İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Transkraniyal optik görüntüleme, canlı fareler korteks içinde sağlam bir kafatası ile beyin omurilik sıvı taşımacılığı geniş alan görüntüleme sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sweeney, A. M., Plá, V., Du, T., Liu, G., Sun, Q., Peng, S., Plog, B. A., Kress, B. T., Wang, X., Mestre, H., Nedergaard, M. In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59774, doi:10.3791/59774 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kemirgenlerde beyin omurilik sıvısı (CSF) akışı büyük ölçüde izleyiciler ex vivo ölçülme kullanılarak incelenmiştir. İki foton mikroskopisi ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi teknikler, CSF akışının in vivo ölçümlemesini sağladı, ancak sırasıyla azaltılmış görüntüleme hacimleri ve düşük uzamsal çözünürlük ile sınırlıdır. Son çalışmalar, CSF 'nin, kemirgen korteksinin pial ve penetran arterlerini çevreleyen perivasküler alanların ağ üzerinden beyin parankimesi girdiğini buldu. Bu perivasküler CSF girişi, glikmiyatik sistemin primer bir sürücüsüdür, toksik metabolik solakların (örn. amiloid-β) temizlenmesinden oluşan bir yol. Burada, floresan CSF izleyicilerini canlı farelerin bozulmamış kafatası ile gerçek zamanlı, mezoskopik görüntüleme sağlayan yeni bir makroskopik görüntüleme tekniği göstermektedir. Bu minimal invazif yöntem, çok sayıda deneysel tasarımı kolaylaştırır ve CSF dinamiklerinin tek veya tekrarlanan testlerini sağlar. Makroskoplar yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüğe sahiptir ve büyük Portal ve çalışma mesafesi davranışsal cihazlarda görev yaparken görüntüleme için izin verir. Bu görüntüleme yaklaşımı, bu teknikten elde edilen iki foton görüntüleme ve floresan ölçümleri ile güçlü bir şekilde ex vivo floresans ve radyo etiketli izleyicileri ölçmek ile ilişkilendirilir. Bu protokolde, canlı farelerde glymphatic taşımacılığı değerlendirmek için Transkraniyal makroskopik görüntülemenin nasıl kullanılabilen olduğunu tarif ediyoruz, daha pahalı görüntüleme yöntemleri için erişilebilir bir alternatif sunuyor.

Introduction

Beyin omurilik sıvısı (CSF) beyinleri ve omuriliği yıkanır ve homeostaz bakımını, besin temini ve intrakranial basıncı düzenleyen1. Subaraknoid uzayda CSF perivasküler boşluklar bir ağ ile beyin girer (PVS) kortikal pial arterlerin çevreleyen ve sonra nüfuz arteriyoller boyunca aşağı akar2. Bir kez parankimat, interstisyel sıvı ile CSF değişimleri (ISF), düşük direnç beyaz madde yolları ve perivenöz alanlar ile beynin dışında amiloid β (Aβ) ve Tau protein agrega gibi zararlı metabolitleri taşıyan2,3 . Bu yol astroglial Aquaporin-4 (AQP4) kanallarına bağlıdır ve bu nedenle glial-lenfatik (glymphatic) sistemi4olarak adlandırılır. Nörofobik atık ürünleri sonunda kraniyal sinirlerin yakınındaki lenfatik damarlardan ve servikal lenf nodlarına doğru meninglerin üzerinden CSF-ıSF ' d a k i temizlenir5. Bu sistemin başarısızlığı, Alzheimer hastalığı6,7, travmatik beyin hasarı3, iskemik ve hemorajik inme8gibi çeşitli nörolojik hastalıklarda karışmıştır.

CSF taşımacılığı, (cm)9,10 ve geçmişte glymphatic çalışmalar özellikle iki foton mikroskopisi4,11,12kullanılmış olan Cisterna içinde izleyicileri infaklama tarafından görselleştirilebilir 13, manyetik rezonans görüntüleme (MRG)14,15,16,17, ve ex vivo görüntüleme3,6,11, 18 . Tracer kinetiği değerlendirmek için. İki foton mikroskobu, PVSs 'deki CSF izleyicileri ve yüksek uzamsal çözünürlüğe bağlı olarak parankimat hakkında ayrıntılı görüntüleme için uygun bir yöntemdir, ancak dar bir bakış alanı vardır ve invaziv bir kafatası penceresi veya kafatası inceltme gerektirir. Ex vivo görüntüleme, immünhistokimya ile birlikte, tek hücrelerden tüm beyin19kadar çok düzeyli analizler sağlar. Ancak, post-mortem doku gözlemlemek için gerekli perfüzyon-fiksasyon süreci CSF akış yönünde derin değişiklikler üretir ve PVS daraltır, önemli ölçüde dağılımı ve izleyicinin konumunu değiştiren12. Son olarak, MRI tüm murine ve insan beyni boyunca CSF akışını izleyebilirken, perivasküler akışın uzamsal ve temporal çözünürlüğüne sahip değildir.

Yeni bir teknik, Transkraniyal makroskopik görüntüleme, canlı farelerin tüm dorsal korteks perivasküler CSF taşıma geniş alan görüntüleme sağlayarak bu sınırlamalar bazı çözer. Bu tür görüntüleme, Multiband filtre küpü, ayarlanabilir LED ışık kaynağı ve yüksek verimli CMOS Kamera10kullanarak bir epifloresan makrokapsam ile yapılır. Bu set-up 1-2 kadar PVSs çözmek edebiliyoruz kafatası yüzeyinin altında mm ve kortikal yüzeyin 5-6 mm kadar fluorophores tespit edebilir kafatası tamamen bozulmamış bırakarak10. Çok bantlı filtreler ve hızlı bir şekilde ayarlanabilir LED 'Ler, CSF 'nin aynı denemede farklı moleküler ağırlıklar ve kimyasal özelliklerin izleyicileri ile etiketlenmesine olanak tanıyan birden fazla fluorophorenin kullanımını sağlar.

Bu prosedür, kafatası ortaya çıkarmak için basit ve minimal invazif bir cerrahi gerektirir ve görüntüleme oturumu sırasında başını stabilize etmek için hafif bir baş plaka yerleştirin. İzleyiciler, kafatası delme veya pipetler veya kanüller ile kortikal doku penetran olmadan cm içine teslim edilebilir9,20. Hem CM kanüller hem de baş plakaları birkaç gün boyunca istikrarlı kalır ve klasik son nokta görselleştirmesine kıyasla daha karmaşık Deneysel tasarımlar kolaylaştırır. Bu protokol, floresan CSF izleyicilerin akut veya kronik enjeksiyonunu takiben anestezik/uyku veya uyanık farelerin CM 'ye doğru, glikmiyatik sistem fonksiyonunu incelemek için Transkraniyal makroskopik görüntülemenin nasıl kullanıldığını açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler, Rochester Üniversitesi 'nde hayvan kaynakları (UCAR, protokol No. 2011-023) üniversite Komitesi tarafından onaylandı ve Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NıH Kılavuzu 'na göre gerçekleştirilir.

1. sarnka Magna kanül, baş plaka ve baş tutucu hazırlanması

  1. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri ve kafa plakalarını sterilize edin.
    Not: floresan izleyiciler doğrudan CSF içine bir sarnısı Magna kanülasyon yoluyla teslim edilir. Bu yordamla ilgili ayrıntılı talimatlar için lütfen Xavier ve Al9' a bakın.
  2. Kısaca, bir iğne sürücüsü kullanarak, bir 30G x 12,7 mm (1/2 inç) iğne, aşağı yol 3/4 ucu kırmak ve polietilen 10 (PE10) boru (yaklaşık 45 cm uzunluğunda) bir ucuna iğne künt ucunu yerleştirin. Sadece eğim PE10 boru kenarlığının dışarı çıkıntılı emin olun.
  3. Break off 1/4 başka bir 30G iğne eğimli ucunu ve PE10 tüp diğer ucuna kalan iğne künt ucunu yerleştirin, plastik Luer-Lock hala bağlı.
  4. 100 μL cam şırıngayı steril, suni CSF (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2Po4, 2 mm MgSO4, 2 mM CAcl2, 10 mm glikoz ve 26 mm NaHCO3) ile doldurun.
  5. Şırıngayı çizginin sonuna takın ve eğimli iğne ucuna ulaşıncaya kadar aCSF ile doldurun. Bir hava sütunu değişken infüzyon hacimlere daha eğilimli olduğu için şırınga, hava değil, aCSF ile geri doldurulur önemlidir.
  6. Kronik deneyler için, hattı aCSF ile dolu bırakın ve adım 1,7 atlayın.
  7. Akut deneyler için, şırınga bir infüzyon pompası üzerine yerleştirin ve yaklaşık 5 mm hava çekme, hangi karıştırma önleyecek. Daha sonra, deneme için istenen toplam izleyici hacmini (ölü alan kayıpları nedeniyle% 20 ekstra tavsiye edilir) geri çekin.
    Not: PE10 boru yeterince uzun olmalıdır böylece hava balonu Tracer yüklerken cam şırınga plastik manşet girmez. Tipik bir deney için, protokol Alexa Fluor 647 (BSA-647) ile% 0,5 ' de acsf seyreltilmiş 10 μL Sığır serum albümin kullanır.
  8. Baş plakasının baş tutucuya uyduğunu ve kullanılan fare için doğru boyutta olduğunu onaylayın. Anatomik belirteçler bu sağlamak için: pencerenin üst sınır interoküler hattı ile hizalar ve posterior sınır oksipital arması rostral düşüyor.
    Not: Paslanmaz çelik kafa plakaları sterilize edilmiş ve yeniden kullanılabilir. Çoğu siyanoakrilat karışımı, bir aseton çözeltisi ile çıkarılabilir.

2. cerrahi prosedür

  1. Tartmak ve fare anestezize (örneğin ketamin/xylazine; 100 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazine; ı.g).
  2. Fare artık bir ayak çimdikine yanıt verdikten sonra, boyun ve kafa steril su ile nemlendirin ve Clippers kullanarak tıraş. Bir kez alan traş, herhangi bir kalıntı saç kaldırmak için tekrar bir alkol çubukla ile alanı silin.
    Not: kırpmadan önce kürk nemlendirme, kesi sonrasında görüntüleme penceresindeki saç miktarını önemli ölçüde azaltır.
  3. Fare, sıcaklık kontrollü bir Pad üzerine bir stereotaktik çerçevede yerleştirin ve onlar kuruması sağlamak için fare gözlerine petrol oftalmik merhem uygulayın.
  4. Bir klorheksidin Swab ile maruz cilt temizleyin. 2 dakika sonra, bir alkol silme ile klorhekidin çıkarın. Son olarak, kurumaya bırakılabilen iyot çözeltisi uygulayın.
  5. Kafatası ve boyun üstüne subkutan analjezi (0,25% Bupivacaine HCl) enjekte.
  6. Boynun oksipital arması kapsayan kısmından başlayarak, aşırı deri içinde bir orta çizgi kesim yapmak ve Interorbital hat doğru rostrally devam. Geçici kas kafatasına ekler sınırına yanal incise. Hem frontal hem de parietal kemikleri ortaya çıkarmak için fusiform kesi tüm cilt çıkarın.
    Dikkat: arkasındaki sinüs gözleri ve posterior yüz ven büyük dalları Pinna için rostral göz kaudal yatıyor. Bu yapıları yedek kesi yaparken dikkatli olun. Bu durumda, birkaç dakika boyunca steril bir pamuklu çubukla hemostaz koruyarak kanamayı durdurun ve devam edin.
  7. Steril tuz ile kafatası irrigate ve bu görüntü kalitesi ile müdahale edecektir çünkü enkaz ve saç ücretsiz böylece yüzey pamuk bezlerden kullanarak temizleyin. Kafatası saydamlığı en iyi periost ve aşırı fasya sağlam bırakarak korunur.
    Not: Bu yapılar yanlışlıkla kaldırılırsa, kafatası zaman içinde kuru ve opak olabilir. ACSF ile yeniden nemlendirin veya akut deneylerde kafatası yansımasını azaltmak için parafin yağı ve gliserol karışımı kullanın21.
  8. Bu prosedürün cerrahi detayları için Cisterna Magna kanül eklemeye devam edin, Xavier ve Al9' a bakın.
  9. CM kanül taktıktan sonra, sınır etrafında baş plaka ventral tarafına siyanoacrylate tutkal ile diş çimento karışımı uygulayın ve böylece kafa plakasının anterior sınır burun kemik ve Po posterior ucu ile hizalar kafatası üzerine yerleştirin sterior sınır, interparietal kemik anterior yönü ile hizalanır, sagittal sütür (orta çizgi) pencere göre ortalanmış ve düz emin olmak (Şekil 1B).
  10. Tutkal Hızlandırıcı birkaç damla kullanarak baş plaka konumunu düzeltin. Çimento karışımı ile kalan boşlukları doldurun ve Hızlandırıcı ile tedavi.
    DIKKAT: siyanoakrilatenin fare gözleri ile temas etmediğini veya görüntüleme penceresini engellemesini sağlayın.
  11. Bu taşıma sırasında veya fare uyanırken ayrılmış hale gelmez emin olmak için baş plaka için CM kanül tutkal.
  12. Akut deneyler için adım 2,16 ' e geçin.
  13. Kronik deneyler için, açık kafatasına ince bir tabakalı siyanoakrilat tutkal uygulayın, bu görüntüleme müdahale edecek gibi kabarcıklar oluşturmak için dikkatli olmak. Tutkal kafatası için koruma sağlar ve görüntüleme ile müdahale etmez. Tutkal maruz kafatası kesi sınırında cilt için tüm yol kapsar emin olun.
  14. Acsf dolu PE10 tüpünü cm 'den 2-3 cm 'ye tutmak için hemostat kelepçe kullanın ve yüksek sıcaklıklı koter ucu ile çizgiyi keser. Bir kez ayrılır, kanül mühür erimiş PE10 boru Düzleştir.
    DIKKAT: kanül mühürleninceye kadar kelepçeyi serbest bırakmayın ve bir bos fistül önlemek için boru içinde hiçbir sızıntı olduğunu teyit emin olun.
  15. Karprofen Yönet (her 24 saat 3 gün boyunca 5 mg/kg; ı.y veya s.c.) ve fareyi sıcaklık kontrollü, tek Konaklı bir kafeye döndürmeniz ve görüntülemenin en az 24 saat önce kurtarmasına izin vermenizi sağlar. Sternal recumbency korumak için yeterli bilinç geri gelene kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Bozulmamış kraniyal pencereler birkaç hafta boyunca istikrarlı kalır.
    Not: kronik deney burada duraklatılabilir.
    DIKKAT: bazı postoperatif komplikasyonlar şunlardır: sefohematom/Subgaleal hematomas, bos fistül, ve enfeksiyon.
  16. Akut deneyler için, kafatasının sabit bir pozisyonda olması için fareyi baş plakasını kullanarak baş tutucuya yerleştirin. Anestezi seviyesini kontrol etmek ve fare altında bir Isıtma Pad yerleştirmek için emin olun. Fare artık makrokapsama götürülmeye hazırdır.
    DIKKAT: fareyi dikkatle bir sepetteki infüzyon pompası ile birlikte taşıma. CM kanülasyon kesilirse, İntrakraniyal basınçta bir damla neden olur ve herhangi bir CSF sızıntısı deneysel sonuçları değiştirecek.

3. fareyi görüntüleme için hazırlama

Not: protokol, görüntüleme denemesinde bir anestezize (adım 3,1 ' de başlangıç) veya uyanık (Step 3,2) faresinde gerçekleştirilecek olup olmadığına bağlı olarak değişir.

  1. Anestezize fareler
    1. Baş tutucuyu makrokapsamın aşamasına yerleştirin, şırınga pompasından CM kanuluna kadar herhangi bir bükülme olmadığından ve bu izleyici infüzyonu etkileyebileceği için gergin olmadığından emin olun.
    2. Solunum hızı ve mukoza zarlarının pembe renklenme gözlemlemek, iyi oksijenasyon gösteren. Gerekirse hidrasyon seviyesini güvenli hale getirmek için tuz subkutan enjekte edilir. Hayvan yeterli anestezize ve yeniden doz gerekirse emin olmak için kontrol edin.
    3. Makrokapsam kamerayı ve LED 'i açın ve LıVE moduna başlayın.
    4. Görüntüleme alanının büyümesini onaylamak için alanın üst kısmındaki nazofrontal sütür ve altta bulunan lambdoid sütür açıkça görüntülenebilir, sagittal sütür paralel ve görüntünün ortasına ortalanır (Şekil 1C). Yerine bir kez, bant ile makrokapsam aşamasında baş tutucu güvenli.
    5. Makrokapsama maruz kalan kafatasına odaklan. Nispeten büyük bir alan derinliğine sahip makroskoplara rağmen, fare kafatasının eğriliği sadece belirli bir alanın odaklanmasını sağlar. En iyi sonuçlar, odak uçağı, koronal sütürler posterior parietal kemiklerin lateral taraflarında bulunduğunda elde edilir.
      Not: Bu, çoğu CSF girişi oluştuğu orta serebral arterlerin (MCA) konumdur (Şekil 1D, E)10.
  2. Uyanık fareler
    1. Görüntüleme seansından önce hayvanların baş plaka cerrahisinde en az 24 saat iyileşmesi için izin verin. Daha uzun kurtarma süreleri (5-7 gün) de önerilir. Bu süre boyunca, kurtarma dönemi süresince günde 0,5-1 h için koruma tüpünde sahnede sabit kafa olmak için fareyi eğitmek.
      Not: habituation fare anestezi olmadan baş tutucuya iliştirilmesi ve gerçek deney sırasında stres ve anksiyete azaltır sağlar. Bu uygulanabilir değilse ve anestezi denemeye müdahale etmez, bir indüksiyon dozu inhale anestezik (örneğin, Isoflurane 2% at 1-2 L/min O2 debi) hızlı bir şekilde baş aşamasına fareyi eklemek için kullanılabilir.
    2. Fare baş tutucuya sabitlendikten sonra ve koruma tüpünün içinde olan Steps 3.1.1-3.1.5.

4. floresan CSF izleyiciler infüzyon

  1. Akut CM kanülasyon
    1. Adım 1,6 içinde Sarnıcı Magna yerleştirilmeden önce izleyici zaten kanül yüklendi beri, istenen oran ve hacim için infüzyon pompası ayarlayın. Rutin olarak kullanılan infüzyon paradigmaları 1-2 μL/dak 'da 5-10 μL 'dir, ancak bu parametreler belirli denemeye veya hayvanın boyutuna ve yaşına bağlı olarak ayarlanabilir.
  2. Kronik CM kanülasyon
    1. Görüntüleme oturumuna başlamadan önce, infüzyon hattını izleyicileri teslim etmek için hazırlamak üzere akut deneyler için 1.2-1.7 adımlarına uyun.
    2. Hat hazırlandıktan sonra, hemostat kelepçe kullanarak kronik CM kanülün mühürlü ucunu kesti. Adım 4.2.1 ' de hazırlanan çizginden iğne alın ve yavaşça kanül içine yerleştirin. Kelepçeyi serbest bırakın ve şırınga pompasını kullanarak, izleme elemanı CM 'de implante edilen iğneye ulaşana kadar, deney için istenen infüzyon oranıyla (örn. 2 μL/dak) CSF izleyici 'yi ilerlet.
      DIKKAT: Eğer iğne, hattı bağlarken boru üzerinden Sapırsa, iğneyi çıkarın, deldi segmenti kesip bu adımı tekrarlayın. PE10 tüpteki herhangi bir gözyaşı bir sızıntı neden olur ve deney sonuçlarını etkiler.

5. Imaging Session kurulumu

  1. İnfaşlık edilen floresan İzleyicine dayanarak, her kanal için uyarma dalga boyu ve pozlama süresini belirleyin. Zaman atlamalı görüntüleme temporal çözünürlüğünü maksimize etmek için izleyici görselleştirmek için gereken en kısa pozlama süresini seçin. Bu pozlama süresi, farklı hayvanlar arasında CSF taşımacılığı karşılaştırmak amaçlayan tüm sonraki deneyler için kullanılacaktır.
    Not: bir ipucu pozlama süresini ayarlamak için CM satırında izleyici kullanmaktır. Bu yararlı bir ilk yaklaşım olsa da, bu zaman içinde optimize edilmelidir.
  2. Denemenin süresini ve görüntülerin elde edilecek aralıklarını seçin. Deney normal olarak son 30-60 arasında en az hangi faz glymphatic taşıma ilgi olduğunu bağlı olarak. 1 kare/dak ve daha hızlı kare hızları çoğu deney için yeterlidir.
  3. Dosya adını ve kaydetme dizinini ayarlayın.
  4. Diğer değişkenlerin eşzamanlı olarak edinilmesi (örn. Elektrokardiyogram, arter kan basıncı, Elektrofizyoloji) yanı sıra görüntüleme toplanacak ise, makrokapsam ve pompa veri edinme yazılımı ile tetiklenecek şekilde programlanabilmektedir. Bir sonraki adıma geçmeden önce makrokapsamdaki tetikleyici fonksiyonunun doğru olup olmadığını kontrol edin.

6. Transkraniyal optik görüntüleme deneyi

  1. İzleyici infüzyon ve görüntüleme aynı anda başlatın.
  2. Herhangi bir sızıntı belirtisi için CM kanülünü ve PE10 tüpünü rutin olarak kontrol edin. CM 'de herhangi bir izleyici sızıntısı varsa, bu denemenin sonuçları hariç tutulmalıdır.
    Not: Tracer serebellum birikmeye başlar ve MCA glymphatic yol seyahat etmez, bu CM kanül beyine enjekte edilmiştir muhtemeldir. Bu veriler eklenmemelidir.
  3. Akut deneyler için, denemenin tamamlandıktan sonra, fareyi mikroskop 'dan çıkarın ve hala yeterli anestezinin olduğunu kontrol edin. Hızlı bir şekilde fareyi dökür ve beyin dokusunu hasat edin. 4 °c ' de bir gecede% 4 civarında formaldehite (PFA) içinde beyni onarın.
    1. Kronik deneyler için, görüntüleme tamamlandıktan sonra, cm çizgisini kanüden çıkarın, steril acsf ile yıkayın ve cm kanülünü yüksek sıcaklıklı koter ucu ile yeniden mühürleyin. Fare baş standı çıkarın ve kafesine geri dönün. Daha fazla görüntüleme gerekli değildir ve sonra adım 6,3 takip kadar bu işlemi yineleyin.

7. veri analizi

Not: CSF ön izleme gibi MATLAB tabanlı analizler, bu görüntüleme veri kümeleri10,22' de Tracer cephede büyük miktarlarda nicel veri ayıklayabilir. Ancak, bu dosya türleri de kolayca ithal ve Fiji23gibi açık kaynak görüntü analiz yazılımı analiz edilebilir.

  1. Bio-formatları içe aktarma aracını kullanarak resim yığınlarını Fiji 'ye aktarın. Bu işlev, zaman ve piksel çözünürlüğünü içeren dosya meta verilerini korur. Görüntü yığını bir. tiff dosyası olarak kaydedin.
  2. Çokgen seçim aracını kullanarak kafatası veya ilgi alanı etrafında bir ilgi bölgesi (YG) el ile çizin. Örneğin, Şekil 1G 'de, travmalı bir beyin yaralanması sonrasında ipsilateral ve kontralateral Yarımküre için ayrı bir YG çekildi. YG 'yi YG yöneticisine (Analiz > Araçları > YG Manager) eklediğinizden emin olun ve kaydedin.
    Not: CSF taşıma iki ana şekilde nicelik olabilir: 1) bir eşik uygulanmadan sonra YG veya Toplam alan (mm2) yüzdesi olarak ifade edilen zaman veya 2) aküle alanı ortalama floresan yoğunluğu. İkinci Yöntem (Şekil 1s) bir sonraki adımda açıklanmıştır.
  3. Eşik seviyesini maksimum floresan ile ayarlayın (görüntü ≫ Adjust ≫ Threshold...). Otsu gibi otomatik eşik yöntemleri normalde CSF Tracer tespit iyi. Eşik uygulayın.
  4. İleriye gitmeden önce, çözümleme ≫ ayarlama ölçümlerinde Seçenekler alanı ve alan kesiri seçili olduğundan emin olun. Sonra YG Yöneticisi'nde, daha fazla > Çoklu ölçüseçin.
  5. % Alan değerini, çıktıda YG 'nin alan değerini kullanarak mm2 olarak dönüştürün. % Alan değerleri, dorsal kortikal yüzeyin yüzde 'ini CSF Tracer ile yansıtır.
  6. Zaman fonksiyonu olarak mm2 ' de CSF Tracer akını arsa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CSF akım bir epifloresan makrokapsam üzerinde görüntülenmiş (Şekil 1a), murine korteks içinde CSF Tracer taşıma mezoskopik görüntüleme için izin verir. Tüm kafatası kafa plakası, rostral burun kemiklerinin, hem ön hem de parietal kemiklerinin merkezinde ve interparietal kemiğin rostral kısmının (Şekil 1B) görselleştirilmesine izin verir. Görüntüleme sırasında, nasofrontal, sagittal, koronal ve lambdoid sütürler kolayca tespit edilebilir (Şekil 1C). CSF Tracer 'ın cm 'ye infüzyon işlemi başladıktan sonra (Şekil 1D), ilk önce bazal Sarnıcı, olfactofrontal sarnıç subaraknoid CSF büyük havuzlarında ve epifiz girinti yakınındaki quadrigeminal Sarnıcı görülür (Şekil 1e , sol). CSF izleyiciler daha sonra orta serebral arter kortikal pial dalları perivasküler alanlar boyunca beyin girin (MCA) (Şekil 1E, sağ).

Transkraniyal optik görüntüleme, travmatik beyin yaralanması (TBı)3sonra glymphatic fonksiyonunu incelemek için kullanılabilir. Fareler ılımlı bir TBı aldı ve hemen sonra bir floresan CSF Tracer (BSA-647) CM24enjekte edildi. CSF taşımacılığı TBı 'dan sonra 60 dk (Şekil 1F) için görüntülenmiş. Makroskopik görüntüleme, izleyici 'nin ilk olarak olfactofrontal Sarnıç olarak görüldüğü, ancak kortikal PVSs boyunca glymphatic akının tamamen TBı 'ın tarafında ortadan kaldırılıp (Şekil 1G, Supp. film 1) olduğunu gösterir. TBı 'ın glymphatic fonksiyon üzerinde inhibe edici etkisi, diğer çeşitli izleyici ölçülebilirleştirme yöntemleri kullanılarak gösterilmiştir ve TBı ile Aβ ve Tau birikimi arasındaki ilişkiyi3. In vivo görüntülerin nicel analizi, ipsilateral akmak alanının kontralateral Yarımküre (Şekil 1s) ile karşılaştırıldığında neredeyse üçüncü azaldığını göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1. Transkraniyal makroskopik görüntüleme. (A) makroskopik görüntüleme şeması ayarlandı. (B) kafatasının baş plakasının konumunun dorsal görünümü. İnterparietal kemik ve burun, frontal, ve parietal kemikler görünür. (C) CSF Tracer önce görüntüleme sırasında bir maruz fare kafatası, açıkça bozulmamış kafatası tüm kranial sütürler gösteren ortaya çıkmıştır. Ölçek çubuğu: 1 mm (D) ŞEMATIK CSF Tracer, sarnıç Magna (cm) girerek ve bazal Sarnıcı glymphatic yol boyunca seyahat lateral görünümü. (E, sol panel) Bir ketamin-xylazine anestezikleştirilmiş wildtype faresinde (2 μL/dak) 20 dakika sonrası CM enjeksiyonu (BSA-647; 10 μL) içinde glymphatic akımını makroskopik olarak görüntüleme. CSF Tracer, nazofrontal sütür altındaki rostral rinal ven etrafında olfactofrontal sarnıç görülür, sagittal sütür altında üstün sagittal sinüs bazı bölümleri boyunca, ve lambdoid altında enine sinüs çevreleyen epifiz girinti Dikiş. (E, sağ panel) Sol tarafta görüntünün dijital büyütme bu mikroskoplar ile elde edilen yüksek uzamsal çözünürlüğü gösterir. CSF Tracer orta serebral arter perivasküler alanlar içinde seyahat (MCA)10. Ölçek çubuğu: 0,5 mm (F) deneysel zaman çizelgesi. Anestezize edilmiş bir joker fare, orta derecede travmatik beyin hasarı (TBı)24 ve bir cm enjeksiyonu (BSA-647; 2 μL/dak 'Da 10 μL) ve ardından 60 dk makroskopik görüntüleme aldı. (G) TBI (kesikli hat) sonra CSF Tracer taşıma zaman atlamalı görüntüler. Ölçek çubuğu: 1 mm (H) akıux alanı (mm2) 60-min deney sırasında her Yarımküre üzerinde, Rois (G), TBI (ipsilateral) ve (kontralateral) vermedi Yarımküre alınan Yarımküre gelen nicelik. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1. Özel kafa plakası planı. (A, B) Transkraniyal makroskopik görüntüleme protokolünde kullanılan özel baş plakasının tam ölçümleri (mm cinsinden). 3 boyutlu bir baş plaka (C) ve tüm baş plaka (D) 3D şemaları. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Ek film 1. Sol parietal kemik orta travmatik beyin yaralanması sonra CSF taşıma zaman atlamalı görüntüleme. Süre: 60 min. ölçek çubuğu: 1 mm bu dosyayı Indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ticari olarak mevcut floresan makroskopları ve izleyiciler kullanarak canlı farelerde Transkraniyal CSF görüntüleme yapmak için ayrıntılı bir protokol tarif ettik. Bu teknik basit ve minimal-invaziv, henüz nicel. In vivo görüntüleme, CM tesliminden sonra 3H-dextran ve 14C-inulin ve ex vivo koronal kesit ölçümü10' da dahil olmak üzere radyo etiketli izleyicileri sıvı scintbrilasyon sayımı gibi hassas yöntemlerle de ilişkilendirir. 18 yaşınakadar. İki foton mikroskopisi ile doğrulama, makrokapsam altında kortikal kan damarlarında görülen CSF izleyicilerinin öncelikle MCA 'nın perivasküler alanları ve dallarının10içinde bulunduğunu göstermektedir. Bu CSF ınlow yolları glymphatic sisteminin kritik bir bileşenidir19. Bu protokol kapsamında olmasa da, bu set-up da meningeal ve servikal lenfatik25,26gibi CSF boşluk yolları görüntü için kullanılabilir.

Baş plaka tasarımında gelişmeler, zaman içinde aynı farenin kronik, istikrarlı ve geniş alan görüntülemesini sağlar. Baş plaka şekli, boyutu ve ağırlığı her özel uygulama için uyarlanmış olabilir. Lazer kesme ve 3D baskı gelişmeler ile, özellikleri için birkaç sınırlamalar vardır. Kafa kaplama da anestezik veya uyanık hayvanların boyuna görüntüleme ve sağlam bir kafatası ile görüntü yeteneği sağlar nöroinflamasyon ve ödem kranial veya ince kafatası pencereleri27yerleştirme ile ilişkili önler, 28 , 29. Bu, flüoryal bir kraniyal Burr delik kullanarak striatum veya lateral ventriküllerin içine korteks aracılığıyla floresan izleyiciler stereotaktik teslim beri önemli bir avantajdır büyük ölçüde glymphatic fonksiyonunu azaltmak20,26. En ticari makroskopların büyük Portal ve çalışma mesafeleri fareler, koşu tekerlekleri veya yüzen labirentine dahil olmak üzere çeşitli konfigürasyonlarda sahneye sabitlenmesine izin verir. Fareler eğitilebilir ve uyanık görüntüleme30kolaylaştırmak için 5-7 günlük kurtarma süresi sırasında mikroskop aşamasında sabit kafa olmak habituated.

Bu yöntemin temel sınırlamalarından biri, iki foton mikroskobu10' a kıyasla makrokapsama ait düşük penetrasyon derinliğidir. Bu cihaz, sağlam kafatası altında kortikal yüzey sadece birkaç milimetre çözme yeteneğine sahiptir. Ancak bu, dokuda daha derin ortaya çıkan süreçlerin görüntülemesinde sınırlar iken, giriş büyük rotaları öncelikle dorsal kortikal yüzeyin ana arterlerin etrafında yer alan bu yana gliserin analizleri için genellikle bir sorun değildir. Daha derin yapıları çözemeymeye rağmen, yüksek verimli bilimsel CMOS kameralar ile makroskoplar büyük floresan algılama vardır; izleyicinin beyin yüzeyinde bulunmasına rağmen, toplam floresan yoğunluğu CM enjeksiyon10' dan sonra her zaman noktasında beynin bulunan İzleyici miktarı ile ilişkilidir. Bu parametreler, çok kırmızı, yakın kızılötesi veya kızılötesi izleyici kullanımı ile geliştirildi, bu uzun dalga boylarında görüntüleme doku otomatik floresans ve ışığın saçılmasını azaltır ve daha düşük emisyona göre üstün bir sinyal-gürültü oranına sahiptir dalga boyu fluorophores. Standart makrokapsam aynı denemede birden fazla izleyici görüntüleme sağlar. Makrokapsam konfigürasyonuna bağlı olarak, filtre tareti alımlar arasında döndürmek, elde edilebilir zamansal çözünürlüğü büyük ölçüde azaltmak zorunda. Bu ayarlanabilir LED 'Ler ve multiband filtre küpü kullanımı ile iyileştirilebilir. Bu iyileştirmeye rağmen, çok kanallı görüntüleme gerçekten eşzamanlı değildir, çünkü satın alma sırasında bir gecikme olduğu için LED uyarma dalga boyları arasında geçiş yapar. En makroskopik ayarlarla uyumlu görüntü bölme optik kullanarak eşzamanlı çift kanallı görüntüleme elde etmek mümkündür; Ancak, bu kurban uzamsal çözünürlüğü, CMOS kameranın tam çözünürlüğünü (2048 x 2048 piksel) yarım çözünürlüğe sahip iki görüş alanına (1024 x 1024 piksel) bölüyor. CMOS kameralar bu kullanım için oldukça yeterli olmakla beraber, bu uygulamaya bir CCD kamera kullanımı da uygulanabilir. Temporal çözünürlüğü azaltan ek bir faktör, normalde 50-1000 ms arasında değişen seçilen fluorophore için yeterli uyarılma için gereken pozlama süresi. Bu, 2x2 veya 4x4 piksel binning kullanılarak daha da optimize edilebilir, bu da Pozlama süresi ve uzamsal çözünürlük pahasına kare hızını artırır. Bu sınırlamalara rağmen, Transkraniyal makroskopik çok kanallı görüntüleme, 10-20 Hz arasında yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip kare hızları elde etme yeteneğine sahiptir.

Transkraniyal makroskopik görüntülemede son örnekler Aquaporin-4 (AQP4) fareler10,20 ve trombosit türeyen büyüme faktörü B (PDGF-B) tutma motif nakavt fare22 ' nin önemini göstermek için kullandı AQP4 ve PDGF-B glymphatic sistemi. Çalışmalar, nakavt fare çizgilerini karşılaştırmak için C57Bl6 wildtype fareler kullanılır. Bunlar, floresan izleyicileri kullanarak 30 dakikalık bir süre boyunca fareler tarafından görüntülenmiş ve sonuçlar, nakavt çizgilerinin wildtypes ile karşılaştırıldığında CSF akını önemli ölçüde azaltmış olduğu sonucuna varmıştır.

Bu özellikler Transkraniyal optik görüntüleme, özellikle 2 veya daha fazla hayvan Kohortlar arasında CSF taşıma çalışması için ideal bir teknik olun. Diğer in vivo görüntüleme modalitelerinin maliyetinin bir kısmını, mikron ölçekli çözünürlükte canlı farelerde intracisternal Tracer kinetiği ölçümlerine izin verir. Bu teknik, glikmiyatik sistemin fizyolojik, non-invaziv bir şekilde çalışmasını sağlar ve sağlık ve hastalıkta fonksiyonunu düzenleyen faktörlerin bazılarını aydınlatmak yardımcı olarak yararlı olmuştur10,20,25 . Ancak, en heyecan verici niteliği CSF hidrodinamik hakkında gelecekteki sorulara cevap potansiyeli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü nörolojik hastalıklar ve Inme ve Ulusal Enstitüsü yaşlanma (ABD Ulusal sağlığı Enstitüleri tarafından finanse edildi; R01NS100366 ve RF1AG057575-MN), Fondation Leducq transatlantik mükemmellik ağları programı ve AB Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı (Grant No. 666881; SVDs @ Target). Biz de grafik çizimler ile uzman yardım için dan Xue teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Bupivacaine HCl University of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock Hamilton Company 81020
A-M Systems Dental Cement Powder Fisher Scientific NC9991371
Carprofen University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine Prevantics B10800
CMOS Camera Hammamatsu ORCA Flash 4.0
Head Plate University of Rochester No catalog # Custom made at the machine shop at the University of Rochester
High-Temperature Cautery Bovie Medical Corporation AA01
Insta-set Accelerator Bob Smith Industries BSI-151
Isoflurane - Fluriso Vet One 502017 University of Rochester Vivarium
Ketamine Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue Elmer's Products, Inc No catalog #, see link in comments https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tape Fisher Scientific 19-027-761
Paraformaldehyde Sigma-aldrich P6148
PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous Braintree Scientific PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe Harvard Apparatus 70-4501
PURALUBE VET OINTMENT Dechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks Fisher Scientific 22-029-553
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
Simple Head Holder Plate (for mice) Narishige International USA Inc MAG-1
Single-use Needles, BD Medical VWR BD305106
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher Scientific 22-363-750
Tunable LED PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine University of Rochester Vivarium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. 21-32 (2017).
  2. Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemical Research. 40, (12), 2583-2599 (2015).
  3. Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34, (49), 16180-16193 (2014).
  4. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, (147), (2012).
  5. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, (7560), 337-341 (2015).
  6. Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
  7. Da Mesquita,, S,, et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560, (7717), 185-191 (2018).
  8. Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45, (10), 3092-3096 (2014).
  9. Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10, (135), (2018).
  10. Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3, (23), (2018).
  11. Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76, (6), 845-861 (2014).
  12. Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9, (1), 4878 (2018).
  13. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342, (6156), 373-377 (2013).
  14. Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
  15. Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123, (3), 1299-1309 (2013).
  16. Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
  17. Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35, (31), 11034-11044 (2015).
  18. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5, (2), (2019).
  19. Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17, (11), 1016-1024 (2018).
  20. Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
  21. Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
  22. Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26, (11), 2955-2969 (2019).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  24. Ren, Z., et al. Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33, (6), 834-845 (2013).
  25. Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35, (2), 518-526 (2015).
  26. Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8, (1), 1434 (2017).
  27. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505, (7482), 223-228 (2014).
  28. Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10, (5), 549-551 (2007).
  29. Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137, (1), 151-165 (2019).
  30. Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics