Humant fedtvæv mikro-fragmentering for celle Phenotyping og Sekretome karakterisering

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her præsenterer vi humant fedtvæv enzym-fri mikro-fragmentering ved hjælp af en lukket systemenhed. Denne nye metode tillader erhvervelse af sub-millimeter klynger af fedtvæv egnet til in vivo transplantation, in vitro-kultur, og yderligere celle isolation og karakterisering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vezzani, B., Gomez-Salazar, M., Casamitjana, J., Tremolada, C., Péault, B. Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization. J. Vis. Exp. (152), e60117, doi:10.3791/60117 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I de seneste ti år, fedtvæv transplantationer har været meget anvendt i plastikkirurgi og ortopædi til at forbedre vævs genskabelse og/eller regenerering. Derfor har teknikker til høst og forarbejdning af humant fedtvæv udviklet sig for hurtigt og effektivt at opnå store mængder væv. Blandt disse, den lukkede system teknologi repræsenterer en innovativ og nem at bruge systemet til høst, proces, og re-injicere raffineret fedtvæv på kort tid og i samme intervention (intra-operativt). Fedtvæv opsamles ved fedtsugning, vasket, emulgeret, skyllet og hakket mekanisk i celle klynger på 0,3 til 0,8 mm. autolog transplantation af mekanisk fragmenteret fedtvæv har vist bemærkelsesværdig effekt i forskellige terapeutiske indikationer såsom æstetisk medicin og kirurgi, ortopædisk og generel kirurgi. Karakterisering af mikro-fragmenteret fedtvæv afslørede tilstedeværelsen af intakte små fartøjer i fedtcellerne klynger; Derfor, den perivaskulære niche er overladt unperturbed. Disse klynger er beriget i perivaskulære celler (dvs., mesenchymal stamcelle (MSC) forfædre) og in vitro-analyse viste en øget frigivelse af vækstfaktorer og cytokiner involveret i vævsreparation og regenerering, sammenlignet med enzymatisk afledte MSCs. Dette tyder på, at det overlegne terapeutiske potentiale af mikrofragmenteret fedtvæv forklares ved en højere hyppighed af formodede MSCs og øget sekretorisk aktivitet. Hvorvidt disse tilsat pericytes direkte bidrager til højere vækstfaktor og cytokin produktion er ikke kendt. Denne klinisk godkendte procedure muliggør transplantation af formodede MSCs uden behov for udvidelse og/eller enzymatisk behandling, hvorved kravene i GMP-retningslinjerne tilsidesættes, og omkostningerne til cellebaserede terapier reduceres.

Introduction

Fedtvæv, længe brugt som fyldstof i rekonstruktiv og kosmetisk kirurgi, er for nylig blevet mere populær i regenerativ medicin engang anerkendt som en kilde til mesenchymal stamceller (MSCs)1. Lipoaspirater dissocieres enzymatisk til enkelt celle suspensioner giver en adipocyt-fri stromale vaskulær fraktion (SVF), der anvendes uændret i patienten eller, mere almindeligt, dyrkes i flere uger i MSCs2.

Men, enzym dissociation rupturer vævs mikromiljøer, herunder tilstødende regulerende celler fra formodede regenerativ celler, der bliver betydeligt modificeret ved in vitro-kultur. For at undgå sådanne eksperimentelle artefakter og deraf følgende funktionelle ændringer, forsøg er blevet gjort for at behandle fedtvæv til terapeutisk brug samtidig bevare sin Native konfiguration så intakt som muligt3,4. Især er mekanisk vævs forstyrrelse begyndt at erstatte enzymatisk dissociation. Til dette formål, den fulde fordybelse lukket system mikro-fragmenter lipoaspirater i sub-millimeter, blod-og oliefri vævs klynger (f. eks, lipogems) via en sekvens af sigte filtrering og stål marmor induceret afbrydelse3. Autologt transplantation af mikro-fragmenteret fedtvæv, ved hjælp af denne lukkede system teknologi, har været en succes i flere indikationer, spænder kosmetik, ortopædi, proctology og Gynækologi4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.

Sammenligning mellem humant mikro-fragmenteret fedtvæv (MAT) opnået med det lukkede system anordning og isogene SVF viste, at med hensyn til vaskulær/stromale celle fordeling og sekretoriske aktivitet i kultur, MAT indeholder mere pericytes, som er formodede MSCs14, og udskiller større mængder af vækstfaktorer og cytokiner15.

