और गर्दन के शीर्ष करने के लिए subcutaneous analgesia (0.25% Bupivacaine एचसीएल) इंजेक्शन।
  6. गर्दन के हिस्से पर शुरू है कि पश्चकपाल शिखर को शामिल किया गया, overlying त्वचा में एक midline कटौती बनाने के लिए और interorbitally की ओर rostrally जारी है. बाद में उस सीमा पर प्रवेश करें जहां अस्थायी मांसपेशी खोपड़ी में सम्मिलित होती है। दोनों ललाट और पार्श्विक हड्डियों को बेनकाब करने के लिए fusiform चीरा की त्वचा के सभी निकालें.
    चेतावनी: रेट्रोऑर्बिटल साइनस आंखों के लिए पुच्छऔर होता है और पीछे के चेहरे की नस की बड़ी शाखाएं पिन्ना के लिए रोस्ट्रल झूठ बोलते हैं। इन संरचनाओं को खाली करने के लिए चीरा बनाते समय सावधान रहें। यदि ऐसा होता है, तो कई मिनट के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ हेमोस्टेसिस को बनाए रखने और जारी रखने के द्वारा रक्तस्राव बंद करो।
  7. बाँझ नमकीन के साथ खोपड़ी को उत्तेजित करें और कपास के swabs का उपयोग करके सतह को साफ करें ताकि यह मलबे और बालों से मुक्त हो क्योंकि ये छवि गुणवत्ता में हस्तक्षेप करेंगे। खोपड़ी पारदर्शिता सबसे अच्छा periosteum और overlying फासिया बरकरार छोड़ने के द्वारा संरक्षित किया जाता है.
    नोट: यदि इन संरचनाओं को गलती से हटा दिया जाता है, तो खोपड़ी समय के साथ सूखी और अपारदर्शी हो सकती है। एसीएसएफ के साथ पुन: नमी या तीव्र प्रयोगों में खोपड़ी परावर्तकता को कम करने के लिए पैराफिन तेल और ग्लिसरॉल के मिश्रण का उपयोगकरें 21
  8. इस प्रक्रिया के शल्य विवरण के लिए, इस प्रक्रिया के शल्य विवरण के लिए सिस्टर्ना मैग्ना कैनुला डालने के लिए आगे बढ़ें, जेवियर एट अल9का संदर्भ लें।
  9. मुख्यमंत्री कैनुला डालने के बाद, सीमा के चारों ओर सिर की थाली के अधर पक्ष में साइनोक्रिलेट गोंद के साथ दंत सीमेंट का मिश्रण लागू करें और इसे खोपड़ी पर रखें ताकि सिर प्लेट की पूर्वकाल सीमा नाक की हड्डी और पो के पीछे की नोक के साथ संरेखित हो सके स्टरियार बॉर्डर इंटरपारीटल हड्डी के पूर्ववर्ती पहलू के साथ संरेखित होती है, जिससे यह सुनिश्चित किया जाता है कि धनुर्धारी सीवन (मध्यरेखा) खिड़की के सापेक्ष और सीधा होता है (चित्र 1ख)।
  10. गोंद त्वरक की एक जोड़ी बूंदों का उपयोग कर सिर प्लेट की स्थिति को ठीक करें। सीमेंट मिश्रण के साथ किसी भी शेष अंतराल को भरें और त्वरक के साथ इलाज करें।
    चेतावनी: सुनिश्चित करें कि cyanoacrylate माउस की आँखों के साथ संपर्क में नहीं आता है या इमेजिंग विंडो ब्लॉक.
  11. सीएम कैनुला को सिर की प्लेट पर गोंद दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ये परिवहन के दौरान या माउस के उठने पर अलग न हों।
  12. तीव्र प्रयोगों के लिए, चरण 2.16 पर जाएँ.
  13. पुराने प्रयोगों के लिए, उजागर खोपड़ी के लिए स्पष्ट सुखाने cyanoacrylate गोंद की एक पतली परत लागू होते हैं, इन इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा के रूप में बुलबुले बनाने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है। गोंद खोपड़ी के लिए सुरक्षा प्रदान करता है और इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा। सुनिश्चित करें कि गोंद चीरा सीमा पर त्वचा के लिए सभी तरह से उजागर खोपड़ी को शामिल किया गया.
  14. मुख्यमंत्री से 2-3 सेमी ट्यूबिंग एक हेमोसैट क्लैम्प का उपयोग करें और एक उच्च तापमान कॉटरी टिप के साथ लाइन में कटौती करें। एक बार जब यह अलग हो जाता है, पिघला PE10 ट्यूबिंग समतल करने के लिए cannula सील.
    चेतावनी: सुनिश्चित करें कि जब तक cannula सील कर दिया गया है और पुष्टि करें कि ट्यूबिंग में कोई लीक एक सीएसएफ नालव्रण को रोकने के लिए कर रहे हैं के बाद दबाना जारी नहीं है.
  15. 3 दिनों के लिए हर 24 एच पर 5 मिलीग्राम/किग्रा प्रशासन; आई.पी. या एस.सी.) और माउस को तापमान नियंत्रित, एकल-हाउस्ड पिंजरे में वापस करें और इसे इमेजिंग से पहले कम से कम 24 एच के लिए ठीक होने दें। माउस को तब तक न छोड़ें जब तक कि वह कठोर पुनर्वसु को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर े। बरकरार कपाल खिड़कियां कई हफ्तों के लिए स्थिर रहते हैं.
    नोट: पुराने प्रयोग यहाँ रोका जा सकता है.
    चेतावनी: कुछ पश्चात जटिलताएं हैं: सेफलोहेमेटोमा/सब्गैलेएल हेमेटोमा, सीएसएफ फिस्टुला, और संक्रमण।
  16. तीव्र प्रयोगों के लिए, सिर की प्लेट का उपयोग करसिर धारक में माउस रखें ताकि खोपड़ी एक निश्चित स्थिति में हो। संज्ञाहरण स्तर की जाँच करें और माउस के नीचे एक हीटिंग पैड जगह करने के लिए सुनिश्चित करें। माउस अब मैक्रोस्कोप पर ले जाने के लिए तैयार है.
    चेतावनी: ध्यान से एक गाड़ी पर जलसेक पंप के साथ एक साथ माउस परिवहन. यदि मुख्यमंत्री canulation disloged हो जाता है, यह इंट्राक्रैनियल दबाव में गिरावट का कारण होगा और किसी भी सीएसएफ लीक प्रयोगात्मक परिणाम बदल जाएगा.

3. इमेजिंग के लिए माउस की तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल इमेजिंग प्रयोग एक एनेस्थेटीकृत पर किया जाएगा कि क्या निर्भर करता है (चरण 3.1 पर शुरू) या जाग (चरण 3.2) माउस पर शुरू.

  1. एनेस्थेटाइज्ड चूहे
    1. मैक्रोस्कोप के मंच पर सिर धारक रखें, सुनिश्चित करें कि सिरिंज पंप से मुख्यमंत्री कैनुला तक लाइन में कोई kinks हैं और यह तना हुआ नहीं है क्योंकि यह ट्रेसर जलसेक को प्रभावित कर सकता है।
    2. श्लेष्म झिल्ली की श्वसन दर और गुलाबी रंग का निरीक्षण करें, जो अच्छी ऑक्सीजन का संकेत देता है। यदि आवश्यक हो तो जलयोजन स्तर को सुरक्षित करने के लिए लवणीय उप-cutaneously इंजेक्शन। सुनिश्चित करें कि पशु पर्याप्त anesthetized और फिर से खुराक अगर जरूरत है बनाने के लिए जाँच करें.
    3. मैक्रोस्कोप कैमरा और एलईडी चालू करें और लाइव मोड शुरू करें।
    4. इमेजिंग क्षेत्र के आवर्धन की पुष्टि करें ताकि क्षेत्र के शीर्ष पर नासोफ्रंटल सीवन और तल पर लैम्बोड सीवन को स्पष्ट रूप से कल्पना की जा सके, जिसमें सैगिटल सीवन समानांतर हो और छवि के मध्य तक केंद्रित हो (चित्र 1C)। एक बार जगह में, टेप के साथ मैक्रोस्कोप चरण के लिए सिर धारक सुरक्षित.
    5. उजागर खोपड़ी पर मैक्रोस्कोप फोकस. क्षेत्र की एक अपेक्षाकृत बड़ी गहराई वाले मैक्रोस्कोप के बावजूद, माउस की खोपड़ी की वक्रता केवल एक विशिष्ट क्षेत्र के लिए ध्यान में रहने की अनुमति देता है। सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब फोकल विमान पार्श्व हड्डियों के पार्श्व पक्षों पर कोरोनल टांके के पीछे स्थित है.
      नोट: यह मध्य मस्तिष्क धमनियों (एमसीए) का स्थान है, जहां सबसे सीएसएफ अंतर्वाह होता है (चित्र 1D, E)10.
  2. सजग चूहे
    1. इमेजिंग सत्र से पहले, जानवरों को सिर प्लेट सर्जरी से कम से कम 24 एच के लिए ठीक हो जाने दें। लंबी वसूली अवधि (5-7 दिन) भी सिफारिश कर रहे हैं. इस समय के दौरान, माउस को वसूली अवधि की अवधि के लिए प्रति दिन 0.5-1 एच के लिए संयम ट्यूब में मंच पर तय किया जा करने के लिए प्रशिक्षित करें।
      नोट: आवास माउस संज्ञाहरण के बिना सिर धारक से जुड़ा होने की अनुमति देता है और वास्तविक प्रयोग के दौरान तनाव और चिंता कम कर देता है. यदि यह संभव नहीं है और संज्ञाहरण प्रयोग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, एक साँस संवेदनाहारी की एक प्रेरण खुराक (जैसे, isoflurane 2% 1-2 L/min O2 प्रवाह दर पर) जल्दी से सिर चरण के लिए माउस संलग्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    2. एक बार माउस सिर धारक के लिए तय हो गई है और संयम ट्यूब में, चरण 3.1.1.3.1.5 का पालन करें.

