In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza

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Summary

L'imaging ottico transcranico consente l'imaging ad ampio campo del trasporto di fluidi cerebrospinali nella corteccia di topi vivi attraverso un cranio intatto.

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Sweeney, A. M., Plá, V., Du, T., Liu, G., Sun, Q., Peng, S., Plog, B. A., Kress, B. T., Wang, X., Mestre, H., Nedergaard, M. In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59774, doi:10.3791/59774 (2019).

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Abstract

Il flusso del liquido cerebrospinale (CSF) nei roditori è stato ampiamente studiato utilizzando la quantificazione ex vivo dei traccianti. Tecniche come la microscopia a due fotoni e la risonanza magnetica (MRI) hanno permesso la quantificazione in vivo del flusso CSF, ma sono limitate rispettivamente dalla riduzione dei volumi di imaging e dalla bassa risoluzione spaziale. Recenti lavori hanno scoperto che il CSF entra nel parenchyma cerebrale attraverso una rete di spazi perivascolari che circondano il pial e le arterie penetranti della corteccia dei roditori. Questa entrata pericolare di CSF è un fattore principale del sistema glimphatico, una via implicata nella clearance dei soluti metabolici tossici (ad es. amiloide-z). Qui, illustriamo una nuova tecnica di imaging macroscopico che permette l'imaging mesoscopico in tempo reale dei traccianti CSF fluorescenti attraverso il cranio intatto dei topi vivi. Questo metodo minimamente invasivo facilita una moltitudine di progetti sperimentali e consente test singoli o ripetuti delle dinamiche CSF. I Macroscopi hanno un'alta risoluzione spaziale e temporale e la loro grande distanza di gantry e lavoro consentono l'imaging durante l'esecuzione di attività sui dispositivi comportamentali. Questo approccio di imaging è stato convalidato utilizzando misurazioni di imaging a due fotoni e fluorescenza ottenute da questa tecnica fortemente correlate alla fluorescenza ex vivo e alla quantificazione dei traccianti con etichetta radio. In questo protocollo, descriviamo come l'imaging macroscopico transcranico può essere utilizzato per valutare il trasporto glimphatico nei topi vivi, offrendo un'alternativa accessibile a modalità di imaging più costose.

Introduction

Il liquido cerebrospinale (CSF) bagna il cervello e il midollo spinale ed è coinvolto nel mantenimento dell'omeostasi, nella fornitura di nutrienti e nella regolazione della pressione intracranica1. CSF nello spazio subaracnoideo entra nel cervello attraverso una rete di spazi perivascolari (PVS) che circondano le arterie corticali piali e poi scorre lungo arteriole penetranti2. Una volta nel parenchyma, CSF si scambia con il fluido interstiziale (ISF), trasportando metaboliti nocivi come l'amiloide-z (A) e gli aggregati proteici tau fuori dal cervello attraverso tratti di materia bianca a bassa resistenza e spazi perivenous2,3 . Questa via dipende dai canali astrogliali di acquaporina-4 (AQP4) ed è stata quindi definita il sistema gliale-linfatico (glimphatico)4. I prodotti di scarto del neuropil vengono infine eliminati dal CSF-ISF attraverso vasi linfatici vicino ai nervi cranici e nelle meningi verso i linfonodi cervicali5. Il fallimento di questo sistema è stato implicato in diverse malattie neurologiche come il morbo di Alzheimer6,7, lesioni cerebrali traumatiche3, e ictus ischemico ed emorragico8.

Il trasporto CSF può essere visualizzato infondendo traccianti nella cisterna magna (CM)9,10 e studi glimphatici in passato hanno utilizzato principalmente la microscopia a due fotoni4,11,12, 13, risonanza magnetica (RM)14,15,16,17ed ex vivo imaging3,6,11, 18 per valutare la cinetica tracciante. La microscopia a due fotoni è un metodo adatto per l'imaging dettagliato dei traccianti CSF nei PVS e del parenchyma a causa della sua alta risoluzione spaziale, tuttavia, ha un campo visivo stretto e richiede una finestra cranica invasiva o un assottigliamento del cranio. L'imaging ex vivo, in combinazione con l'immunohistochimica, consente analisi multilivello che vanno da singole cellule fino all'intero cervello19. Tuttavia, il processo di perfusione-fissazione che è necessario per osservare il tessuto post-mortem produce profondi cambiamenti nella direzione del flusso CSF e collassa il PVS, alterando significativamente la distribuzione e la posizione dei traccianti12. Infine, mentre la risonanza magnetica può tracciare il flusso di CSF in tutto il murino e il cervello umano, manca di risoluzione spaziale e temporale del flusso perivascolare.

Una nuova tecnica, l'imaging macroscopico transcranico, risolve alcuni di questi limiti consentendo l'imaging ad ampio campo del trasporto di CSF perivascolare nell'intera corteccia dorsale dei topi viventi. Questo tipo di imaging viene eseguito con un macroscopio epifluorescente utilizzando un cubo di filtro multibanda, una sorgente luminosa a LED regolabile e una fotocamera CMOS ad alta efficienza10. Questi set-up sono in grado di risolvere PVS fino a 1-2 mm sotto la superficie del cranio e in grado di rilevare fluorofori fino a 5-6 mm sotto la superficie corticale, lasciando il cranio completamente intatto10. Filtri multibanda e LED in grado di ottimizzare rapidamente la lunghezza d'onda dell'eccitazione consentono l'uso di più fluorofori che consentono alla CSF di essere etichettati con traccianti di diversi pesi molecolari e proprietà chimiche nello stesso esperimento.

Questa procedura richiede un intervento chirurgico semplice e minimamente invasivo per esporre il cranio e posizionare una piastra della testa leggera per stabilizzare la testa durante la sessione di imaging. I traccianti possono essere consegnati nel CM senza perforare nel cranio o penetrare nel tessuto corticale con pipette o cannulas9,20. Sia le cannule CM che le piastre della testa rimangono stabili da diversi giorni a settimane e facilitano progetti sperimentali più complessi rispetto alla classica visualizzazione del punto finale. Questo protocollo descrive come l'imaging macroscopico transcranico viene utilizzato per studiare la funzione del sistema glimphatico a seguito di iniezione acuta o cronica di tracciante CSF fluorescente nel CM di topi anestetizzati/dormienti o svegli.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato universitario per le risorse animali (UCAR, Protocollo n. 2011-023) presso l'Università di Rochester ed eseguiti secondo la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Preparazione della cisterna magna cannula, della piastra di testa e del supporto della testa

  1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e le piastre della testa prima dell'intervento chirurgico.
    NOTA: I traccianti fluorescenti vengono consegnati direttamente in CSF tramite una cannulazione cisterna magna. Per istruzioni dettagliate su questa procedura, fare riferimento a Xavier et al9.
  2. In breve, utilizzando un driver ad ago, rompere la punta di un ago 30G x 12,7 mm (1/2 pollici), 3/4 della strada verso il basso, e posizionare l'estremità smussata dell'ago in un'estremità del tubo di polietilene 10 (PE10) (circa 45 cm di lunghezza). Assicurarsi che solo lo svelatura sporge dal bordo del tubo PE10.
  3. Rompere 1/4 dell'estremità smussata di un altro ago 30G e posizionare l'estremità smussata dell'ago rimanente nell'altra estremità del tubo PE10, con la plastica Luer-lock ancora attaccata.
  4. Riempire una siringa di vetro da 100 -L con un CSF artificiale sterile (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM di glucosio e 26 mM NaHCO3).
  5. Fissare la siringa all'estremità della linea e riempirla con aCSF fino a raggiungere la punta dell'ago smussato. È importante che la siringa sia riempita con aCSF e non aria, poiché una colonna d'aria è più soggetta a volumi di infusione variabile.
  6. Per esperimenti cronici, lasciare la linea riempita con aCSF e saltare il passaggio 1.7.
  7. Per esperimenti acuti, posizionare la siringa su una pompa di infusione e ritirare circa 5 mm di aria, che impedirà la miscelazione. Successivamente, ritirare il volume totale di traccianti desiderato per l'esperimento (20% in più è raccomandato a causa di perdite di spazio morto).
    NOTA: Il tubo PE10 deve essere abbastanza lungo in modo che la bolla d'aria non entri nel polsino di plastica della siringa di vetro durante il caricamento del tracciante. Per un esperimento tipico, il protocollo utilizza 10 l di albumina di siero bovino coniugata ad Alexa Fluor 647 (BSA-647) diluito in aCSF allo 0,5%.
  8. Confermare che la piastra di testa si inserisce nel supporto della testa e che è la dimensione giusta per il mouse utilizzato. Marcatori anatomici per garantire questo sono: il bordo superiore della finestra si allinea con la linea interoperabile e il bordo posteriore cade rostral alla cresta occipitale.
    NOTA: le piastre di testa in acciaio inossidabile possono essere sterilizzate e riutilizzate. La maggior parte delle miscele di cianoacrilato possono essere rimosse con una soluzione di acetone.

2. Procedura chirurgica

  1. Pesare e anestesizzare il topo (ad esempio ketamina/xylazina; 100 mg/kg di ketamina, 10 mg/kg di xilarina; i.p.).
  2. Una volta che il mouse non risponde più a un pizzico di punta, inumidire il collo e la testa con acqua sterile e radere con i clipper. Una volta rasata l'area, pulire nuovamente l'area con un tampone alcolico per rimuovere eventuali capelli residui.
    NOTA: L'umidità della pelliccia prima del ritaglio riduce drasticamente la quantità di peli nella finestra di imaging dopo l'incisione.
  3. Posizionare il mouse in una cornice stereotassica sopra un pad a temperatura controllata e applicare unguento oftalmico di petrolio agli occhi del mouse per assicurarsi che non si asciughino.
  4. Pulire la pelle esposta con un tampone di cloressia. Dopo 2 min, rimuovere la clorhesiadina con una salvietta alcolica. Infine, applicare una soluzione di iodio che può essere lasciata asciugare.
  5. Iniettare analgesia sottocutanea (0,25% Bupivacaine HCl) nella parte superiore del cranio e del collo.
  6. Partendo dalla parte del collo che copre la cresta occipitale, fai un taglio di linea mediana nella pelle sovrastante e continua tristemente verso la linea interorbitale. Incise lateralmente al confine dove il muscolo temporale si inserisce nel cranio. Rimuovere tutta la pelle dell'incisione fusiforme per esporre sia le ossa frontali che le ossa parietali.
    INFORMATIVA: Il sinus retroorbitale si trova caudale agli occhi e grandi rami della vena facciale posteriore si trovano rostral alla pinna. Fare attenzione quando si effettua l'incisione per risparmiare queste strutture. In questo caso, interrompere il sanguinamento mantenendo l'emostasi con un tampone di cotone sterile per diversi minuti e continuare.
  7. Irrigare il cranio con sterile salina e pulire la superficie utilizzando tamponi di cotone in modo che sia privo di detriti e capelli dal momento che questi interferiranno con la qualità dell'immagine. La trasparenza del cranio è meglio preservata lasciando intatta la fascia periosteo e la fascia sovrastante.
    NOTA: Se queste strutture vengono accidentalmente rimosse, il cranio può diventare asciutto e opaco nel tempo. Re-inumidire con aCSF o utilizzare una miscela di olio di paraffina e glicerolo per ridurre la riflettanza del cranio negli esperimenti acuti21.
  8. Procedere con l'inserimento della cisterna magna cannula - per i dettagli chirurgici di questa procedura, fare riferimento a Xavier et al9.
  9. Dopo aver inserito la cannula CM, applicare una miscela di cemento dentale con colla cianoacrilata sul lato ventrale della piastra di testa intorno al bordo e posizionarla sul cranio in modo che il bordo anteriore della piastra della testa si allinei con la punta posteriore dell'osso nasale e bordo sterior si allinea con l'aspetto anteriore dell'osso interparietale, assicurandosi che la sutura sagittale (linea mediana) sia centrata e dritta rispetto alla finestra (Figura 1B).
  10. Fissare la posizione della piastra di testa utilizzando un paio di gocce di acceleratore di colla. Riempire le lacune rimanenti con la miscela di cemento e curarlo con acceleratore.
    AGGIORNAMENTO: Assicurarsi che il cianoacrylato non entri in contatto con gli occhi del mouse o blocchi la finestra di imaging.
  11. Incollare la cannula CM alla piastra di testa per assicurarsi che non si stacchino durante il trasporto o quando il mouse si sveglia.
  12. Per esperimenti acuti, andare al passaggio 2.16.
  13. Per esperimenti cronici, applicare un sottile strato di colla cianoacrilata trasparente al cranio esposto, facendo attenzione a non creare bolle in quanto queste interferiranno con l'imaging. La colla fornisce protezione per il cranio e non interferisce con l'imaging. Assicurarsi che la colla copra il cranio esposto fino alla pelle al bordo dell'incisione.
  14. Utilizzare un morsetto emostat per tenere il tubo PE10 riempito con aCSF 2-3 cm dal CM e tagliare la linea con una punta di cautery ad alta temperatura. Una volta separato, appiattire il tubo PE10 fuso per sigillare la cannula.
    AGGIORNAMENTO: Assicurarsi di non rilasciare il morsetto fino a dopo che la cannula è stata sigillata e confermare che non ci sono perdite nel tubo per evitare una fistola CSF.
  15. Amministrare il carprofene (5 mg/kg ogni 24 h per 3 giorni; i.p. o s.c.) e riportare il mouse in una gabbia mono-casa controllata a temperatura e lasciarla recuperare per almeno 24 h prima dell'imaging. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non riacquista sufficiente consapevolezza per mantenere la recumbency sternale. Le finestre craniche intatte rimangono stabili per diverse settimane.
    NOTA: l'esperimento cronico può essere messo in pausa qui.
    ATTIVITA': Alcune complicazioni postoperatorie sono: cefalohematoma/ematomi subgaleali, fistola CSF e infezione.
  16. Per esperimenti acuti, posizionare il mouse nel supporto della testa utilizzando la piastra di testa in modo che il cranio si trova in una posizione fissa. Assicurarsi di controllare il livello di anestesia e posizionare un pad di riscaldamento sotto il mouse. Il mouse è ora pronto per essere portato al macroscopio.
    AVVISO: Trasportare con attenzione il mouse insieme alla pompa di infusione su un carrello. Se la cannulation CM si sposta, causerà un calo della pressione intracranica e qualsiasi perdita di CSF altererà i risultati sperimentali.

3. Preparazione del mouse per l'imaging

NOTA: il protocollo varia a seconda che l'esperimento di imaging venga eseguito su un mouse acuito (a partire dal passaggio 3.1) o sveglio (a partire dal passaggio 3.2).

  1. Topi anestesizzati
    1. Posizionare il supporto della testa sullo stage del macroscopio, assicurandosi che non ci siano nodi nella linea dalla pompa delle siringhe alla cannula CM e che non sia tesa poiché ciò potrebbe influenzare l'infusione del tracciante.
    2. Osservare la frequenza respiratoria e la colorazione rosa delle membrane mucose, indicando una buona ossigenazione. Iniettare la solina sottocutanea per garantire il livello di idratazione, se necessario. Verificare che l'animale sia sufficientemente anetizzato e, se necessario, ri-dosaggio.
    3. Accendere la fotocamera macroscopio e LED e avviare la modalità LIVE.
    4. Confermare l'ingrandimento del campo di imaging in modo che la sutura nasofrontale nella parte superiore del campo e la sutura lambdoid nella parte inferiore sia chiaramente visualizzata, con la sutura sagittale parallela e centrata al centro dell'immagine (Figura 1C). Una volta in posizione, fissare il supporto della testa allo stadio macroambito con nastro adesivo.
    5. Concentrare il macroscopio sul cranio esposto. Nonostante i macroscopi abbiano una profondità di campo relativamente grande, la curvatura del cranio del topo consente solo che un'area specifica sia messa a fuoco. I migliori risultati si ottengono quando il piano focale si trova sui lati laterali delle ossa parietali posteriori alle suture coronali.
      NOTA: Questa è la posizione delle arterie cerebrali centrali (MCA), dove si verifica la maggior parte dell'afflusso di CSF (Figura 1D,E)10.
  2. Topo sveglio
    1. Prima della sessione di imaging, lasciare che gli animali si riprendano per almeno 24 ore dall'intervento chirurgico della piastra della testa. Si raccomandano anche periodi di recupero più lunghi (5-7 giorni). Durante questo periodo, allenare il mouse a essere fissato a testa sul palco nel tubo di ritenuta per 0,5-1 h al giorno per la durata del periodo di recupero.
      NOTA: L'abitudine consente al mouse di essere attaccato al supporto della testa senza anestesia e riduce lo stress e l'ansia durante l'esperimento vero e proprio. Se questo non è fattibile e l'anestesia non interferisce con l'esperimento, una dose di induzione di un anestetico inalato (ad esempio, isoflurane 2% a 1-2 L/min O2 flow rate) può essere utilizzata per collegare rapidamente il mouse alla fase della testa.
    2. Una volta che il mouse è fissato al supporto della testa e nel tubo di ritenuta, seguire i passaggi 3.1.1-3.1.5.

4. Infusione di traccianti CSF fluorescenti

  1. Canonaminazione acuta di CM
    1. Poiché il tracciante era già stato caricato nella cannula prima di essere collocato nella cisterna magna nel passo 1.6, impostare la pompa di infusione al tasso e al volume desiderati. I paradigmi di infusione utilizzati di routine sono 5-10 L a 1-2 l/min, ma questi parametri possono essere regolati a seconda del particolare esperimento, o delle dimensioni e dell'età dell'animale.
  2. Canulazione CM cronica
    1. Prima di iniziare la sessione di imaging, seguire i passaggi 1.2-1.7 per esperimenti acuti per preparare la linea di infusione per fornire i traccianti.
    2. Una volta che la linea è preparata, utilizzando un morsetto hemostat tagliare l'estremità sigillata della cannula CM cronica. Prendere l'ago dalla linea preparata nel passo 4.2.1 e inserirlo delicatamente nella cannula. Rilasciare il morsetto e utilizzare la pompa della siringa, far avanzare il tracciante CSF alla velocità di infusione desiderata (ad es., 2 gradi centigradi/min) per l'esperimento fino a quando il tracciante non raggiunge l'ago impiantato nel CM.
      AVVERTEnza: Se l'ago penetra attraverso il tubo quando collega la linea, rimuovere l'ago, tagliare il segmento trafitto e ripetere questo passaggio. Qualsiasi strappo nel tubo PE10 causerà una perdita e influenzare i risultati dell'esperimento.

5. Impostazione della sessione di imaging

  1. In base al tracciante fluorescente infuso, determinare la lunghezza d'onda dell'eccitazione e il tempo di esposizione per ogni canale. Scegliere il tempo di esposizione più breve necessario per visualizzare il tracciante al fine di massimizzare la risoluzione temporale dell'imaging time-lapse. Questo tempo di esposizione sarà utilizzato per tutti gli esperimenti successivi che mirano a confrontare il trasporto di CSF tra diversi animali.
    NOTA: un suggerimento consiste nell'utilizzare il tracciante nella linea CM per regolare il tempo di esposizione. Anche se questo è un primo approccio utile, questo dovrebbe essere ottimizzato nel tempo.
  2. Scegli la durata dell'esperimento e gli intervalli in cui le immagini verranno acquisite. Gli esperimenti normalmente durano tra 30-60 min a seconda di quale fase del trasporto glimphatico è di interesse. Per la maggior parte degli esperimenti sono sufficienti frequenze di fotogramma di 1 fotogramma/min e velocità.
  3. Impostare il nome del file e la directory di salvataggio.
  4. Se l'imaging sarà raccolto in aggiunta all'acquisizione simultanea di altre variabili (ad esempio, elettrocardiogramma, pressione sanguigna arteriosa, elettrofisiologia), il macroscopio e la pompa possono essere programmati per essere attivati con il software di acquisizione dati. Verificare che la funzione di attivazione sul macroscopio sia corretta prima di passare al passaggio successivo.

6. Esperimento transcranica di imaging ottico

  1. Avviare l'infusione del tracciante e l'imaging allo stesso tempo.
  2. Controllare regolarmente la cannula CM e il tubo PE10 per eventuali segni di una perdita. Se c'è qualche tracciante che perde al CM, i risultati di questo esperimento devono essere esclusi.
    NOTA: Se il tracciante inizia ad accumularsi nel cervelletto e non percorre il percorso glimphatico dell'MCA, è probabile che la cannula CM sia stata iniettata nel cervelletto. Questi dati non devono essere inclusi.
  3. Per gli esperimenti acuti, dopo il completamento dell'esperimento, rimuovere il mouse dal microscopio e verificare che sia ancora adeguatamente anetizzato. Decapitare rapidamente il topo e raccogliere il tessuto cerebrale. Immersione-correggere il cervello in 4% paraformaldeide (PFA) durante la notte a 4 gradi centigradi.
    1. Per esperimenti cronici, una volta completata l'imaging, rimuovere la linea CM dalla cannula, lavare con aCSF sterile e ricucire la cannula CM con una punta di cautery ad alta temperatura. Togliere il mouse dal supporto della testa e riportarlo alla sua gabbia. Ripetere questo processo fino a quando non sono necessarie ulteriori immagini, quindi seguire il passaggio 6.3.

7. Analisi dei dati

NOTA: le analisi basate su Matlab, come il front-tracking CSF, possono estrarre grandi quantità di dati quantitativi dai fronti traccianti in questi set di dati di imaging10,22. Tuttavia, questi tipi di file possono anche essere facilmente importati e analizzati in software di analisi delle immagini open-source come Fiji23.

  1. Importate le pile di immagini in Figi utilizzando lo strumento di importazione Bioformati. Questa funzione manterrà i metadati del file che includono il tempo e la risoluzione dei pixel. Salvare la pila di immagini come file .tiff.
  2. Disegnare manualmente una regione di interesse (ROI) intorno al cranio o all'area di interesse utilizzando lo strumento di selezione poligono. Ad esempio, nella Figura 1G un ROI è stato disegnato separatamente per l'ipsilaterale e per l'emisfero contralaterale dopo una lesione cerebrale traumatica. Assicurarsi di aggiungere il ROI in Gestione ROI (Analizza>Strumenti>Gestione ROI) e salvarlo.
    NOTA: il trasporto CSF può essere quantificato in due modi principali: 1) intensità media di fluorescenza nel tempo o 2) area di afflusso espressa come percentuale del ROI o dell'area totale (mm2) dopo aver applicato una soglia. Quest'ultimo metodo (Figura 1H) verrà descritto nei passaggi successivi.
  3. Impostare la soglia sul fotogramma con fluorescenza massima (Seleziona immagine>Regola>Soglia...). I metodi di soglia automatizzati come Otsu sono normalmente bravi a rilevare il tracciante CSF. Applicare la soglia.
  4. Prima di andare avanti, assicurarsi che in Analizza>Imposta misurazioni siano selezionate le opzioni Area e Frazione area. Quindi, in Gestione ROI selezionare Altro>Multi Misura.
  5. Convertire il valore %Area in mm2 utilizzando il valore Area del ROI dell'output. I valori %Area riflettono la percentuale della superficie corticale dorsale con il tracciante CSF.
  6. Stampa l'afflusso del tracciante CSF in mm2 in funzione del tempo.

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Representative Results

L'afflusso di CSF è rappresentato su un macroscopio epifluorescente (Figura 1A), che consente l'imaging mesoscopico del trasporto tracciante CSF nella corteccia murina. La piastra della testa integrale permette la visualizzazione delle ossa nasali rostrali, sia ossa frontali che parietali al centro, e la porzione rostrale dell'osso interparietale caudally (Figura 1B). Durante l'imaging, le suture nasofrontale, sagittale, coronale e lambdoid possono essere facilmente identificate (Figura 1C). Una volta che inizia l'infusione di tracciante CSF nel CM (Figura 1D), la fluorescenza tracciante è vista per la prima volta in grandi pozze di CSF subaracnoide alla cisterna basale, cisterna olfattiofrontal, e la cisterna quadrigeminale vicino alla pausa pineale (Figura1E , a sinistra). I tracciatori CSF entrano quindi nel cervello lungo gli spazi pericolari dei rami corticali dell'arteria cerebrale centrale (MCA) (Figura 1E, destra).

L'imaging ottico transcranico può essere utilizzato per studiare la funzione gliantica dopo lesioni cerebrali traumatiche (TBI)3. I topi hanno ricevuto un TBI moderato e subito dopo un tracciante CSF fluorescente (BSA-647) è stato iniettato nel CM24. Il trasporto CSF è stato imageato per 60 min dopo TBI (Figura 1F). L'imaging macroscopico mostra che il tracciante è visto per la prima volta alla cisterna olfattiofrontale ma l'afflusso glimphatico lungo i PVS corticali è completamente abolito sul lato del TBI (Figura 1G, Supp. Film 1). L'effetto inibitorio della TBI sulla funzione glimphatatica è stato dimostrato utilizzando diversi altri metodi di quantificazione del tracciante e potrebbe essere alla base della relazione tra la TBI e l'accumulo di A e tau visto dopo la lesione3. L'analisi quantitativa delle immagini in vivo mostra che l'area di afflusso ipsilaterale è diminuita di quasi un terzo rispetto all'emisfero contralaterale (Figura 1H).

Figure 1
come illustrato nella Figura 1. Imaging macroscopico transcranico. (A) Schematico dell'imaging macroscopico impostato. (B) Vista dorsale della posizione della piastra della testa sul cranio. L'osso interparietale e le ossa nasali, frontali e parietali sono tutte visibili. (C) Un cranio di topo esposto durante l'imaging prima che sia apparso il tracciante CSF, mostrando chiaramente tutte le suture craniche del cranio intatto. Barra della scala: 1 mm (D) Schema di una vista laterale del tracciante CSF che entra nella cisterna magna (CM) e viaggia dalla cisterna basale lungo il percorso glimphatico. (E, pannello sinistro) Imaging macroscopico dell'afflusso glimphatico in un topo amatrice-xlazina anestetizzato a 20 minuti dopo l'iniezione CM (BSA-647; 10 l a 2 l/min). Il tracciante CSF è visto nella cisterna olfattiva intorno alla vena di rinoceronte rostrale sotto la sutura nasofrontale, lungo alcune parti del seno sagittale superiore sotto la sutura sagittale, e nella cavità pineale che circonda il seno trasversale sotto il lambdoid sutura. (E, pannello a destra) L'ingrandimento digitale dell'immagine a sinistra mostra l'alta risoluzione spaziale ottenuta con questi microscopi. il tracciante CSF viaggia all'interno degli spazi perivascolari dell'arteria cerebrale media (MCA)10. Barra della scala: 0,5 mm (F) Sequenza temporale sperimentale. Un topo wildtype acuito ha ricevuto una lesione cerebrale traumatica moderata (TBI)24 e subito dopo un'iniezione di CM (BSA-647; 10 -L a 2 l/min), seguito da 60 min di imaging macroscopico. (G) Immagini time-lapse del trasporto tracciante CSF dopo Il TBI (linea tratteggiata). Barra della scala: 1 mm (H) Area di afflusso (mm2)su ogni emisfero durante l'esperimento di 60 min, quantificata dai ROI in (G), l'emisfero che ha ricevuto TBI (ipsilaterale) e l'emisfero che non ha (contralaterale). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1. Blueprint di piastra di testa personalizzata. (A, B) Misure esatte (in mm) della piastra di testa personalizzata utilizzata nel protocollo di imaging macroscopico transcranico. Schemi 3D di una piastra di testa scavata (C) e di un'intera piastra di testa (D). Fare clic qui per scaricare questo file.

Filmato supplementare 1. L'imaging time-lapse del trasporto CSF dopo una lesione cerebrale traumatica moderata all'osso parietale sinistro. Durata: 60 min. Barra della scala: 1 mm Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Abbiamo descritto un protocollo dettagliato per l'esecuzione di imaging TRANScranico CSF in topi vivi utilizzando macroscopi fluorescenti e traccianti fluorescenti disponibili in commercio. Questa tecnica è semplice e minimamente invasiva, ma quantitativa. L'imaging in vivo è ben correlato con metodi sensibili come il conteggio della scintillazione liquida di traccianti con etichetta radio, tra cui 3H-dextran e 14C-inulin dopo la consegna CM, e con la quantificazione della sezione coronale ex vivo10, 18. La convalida con microscopia a due fotoni dimostra che i traccianti CSF osservati lungo i vasi sanguigni corticali sotto il macroscopio si trovano principalmente all'interno degli spazi perivascolari dell'MCA e dei suoi rami10. Questi percorsi di afflusso CSF sono una componente critica del sistema glimphatico19. Anche se non coperti da questo protocollo, questi set-up possono essere utilizzati anche per l'immagine di percorsi di gioco CSF come i linfatimenici e cervicali25,26.

I miglioramenti nella progettazione delle lastre di testa consentono l'imaging cronica, stabile e ampio campo dello stesso mouse nel tempo. La forma, le dimensioni e il peso della piastra della testa possono essere adattati per ogni applicazione specifica. Con i progressi nel taglio laser e nella stampa 3D, ci sono poche limitazioni per quanto riguarda le specifiche. La placcatura della testa consente anche l'imaging longitudinale di animali anestesio o sveglio e la capacità di immagine attraverso un cranio intatto evita la neuroinfiammazione e l'edema associati al posizionamento di finestre craniche o sottili del cranio27, 28 mi la più del 24 , 29.Questo è un vantaggio importante dal momento che la consegna stereotassica di traccianti fluorescenti attraverso la corteccia nello striato o ventricoli laterali utilizzando un foro di burra cranica ridurre notevolmente la funzione glianziale20,26. Le grandi distanze di gantry e di lavoro della maggior parte dei macroscopi commerciali consentono di fissare i topi allo stadio in varie configurazioni, tra cui ruote scorrevoli o labirinti galleggianti. I topi possono essere addestrati e abituati ad essere fissati alla testa allo stadio del microscopio durante il periodo di recupero di 5-7 giorni per facilitare l'imaging sveglio30.

Una delle principali limitazioni di questo metodo è la bassa profondità di penetrazione del macroscopio rispetto alla microscopia a due fotoni10. Questo dispositivo è in grado di risolvere solo pochi millimetri della superficie corticale sotto il cranio intatto. Tuttavia, mentre questo limita l'imaging dei processi che si verificano più in profondità nel tessuto, generalmente non è un problema per le analisi glimphatiche poiché le principali vie di ingresso si trovano principalmente intorno alle arterie principali della superficie corticale dorsale. Nonostante non siano in grado di risolvere strutture più profonde, i macroscopi con telecamere CMOS scientifiche ad alta efficienza hanno un grande rilevamento della fluorescenza; nonostante il tracciante non sia localizzato sulla superficie del cervello, l'intensità totale della fluorescenza è correlata alla quantità di tracciante trovata nel cervello ad ogni momento dopo l'inizio dell'iniezione CM10. Questi parametri sono migliorati dall'uso di traccianti di lunghezza rossa, vicino all'infrarosso o infrarossi poiché l'imaging a queste lunghezze d'onda più lunghe riduce l'auto-fluorescenza dei tessuti e la dispersione della luce, e hanno un rapporto segnale-rumore superiore rispetto alle emissioni inferiori fluorofori di lunghezza d'onda. Il macroscopio standard consente l'imaging di più di un tracciante nello stesso esperimento. A seconda della configurazione del macroscopio, la torretta del filtro deve ruotare tra le acquisizioni, riducendo drasticamente la risoluzione temporale che si può ottenere. Questo può essere migliorato con l'uso di LED regolabili e un cubo di filtro multibanda. Nonostante questo miglioramento, l'imaging multicanale non è realmente simultaneo, poiché c'è un ritardo nell'acquisizione mentre il LED passa tra le lunghezze d'onda dell'eccitazione. È possibile ottenere immagini a doppio canale simultanee utilizzando ottiche di divisione delle immagini compatibili con la maggior parte delle impostazioni macroscopiche; tuttavia, questi sacrificano la risoluzione spaziale dividendo la risoluzione completa della fotocamera CMOS (2048 x 2048 pixel) in due campi visivi con metà della risoluzione (1024 x 1024 pixel). Mentre le telecamere CMOS sono abbastanza adeguate per questo utilizzo, l'uso di una fotocamera CCD può essere applicato anche a questa applicazione. Un ulteriore fattore che riduce la risoluzione temporale è il tempo di esposizione necessario per un'adeguata eccitazione del fluoroforo scelto, che normalmente varia tra 50 - 1000 ms. Questo può essere ulteriormente ottimizzato utilizzando il binning di pixel 2x2 o 4x4, che riduce il tempo di esposizione e aumenta la frequenza dei fotogrammi, a scapito della risoluzione spaziale. Nonostante queste limitazioni, l'imaging multicanale macroscopico transcranico è in grado di raggiungere frequenze di fotogrammi comprese tra 10-20 Hz con alta risoluzione spaziale.

Recenti esempi nell'imaging macroscopico transcranico hanno usato l'acquaporina-4 (AQP4) buttare fuori i topi10,20 e il fattore di crescita derivato dalle piastrine B (PDGF-B) i topi knockout22 per dimostrare l'importanza dell'AQP4 e PDGF-B nel sistema glimphatico. Gli studi hanno utilizzato i topi wildtype C57Bl6 per confrontare con le linee del topo knockout. Hanno immaginato transcranicamente i topi per una durata di 30 min utilizzando traccianti fluorescenti e i risultati hanno concluso che le linee knockout avevano ridotto drasticamente l'afflusso di CSF rispetto ai tipi selvatici.

Queste proprietà rendono l'imaging ottico transcranico una tecnica ideale per studiare il trasporto di CSF, in particolare tra 2 o più coorti di animali. Permette misurazioni della cinetica tracciante intracisternale nei topi vivi a una risoluzione in scala di micron, ad una frazione del costo di altre modalità di imaging in vivo. Questa tecnica permette lo studio del sistema glimphatico in modo fisiologico, non invasivo, ed è stata utile per aiutare a chiarire alcuni dei fattori che regolano la sua funzione in salute e malattia10,20,25 . Tuttavia, il suo attributo più eccitante è il suo potenziale per rispondere a domande future sull'idrodinamica del CSF.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke e dal National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 e RF1AG057575 a MN), il programma Fondation Leducq Transatlantic Networks of Excellence e il programma di ricerca e innovazione EU Horizon 2020 (n. 666881; SVDs-target). Ringraziamo anche Dan Xue per l'assistenza di esperti con illustrazioni grafiche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Bupivacaine HCl University of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock Hamilton Company 81020
A-M Systems Dental Cement Powder Fisher Scientific NC9991371
Carprofen University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine Prevantics B10800
CMOS Camera Hammamatsu ORCA Flash 4.0
Head Plate University of Rochester No catalog # Custom made at the machine shop at the University of Rochester
High-Temperature Cautery Bovie Medical Corporation AA01
Insta-set Accelerator Bob Smith Industries BSI-151
Isoflurane - Fluriso Vet One 502017 University of Rochester Vivarium
Ketamine Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue Elmer's Products, Inc No catalog #, see link in comments https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tape Fisher Scientific 19-027-761
Paraformaldehyde Sigma-aldrich P6148
PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous Braintree Scientific PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe Harvard Apparatus 70-4501
PURALUBE VET OINTMENT Dechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks Fisher Scientific 22-029-553
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
Simple Head Holder Plate (for mice) Narishige International USA Inc MAG-1
Single-use Needles, BD Medical VWR BD305106
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher Scientific 22-363-750
Tunable LED PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine University of Rochester Vivarium

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