Denne artikel illustrerer enzym-fri mikro-fragmentering af humant subkutant fedtvæv ved hjælp af en lukket system anordning, og den videre behandling af sådanne mikroniserede fedtvæv for in vitro-kultur, immunhistokemi og FACS analyse, for at identificere de tilstedeværende celletyper og de opløselige faktorer, som udskilles (figur 1). Den beskrevne metode genererer sikkert fedtvæv afledte sub-millimeter organoider indeholdende levedygtige fedtvæv cellepopulationer i en intakt niche, egnet til yderligere applikationer og undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etisk godkendelse af brugen af humane væv i denne forskning blev indhentet fra det sydøstlige Skotland Forskningsetiske udvalg (reference: 16/SS/0103).

1. subkutan abdominal fedtvæv samling

Bemærk: Alle instrumenter, der anvendes i den manuelle Lipo-Aspirations procedure, leveres af producenten af mikro-fragmenteringsanordningen.

  1. Opretholde sterilitet for alle væsker, beholdere, instrumenter og det operative område under hele forsøget.
  2. Placer den mave prøve (udtaget af det kirurgiske hold i en steril pose uden nogen løsning) oven på en kirurgisk klud med huden opad. Ingen vask er påkrævet. For at opnå optimal anvendelse skal prøven opbevares ved 4 °c, og fedtvæv prøven behandles inden for 16 timer efter høst.
  3. Injicer 50 til 100 mL 37 °C 0,9% NaCl-opløsning, afhængigt af vævs prøvens størrelse (brug 50 mL til maksimal en 15 cm2 fedtvæv overflade og øg volumenet tilsvarende) ved hjælp af en engangs vævs infiltrations kanyle i den subkutane Fedtvæv. Håndtér præparatet ved den kutane del.
  4. Tilslut en 10 mL luer låse sprøjte til en engangs Fedtsugning kanyle.
  5. Forsigtigt introducere kanyle inde i fedtvæv fra kanterne. Når du er inde, Opret vakuum inde i sprøjten ved at trække stemplet. Hold stemplet i position i hånden for at sikre vakuum Sugningen.
  6. Foretag radiale bevægelser inde i fedtvæv prøven, indtil sprøjten er fuld af lipoaspirat. Fjern forsigtigt kanylen fra vævet og frakobl sprøjten. Tilslut en ny, Tom sprøjte.
  7. Gentag proceduren, indtil 60 mL lipoaspirat er blevet indsamlet.
    Bemærk: Den maksimale mængde af lipoaspirat, der kan behandles ændringer i henhold til den anvendte type enhed. Se producentens anvisninger (tabel over materialer).

2. mikrofragmentering af lipoaspiratet

Bemærk: Denne protokol er kun beregnet til forskningsbrug. Mikro-fragmentering udføres ved hjælp af en kommercielt tilgængelig enhed (tabel over materialer).

  1. Fjern enheden fra pakken, og kontroller, at hovedenheden er sluttet til Affaldsposen. Anbring affalds opsamlingsposen på jorden, og sørg for, at ventilerne er fastgjort til proces enhedens hætter.
  2. Tilslut Terminal spidsen af indgangs ledningen til salt posen ved at gennemtrænge posen tilslutningsporten. Opbevar salt posen højere end forarbejdningsenheden.
    Bemærk: For den type enhed, der anvendes i denne protokol, anbefales en 2.000 mL pose steril saltvand.
  3. Kontroller, at alle 5 klemmer, der er sluttet til rørene i kredsløbene, er åbne. Anbring forarbejdningsenheden i en lodret position med den grå hætte opad.
  4. Lad saltopløsningen fylde behandlingsenheden. Kontrollér, at strømmen Når Affaldsposen. Fjern alle luftbobler fra forarbejdningsenheden ved at ryste den.
    Bemærk: Alle følgende passager skal udføres uden luft i forarbejdningsenheden.
  5. Anbring forarbejdningsenheden i en lodret position med den blå hætte opad, og luk klemmen ved siden af indgangs ledningen.
  6. Begynd at injicere lipoaspiratet ved at tilslutte sprøjten til den blå indgangs hætte. Hold forarbejdningsenheden lodret under denne procedure, og træk langsomt i sprøjtens stempel, indtil alle lipoaspiratet er blevet overført til enheden. Gentag processen, indtil alle lipoaspiratet er inde i forarbejdningsenheden.
    Bemærk: For den forarbejdningsenhed, der anvendes i videoen, tilsættes maksimalt 30 mL lipoaspirat på det tidspunkt. Proceduren kan udføres maksimalt to gange, indtil 60 mL lipoaspirat er blevet behandlet.
  7. Åbn indgangs klemmen for at genoprette salt strømmen.
  8. Kraftigt ryste forarbejdningsenheden i 2 min mindst, regelmæssigt kontrollere saltopløsning flow i Affaldsposen.
  9. Når saltvands opløsningen i forarbejdningsenheden bliver gennemsigtig, placeres enheden med den grå hætte opad, efter tilnærmeltligt 2 min., og luk klemmen, som er placeret på afløbet i nærheden af den grå hætte. Det forarbejdede væv vil flyde i toppen.
  10. Fyld en 10 mL luer-låse sprøjte med saltvandsopløsning, og Tilslut den til den blå hætte. Luk klemmen, som er placeret i nærheden af den blå hætte. Tilslut en tom 10 mL luer lås sprøjte, med stemplet helt indsat, til ventilen af den grå hætte.
    Bemærk: Brug kun luer-låse sprøjter.
  11. Indsprøjte saltvand i forarbejdningsenheden fra den blå hætte. Sørg for, at sprøjten, der er sluttet til den grå ventil, derfor fyldes med det forarbejdede væv. Når du har injiceret al saltvand, forsigtigt fjerne begge sprøjter.
  12. Gentag trin 2,10 og 2,11, indtil alt forarbejdet væv er indsamlet.
    Bemærk: Det gennemsnitlige udbytte af MÅTTEN er 30 mL fra 60 mL manuel lipoaspirat. Nogle væv vil forblive inde i forarbejdningsenheden, og nogle klumper kan være til stede fastgjort til den blå kant inde i enheden.
  13. Ved afslutningen af behandlingen skal du fjerne alle sprøjter, lukke alle klemmer, løsne salt posen og kassere enheden i henhold til lokale protokoller.
    Bemærk: Behandlingsenheden kan ikke genbruges.

3. fluorescens immun histokemi

  1. Overfør 300-500 μL af MÅTTEN til et 1,5 mL rør. Der tilsættes 1 mL 4% bufferet PARAFORMALDEHYD (PFA), blandes forsigtigt med hånden (ingen vortexing) og efterlades ved 4 °C natten over (fra 16 til 24 timer).
  2. Prøven opsamles og overføres til et rent 1,5 mL rør, der indeholder 1 mL PBS. Gentag trinnet to gange for at fjerne PFA-overskydende.
  3. Prøven overføres i 15% (w/v) saccharose i PBS-opløsning og inkubates ved 4 °C fra den ene dag til den anden (fra 16 til 24 timer)
  4. Prøven overføres i en brønd af en 24-brønd plade, og der tilsættes en indlejrings opløsning af 15% saccharose og 7% gelatine (w/v) i PBS. Fyld brønden halvvejs. Inkuber i 4 timer ved 37 °C.
  5. Prøverne overføres til 4 °C. Efter 2-4 h for gelatine at størkne, fylde brønden med indlejrings opløsningen og lad ved 4 °C natten over.
  6. Fjern prøverne fra brøndene. Fjern overskydende indlejring sammensatte og fryse på tøris. Prøverne opbevares ved-80 °C.
  7. Skær 8-10 μm tykke sektioner ved hjælp af en cryostat. Brug kryostat ved-30 °c til optimal skæring. Slides kan opbevares ved-80 °C.
  8. Før du fortsætter med immunofluorescens, skal du fastgøre sektionerne i 4% PFA i 7 min. Fjern PFA og vask to gange med lunkent PBS (37 °C) for at fjerne gelatine fra sektionerne.
  9. Bloker ikke-specifik antistof binding ved at inkube slides med 10% gede serum i PBS (v/v) i 1 time ved stuetemperatur.
  10. De primære antistoffer i antistoffortynd eller 0,2% (w/v) bovin serumalbumin (BSA) fortyndes i PBS (w/v): mus anti-Human-NG2 (1:100, Stock 0,5 mg/mL), kanin anti-Human-PDGFRβ (1:100, Stock 0,15 mg/mL).
  11. Fjern blokerings opløsningen, og tilsæt de fortyndede primære antistoffer. Inkuber ved 4 °C natten over.
    Bemærk: Udfør alle inkubations trinene fra nu af i mørket.
  12. Fjern de primære antistoffer og vask 3 gange med PBS i 10 minutter hver gang.
  13. De sekundære antistoffer fortyndes i antistof fortyndingsmiddel eller 0,2% (w/v) BSA i PBS: ged anti-Mouse-555 (1:300), ged anti-kanin-647 (1:300). Inkuber 1 t ved stuetemperatur.
  14. Fjern de sekundære antistoffer, og vask tre gange med PBS i 10 minutter hver gang.
  15. Hvis der anvendes en biotin konjugeret lektin, bruges Avidin/biotin blokerende kit. Inkuber i 10 min. med hver reagens, der leveres med to skyller i mellem med PBS.
  16. Gentag blokerings trinnet ved at inkube diasene i 1 time ved stuetemperatur med 10% gede serum i PBS.
  17. Tilsæt biotinyleret lektin, biotinyleret ulex Benved lektin (1:200, bestand 2 mg/ml), fortyndet enten i 0,2% BSA (w/v) i PBS eller antistoffortynd. Inkuber 1 t og 30 min ved stuetemperatur.
  18. Fjern overskydende biotinyleret lektin og vask tre gange med PBS i 10 minutter hver gang.
  19. Tilsæt det sekundære streptavidin konjugeret antistof fortyndet i enten 0,2% (w/v) BSA i PBS eller antistof fortyndingsmiddel. Inkuber i 1 time.
  20. Fjern det sekundære antistof og vask tre gange med PBS i 10 minutter hver gang.
  21. Counterstain kerner med 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:500, bestand 5 mg/mL), fortyndet i 0,2% BSA (w/v) i PBS, for 10 min ved stuetemperatur.
  22. Fjern DAPI-opløsningen og vask to gange med PBS, 10 min hver gang.
  23. Monter gliderne med et vandigt monterings middel. Lad det tørre helt, enten natten over på bænken i mørket eller 1 h ved 37 °C.
  24. Opbevar gliderne ved 4 °C i mørket, og få billeder på et epifluorescens mikroskop.

4. fordøjelsen af mikro-fragmenteret fedtvæv og celle isolation

  1. Det mikro-fragmenterede fedtvæv overføres til en steril beholder.
  2. Frisk udgør fordøjelses mediet ved at opløse type II-kollagenase i DMEM ved en koncentration på 1 mg/mL.
  3. Tilsæt det samme volumen af fordøjelses mediet til det mikro-fragmenterede fedtvæv (dvs. for 30 mL af prøven tilsættes 30 mL fordøjelses medium).
  4. Anbring den forseglede beholder i et 37 °C omrystning af vandbad indstillet til 120 rpm for 45 min. Bemærk venligst, at beholderen skal gøre det muligt at ryste prøven korrekt. Hvis en stor beholder ikke er tilgængelig, skal du bruge 2 50 mL rør (30 mL prøve/fordøjelsesmiddelblanding i hver) placeret vandret.
  5. Efter inkubationen blokeres fordøjelsen ved at tilføje en tilsvarende mængde blokerende opløsning (2% (v/v) FCS/PBS) og filtreres sekventielt gennem 100 μm-og 70 μm-celle-strainere.
  6. Centrifuger den filtrerede suspension i 5 minutter ved 200 x g. Kassér supernatanten.
  7. Resuspension af pellet i ca 5 mL erythrocyt lyse buffer (155 mM NH4Cl, 170 mm Tris, pH 7,65). Buffer volumen kan variere afhængigt af den erytrocyt-kontaminering, som er observeret i celle pellet. Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
  8. Tilsæt en tilsvarende mængde blokerende opløsning og Filtrer gennem en 40 μm celle-si.
  9. Centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 200 x g , og kassér supernatanten.
  10. Resuspension af pellet i blokerende opløsning. Bland godt ved pipettering. Tæl levedygtige celler med Trypan blå udelukkelse på en hemocytometer.
    1. Bland et tilsvarende volumen af cellesuspensionen med Trypan Blue Stain. Aspirer 10 μL af opløsningen og anbring den på et hemocytometer.
    2. Tæl antallet af levende celler (lyse og runde) til stede i mindst 5 firkanter og få den gennemsnitlige celle nummer. For at inkludere plet fortyndingsfaktoren multipliceres middel celletallet med 2. For at få det samlede antal levende celler pr 1 mL prøve multipliceres det opnåede tal med 104.
      Bemærk: den opnåede enkelt cellesuspension, nemlig den stromale vaskulære fraktion (SVF), kan enten seedede ved 20.000 celler/cm2 i perivaskulære cellevækst medium (DMEM suppleret med 20% varme INAKTIVEREDE FCS, 1% penicillin/streptomycin og 1% L-glutamin) eller anvendes til flow cytometri analyse og sortering. Det gennemsnitlige udbytte af nukleerede celler i SVF er ca. 3 x 104 celler pr. ml mat. Sortering eksperimenter kræver mindst 8 x 105 celler for at opnå nok perivaskulære celler til dyrkning.

5. celle mærkning og sortering

  1. Cellesuspensionen centrifugeres ved stuetemperatur i 5 minutter ved 200 x g, og der gensuspenderes pellet i blokerende medium ved en koncentration på 1 x 106 celler pr. 100 μl.
  2. Alikvot mindst 50.000 celler til den ufarvede kontrol og fluorescens minus en (FMO) kontrol i polystyren runde bund flow cytometri rør. Brug resten af cellerne til flerfarvet farvning ved at anbringe i et andet rør.
    Bemærk: når indstillingerne for forsøget er blevet fastlagt (dvs., laser intensitet, gating strategi), antallet af celler, der anvendes til den ufarvede kontrol og FMOs kan reduceres, hvis, de anvendte antistoffer er de samme.
  3. Tilføj CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) og CD146-BV711 (1:100) antistoffer mod enkelt cellesuspensionen for multi farve farvning. For FMO-kontrollerne, Tilføj: for V450 FMO-ækvivalente volumener af CD34-PE og CD146-BV711 plus V450 isotype kontrol; for PE FMO-ækvivalente volumener af CD31-V450, CD45-V450 og CD146-BV711 plus PE isotype kontrol; for BV711 FMO-ækvivalente volumener af CD31-V450, CD45-V450 og CD34-PE plus BV711 isotype kontrol.
  4. Pipetten forsigtigt eller vortex langsomt opløsningen i røret for at blande og inkubere rørene ved 4 °C i 20 minutter i mørke.
  5. Forbered kompensation kontrol perler. Tilsæt 15 μL positive perler og 15 μL negative perler til 70 μL blokerende medium i 3 polystyren rund bund flow-cytometri rør. Tilføj CD34-PE, CD31-V450 eller CD45-V450, og CD146-BV711 antistoffer, en pr. tube.
  6. Pipetten forsigtigt eller vortex langsomt for at blande antistofferne med perlerne og inkubere alle rør ved 4 °C i 20 minutter i mørke.
    Bemærk: den beskrevne fremgangsmåde kan anvendes enten til flow cytometri-analyse eller celle sortering.
  7. Forbered opsamlings rørene ved at forfuske den indvendige overflade af rørene med endotel vækstmedium (EGM), hvilket giver ca. 50 μL medium på bunden af hvert rør.
  8. Efter antistof inkubation fjernes overskydende antistof ved at vaske cellerne og perlerne med 2 mL blokerende medium.
  9. Opløsningen fjernes ved at centrifugere rørene ved 200 x g i 5 minutter og forsigtigt aspirere supernatanten. Replikere vaske trinnet.
  10. Resuspendering af cellerne i blokerende medium ved en endelig koncentration på 1 x 106 celler pr. 250 μl. resuspension af perlerne i 100 μl af blokerende medium.
  11. Overføre cellerne til nye polystyren rund bund flow cytometri rør med celle si cap. Dette vil tillade afbrydelse af celle klumper.
  12. Transportere alle celle-og perle suspensioner til celle sorteringen på is i mørket.
  13. Kør uplettet kontrol celler for at fastslå baggrunden fluorescens og indstille spændinger.
  14. Kør kompensations kontrolrørene for at indstille fluorescens kompensationen.
  15. Brug fremadgående punkt område (FSC-a) vs. side punkt-område (SSC-A) til at identificere celler, og brug derefter fremad scatter-område (FSC-A) vs. fremad scatter højde (FSC-H) til at vælge enkeltceller.
  16. Der tilsættes DAPI, 1 μL 5 μg/mL opløsning til hver mL prøve, til den ufarvede kontrol for at indstille gating for døde celler (figur 2). Ingen vask er påkrævet efter DAPI farvning.
  17. Kør isotype-kontrolelementer for at fastlægge baggrunds fluorescens tærskler relateret til ikke-specifik binding og indstille gating.
  18. Kør eksemplet med flere farver. Udelukke hæmatopoietiske og endotelceller ved gating på CD31 og CD45 negative celler. Indsaml pericyte (CD146+ CD34-) og en utilsigtet celle (CD146- CD34+) i opsamlings rørene (figur 2).
    Bemærk: optimale levedygtige celle udbytter er ca. 2% af den totale levende celle dissociation for pericytes og 1,5% for adventielle celler.

6. cellekultur

  1. Frø nysorteret pericytes og adventitial celler med en densitet på 30.000 til 40.000 celler/cm2 på gelatine belagte kultur plader
  2. For at belægge kultur pladerne skal du dække plade arealet med steril 0,2% (w/v) gelatine i PBS-opløsning (ca. 100 μL opløsning pr. cm2). Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter, og fjern opløsningen. Hold frisk sorteret celler på is under kultur plade belægning.
  3. Centrifuge friskindsamlede celler ved 200 x g i 5 min og forsigtigt re-suspendere celle pellet i en passende mængde endotel vækstmedium (EGM). Hvis antallet af indsamlede celler er meget lavt, undgå Centrifugerings-og plade direkte de indsamlede celler.
  4. Frø cellerne på gelatine-belagte plader. Inkuber ved 37 °C i 5% CO2.
  5. Når cellerne har fastgjort og overholdt pladen (efter mindst 72 h), udveksling EGM med perivaskulære cellevækst medium (DMEM suppleret med 20% varme inaktiverede FCS, 1% penicillin/streptomycin og 1% L-glutamin) for både pericytes og adventitial celler.
  6. Når pericytes og adventitial celler har nået 80%-90% sammenløbet, dissocierer celler ved hjælp af 0,05% trypsin-EDTA. Saml med 5% FCS/PBS, centrifuge ved 200 x g i 5 min, re-suspendere i perivaskulære cellevækst medium, og derefter passage cellerne fra 1:3 til 1:5 ratio (eller ved ca. 7.000 celler/cm2) på ubestrøget polystyren kultur plader eller kolber.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mekanisk dissociation af manuelle lipoaspirater resulterede i produktion af mikro-fragmenteret fedtvæv (MAT), bestående af et aggregat af adipocytter omslutter et mikrovaskulære netværk (figur 3). Immunofluorescens analyse af gelatine-indlejret og cryofixed mat fremhæver denne struktur, der viser det vaskulære netværk markeret med endotel cellemarkør ulex Benved kold 1 (UEA-1) receptor hovedsagelig bestående af små, kapillar lignende beholdere ( Figur 4). Især pericytes udtrykker NG2 eller PDGFRβ normalt distribueres, ensheathing endotheliale celler (figur 4). Disse data bekræfter, at den mekaniske mikro-fragmentering proces ikke påvirker perivaskulære celle rum. Tilstedeværelsen af perivaskulære celler, både pericytes og adventitial celler, er blevet bekræftet af flow cytometri. Hvis du vil markere celler, er der anvendt et Forward scatter-område (FSC-A) vs. side punkt område (SSC-A)-port (figur 2a). Den identificerede cellepopulation blev yderligere indhegnet ved hjælp af Forward scatter-området (FSC-A) vs. Forward scatter højde (FSC-H) for at vælge enkeltceller, og levende celler blev identificeret som negative for DAPI-farvning (figur 2B-C). CD31 og CD45 markører blev anvendt til at udelukke hæmatopoietiske og endoteliale celler (figur 2C). Endelig blev pericytes identificeret som CD146+ CD34- og adventitial celler som CD146- CD34+ (figur 2D). Gating-strategien er opsummeret i figur 2. Den samme gating strategi blev fulgt for sortering eksperimenter. FACS-renset MAT pericytes og adventitial celler begge udviser en spindel til stellate morfologi i kulturen. Kultur i 8 dage viste, at MÅTTEN udskiller flere cytokiner (adiponectin, CD14, CD31, CD154, chitinase 3-lignende 1, komplement faktor D, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, IP-10, M-CSF, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFAA, CCL5, RBP-4, relaxin-2, ST2, TNF-α, CD87), og angiogen faktorer (angiogenin, angiostatin, DPPIV, endoglin, HGF, leptin, PDGFAB/BB, PlGF, trombospondin 2, TIMP4, uPA) in vitro end SVF. Desuden var cytokiner og angiogene faktorer, der produceres af både MAT og SVF, mere rigelige i MAT supernatanter. Derfor, mat fordøjet med kollagenase og placeret i kultur produceret en sekretions lignende som observeret fra konventionelle SVF15. Globalt set viser alle disse data, at mikro-fragmenteret fedtvæv ikke kun er en terapeutisk fordel, men også kan anvendes til fænotypiske og funktionelle undersøgelser. Især den lille størrelse af MAT klynger gør det muligt at teste sekretoriske aktivitet i kulturen, hvilket ville være vanskeligere med store fedtvæv klumper.

Figure 1
Figur 1: skematisk gengivelse af mikro-fragmentering af subkutant fedtvæv. Lipoaspirat opsamles fra subkutant fedtvæv ved hjælp af en kanyle. Indsamlede lipoaspirat er mikro-fragmenteret ved hjælp af lukke systemet enhed. Resulterende mikro-fragmenteret fedtvæv (MAT) er sammensat af flere celletyper, herunder perivaskulære celler og adipocytter. MÅTTEN kan bruges i flere tests, herunder forklarende kultur og immun histokemi, og til celle isolation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentativ gating strategi for perivaskulær celle analyse/sortering fra mat. Et fremadgående punkt område (FSC-a) vs. side scatter område (SSC-A)-Gate bruges til at identificere celler (A), efterfulgt af et fremadrettet punkt område (FSC-a) vs. fremad scatter højde (FSC-H) for at vælge enkeltceller (B). Levedygtige ikke-endoteliale og ikke-hæmatopoietiske celler er indhegnet som negative for henholdsvis DAPI, CD31-V450 og CD45-V450 i samme panel (C). Endelig identificeres perivaskulære celler som pericytes (CD146+ CD34-) eller adventitial celler (CD146- CD34+) (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: måtten morfologi. Lys-felt visning af MAT kultiveret i basal medium. Scale bar = 1.000 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: vaskulatur netværk i mat. Endotelceller er plettet med UEA-1. Boxed områder i A er vist forstørret i B og C. Arrowheads indikerer pericytes, som er blevet plettet ved hjælp af antistoffer mod PDGFRβ og NG2. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papir beskriver den fysiske fraktionering, ved hjælp af en lukket systemenhed, af humant fedtvæv i små klynger, der viser normal fedtvæv mikroanatomi.

Manuelt aspireret humant subkutant fedtvæv og saltopløsning er indlæst i en gennemsigtig plastik cylinder, der indeholder store Pinball-stil metalliske kugler, der efter kraftig manuel rystning af enheden, ruptur fedt i sub-millimeter Fragmenter. Vedlagte filtre og udløb tillader eliminering af snavs, blod og frie lipider og MÅTTEN opsamles i en sprøjte forbundet med enheden. Her er MAT blevet yderligere behandlet for immun histokemi, flow cytometri og kultur, selv om denne specifikke enhed blev udviklet i et medicinsk perspektiv, at erstatte i teatret den enzymatisk producerede fedtvæv stromale vaskulære fraktion eller kultur afledte fedtvæv stamceller, og faktisk viste sig meget effektiv i plastikkirurgi og forskellige andre cellebaserede terapier4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13.

Derfor fedtvæv længe anvendes intakt som blot fyldstof16 afkast i sin oprindelige 3-dimensionelle konfiguration, efter år med enzymatisk dissociation og in vitro-kultur. Dette følger en generel tendens til at vokse og studere væv i deres medfødte flercellede arrangement snarere end som spredte cellepopulationer, som illustreret ved den stigende popularitet af organoider17.

Fedtvæv fragmentering ved hjælp af denne mekaniske anordning har vist sig pålidelige og reproducerbare og ingen ændring af den oprindelige protokol var nogensinde nødvendig. Den almindelige tilførsel af humant subkutant fedt til eksperimentelle undersøgelser er en lipoaspirat indsamlet af kosmetiske årsager, som er indlæst direkte på fragmenteringsanordningen. En begrænsning for brugere i Forskningslaboratoriet, dog, er, at fedtvæv, der skal forarbejdes forsigtigt aspireres i hånden, at opretholde vævs mikroarkitektur så intakt som muligt, og ikke suge ud med en vakuumpumpe, som det rutinemæssigt sker i operativ Værelse. Medmindre en kirurg, der er villig til at indsamle fedt manuelt, kan identificeres, kan man anvende en frisk genbrugt mave-rest. Fedtet fastgjort til det indre aspekt af abdominal hud kan derefter omhyggeligt og sterilely aspireres med sprøjten leveres med sættet. Dette er grunden til, at vi har beskrevet dette skridt i begyndelsen af protokollen (trin 1).

Hvad faktisk forklarer den terapeutiske overlegenhed af MAT over enzym dissocieret fedtvæv? Flow cytometri analyse af MAT enzymatisk dissocieret umiddelbart efter fraktionering afslørede en større andel af pericytes, kendt som medfødte forløbere for mesenchymale stamceller14, sammenlignet med totalt aspireret fedtvæv15 . Mere direkte viste den komparative analyse af mat-og SVF-kultur supernatanter, at de tidligere udskiller, kvalitativt og kvantitativt, flere vækstfaktorer og cytokiner involveret indirekte i vævsreparation. Disse omfatter Pro-angiogen faktorer, samt forskellige mediatorer af immuno-inflammation15.

Ud over disse nylige resultater, er der stadig meget at forstå med hensyn til det molekylære grundlag for MAT terapeutisk potentiale. Til dette formål, den beskrevne metode er en enkel, hurtig teknik, der er lav-effekt til fedtniche og genererer MAT ideel til yderligere eksperimentel manipulation. Fra et accessorisk synspunkt udføres der også forskning for at forbedre anvendeligheden af MAT i klinikken; i denne forbindelse er det en prioritet at afgøre, om mikrofragmenteret fedtvæv kan fryses for forsinket autolog eller allogen administration. Endelig vil det være vigtigt at afgøre, om andre væv og organer såsom knoglemarv, bugspytkirtel eller skeletmuskulatur, at citere, men et par, kan være mikro-fragmenteret med den samme enhed og give intakt mikrovaskulaturen forbundet cellulære nicher modtagelig til eksperimentel intervention.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CT er en grundlægger af Lipogems.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Claire Cryer og Fiona Rossi på universitetet i Edinburgh for deres eksperthjælp med flow cytometry. Vi vil også gerne takke personalet på Murrayfield Hospital, der bidrog ved at levere vævsprøver.

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra British Heart Foundation og Lipogems, som leverede fedtvæv behandlings kits. Humane voksne vævsprøver blev udtaget med fuld etik tilladelse fra South East Scotland Research etik Committee (reference: 16/SS/0103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Buffered paraformaldehyde (PFA) VWR chemicals 9317.901
0.9% NaCl Solution Baxter 3KB7127
AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG  Life Technologies A21422
AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG Life Technologies  A21245
Ammonium chloride fisher chemicals 1158868
Antigent Diluent Life Technologies 3218
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus BD Biosciences 560497
Avidin/Biotin Blocking Kit Life Technologies 4303
BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer  BD Biosciences Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies 
Biotinylated Ulex europaeus lectin Vector Laboratories Vector-B1065
BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control BD Biosciences 563044
CD146-BV711 BD Biosciences 563186
CD31-V450 BD Biosciences 561653
CD34-PE BD Biosciences 555822
CD45-V450 BD Biosciences 560367
DAPI Life Technologies D1306 stock concentration: 5mg/mL
Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18)   Lipogems  provided in the Lipogems surgical kit
Diva software 306 (v.6.0) BD Biosciences
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate Life Technologies 61965026
EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM Lonza  CC-3156
Fetal Calf Serum (FCS) Sigma-Aldrich F2442
FlowJo (v.10.0) FlowJo
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
Gelatin Acros Organics 410870025
Lipogems Surgical Kit Lipogems  LG SK 60
Mouse anti human- NG2 BD Biosciences 554275 stock concentration: 0.5 mg/mL
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555749
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap  BD Biosciences 352235, 25/Pack
Polystyrene round bottom 5 mL tubes BD Biosciences 352003
Rabbit anti human - PDGFRb Abcam 32570 stock concentration: 0.15 mg/mL
Streptavidin conjugated-488 Life Technologies  S32354
Sucrose Sigma-Aldrich 84100-5kg
Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18)  Lipogems  provided in the Lipogems surgical kit
Tris base fisher chemicals BP152-500
Type- II Collagenase Gibco 17101-015
V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 560373
Widefield Zeiss observer Zeiss Objective used: Plan-Apo 20x/0.8
Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) Zeiss DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm;  555: Green, excitation 555 nm;  647:Red, excitation 630 nm 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7, (2), 211-228 (2001).
  2. Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25, (4), 818-827 (2007).
  3. Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
  4. Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2, (4), (2014).
  5. Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10, (2), 337-341 (2015).
  6. Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3, (7), 1073-1075 (2016).
  7. Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11, (3), 229-234 (2015).
  8. Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3, (2), (2015).
  9. Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3, (2), 57-67 (2014).
  10. Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3, (5), (2015).
  11. Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
  12. Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2, (6), (2014).
  13. Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3, (3), (2015).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
  15. Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7, (12), 876-886 (2018).
  16. Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118, (3), 108S-120S (2006).
  17. Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20, (6), 633 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics