गैस्ट्रिक कैंसर रोगी व्युत्पन्न Xenograft मॉडल और प्राथमिक सेल लाइनों की स्थापना

* These authors contributed equally
Cancer Research

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Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल शल्य गैस्ट्रिक कैंसर के नमूनों से रोगी व्युत्पन्न xenograft (PDX) मॉडल और प्राथमिक कैंसर सेल लाइनों स्थापित करने के लिए तरीकों का वर्णन करता है। तरीकों दवा के विकास और कैंसर जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं.

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Lu, J. h., Wang, Y., Meng, Q., Zeng, Z. l. Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines. J. Vis. Exp. (149), e59871, doi:10.3791/59871 (2019).

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Abstract

ट्यूमर जीव विज्ञान की हमारी समझ अग्रिम और चिकित्सीय एजेंटों की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए पूर्व नैदानिक मॉडल का उपयोग कैंसर अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि वहाँ कई स्थापित गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों और पूर्व नैदानिक अनुसंधान के लिए कई पारंपरिक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल हैं, इन इन विट्रो में और विवो मॉडल में नुकसान उनके अनुप्रयोगों की सीमा. क्योंकि इन मॉडलों की विशेषताओं संस्कृति में बदल गया है, वे अब मॉडल ट्यूमर विषमता, और उनकी प्रतिक्रियाओं मनुष्यों में प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने में सक्षम नहीं किया गया है. इस प्रकार, वैकल्पिक मॉडल है कि बेहतर ट्यूमर विषमता का प्रतिनिधित्व विकसित किया जा रहा है. रोगी व्युत्पन्न xenograft (PDX) मॉडल कैंसर कोशिकाओं के हिस्टोलॉजिक उपस्थिति की रक्षा, intratumoral विषमता बनाए रखने, और बेहतर ट्यूमर microenvironment के प्रासंगिक मानव घटकों को प्रतिबिंबित. हालांकि, यह आमतौर पर 4-8 महीने लगते हैं एक PDX मॉडल है, जो कई गैस्ट्रिक रोगियों की उम्मीद अस्तित्व से अधिक है विकसित करने के लिए. इस कारण से, प्राथमिक कैंसर सेल लाइनों की स्थापना दवा प्रतिक्रिया अध्ययन के लिए एक प्रभावी पूरक विधि हो सकती है. वर्तमान प्रोटोकॉल शल्य गैस्ट्रिक कैंसर के नमूनों से PDX मॉडल और प्राथमिक कैंसर सेल लाइनों स्थापित करने के लिए तरीकों का वर्णन करता है. इन तरीकों दवा के विकास और कैंसर जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं.

Introduction

गैस्ट्रिक कैंसर दुनिया भर में पांचवें सबसे आम कैंसर और कैंसर की मौत का तीसरा प्रमुख कारण है। 2018 में, गैस्ट्रिक कैंसर के 1,000,000 से अधिक नए मामलों का विश्व स्तर पर निदान किया गया, और एक अनुमान के अनुसार 783,000 लोग इस बीमारी से मारे गए1. पूर्वोत्तर एशियाई देशों में गैस्ट्रिक कैंसरकी घटना और मृत्यु दर बहुत अधिक बनी हुईहै. कैंसर चिकित्सा के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, उन्नत गैस्ट्रिक कैंसर के साथ रोगियों का पूर्वानुमान गरीब रहता है, लगभग 25%4, 5,6के पांच साल के जीवित रहने की दरकेसाथ, 7,. . इस प्रकार, गैस्ट्रिक कैंसर के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए एक तत्काल आवश्यकता है

गैस्ट्रिक कैंसर का उपचार इसकी उच्च विषमता8,9के कारण चुनौतीपूर्ण है . इस प्रकार, कैसे ट्यूमर विषमता की चुनौतियों का समाधान करने के लिए सटीक दवा का एहसास करने का सवाल कैंसर अनुसंधान के लिए केंद्रीय है. इन विट्रो और विवो मॉडल में विषमांगी तंत्र और गैस्ट्रिक कैंसर के जीव विज्ञान को स्पष्ट करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, हालांकि वहाँ कई गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों और पूर्व नैदानिक अनुसंधान के लिए कई पारंपरिक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल हैं, इन मॉडलों के नुकसान उनके अनुप्रयोगों की सीमा10. क्योंकि इन मॉडलों की विशेषताओं संस्कृति में बदल गया है, वे अब मॉडल ट्यूमर विषमता, और उनकी प्रतिक्रियाओं के लिए मानव में प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने में सक्षम नहीं किया गया है11. इन मुद्दों को गंभीर रूप से कैंसर रोगियों है कि लक्षित दवाओं का जवाब देंगे के उपसमूहों की पहचान करने की संभावना को सीमित. प्राथमिक ट्यूमर की अल्पकालिक संस्कृति एक अपेक्षाकृत तेजी से और व्यक्तिगत तरीका कैंसर औषधीय गुणों की जांच करने के लिए प्रदान करता है, जो संभावना व्यक्तिगत कैंसर के इलाज की पहचान होगी.

रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDXs) दवा प्रतिक्रिया रूपरेखा12के लिए एक वैकल्पिक पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में पसंद कर रहे हैं. इसके अलावा, PDX मॉडल दीक्षा और कैंसर 13,14की प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं. पीडीएक्स मॉडल कैंसर कोशिकाओं के हिस्टोलॉजिक रूप को संरक्षित करते हैं, इंट्राट्यूमरल विषमता को बनाए रखते हैं, और बेहतर ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट15,16के प्रासंगिक मानव घटकों को प्रतिबिंबित करते हैं। हालांकि, व्यापक रूप से इस्तेमाल किया PDX मॉडल की सीमा की स्थापना और क्रमिक मानव ठोस ट्यूमर प्रचार के लिए कम सफलता दर है. इस अध्ययन में, PDX मॉडल और प्राथमिक सेल लाइनों की स्थापना के लिए शालीनता से सफल तरीकों का वर्णन कर रहे हैं.

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Protocol

इस मानव अध्ययन सूर्य Yat-सेन विश्वविद्यालय कैंसर केंद्र (SYSUCC, ग्वांग्झू, चीन) के संस्थागत आचार समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था. पशु अध्ययन सूर्य यात-सेन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। नोट: सभी प्रयोग प्रासंगिक कानूनों और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए, जिनमें रक्त जनित रोगजनकों के खिलाफ व्यावसायिक जोखिम सुरक्षा के लिए दिशानिर्देश शामिल हैं।

1. नमूना तैयारी

  1. ऑपरेशन से सीधे गैस्ट्रिक कैंसर के ऊतकों (पी0 जेड मार्ग 0) प्राप्त करें। ट्यूमर का नमूना 0.5 बउ3से बड़ा होना चाहिए .
  2. स्टॉक समाधान के 3-4 एमएल तैयार करें: उदाहरण के लिए, RPMI-1640 मध्यम (1x) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 100 U/mL पेनिसिलिन और 0.1 mg/
  3. स्टॉक समाधान में ताजा ट्यूमर नमूना 4 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं 4 घंटे के लिए रखो।

2. PDX मॉडल की स्थापना (चित्र 1)

  1. एक बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र सुनिश्चित करने के लिए, पशु प्रयोगशाला में स्थानांतरण से पहले 30 मिनट से अधिक के लिए पराबैंगनी प्रकाश के साथ सभी सामग्री कीटाणुरहित।
    नोट: ऑपरेशन रूम को 30 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश के साथ कीटाणुरहित करने की आवश्यकता है, इससे पहले कि हम डाइक्लोरो आइसोसाइन्यूरिक एसिड सोडियम सपोसिटोरिया कीटाणुनाशक के साथ डेस्क को साफ करें। फिर पोविडोन-आयोडीन का उपयोग त्वचा को कीटाणुरहित करने के लिए किया जाता है।
  2. संद कैंची का उपयोग करना, ध्यान से ट्यूमर के ऊतकों को विभाजित करें और बाँझ परिस्थितियों के तहत उन्हें कई छोटे टुकड़ों (लगभग 1 मिमी3 क्यूब्स) में ट्रिम करें।
  3. एक संज्ञाहरण मशीन के साथ 1-1.5% isoflurane के लिए जोखिम द्वारा महिला 5 से 7 सप्ताह पुराने NOD-SCID-IL2rg (एनएसजी) चूहों एनेस्थेटाइज करें।
    1. माउस को तब तक एनेस्थेटाइज करें जब तक कि वह संघर्ष करना बंद न कर दे, लेकिन सांस लेने में भी रोक नहीं लगा देता।
      नोट: 50 एमएल ट्यूब एक सरल उपकरण है कि एक संज्ञाहरण मशीन के समान कार्य करता है. सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सा नेत्र मरहम का उपयोग कम ऑपरेशन समय के कारण अनावश्यक है।
  4. बाँझ कैंची का उपयोग कर दोनों पृष्ठीय flanks पर एक 1 सेमी चीरा बनाओ, और माउस के प्रत्येक पार्श्व में एक ट्यूमर टुकड़ा प्रत्यारोपण.
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि ट्यूमर का टुकड़ा बाहर नहीं निकलता है, नीचे के ऊतकों को बाधित करने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें। फिर, ट्यूमर ऊतक का एक टुकड़ा क्लिप, और यह गहरी साइट में जगह है.
  5. शल्य सीवन सुइयों के साथ subcutaneous सीवन द्वारा प्रत्यारोपण क्षेत्र बंद करें, और लेबल कान टैग के साथ माउस कान निशान
  6. आयोडीन के साथ घाव को बाँझ.
  7. सर्जरी के बाद चूहों को एक खाली पिंजरे में धीरे-धीरे रखें, जबकि स्टर्नल रिक्युमेंसी को बनाए रखें। चूहों की स्थिति पर करीब से ध्यान देना; वे जाग और लगभग 3-4 मिनट बाद चलना शुरू करते हैं. एक और नए पिंजरे में सर्जरी की गई है कि चूहों को सर्जरी के अधीन नहीं उन लोगों से अलग जगह.
  8. प्रत्यारोपण स्थल के स्पर्श द्वारा ट्यूमर के आकार का आकलन करें। एक Vernier कैलिपर के साथ ट्यूमर को मापने के दो बार एक सप्ताह.
  9. एक बार ट्यूमर व्यास में 10 मिमी तक पहुँच जाता है, पशु हालत बिगड़ जाती है, या ट्यूमर ulcerates, एक आईआरबी अनुमोदित विधि के साथ माउस euthanize. Reimplant passaging के लिए 2 नए चूहों में ताजा ट्यूमर टुकड़े काटा, या अस्थायी रूप से प्राथमिक सेल लाइनों के अलगाव के लिए बर्फ पर पीबीएस में नमूनों की दुकान.

3. ऊतक क्रायोप्रेक्षण

नोट: यह हिस्सा मुख्य रूप से लाइव ऊतक किट Cryo किट के लिए तरीकों का संदर्भ. मुख्य किट और उपकरण सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं .

  1. ट्यूमर व्यास में 10 मिमी से अधिक है जब एक आईआरबी अनुमोदित विधि के साथ चूहों Euthanize.
  2. बाँझ संदंश और कैंची का उपयोग करना, धीरे धीरे चूहों से ट्यूमर को अलग.
  3. एक 10 सेमी डिश में DPBS के साथ ट्यूमर के ऊतकों को धो लें। नेक्रोटिक क्षेत्रों, फैटी ऊतक, रक्त के थक्के और बल और कैंची के साथ संयोजी ऊतक को अलग और हटा दें।
  4. एक मोल्ड के साथ एक अधिकतम 1 मिमी मोटाई के लिए ट्यूमर के ऊतकों में कटौती।
  5. एक 10 सेमी पकवान में DPBS के साथ स्लाइस धो लें.
    नोट: विचालकीकरण प्रक्रिया में 3.6-3.8 चरणों में V1/V2/V3 लेबल वाले ट्यूबों का उपयोग शामिल है। मुख्य तत्व DMSO और sucrose हैं.
  6. स्लाइस को संदने के साथ ट्यूब V1 में स्थानांतरित करें, और 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें और ट्यूब को संक्षेप में उलटें, और इसे 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. V1 समाधान और स्लाइस एक 10 सेमी पकवान में डालो. स्लाइस को संदने के साथ ट्यूब V2 में स्थानांतरित करें, और 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ट्यूब V2 रोल और ट्यूब को संक्षेप में उलटें, और इसे 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  8. V2 समाधान और स्लाइस एक 10 सेमी पकवान में डालो. स्लाइस को संदगों के साथ ट्यूब V3 में स्थानांतरित करें, और ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और ट्यूब को संक्षेप में उलट ें, और इसे कम से कम 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। सुनिश्चित करें कि स्लाइस सभी ट्यूब के नीचे सिंक करें।
    1. यदि कई स्लाइस चल रहे हैं, रोल और ट्यूब संक्षेप में उलटा, और 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से ट्यूब जगह जब तक सभी स्लाइस पूरी तरह से सिंक; यदि आवश्यक हो, अस्थायी स्लाइस छोड़ दें.
  9. V3 समाधान और स्लाइस एक 10 सेमी पकवान में डालो.
  10. ऊतक धारकों को उचित लंबाई में काटें, और उन्हें बाँझ धुंध पर रखें। धारकों पर स्लाइस स्थानांतरण. धुंध के साथ धारकों लपेटें, और उन्हें तरल नाइट्रोजन में संदंश का उपयोग कर जगह है, 5 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद.
  11. क्यूजेनिक शीशियों को ऊतक की जानकारी के साथ लेबल करें।
  12. धारकों को क्रायोजेनिक शीशियों में ऊतक स्लाइस के साथ स्थानांतरित करें, जो तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत होते हैं।

4. प्राथमिक कोशिकाओं का पृथक्णन (चित्र 2)

  1. 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर उच्च दबाव भाप के साथ बलऔर कैंची स्टरलाइज़ करें।
  2. प्रतिरोध गैस्ट्रिक कैंसर के नमूनों को resected नमूनों या काटा PDX ऊतकों से. बर्फ पर ऊतकों प्लेस, और फिर, एक 10 सेमी बाँझ संस्कृति पकवान के लिए ऊतकों को स्थानांतरित.
  3. नेक्रोटिक क्षेत्रों, फैटी ऊतक, रक्त के थक्के और बल और कैंची के साथ संयोजी ऊतक को अलग और हटा दें।
  4. एक 10 सेमी डिश में 100 यू/एमएल पेनिसिलिन और 0.1 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीपीबीएस के साथ ट्यूमर के ऊतकों को एक बार धोएं।
  5. डिश के ढक्कन पर 1 मिमी3 टुकड़ों में ट्यूमर ऊतक कट; प्रत्येक टुकड़ा की अधिकतम मोटाई 1 मिमी होना चाहिए.
  6. ऊतकों को लगभग 7 एमएल प्रकार 1 कोलाजनेस और ट्रिप्सिन (1:14) समाधान के साथ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। मिश्रण संक्षेप में भंवर.
  7. 30-40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ट्यूब को इनक्यूबेट करें। मिश्रण को हर 5 मिनट में भंवर करें।
  8. आरपीएमआई-1640 मध्यम (1x) ट्यूब के लिए 10% FBS के साथ पूरक की एक समान मात्रा जोड़ें. मिश्रण को अच्छी तरह से तैयार करें।
  9. एक 40 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से धीमी निस्पंदन द्वारा एक नया 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिश्रण स्थानांतरण।
    नोट: कैंसर कोशिकाओं के उच्च अनुपात को सुनिश्चित करने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस फिल्टर का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो अधिक प्रकार की कोशिकाओं, जैसे इम्यूनोलॉजिकल कोशिकाओं को संरक्षित करने के लिए 100 डिग्री सेल्सियस फिल्टर का उपयोग किया जा सकता है।
  10. RT. ध्यान से supernatant पर 5-7 मिनट के लिए 113-163 x ग्राम पर छानना.
  11. पीबीएस के 5 एमएल के साथ गोली धो लें, और ध्यान से supernatant हटा दें।
  12. यदि गोली लाल है, यह कई एरिथ्रोसाइट्स शामिल हैं. लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 500 $L के साथ गोली धीरे से resuspend. 5 मिनट के ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के 5 एमएल जोड़ें, और ध्यान से supernatant हटा दें।
  13. संस्कृति माध्यम के साथ गोली resuspend, और एक बाँझ 10 सेमी पकवान के लिए मिश्रण हस्तांतरण.
  14. सीरम युक्त माध्यम के साथ हर 2-3 दिनों में मध्यम बदलें।
  15. जब वे 50% संगम तक पहुंचजाते हैं तो ट्रिप्सिन/एडटा का उपयोग करके प्राथमिक कोशिकाओं को पास करना।

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Representative Results

यहाँ, एक ऑपरेशन से ट्यूमर ऊतकों अगले कदम तक शेयर समाधान में संरक्षित किया गया. 4 घंटे के भीतर, ट्यूमर के ऊतकों को छोटे टुकड़ों में काट दिया गया और एनएसजी चूहों के पृष्ठीय पार्श्वों में प्रत्यारोपित किया गया था जो इस्सोलुरेन से लथपथ कपास का उपयोग करके एनेस्थेटाइज किया गया था। 1 बउ3 से बड़े ट्यूमर को नए चूहों में प्रत्यारोपण के लिए पुन: संक्षिख किया जा सकता है (चित्र 1) या प्रोटोकॉल के बाद तरल नाइट्रोजन में सावधानी से कटा हुआ और संरक्षित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, पहली पीढ़ी के ट्यूमर बाद की पीढ़ियों में उन लोगों की तुलना में अधिक धीरे धीरे वृद्धि हुई, 3 सप्ताह या उससे अधिक लेने के लिए उपयुक्त आकार तक पहुँचने. पहली पीढ़ी के उपस्थानुजनक ट्यूमर गठन की सफलता दर 80% से अधिक थी। हमने एक माइक्रोस्कोप के नीचे एच एंड ई धुंधला द्वारा पीडीएक्स मॉडल से कैंसर कोशिकाओं की पहचान की पुष्टि की (चित्र 3C)। अंत में, cryopreserved ट्यूमर ऊतक से ट्यूमर गठन की सफलता की दर लगभग 95% था.

प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं को अलग-अलग ट्यूमर की जांच करने के लिए एक और तरीका के रूप में अलग किया गया। कोशिकाओं या तो ऑपरेटिव नमूनों या PDX मॉडल से अलग थे. ट्यूमर के ऊतकों को डीबीएस के साथ धोया गया और टुकड़ों में काट दिया गया। ऊतक के टुकड़े प्रकार के साथ अच्छी तरह से पचा रहे थे 1 collagenase और trypsin (1:14) निस्पंदन से पहले. एरिथ्रोसाइट्स को हटाने के बाद, कोशिकाओं को अन्य कैंसर कोशिकाओं के रूप में उसी तरह सुसंस्कृत थे. जीवित मध्यकांतक कोशिकाएं बाद के अंशों में मर जाती हैं (चित्र 2)। आकारिकी में मतभेद के आधार पर, हम आसानी से ट्यूमर कोशिकाओं को पहचान सकते हैं. सामान्य कोशिकाओं को एक समान आकार और आकार है, लेकिन कैंसर की कोशिकाओं को विभिन्न आकारों और आकार में आते हैं. इसके अतिरिक्त, कैंसर की कोशिकाओं में, नाभिक अनियमित संरचनाओं और एक अपेक्षाकृत छोटे कोशिका द्रव्य है. अतः प्राथमिक कोशिकाओं को सूक्ष्मदर्शी के अधीनदो पैथोलॉजिस्टद्वारा स्वतंत्र रूप से प्रमाणित किया गया था (चित्र 3क)। आगे की पुष्टि के लिए, एच एंड ई धुंधला निर्धारण के बाद कैंसर कोशिका आकारिकी का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्र 3 बी)। प्राथमिक सेल लाइनों के सफल अलगाव की दर लगभग 40% थी. प्राथमिक कोशिकाओं को अलगाव के बाद 4 या 5 बार पारित किया जाना चाहिए, और पैथोलॉजिकल प्रमाणीकरण की आवश्यकता है। इन चरणों में लगभग 20 दिन लग सकते हैं।

Figure 1
चित्र 1. रोगी व्युत्पन्न xenograft (PDX) मॉडल की स्थापना के लिए स्कीमा.
सफलतापूर्वक PDX मॉडल स्थापित करने के लिए, तत्काल प्रसंस्करण के लिए ऑपरेटिंग कमरे में ट्यूमर जनता resect. ट्यूमर को कई छोटे टुकड़ों में विभाजित करें। चूहों को एनेस्थेटाइज करने के लिए 50 एमएल ट्यूब में isoflurane से लथपथ कपास की गेंदों रखो, और पृष्ठीय flanks में घावों में कटौती। ब्लंट विच्छेद जश्न सस्ते के साथ subcutaneous ऊतकों, और संदंश का उपयोग करने के लिए घाव से दूर ट्यूमर का एक टुकड़ा subcutaneously जगह है. घावों को सीवन और बंध्याकरण करें। संज्ञाहरण प्रक्रिया माउस महत्वपूर्ण संकेत की सावधान निगरानी की आवश्यकता है, इस तरह के श्वसन दर के रूप में. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. प्राथमिक कोशिकाओं के अलगाव के लिए स्कीमा.
ऑपरेटिंग रूम से ट्यूमर नमूने प्राप्त करें। जल्दी से ट्यूमर के ऊतकों को धो लें, और उन्हें टुकड़ों में काट लें। 30-40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर टाइप 1 कोलैडेनेस और ट्रिप्सिन के साथ ट्यूमर नमूनों को डाइजेस्ट करें, ट्यूब को हर 5 मिनट में मिलाएं। फिर, 10% FBS के साथ मध्यम की एक समान मात्रा में जोड़ें, मिश्रण centrifuge, और एक नई ट्यूब में निस्पंदन जगह है. supernatant निकालें, और गोली धो लें. गोली के रंग के आधार पर, तय है कि लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए. एक नया 10 सेमी बाँझ पकवान में गोली स्थानांतरण, और संस्कृति कैंसर सेल स्क्रीनिंग से पहले कई मार्ग के लिए कोशिकाओं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं का प्रमाणीकरण.
(क) जीसी रोगियों से प्राथमिक सेल छवियों। कोशिकाओं को सीधे ताजा ऊतकों से अलग किया गया और 5 से अधिक बार पारित किया गया। स्केल बार: 200 m (बाएं), 100 डिग्री (मध्य) और 50 डिग्री (दाएं)। (बी) एच एंड ई से सना हुआ प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर कोशिकाओं के चित्र. स्केल बार: 500 m (बाएं), 200 m (मध्य) और 100 डिग्री (दाएं)। (सी) एच एंड ई सना हुआ PDX ट्यूमर के चित्र. स्केल बार: 500 m (बाएं), 200 m (मध्य) और 100 डिग्री (दाएं)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

गैस्ट्रिक कैंसर सीमित चिकित्सीय विकल्पों के साथ एक आक्रामक बीमारी है; इस प्रकार गैस्ट्रिक कैंसर के मॉडल क्लिनिक4,8,17में प्रत्यक्ष अनुवाद के साथ कार्यात्मक अनुसंधान अध्ययन को सक्षम करने के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन बन गए हैं। यहाँ, हम तरीकों और गैस्ट्रिक कैंसर PDX मॉडल और प्राथमिक सेल लाइनों की स्थापना के प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. महत्वपूर्ण बात, दोनों गैस्ट्रिक कैंसर नमूनों के रूपात्मक और जैविक विशेषताओं ज्यादातर PDX मॉडल में बनाए रखा गया.

वहाँ PDX मॉडल है कि engraftment दर बढ़ाने के लिए जोर दिया जाना चाहिए स्थापित करने के लिए प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण बिंदु हैं. एनएसजी (एन ओडी-एससीआईडी-आईएल2आरजी) चूहों को इम्यूनोडेसाइड माउस मॉडल के रूप में सिफारिश की जाती है क्योंकि ये चूहे अधिक गंभीर रूप से इम्यूनोसप्रेस्ड होते हैं और टी, बी और एनके कोशिकाओं में18,19,20,21की कमी होती है। इसके अतिरिक्त, चूहों की गंभीर इम्यूनोडेफिशियेंसी के कारण, सभी प्रयोगों में बाँझपन बनाए रखा जाना चाहिए। संदंश और कैंची सहित सभी उपकरण बाँझ रखा जाना चाहिए। एनएसजी चूहों को संक्रमण से बचने के लिए कम घनत्व पर पैदा किया जाना चाहिए। इसके अलावा, कई कारकों को भी ट्यूमर गठन को प्रभावित हो सकता है, इस तरह के नमूना आकार के रूप में, नमूना में mesenchymal कोशिकाओं के अनुपात, और प्रत्यारोपण साइट.

प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं की स्थापना में एक महत्वपूर्ण पहलू बाँझपन है. इसके अलावा, क्योंकि mesenchymal कोशिकाओं को आम तौर पर प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं की तुलना में तेजी से बढ़ने, कोशिकाओं को कई पीढ़ियों के लिए पारित किया जा जब तक mesenchymal कोशिकाओं से बाहर मर आवश्यकता हो सकती है. अंत में, सुसंस्कृत कोशिकाओं को प्रमाणित करने की आवश्यकता है।

हम PDX ट्यूमर के नमूने को बनाए रखने के लिए vitrified cryopservation विधि का इस्तेमाल किया. इस संरक्षण विधि के मुख्य गुण इस प्रकार हैं: 1) ठंड के बाद दीर्घकालिक भंडारण संभव है (लगभग 10 साल); 2) thaw के बाद आकृति विज्ञान ताजा ऊतक के साथ संगत है; 3) प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं अभी भी thawing के बाद अलग किया जा सकता है; 4) PDXs के ट्यूमर गठन की क्षमता मूल रूप से पहले और cryopservation के बाद अपरिवर्तित रहता है; 5) ऊतकों जमे हुए वर्गों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और पैराफिन के साथ तय किया जा सकता है; 6) डीएनए, आरएनए और प्रोटीन गतिविधि संरक्षित है; और 7) इस विधि दोनों शल्य नमूनों और बायोप्सी ऊतकों के लिए लागू है.

PDX मॉडल की प्रमुख सीमा इम्यूनो समझौता चूहों का उपयोग शामिल है, जो ट्यूमर के विकास और दवा प्रतिक्रियाओं पर ट्यूमर microenvironment के प्रभाव को कम कर सकते हैं और इस तरह स्क्रीनिंग इम्यूनोमॉड्यूलेटरी एजेंटों में PDX मॉडल के आवेदन को सीमित. इसके अतिरिक्त, यह आम तौर पर लेता है 4-8 महीने एक PDX मॉडल है, जो कई गैस्ट्रिक रोगियों की उम्मीद अस्तित्व से अधिक है विकसित करने के लिए. इस कारण से, प्राथमिक कैंसर सेल लाइनों की स्थापना दवा प्रतिक्रिया अध्ययन के लिए एक प्रभावी पूरक विधि हो सकती है.

PDX मॉडल और प्राथमिक सेल लाइनों दवा के विकास और दीक्षा और ट्यूमर जीव विज्ञान अनुसंधान की प्रगति का एक अभिन्न हिस्सा होते जा रहे हैं. इन मॉडलों पारंपरिक कैंसर सेल लाइनों की तुलना में मानव कैंसर का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व प्रदान करते हैं और उपन्यास कैंसर विरोधी चिकित्सा के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन में सुधार करने की क्षमता है. इसके अलावा, इन मॉडलों आणविक विशेषताओं या कैंसर रोगियों के विभिन्न उपसमूहों के बीच ट्यूमर हस्ताक्षर की तुलना में उपयोगी हो सकता है. इसमें कोई शक नहीं है कि इन उपकरणों अंततः दवा के विकास और कैंसर जीव विज्ञान अनुसंधान में एक व्यापक भूमिका निभानी होगी.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81572392) द्वारा समर्थित किया गया था; चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016YFC1201704); गुआंग्डोंग विशेष सहायता कार्यक्रम (2016TQ03R614) के टिप-टॉप वैज्ञानिक और तकनीकी अभिनव युवा प्रतिभा।

हम विशेष रूप से आंकड़ों की तैयारी में सहायता के लिए ग्वांग्झू Sagene बायोटेक कं, लिमिटेड धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 μm Cell Strainer Biologix, Shandong, China 15-1040
Biological Microscope OLYMPUS, Tokyo, Japan OLYMPUS CKX41
Centrifuge Eppendorf, Mittelsachsen, Germany. 5427R
CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA HERACELL 150i
DPBS Basalmedia Technology, Shanghai, China L40601
Electro-Thermostatic Water Cabinet Yiheng, Shanghai, China DK-8AXX
Fetal bovine serum Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada 86150040
Isoflurane Baxter, China CN2L9100
Live Tissue Kit Cryo Kit Celliver Biotechnology, Shanghai, China LT2601
Live Tissue Thaw Kit Celliver Biotechnology, Shanghai, China LT2602
NSG Biocytogen, Beijing, China B-CM-002-4-5W
Penicilin&streptomycin Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 15140122
Red blood cell lysis buffer Solarbio, Beijing, China R1010
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 8118367
Surgical Suture Needles with Thread LingQiao, Ningbo, China 3/8 arc 4×10
Tissue-processed molds and auxiliary blades Celliver Biotechnology, Shanghai, China LT2603
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 2003779
Type 1 collagenase Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 17100017

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References

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