4. फ्लोरोसेंट सीएसएफ ट्रेसर का इन्फ्यूजन

  1. तीव्र मुख्यमंत्री कैनुलेशन
    1. चूंकि ट्रेसर पहले से ही चरण 1.6 में cisterna मैग्ना में रखा जा रहा से पहले cannula में लोड किया गया था, वांछित दर और मात्रा के लिए जलसेक पंप सेट. नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले इन्फ्यूजन प्रतिमान ोंकोन 1-2 डिग्री सेल्सियस/मिनट पर 5-10 डिग्री सेल्सियस हैं, लेकिन इन पैरामीटरों को विशेष प्रयोग, या जानवर के आकार और आयु के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
  2. जीर्ण मुख्यमंत्री कैनुलेशन
    1. इमेजिंग सत्र शुरू करने से पहले, ट्रेसरों को वितरित करने के लिए जलसेक लाइन तैयार करने के लिए तीव्र प्रयोगों के लिए चरण 1.2-1.7 का पालन करें।
    2. एक बार लाइन तैयार की है, एक hemostat दबाना का उपयोग कर पुरानी मुख्यमंत्री cannula के सील अंत में कटौती. चरण 4-2.1 में तैयार की गई रेखा से सुई को ली ं ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी ी क्लैम्प को रिलीज करें और सिरिंज पंप का उपयोग करें, सीएसएफ ट्रेसर को वांछित जलसेक दर (उदाहरण के लिए, 2 डिग्री सेल्सियस) प्रयोग के लिए अग्रिम करें जब तक ट्रेसर मुख्यमंत्री में प्रत्यारोपित सुई तक नहीं पहुंच जाता है।
      चेतावनी: यदि सुई ट्यूबिंग के माध्यम से छेद जब लाइन जोड़ने, सुई को हटा दें, छेदा खंड में कटौती और इस कदम को दोहराने. PE10 ट्यूबिंग में किसी भी आंसू एक रिसाव का कारण होगा और प्रयोग के परिणामों को प्रभावित.

5. इमेजिंग सत्र की स्थापना

  1. फ्लोरोसेंट अनुरेखक संचार किया जा रहा के आधार पर, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और प्रत्येक चैनल के लिए जोखिम समय निर्धारित करते हैं. समय चूक इमेजिंग के लौकिक संकल्प को अधिकतम करने के क्रम में अनुरेखक कल्पना करने के लिए आवश्यक कम से कम जोखिम समय चुनें। इस जोखिम समय विभिन्न जानवरों के बीच सीएसएफ परिवहन की तुलना करने के लिए लक्ष्य सभी बाद के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    नोट: एक टिप जोखिम समय को समायोजित करने के लिए मुख्यमंत्री लाइन में ट्रेसर का उपयोग करने के लिए है। हालांकि यह एक उपयोगी पहला दृष्टिकोण है, यह समय के साथ अनुकूलित किया जाना चाहिए.
  2. प्रयोग की अवधि और उन अंतरालों को चुनें, जिन पर चित्र प्राप्त किए जाएँगे. प्रयोग आम तौर पर 30-60 मिनट के बीच पिछले ग्लिम्फेटिक परिवहन के किस चरण के आधार पर ब्याज की है. 1 फ्रेम/मिनट और तेजी की फ़्रेम दरें अधिकांश प्रयोगों के लिए पर्याप्त हैं।
  3. फ़ाइल का नाम और बचत निर्देशिका सेट करें।
  4. यदि इमेजिंग अन्य चर (जैसे, इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम, धमनी रक्तचाप, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) के एक साथ अधिग्रहण के अलावा एकत्र किया जाएगा, मैक्रोस्कोप और पंप डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ ट्रिगर किया जा करने के लिए क्रमादेशित किया जा सकता है। जाँच करें कि अगले चरण पर जाने से पहले मैक्रोस्कोप पर ट्रिगरिंग फ़ंक्शन सही है.

6. ट्रांसक्रैनियल ऑप्टिकल इमेजिंग प्रयोग

  1. ट्रेसर जलसेक और एक ही समय में इमेजिंग शुरू करें।
  2. नियमित रूप से एक रिसाव के किसी भी लक्षण के लिए मुख्यमंत्री cannula और PE10 ट्यूबिंग की जाँच करें. यदि मुख्यमंत्री पर कोई ट्रेसर लीक होता है, तो इस प्रयोग के परिणामों को बाहर रखा जाना चाहिए।
    नोट: यदि ट्रेसर सेरिबैलम में जमा करने के लिए शुरू होता है और एमसीए के ग्लिम्फेटिक मार्ग यात्रा नहीं करता है, यह संभावना है कि मुख्यमंत्री cannula सेरिबैलम में इंजेक्ट किया गया था. इस डेटा को शामिल नहीं किया जाना चाहिए.
  3. तीव्र प्रयोगों के लिए, प्रयोग के पूरा होने के बाद, माइक्रोस्कोप से माउस को हटा दें और जांच करें कि यह अभी भी पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज़ किया गया है। जल्दी से माउस decapitate और मस्तिष्क के ऊतकों फसल. विसर्जन-4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस में मस्तिष्क को ठीक करें।
    1. पुराने प्रयोगों के लिए, एक बार इमेजिंग पूरा हो गया है, कैनुला से मुख्यमंत्री लाइन को हटा दें, बाँझ एसीएसएफ के साथ फ्लश करें और एक उच्च तापमान के कारण सीएम कैनुला को रीसील करें। सिर स्टैंड से माउस निकालें और इसे अपने पिंजरे में वापस. इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएँ जब तक कि आगे इमेजिंग की आवश्यकता न हो और तब चरण 6.3 का पालन करें.

7. डेटा विश्लेषण

नोट: Matlab आधारित विश्लेषण, जैसे सीएसएफ सामने ट्रैकिंग इन इमेजिंग डेटासेट10,22में अनुरेखक मोर्चों से मात्रात्मक डेटा की बड़ी मात्रा में निकाल सकते हैं. हालांकि, इन फ़ाइल प्रकार भी आसानी से आयात किया जा सकता है और फिजी23की तरह खुला स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में विश्लेषण किया.

  1. बायो-फ़ॉर्मेट आयात उपकरण का उपयोग करके छवि स्टैक को फिजी में आयात करें. यह फ़ंक्शन फ़ाइल मेटाडेटा को संरक्षित करेगा जिसमें समय और पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन शामिल है. छवि स्टैक को .tiff फ़ाइल के रूप में सहेजें.
  2. मैन्युअल रूप से खोपड़ी या बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र के आसपास ब्याज (आरओआई) का एक क्षेत्र आकर्षित। उदाहरण के लिए, चित्रा 1जी में एक ROI को एक दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के बाद ipsilateral के लिए और contralateral गोलार्द्ध के लिए अलग से तैयार किया गया था. ROI प्रबंधक में ROI जोड़ना सुनिश्चित करें ( विश्लेषण करें ; उपकरण औरROI प्रबंधक) और उसे सहेजें.
    नोट: सीएसएफ परिवहन दो मुख्य तरीकों से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है: 1) मतलब समय के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता या 2) एक सीमा लागू करने के बाद ROI या कुल क्षेत्र (मिमी2) के प्रतिशत के रूप में व्यक्त प्रवाह क्षेत्र। उत्तरार्द्ध विधि (चित्र 1H) अगले चरणों में वर्णित किया जाएगा।
  3. अधिकतम फ्लोरोसेंट के साथ फ्रेम पर सीमा सेट करें (छविका चयन करें और समायोजित करें; थ्रेशहोल्ड...)। Otsu जैसे स्वचालित थ्रेशोल्ड तरीके सामान्य रूप से CSF अनुरेखक का पता लगाने में अच्छे हैं। थ्रेशोल्ड लागू करें।
  4. आगे जाने से पहले, सुनिश्चित करें कि विश्लेषण में और सेट माप, विकल्प क्षेत्र और क्षेत्र अंश का चयन कर रहे हैं. फिर ROI प्रबंधकमें, अधिक और बहु उपायका चयन करें.
  5. आउटपुट से ROI के क्षेत्र मान का उपयोग करके %Area मान को मिमी2 में कनवर्ट करें. %Area मान CSF ट्रेसर के साथ पृष्ठीय cortical सतह के प्रतिशत को प्रतिबिंबित करते हैं।
  6. समय के एक समारोह के रूप में मिमी2 में प्लॉट सीएसएफ अनुरेखक प्रवाह।

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Representative Results

सीएसएफ प्रवाह एक एपिफ्लोरेसेंट मैक्रोस्कोप पर छवि बनाई गई है (चित्र 1A), जो murine प्रांतस्था में सीएसएफ अनुरेखक परिवहन के mesoscopic इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. पूरे-स्कॉल हेड प्लेट से रोस्ट्रल नाक की हड्डियों, मध्य में ललाट और पार्श्विक हड्डियों, और अंतरापारिक अस्थि का रोस्ट्रल भाग के दृश्य को अनुमति मिलती है (चित्र 1 ख)। इमेजिंग के दौरान, नासोफ्रंटल, सैगिटल, कोरोनल, और लैम्ब्डॉइड टांके को आसानी से पहचाना जा सकता है (चित्र 1C)। एक बार मुख्यमंत्री में सीएसएफ अनुरेखक का अर्क शुरू होता है (चित्र 1D), अनुरेखक फ्लोरोसेंट पहली बार बेसल कुंड में subarachnoid सीएसएफ के बड़े पूल में देखा जाता है, olfactofrontal कुंड, और पाइनल अवकाश के पास चतुष्कोणीय कुंड (चित्र 1E , छोड़ दिया)। सीएसएफ अनुरेखक तब मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए ) की कॉर्टिकल पायल शाखाओं के परिसंवहनी स्थानों के साथ मस्तिष्क में प्रवेश करते हैं (चित्र 1ई, दायां) .

ट्रांसक्रैनियल ऑप्टिकल इमेजिंग का उपयोग दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई)3के बाद ग्लिम्फेटिक फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। चूहे एक मध्यम टीबीआई प्राप्त किया और तुरंत बाद में एक फ्लोरोसेंट सीएसएफ अनुरेखक (BSA-647) मुख्यमंत्री24में इंजेक्ट किया गया था. सीएसएफ परिवहन TBI के बाद 60 मिनट के लिए छवि (चित्र 1F) था. मैक्रोस्कोपिक इमेजिंग से पता चलता है कि ट्रेसर को सबसे पहले ओल्टैक्टोफ्रंटल कुंड में देखा जाता है लेकिन कॉर्टिकल पीवीएस के साथ ग्लिम्फेटिक प्रवाह को पूरी तरह से टीबीआई के पक्ष में समाप्त कर दिया जाता है (चित्र 1जी, सप. मूवी 1) । ग्लिम्फेटिक फंक्शन पर टीबीआई के निरोधात्मक प्रभाव को कई अन्य अनुरेखक परिमाणीकरण विधियों का उपयोग करके दिखाया गया है और यह टीबीआई के बीच के संबंधों और चोट3के बाद देखा एजेड और ताऊ के संचय को रेखांकित कर सकता है . विवो छवियों का मात्रात्मक विश्लेषण दर्शाता है कि प्रतिपार्श्विक गोलार्द्ध की तुलना में इपिपार्श्व प्रवाह क्षेत्र में लगभग एक तिहाई की कमी आई है (चित्र 1ह)

Figure 1
चित्र 1. ट्रांसक्रैनियल स्थूल इमेजिंग. (ए) स्थूल इमेजिंग की स्थापना की। (ख) खोपड़ी पर हेड प्लेट की स्थिति का डोर्सल दृश्य। अंतरापारिक अस्थि और नाक, ललाट, और पार्श्विक हड्डियां सभी दिखाई देती हैं। (ग) सीएसएफ अनुरेखक प्रकट होने से पहले इमेजिंग के दौरान एक उजागर माउस खोपड़ी, स्पष्ट रूप से बरकरार खोपड़ी के सभी कपाल टांके दिखा. स्केल बार: 1 मिमी (डी) सीएसएफ अनुरेखक के एक पार्श्व दृश्य के Schematic कुंड मैग्ना (सीएम) में प्रवेश करने और ग्लिम्फेटिक मार्ग के साथ बेसल कुंड से यात्रा. (ई, बाएँ पैनल) एक ketamine-xylazine में ग्लिम्फेटिक प्रवाह के मैक्रोस्कोपिक इमेजिंग 20 मिनट के बाद मुख्यमंत्री इंजेक्शन पर जंगली प्रकार माउस (BSA-647; 10 $L पर 2 $L/ सीएसएफ अनुरेखक को नासोफ्रंटल सीवन के नीचे रोस्ट्रल राइनल नस के चारों ओर ओल्टैक्टोफ्रंटल कुंड में देखा जाता है, जो सैगिटल सीवन के नीचे बेहतर सैगिटल साइनस के कुछ हिस्सों के साथ, और लैम्ब्डॉइड के नीचे अनुप्रस्थ साइनस के आसपास के पाइनल अवकाश में देखा जाता है। टांका. (ई, सही पैनल) बाईं ओर की छवि का डिजिटल आवर्धन इन सूक्ष्मदर्शी ोंयकों के साथ प्राप्त उच्च स्थानिक विभेदन को दर्शाता है। सीएसएफ अनुरेखक मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए)10के परिसंवहनी रिक्त स्थान के भीतर यात्रा करता है। स्केल बार: 0.5 मिमी (एफ) प्रायोगिक समयरेखा. एक एनेस्थेटाइज्ड वाइल्डटाइप माउस को एक मध्यम दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई)24 और तुरंत एक सीएम इंजेक्शन (बीएसए-647; 2 डिग्री सेल्सियस/मिनट पर 10 डिग्री सेल्सियस) प्राप्त हुई, जिसके बाद 60 मिनट मैक्रोस्कोपिक इमेजिंग का उपयोग किया गया। (छ) टीबीआई (डैश्ड लाइन) के बाद सीएसएफ अनुरेखक परिवहन की समय-चूक छवियां। स्केल बार: 1मिमी (एच ) प्रवाह क्षेत्र (मिमी2) 60-मिनट प्रयोग के दौरान प्रत्येक गोलार्द्ध पर, (जी) में ROIs से मात्रा निर्धारित, गोलार्द्ध कि TBI प्राप्त (आइपिसिओरल) और गोलार्द्ध कि नहीं था (contralateral). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1. कस्टम सिर प्लेट का खाका. (ए, बी) ट्रांसक्रैनियल मैक्रोस्कोपिक इमेजिंग प्रोटोकॉल में प्रयुक्त कस्टम हेड प्लेट का सटीक माप (मिमी में)। एक खोखले बाहर सिर की प्लेट (सी) और एक पूरे सिर की प्लेट (डी) के 3 डी योजनाबद्ध . इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक मूवी 1. बाएं पार्श्विक हड्डी के लिए मध्यम दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के बाद सीएसएफ परिवहन के समय चूक इमेजिंग। अवधि: 60 मिनट स्केल बार: 1 मिमी कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट मैक्रोस्कोप और अनुरेखक का उपयोग कर रहते चूहों में ट्रांसक्रैनियल सीएसएफ इमेजिंग प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। इस तकनीक सरल और न्यूनतम इनवेसिव, अभी तक मात्रात्मक है. विवो इमेजिंग में सीएम डिलीवरी के बाद 3एच-डेक्सट्रान और 14सी-इनुलिन सहित रेडियो-लेबल ट्रेसर्स की तरल प्रस्फुरण गिनती जैसे संवेदनशील तरीकों के साथ अच्छी तरह से संबंधित है, और पूर्व विवो कोरोनल अनुभाग परिमाणीकरण10केसाथ, 18. दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी के साथ सत्यापन दर्शाता है कि मैक्रोस्कोप के तहत cortical रक्त वाहिकाओं के साथ देखा सीएसएफ अनुरेखक मुख्य रूप से एमसीए और इसकी शाखाओं10के perivascular रिक्त स्थान के भीतर स्थित हैं. ये सीएसएफ अंतर्वाह पथ ग्लिम्फेटिक प्रणाली19का एक महत्वपूर्ण घटक हैं . हालांकि इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है, इन सेट अप भी इस तरह के meningeal और गर्भाशय ग्रीवा लसीका25,26के रूप में सीएसएफ निकासी रास्ते छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

सिर प्लेट डिजाइन में सुधार समय के साथ एक ही माउस की पुरानी, स्थिर, व्यापक क्षेत्र इमेजिंग सक्षम बनाता है। सिर प्लेट आकार, आकार, और वजन प्रत्येक विशिष्ट आवेदन के लिए सिलवाया जा सकता है। लेजर काटने और 3 डी मुद्रण में अग्रिम के साथ, विनिर्देशों के रूप में कुछ सीमाएं हैं. सिर चढ़ाना भी या तो एनेस्थेटाइज़्ड या जाग जानवरों की अनुदैर्घ्य इमेजिंग के लिए अनुमति देता है और एक बरकरार खोपड़ी के माध्यम से छवि करने की क्षमता कपाल या पतली खोपड़ी खिड़कियों27की नियुक्ति के साथ जुड़े neuroinflammation और edema से बचा जाता है, 28 , 29. यह एक महत्वपूर्ण लाभ है क्योंकि कॉर्टेक्स के माध्यम से फ्लोरोसेंट ट्रेसरों की स्टीरियोटैक्सिक डिलीवरी स्ट्रियाटम या पार्श्व वेंट्रिकल्स में एक कपाल बर्र होल का उपयोग करके ग्लिम्फेटिक फंक्शन20,26को बहुत कम कर देता है . अधिकांश वाणिज्यिक मैक्रोस्कोप की बड़ी गैन्ट्री और काम करने की दूरी चूहों को विभिन्न विन्यास में मंच पर तय करने की अनुमति देती है, जिसमें चल रहे पहियों या फ्लोटिंग भूलभुलैया शामिल हैं। चूहे को प्रशिक्षित किया जा सकता है और 5-7 दिन की वसूली अवधि के दौरान माइक्रोस्कोप चरण में सिर तय करने के लिए आदत हो सकती है ताकि जाग इमेजिंग30की सुविधा मिल सके।

इस विधि की मुख्य सीमाओं में से एक मैक्रोस्कोप की कम पैठ गहराई है, जो दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी10की तुलना में कम है। यह डिवाइस बरकरार खोपड़ी के नीचे कॉर्टिकल सतह के केवल कुछ मिलीमीटर को हल करने में सक्षम है। हालांकि, जबकि यह ऊतक में गहरी होने वाली प्रक्रियाओं की इमेजिंग को सीमित करता है, यह आम तौर पर ग्लिम्फेटिक विश्लेषण के लिए एक समस्या नहीं है क्योंकि प्रवेश के प्रमुख मार्ग मुख्य रूप से पृष्ठीय cortical सतह के मुख्य धमनियों के आसपास स्थित हैं। गहरी संरचनाओं को हल करने में असमर्थ होने के बावजूद, उच्च दक्षता वैज्ञानिक CMOS कैमरों के साथ मैक्रोस्कोप महान फ्लोरोसेंट का पता लगाने है; मस्तिष्क की सतह पर ट्रेसर का पता नहीं होने के बावजूद, सीएम इंजेक्शन10की शुरुआत के बाद हर समय मस्तिष्क में पाए जाने वाले ट्रेसर की मात्रा के साथ कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता संबंधित होती है। इन मापदंडों के उपयोग से सुधार कर रहे हैं दूर-लाल, के पास-infrared, या अवरक्त अनुरेखक इन लंबे समय तक तरंगदैर्ध्य पर इमेजिंग के बाद से ऊतक ऑटो-fluorscence और प्रकाश के प्रकीर्णन कम कर देता है, और कम उत्सर्जन की तुलना में एक बेहतर संकेत करने वाली शोर अनुपात है तरंगदैर्ध्य फ्लोरोफोर। मानक मैक्रोस्कोप एक ही प्रयोग में एक से अधिक अनुरेखक की इमेजिंग सक्षम बनाता है। मैक्रोस्कोप के विन्यास के आधार पर, फिल्टर बुर्ज अधिग्रहण के बीच बारी बारी से करने के लिए है, काफी प्राप्त किया जा सकता है कि लौकिक संकल्प को कम करने. यह टूनाबल एल ई डी और एक multiband फिल्टर घन के उपयोग से सुधार किया जा सकता है. इस सुधार के बावजूद, multichannel इमेजिंग वास्तव में एक साथ नहीं है, के बाद से वहाँ अधिग्रहण में देरी है, जबकि उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के बीच एलईडी स्विच. यह सबसे स्थूल सेट-अप के साथ संगत कर रहे हैं कि छवि बंटवारे प्रकाशिकी का उपयोग कर एक साथ दोहरी चैनल इमेजिंग को प्राप्त करने के लिए संभव है; हालांकि, इन बलिदान स्थानिक संकल्प CMOS कैमरा (2048 x 2048 पिक्सेल) का पूरा संकल्प आधा संकल्प (1024 x 1024 पिक्सेल) के साथ देखने के दो क्षेत्रों में विभाजित करके. CMOS कैमरों इस उपयोग के लिए काफी पर्याप्त हैं, एक सीसीडी कैमरे का उपयोग के रूप में अच्छी तरह से इस आवेदन करने के लिए लागू किया जा सकता है. एक अतिरिक्त कारक है कि लौकिक संकल्प कम कर देता है जोखिम समय चुना fluorophore की पर्याप्त उत्तेजना के लिए आवश्यक है, जो आम तौर पर 50 - 1000 एमएस के बीच पर्वतमाला यह आगे या तो 2x2 या 4x4 पिक्सेल binning, जो कम कर देता है का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है जोखिम समय और फ्रेम दर बढ़ जाती है, स्थानिक संकल्प की कीमत पर. इन सीमाओं के बावजूद, ट्रांसक्रैनियल मैक्रोस्कोपिक मल्टीचैनल इमेजिंग उच्च स्थानिक संकल्प के साथ 10-20 हर्ट्ज के बीच फ्रेम दरों को प्राप्त करने में सक्षम है।

ट्रांसक्रैनियल मैक्रोस्कोपिक इमेजिंग में हाल के उदाहरणों ने एक्वापोरिन-4 (AQP4) चूहों को दस्तक10,20 और प्लेटलेट व्युत्पन्न विकास कारक बी (PDGF-B) प्रतिधारण आकृति नॉकआउट चूहों22 का इस्तेमाल किया है AQP4 के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए और ग्लिम्फाटिक प्रणाली में PDGF-बी. अध्ययन C57Bl6 wildtype चूहों का इस्तेमाल किया नॉकआउट माउस लाइनों की तुलना करने के लिए. वे transcranially फ्लोरोसेंट अनुरेखक का उपयोग कर 30 मिनट की अवधि के लिए चूहों की छवि और परिणाम निष्कर्ष निकाला है कि नॉकआउट लाइनों नाटकीय रूप से wildtypes की तुलना में सीएसएफ प्रवाह कम हो गया था.

इन गुणों transcranial ऑप्टिकल इमेजिंग एक आदर्श तकनीक सीएसएफ परिवहन का अध्ययन करने के लिए, विशेष रूप से जानवरों के 2 या अधिक सहगण के बीच बनाते हैं. यह एक माइक्रोन पैमाने संकल्प पर जीवित चूहों में intracisternal अनुरेखक गतिकी के माप की अनुमति देता है, vivo इमेजिंग रूपरेखा में अन्य की लागत का एक अंश पर. इस तकनीक को एक शारीरिक, गैर इनवेसिव रास्ते में ग्लिम्फेटिक प्रणाली के अध्ययन की अनुमति देता है, और स्वास्थ्य और रोग10,20,25 में अपने कार्य को विनियमित करने वाले कारकों में से कुछ को स्पष्ट करने में मदद करने में उपयोगी रहा है . हालांकि, इसकी सबसे रोमांचक विशेषता सीएसएफ हाइड्रोडायनामिक्स के बारे में भविष्य के सवालों के जवाब देने की क्षमता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ; R01NS100366 और RF1AG057575 MN के लिए, Fondation LedukQ उत्कृष्टता कार्यक्रम के ट्रान्साटलांटिक नेटवर्क, और यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (नहीं. 666881 अनुदान; SVDs$लक्ष्य). हम भी ग्राफिक चित्र के साथ विशेषज्ञ सहायता के लिए दान Xue शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Bupivacaine HCl University of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock Hamilton Company 81020
A-M Systems Dental Cement Powder Fisher Scientific NC9991371
Carprofen University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine Prevantics B10800
CMOS Camera Hammamatsu ORCA Flash 4.0
Head Plate University of Rochester No catalog # Custom made at the machine shop at the University of Rochester
High-Temperature Cautery Bovie Medical Corporation AA01
Insta-set Accelerator Bob Smith Industries BSI-151
Isoflurane - Fluriso Vet One 502017 University of Rochester Vivarium
Ketamine Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue Elmer's Products, Inc No catalog #, see link in comments https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tape Fisher Scientific 19-027-761
Paraformaldehyde Sigma-aldrich P6148
PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous Braintree Scientific PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe Harvard Apparatus 70-4501
PURALUBE VET OINTMENT Dechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks Fisher Scientific 22-029-553
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
Simple Head Holder Plate (for mice) Narishige International USA Inc MAG-1
Single-use Needles, BD Medical VWR BD305106
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher Scientific 22-363-750
Tunable LED PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine University of Rochester Vivarium

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