Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

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Cancer Research

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Summary

Il protocollo attuale descrive i metodi per stabilire modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente e linee cellulari tumorali primarie da campioni di cancro gastrico chirurgico. I metodi forniscono uno strumento utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca sulla biologia del cancro.

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Lu, J. h., Wang, Y., Meng, Q., Zeng, Z. l. Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines. J. Vis. Exp. (149), e59871, doi:10.3791/59871 (2019).

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Abstract

L'uso di modelli preclinici per far progredire la nostra comprensione della biologia tumorale e studiare l'efficacia degli agenti terapeutici è fondamentale per la ricerca sul cancro. Anche se ci sono molte linee cellulari di cancro gastrico stabilite e molti modelli di topo transgenici convenzionali per la ricerca preclinica, gli svantaggi di questi modelli in vitro e in vivo limitano le loro applicazioni. Poiché le caratteristiche di questi modelli sono cambiate nella coltura, non modellano più l'eterogeneità tumorale e le loro risposte non sono state in grado di prevedere le risposte negli esseri umani. Così, si stanno sviluppando modelli alternativi che meglio rappresentano l'eterogeneità del tumore. I modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente conservano l'aspetto istologico delle cellule tumorali, mantengono l'eterogeneità intratuita e riflettono meglio i componenti umani rilevanti del microambiente tumorale. Tuttavia, di solito ci vogliono 4-8 mesi per sviluppare un modello PDX, che è più lungo della sopravvivenza prevista di molti pazienti gastrici. Per questo motivo, stabilire linee cellulari tumorali primarie può essere un metodo complementare efficace per gli studi di risposta ai farmaci. Il protocollo attuale descrive i metodi per stabilire modelli PDX e linee cellulari tumorali primarie da campioni di cancro gastrico chirurgico. Questi metodi forniscono uno strumento utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca sulla biologia del cancro.

Introduction

Il cancro gastrico è il quinto cancro più comune al mondo e la terza causa di morte per cancro. Nel 2018, oltre 1.000.000 nuovi casi di cancro gastrico sono stati diagnosticati a livello globale, e si stima che 783.000 persone siano state uccise da questa malattia1. L'incidenza e la mortalità del cancro gastrico rimangono molto elevate nei paesi dell'Asia nordorientale2,3. Nonostante i progressi significativi nel campo delle terapie contro il cancro, la prognosi dei pazienti con cancro gastrico avanzato rimane scarsa, con un tasso di sopravvivenza a cinque anni di circa il 25%4,5,6, 7,. Pertanto, vi è un'urgente necessità di sviluppare nuove strategie terapeutiche per il cancro gastrico

Il trattamento del cancro gastrico è impegnativo a causa della sua elevata eterogeneità8,9. Così, la questione di come affrontare le sfide dell'eterogeneità tumorale per realizzare la medicina di precisione è centrale nella ricerca sul cancro. I modelli in vitro e in vivo svolgono un ruolo cruciale nel chiarire i meccanismi eterogenei e la biologia del cancro gastrico. Tuttavia, sebbene esistano numerose linee cellulari del cancro gastrico e molti modelli di topo transgenici convenzionali per la ricerca preclinica, gli svantaggi di questi modelli limitano le loro applicazioni10. Poiché le caratteristiche di questi modelli sono cambiate nella coltura, non modellano più l'eterogeneità tumorale e le loro risposte non sono state in grado di prevedere le risposte negli esseri umani11. Questi problemi limitano gravemente la possibilità di identificare sottogruppi di pazienti oncologici che risponderanno a farmaci mirati. La cultura a breve termine dei tumori primari fornisce un modo relativamente rapido e personalizzato per indagare le proprietà farmacologiche anticancro, che sarà probabilmente il segno distintivo del trattamento del cancro personalizzato.

Gli xenografi derivati dai pazienti (PDX) sono preferiti come modello preclinico alternativo per la profilazione della risposta ai farmaci12. Inoltre, i modelli PDX offrono un potente strumento per studiare l'inizio e la progressione del cancro13,14. I modelli PDX conservano l'aspetto istologico delle cellule tumorali, mantengono l'eterogeneità intratutale e riflettono meglio i componenti umani rilevanti del microambiente tumorale15,16. Tuttavia, la limitazione dei modelli PDX ampiamente utilizzati è il basso tasso di successo per stabilire e propagare serialmente i tumori solidi umani. In questo studio, sono descritti metodi di decente successo per stabilire modelli PDX e linee cellulari primarie.

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Protocol

Questo studio umano è stato approvato dal Institutional Ethics Review Board del Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, Cina). Lo studio sugli animali è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Sun Yat-sen. Nota: tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con le leggi pertinenti e le linee guida istituzionali, tra cui la linea guida per la protezione dell'esposizione professionale contro gli agenti patogeni di origine ematica.

1. Preparazione del campione

  1. Ottenere tessuti gastrici del cancro (P0 - passaggio 0) direttamente dall'operazione. Il campione di tumore deve essere maggiore di 0,5 cm3.
  2. Preparare 3-4 mL di soluzione stock: ad esempio, RPMI-1640 medio (1x) integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL penicillina e 0,1 mg/mL streptomicina.
  3. Mettere il campione di tumore fresco nella soluzione di magazzino a 4 gradi centigradi per non più di 4 ore.

2. Istituzione del modello PDX (Figura 1)

  1. Per garantire un'area chirurgica sterile, disinfettare tutti i materiali con luce ultravioletta per più di 30 min prima del trasferimento nel laboratorio animale.
    Nota: la sala operatoria deve essere disinfettata con luce ultravioletta per 30 min, prima di pulire la scrivania con dicloro isocianurico acido suppositoria disinfettante. Quindi il povidone-iodio viene utilizzato per disinfettare la pelle.
  2. Utilizzando pinze e forbici, sezionare attentamente i tessuti tumorali e tagliarli in diversi piccoli pezzi (circa 1 mm3 cubetti) in condizioni sterili.
  3. Anestetizza i topi NOD-SCID-IL2rg (NSG) di sesso femminile da 5 a 7 settimane, dall'esposizione all'1-1,5% dell'isoflurane con una macchina per l'anestesia.
    1. Anestesizzare il mouse fino a quando non smette di lottare, ma mantiene anche la respirazione.
      NOTA: Il tubo da 50 mL è un'apparecchiatura semplice che funziona in modo simile a una macchina per anestesia. L'uso di unguento oculare veterinario per evitare la secchezza non è necessario a causa del breve tempo di funzionamento.
  4. Fare un'incisione di 1 cm su entrambi i fianchi dorsali utilizzando forbici sterili, e impiantare un pezzo di tumore in ogni fianco del mouse.
    1. Per garantire che il pezzo di tumore non scivoli, utilizzare pinze sterili per interrompere il tessuto sottocutaneo. Quindi, agganciare un pezzo del tessuto tumorale e posizionarlo nel sito profondo.
  5. Chiudere l'area dell'impianto con sutura sottocutanea con aghi di sutura chirurgica e contrassegnare le orecchie del mouse con etichette auricolari etichettate
  6. Sterilizzare la ferita con lo iodio.
  7. Posizionare delicatamente i topi in una gabbia vuota dopo l'intervento chirurgico, pur mantenendo la recumbency sternale. Prestare molta attenzione alle condizioni dei topi; si svegliano e cominciano a camminare circa 3-4 minuti più tardi. Posizionare i topi che hanno subito un intervento chirurgico in un'altra nuova gabbia separata da quelli non sottoposti a intervento chirurgico.
  8. Valutare le dimensioni del tumore mediante palpazione del sito di impianto. Misurare i tumori con una pinza Vernier due volte a settimana.
  9. Una volta che il tumore raggiunge i 10 mm di diametro, la condizione animale peggiora, o il tumore ulcera, eutanasia il topo con un metodo approvato dall'IRB. Reimplant ha raccolto frammenti tumorali freschi in 2 nuovi topi per passare, o memorizzare temporaneamente i campioni in PBS sul ghiaccio per l'isolamento delle linee cellulari primarie.

3. Crioconservazione dei tessuti

NOTA: Questa parte fa riferimento principalmente ai metodi per il kit Cryo Kit di tessuto vivo. I kit e le attrezzature principali sono elencati nella Tabella dei Materiali.

  1. Eutanasia i topi con un metodo approvato IRB quando il tumore è maggiore di 10 mm di diametro.
  2. Utilizzando pinze sterili e forbici, isolare lentamente il tumore dai topi.
  3. Lavare i tessuti tumorali con DPBS in un piatto di 10 cm. Dissezionare e rimuovere aree necrotiche, tessuto adiposo, coaguli di sangue e tessuto connettivo con pinze e forbici.
  4. Tagliare i tessuti tumorali ad uno spessore massimo di 1 mm con uno stampo.
  5. Lavare le fette con DPBS in un piatto di 10 cm.
    NOTA: Il processo di vitrificazione prevede l'uso di tubi etichettati V1/V2/V3 nei passaggi 3.6-3.8. Gli ingredienti principali sono DMSO e saccarosio.
  6. Trasferire le fette nel tubo V1 con pinze, e incubare il tubo a 4 gradi centigradi per 4 min. Roll e invertire brevemente il tubo, e posizionarlo a 4 gradi centigradi per altri 4 min.
  7. Versare la soluzione V1 e le fette in un piatto di 10 cm. Trasferire le fette nel tubo V2 con pinze, e incubare tubo V2 a 4 gradi centigradi per 4 min. Roll e invertire brevemente il tubo, e posizionarlo a 4 gradi centigradi per altri 4 min.
  8. Versare la soluzione V2 e le fette in un piatto di 10 cm. Trasferire le fette nel tubo V3 con pinze, e incubare il tubo a 4 gradi centigradi per 5 min. Roll e invertire brevemente il tubo, e posizionarlo a 4 gradi centigradi per almeno 5 min. Assicurarsi che le fette si affondino tutte sul fondo del tubo.
    1. Se più fette rimangono galleggianti, rotolare e invertire brevemente il tubo, e posizionare il tubo a 4 gradi centigradi di nuovo fino a quando tutte le fette affondano completamente; se necessario, scartare le sezioni mobili.
  9. Versare la soluzione V3 e le fette in un piatto di 10 cm.
  10. Tagliare i supporti del tessuto alla giusta lunghezza e metterli su garza sterile. Trasferire le fette sui supporti. Avvolgere i supporti con la garza e metterli in azoto liquido usando pinze, seguite da incubazione per 5 min.
  11. Etichettare le fiale criogeniche con le informazioni sui tessuti.
  12. Trasferire i supporti con fette di tessuto in fiale criogeniche, che vengono immagazzinate in azoto liquido.

4. Isolamento delle celle primarie (Figura 2)

  1. Sterilizzare pinze e forbici con vapore ad alta pressione a 121 gradi centigradi per 30 min.
  2. Resect campioni di cancro gastrico da campioni resedati o tessuti PDX raccolti. Posizionare i tessuti sul ghiaccio, e poi, trasferire i tessuti in un piatto di coltura sterile 10 cm.
  3. Dissezionare e rimuovere aree necrotiche, tessuto adiposo, coaguli di sangue e tessuto connettivo con pinze e forbici.
  4. Lavare i tessuti tumorali una volta con DPBS contenente 100 U/mL penicillina e 0,1 mg/mL di streptomicina in un piatto di 10 cm.
  5. Tagliare il tessuto tumorale in 1 mm3 pezzi sul coperchio del piatto; lo spessore massimo di ogni pezzo deve essere di 1 mm.
  6. Trasferire i tessuti in un tubo di centrifuga di 50 mL con circa 7 mL di collagenasi di tipo 1 e soluzione di trypsin (1:14). Vortice brevemente la miscela.
  7. Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 30-40 min.
  8. Aggiungere un volume uguale di RPMI-1640 medio (1x) integrato con 10% FBS al tubo. Vortice accuratamente la miscela.
  9. Trasferire la miscela in un nuovo tubo di centrifuga di 50 mL filtrando lentamente attraverso un filtro da 40 m.
    NOTA: Utilizzare filtri da 40 m per garantire un rapporto più elevato tra le cellule tumorali. Se necessario, è possibile utilizzare filtri da 100 m per preservare più tipi di cellule, come le cellule immunologiche.
  10. Centrifugare i filtrati a 113-163 x g per 5-7 min a RT. Rimuovere con attenzione il sovrentrato.
  11. Lavare il pellet con 5 mL di PBS e rimuovere con cura il supernatante.
  12. Se il pellet è rosso, contiene molti eritrociti. Risospendere delicatamente il pellet con 500 lun di lisi di lissi dei globuli rossi. Dopo un'incubazione di 5 min, aggiungere 5 mL di PBS e rimuovere con attenzione il supernatante.
  13. Risospendere il pellet con il mezzo di coltura e trasferire la miscela in un piatto sterile di 10 cm.
  14. Sostituire il mezzo con un supporto contenente siero ogni 2-3 giorni.
  15. Passare le cellule primarie utilizzando trypsin / EDTA quando raggiungono 50% confluenza.

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Representative Results

Qui, i tessuti tumorali di un'operazione sono stati conservati in soluzione stock fino al passo successivo. Nel giro di 4 ore, i tessuti tumorali sono stati tagliati in piccoli pezzi e impiantati nei fianchi dorsali dei topi NSG che erano stati anestesizzati utilizzando cotone imbevuto di isoflurane. I tumori superiori a 1 cm3 potrebbero essere resezionati per l'impianto in nuovi topi (Figura1) o tagliati con cura e conservati in azoto liquido seguendo il protocollo. In questo studio, i tumori di prima generazione sono cresciuti più lentamente di quelli delle generazioni successive, prendendo 3 settimane o più per raggiungere la dimensione appropriata. Il tasso di successo della formazione del tumore sottocutaneo di prima generazione era superiore all'80%. Abbiamo confermato l'identità delle cellule tumorali dei modelli PDX da macchie H&E al microscopio (Figura 3C). Infine, il tasso di successo della formazione del tumore dal tessuto tumorale crioconservato era di circa il 95%.

Le cellule tumorali primarie sono state isolate come un altro modo per studiare il tumore individuale. Le cellule sono state isolate da campioni operativi o modelli PDX. I tessuti tumorali sono stati lavati con DPBS e tagliati a pezzi. I frammenti di tessuto sono stati digeriti accuratamente con collagenasi di tipo 1 e la trypsina (1:14) prima della filtrazione. Dopo aver rimosso gli eritrociti, le cellule sono state coltivate allo stesso modo di altre cellule tumorali. Le cellule mesenchimale sopravvissute muoiono nei passaggi successivi (Figura 2). Sulla base delle differenze nella morfologia, possiamo facilmente riconoscere le cellule tumorali. Le cellule normali hanno una forma e dimensioni uniformi, ma le cellule tumorali sono disponibili in varie dimensioni e forme. Inoltre, nelle cellule tumorali, il nucleo ha strutture irregolari e un citoplasma relativamente piccolo. Pertanto, le cellule primarie sono state autenticate in modo indipendente da due patologi al microscopio (Figura 3A). Per ulteriori conferme, la colorazione H&E è stata utilizzata per osservare la morfologia delle cellule tumorali dopo la fissazione (Figura 3B). Il tasso di isolamento delle linee cellulari primarie è stato di circa il 40%. Le celle primarie devono essere passaggiate 4 o 5 volte dopo l'isolamento ed è necessaria l'autenticazione patologica. Questi passaggi possono richiedere circa 20 giorni.

Figure 1
come illustrato nella Figura 1. Schema per la creazione di modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX).
Per stabilire con successo i modelli PDX, riporre le masse tumorali in sala operatoria per l'elaborazione immediata. Dividere il tumore in diversi piccoli pezzi. Mettere le sfere di cotone imbevute di isoflurane in un tubo da 50 mL per anesizzare i topi e tagliare le ferite nei fianchi dorsali. Tunanti tessuti sottocutanei sezionati con pinze, e utilizzare pinze per posizionare un pezzo del tumore sottocutaneamente lontano dalla ferita. Suturare e sterilizzare le ferite. Il processo di anestesia richiede un attento monitoraggio dei segni vitali del topo, come il tasso di respirazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
come illustrato nella Figura 2. Schema per l'isolamento delle celle primarie.
Ottenere campioni di tumore dalla sala operatoria. Lavare rapidamente i tessuti tumorali e tagliarli a pezzi. Digerire i campioni tumorali con collagenasi di tipo 1 e la tripsina a 37 gradi centigradi per 30-40 min, mescolando il tubo ogni 5 min. Quindi, aggiungere un volume uguale di mezzo con 10% FBS, centrifugare la miscela, e posizionare il filtrato in un nuovo tubo. Togliere il supernatante e lavare il pellet. In base al colore del pellet, decidere se lizzare i globuli rossi. Trasferire il pellet in un nuovo piatto sterile di 10 cm e coltura le cellule per diversi passaggi prima dello screening delle cellule tumorali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
come illustrato nella figura 3. Autenticazione delle cellule tumorali primarie.
(A) Immagini cellulari primarie da pazienti affetti da GC. Le cellule sono state isolate direttamente dai tessuti freschi e sono state smistate più di 5 volte. Barre della scala: 200 m (a sinistra), 100 m (al centro) e 50 m (a destra). (B) Immagini di cellule tumorali gastriche primarie macchiate di H&E. Barre della scala: 500 m (a sinistra), 200 m (al centro) e 100 m (a destra). (C) Immagini di tumori della PDX macchiati h&E. Barre della scala: 500 m (a sinistra), 200 m (al centro) e 100 m (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il cancro gastrico è una malattia aggressiva con opzioni terapeutiche limitate; così, i modelli di cancro gastrico sono diventati una risorsa critica per consentire studi di ricerca funzionale con traduzione diretta alla clinica4,8,17. Qui, abbiamo descritto i metodi e il protocollo per stabilire modelli PDX di cancro gastrico e linee cellulari primarie. È importante sottolineare che le caratteristiche morfologiche e biologiche dei campioni di cancro gastrico sono state per lo più mantenute nei modelli PDX.

Ci sono alcuni punti critici nel protocollo per stabilire modelli PDX che devono essere enfatizzati per aumentare il tasso di innesto. I topi NSG (NOD-SCID-IL2rg) sono raccomandati come modello di topo immunodeficiente perché questi topi sono più gravemente immunosoppressi e sono carenti nelle cellule T, B e NK18,19,20,21. Inoltre, a causa della grave immunodeficienza dei topi, la sterilità deve essere mantenuta in tutti gli esperimenti. Tutti gli utensili, comprese le pinze e le forbici, devono essere mantenuti sterili. I topi NSG devono essere allevati a bassa densità per evitare infezioni. Inoltre, molti fattori potrebbero anche influenzare la formazione del tumore, come la dimensione del campione, la proporzione delle cellule mesenchymal nel campione e il sito di impianto.

Un aspetto chiave nella creazione di cellule tumorali primarie è la sterilità. Inoltre, poiché le cellule mesenchice di solito crescono più velocemente delle cellule tumorali primarie, le cellule potrebbero dover essere accompagnate per diverse generazioni fino a quando le cellule mesenmal si esaurisce. Infine, le celle coltivate devono essere autenticate.

Abbiamo usato il metodo della crioconservazione vetrificata per preservare i campioni di tumore del PDX. I principali meriti di questo metodo di conservazione sono i seguenti: 1) conservazione a lungo termine dopo il congelamento è possibile (circa 10 anni); 2) la morfologia dopo lo secco è coerente con quella del tessuto fresco; 3) le cellule tumorali primarie possono ancora essere isolate dopo lo scongelamento; 4) la capacità di formazione del tumore delle PDX rimane sostanzialmente invariata prima e dopo la crioconservazione; 5) i tessuti possono essere utilizzati per fare sezioni congelate e possono essere fissati con paraffina; 6) L'attività di DNA, RNA e proteine è preservata; e 7) questo metodo è applicabile sia ai campioni chirurgici che ai tessuti biopsia.

La principale limitazione dei modelli PDX prevede l'uso di topi immunocompromessi, che possono attenuare l'impatto del microambiente tumorale sulla crescita del tumore e sulle risposte ai farmaci e quindi limitare l'applicazione di modelli PDX negli agenti immunomodulatori di screening. Inoltre, in genere ci vogliono 4-8 mesi per sviluppare un modello PDX, che è più lungo della sopravvivenza prevista di molti pazienti gastrici. Per questo motivo, stabilire linee cellulari tumorali primarie può essere un metodo complementare efficace per gli studi di risposta ai farmaci.

I modelli PDX e le linee cellulari primarie stanno diventando parte integrante dello sviluppo di farmaci e dell'avvio e della progressione della ricerca sulla biologia tumorale. Questi modelli offrono rappresentazioni più accurate del cancro umano rispetto alle tradizionali linee cellulari tumorali e hanno il potenziale per migliorare la valutazione preclinica di nuove terapie anticancro. Inoltre, questi modelli possono essere utili per confrontare le caratteristiche molecolari o le firme tumorali tra diversi sottogruppi di pazienti oncologici. Non c'è dubbio che questi strumenti alla fine giocheranno un ruolo più ampio nello sviluppo dei farmaci e nella ricerca sulla biologia del cancro.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81572392); il National Key Research and Development Program of China (2016YFC1201704); Tip-top talento giovanile scientifico e tecnico innovativo del programma di supporto speciale Guangdong (2016TQ03R614).

Ringraziamo specificamente Guangzhou Sagene Biotech Co., Ltd. per l'aiuto nella preparazione delle cifre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 μm Cell Strainer Biologix, Shandong, China 15-1040
Biological Microscope OLYMPUS, Tokyo, Japan OLYMPUS CKX41
Centrifuge Eppendorf, Mittelsachsen, Germany. 5427R
CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA HERACELL 150i
DPBS Basalmedia Technology, Shanghai, China L40601
Electro-Thermostatic Water Cabinet Yiheng, Shanghai, China DK-8AXX
Fetal bovine serum Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada 86150040
Isoflurane Baxter, China CN2L9100
Live Tissue Kit Cryo Kit Celliver Biotechnology, Shanghai, China LT2601
Live Tissue Thaw Kit Celliver Biotechnology, Shanghai, China LT2602
NSG Biocytogen, Beijing, China B-CM-002-4-5W
Penicilin&streptomycin Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 15140122
Red blood cell lysis buffer Solarbio, Beijing, China R1010
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 8118367
Surgical Suture Needles with Thread LingQiao, Ningbo, China 3/8 arc 4×10
Tissue-processed molds and auxiliary blades Celliver Biotechnology, Shanghai, China LT2603
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 2003779
Type 1 collagenase Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 17100017

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References

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