عزل الكريات البيض عن حليب الثدي البشري للاستخدام في فحص الفيغوسية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة لأهداف فيروس نقص المناعة البشرية

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وينقل حليب الثدي فيروس نقص المناعة البشرية، على الرغم من أن حوالي 15 في المائة فقط من الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية من الأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية يصابون بالعدوى. الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية تناول ~ 105−108 الكريات البيض الأمومية يوميا، على الرغم من أن هذه الخلايا هي أقل دراسة. هنا نقوم بوصف عزل ة حليب الثدي الكريات البيض وتحليل قدرتها الفصوتية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Powell, R. L., Fox, A. Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets. J. Vis. Exp. (151), e60149, doi:10.3791/60149 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وحتى في غياب العقاقير المضادة للفيروسات العكوسة، فإن حوالي 15 في المائة فقط من الرضع الذين ترضعهم الأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية يصابون بالعدوى، مما يشير إلى وجود تأثير وقائي قوي لحليب الثدي. وما لم يكن الحصول على المياه النظيفة وحليب الرضع المناسب موثوقاً به، فإن منظمة الصحة العالمية لا توصي بوقف الرضاعة الطبيعية للأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية. ومن المرجح أن تعمل عوامل عديدة جنبا إلى جنب للحد من انتقال BM. الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية تناول ~ 105−108 الكريات البيض الأمومية يوميا، على الرغم من أن ما لا يزال غير واضح إلى حد كبير هو مساهمة هذه الخلايا في الصفات المضادة للفيروسات من BM. في الوقت الحاضر كنا نهدف إلى عزل الخلايا من BM الإنسان من أجل قياس الفيغوسيات الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP)، وهي واحدة من الاستجابات المناعية الفطرية الأكثر أهمية وانتشاراً، من قبل خلايا الفيغاسضدية BM ضد أهداف فيروس نقص المناعة البشرية. تم عزل الخلايا من 5 عينات BM البشرية التي تم الحصول عليها في مراحل مختلفة من الرضاعة. تم إجراء العزلة عن طريق الطرد المركزي لطيف تليها إزالة دقيقة من الدهون الحليب والغسيل المتكرر من بيليه الخلية. وقد استخدمت حبات الفلورسنت المغلفة بغلاف فيروس نقص المناعة البشرية (Env) كأهداف لتحليل ADCP. كانت الخلايا ملطخة بعلامة سطح CD45 لتحديد الكريات البيض. وتبين أن نشاط برنامج مكافحة المخدرات كان كبيرا فوق تجارب المراقبة ويمكن قياسه بشكل قابل للقياس باستخدام جسم مضاد خاص بفيروس نقص المناعة البشرية 830A.

Introduction

يتكون حليب الثدي البشري (BM) من خلايا الأمومة التي هي > 90٪ قابلة للحياة1. يتأثر تكوين الخلية بشدة بمرحلة الرضاعة، والحالة الصحية للأم والرضيع، والتباين الفردي، الذي لا يزال غير مفهومبشكلجيد4. وبالنظر إلى أن BM يحتوي على ~ 103−105 الكريات البيض / مل، يمكن تقدير أن الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية تناول ~ 105−108 الكريات البيض الأم يوميا5. وقد أظهرت دراسات مختلفة في الجسم الحي أن الكريات البيض الأمومية توفر مناعة حرجة للطفل وتعمل بشكل جيد خارج هذه المواقع من الابتلاع الأولي5و6و7و8 ،9،10،11. جميع الخلايا المشتقة من الأمومة التي ابتلعها الرضيع لديها القدرة على أداء وظائف المناعة جنبا إلى جنب أو للتعويض عن الكريات البيض الخاصة بالرضيع12.

ولا يزال انتقال فيروس نقص المناعة البشرية من الأم إلى الطفل يشكل أزمة في البلدان المحدودة الموارد. وبما أن أمراض الإسهال والجهاز التنفسي مسؤولة عن معدلات كبيرة من الوفيات بين الرضع في البلدان المحدودة الموارد، وهذه الأمراض تنخفض بدرجة كبيرة عن طريق الرضاعة الطبيعية الخالصة، والفوائد التي تعود على الأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية من الرضاعة الطبيعية تفوق بكثير المخاطر13،14،15. وما لم يكن الحصول على المياه النظيفة وحليب الرضع المناسب موثوقاً به، فإن منظمة الصحة العالمية لا توصي بوقف الرضاعة الطبيعية للأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية16. ويحدث سنوياً ما يقرب من 000 100 طن متري من الـ MTCT عن طريق BM؛ حتى الآن، فقط ~ 15٪ من الرضع الرضاعة الطبيعية من قبل أمهاتهم المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية تصبح مصابة، مما يشير إلى تأثير وقائي قوي من BM17،18،19،20،21. ومن المرجح أن تعمل عوامل عديدة جنبا إلى جنب لمنع انتقال العدوى. والأهم من ذلك أن الأجسام المضادة الخاصة بفيروس نقص المناعة البشرية (Abs) في BM قد ارتبطت بانخفاض انتقال العدوى من الأم إلى الطفل و/أو انخفاض وفيات الرضع بسبب الإصابة بفيروس نقصالمناعةالبشرية22و23. ما لا يزال غير واضح إلى حد كبير هو مساهمة الجزء الخلوي من BM لصفاته المضادة للفيروسات.

العديد من Abs تسهيل مجموعة متنوعة من الأنشطة المضادة للفيروسات بوساطة المنطقة 'ثابتة' من جزيء الغلوبولين المناعي، والجزء القابل للتبلور (Fc)، عن طريق التفاعل مع مستقبلات Fc (FcRs) وجدت على جميع الخلايا المناعية الفطرية تقريبا، وكلها تقريبا موجودة في الإنسان BM24. وقد ثبت أن الفيغوسياتوsات الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP) ضرورية لإزالة العدوى الفيروسية، وقد تم دراسة ناقصة في حالة الوقاية من انتقال الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية25،26،27، 28 , 29.نظرا لندرة المعرفة حول المساهمة المحتملة لنشاط ADCP من قبل phagocytes BM للوقاية من انتقال انتقال الإصابة من الأم إلى الطفل من فيروس نقص المناعة البشرية، كنا نهدف إلى تطوير طريقة صارمة لعزل الخلايا من BM البشرية من أجل إجراء دراسة للADCP بوساطة الخلايا من BM التي تم الحصول عليها في مراحل مختلفة من الرضاعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تعيين كل مشارك في هذه الدراسة واستجوابه وفقًا لموافقة مجلس المراجعة الأخلاقية والمؤسسية (IRB) مع توجيه وترخيص برنامج جبل سيناء لحماية البشر (PPHS) باستخدام موافقة مجلس الهجرة واللاجئين بروتوكول للحصول على عينات حليب الثدي.

1 - إعداد الهدف للغلاف الجزئي

  1. حدد مستضد هدف ذي صلة.
    ملاحظة: في هذا المثال، تم استخدام البروتين المؤتلف V1V2-2F5K، الذي تم تصميمه لتقليد قمة التريمريك من مغلف فيروس نقص المناعة البشرية الأصلي30.
  2. قم بإجراء biotinylation باستخدام مجموعة تجارية(جدول المواد)وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    1. حساب مليمول من كاشف البيوتين لإضافة إلى رد الفعل لفائض الأضراس 5 أضعاف باستخدام الصيغة: الكائنات الحية ملو (مل بروتين x (بروتين ملغ البروتين / مل البروتين) س (بروتين mmol / ملغ البروتين) س (5 بروتين الأحياء مليمول / مليمول)30،31. ثم حساب ميكرولتر من كاشف البيوتين لإضافة باستخدام الصيغة: الكائنات الحية = الكائنات الحية مليمول x (1,000,000 € L) س (L /10 مل).
    2. متساوية الكائنات الحية إلى درجة حرارة الغرفة قبل الفتح. حل البروتين في 0.5-2.0 مل من السلالة المخزنة بالفوسفات (PBS) وفقا للحساب المذكور أعلاه.
    3. إعداد حل 10 M من كاشف البيوتين في ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) وإضافة الحجم المناسب من 10 مل الكاشف البيوتين إلى محلول البروتين، واحتضان رد فعل على الجليد لمدة 2 ساعة أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. إزالة البيوتين الزائد باستخدام المكثفات البروتين (بوليإيثرسولفون [PES] الأغشية، 3 kDa قطع الوزن الجزيئي [MWCO]، 0.5 مل؛ جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    1. إيداع عينة في الغرفة العليا من عمود تدور وإضافة PBS تصل إلى 400 درجة مئوية كاب، ثم إدراج هذه الغرفة عينة في أنبوب جمع. الطرد المركزي في 12،000 × ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    2. تجاهل التدفق من خلال وإضافة PBS إلى 400 درجة مئوية. تجاهل التدفق من خلال وإضافة PBS إلى 100 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن اقتباس البروتين وتجميده عند -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامه.

2. الأجسام المضادة تعتمد على الفيوسيتوس الخلوي (ADCP) إعداد لوحة الاختبار

  1. بروتين بيونيلاتيب مترافق إلى 1 ميكروسفير ('الخرز'؛ جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    1. لكل طبق من الخرز المترافق، حضانة 6 ميكروغرام من البروتين مع 12 ميكرولتر من حبات الأسهم في 200 ميكرولتر من 0.1٪ ألبوم المصل البقري (BSA) - PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، دوامة بلطف كل 20 دقيقة.
    2. الطرد المركزي في 13،000 × ز لمدة 5 دقائق. كرر الدوران وغسل الخطوة 2x. إعادة تعليق في 1200 درجة مئوية من 0.1٪ BSA-PBS.
  2. Aliquot 10 درجة مئوية من محلول حبة لكل بئر في أسفل جولة 96 جيدا لوحة. إعداد تخفيف اتلاف الأجسام المضادة أو سيرا المناعية من الفائدة في 12 ميكرولتر من 2٪ HSA HBSS، وعادة ما تبدأ من 50 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة أو تخفيف المصل 1/100.
    ملاحظة: في نموذج البيانات، تم استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb) 830A.
  3. أضف 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة/سيرا المعبلة إلى لوحة الخرز ة وحضانة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. إضافة 200 ميكرولتر من 2٪ HSA HBSS إلى كل بئر ولوحة الطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 10 دقائق.
  4. إزالة بعناية supernatant عن طريق الانقلاب السريع وdecanting من السائل من الآبار لوحة في بالوعة لتجنب إزعاج بيليه حبة غير مرئية.

3. عزل خلايا حليب الثدي

  1. الحصول على حليب الثدي البشري من النساء المرضعات الصحية، وأعرب عن استخدام مضخات الإلكترونية أو اليدوية المزدوجة. عزل الخلايا داخل ~ 4 ساعة من التعبير، والحفاظ على الحليب في درجة حرارة الغرفة.
  2. باستخدام أنابيب 50 مل، الطرد المركزي 50 مل الحليب في 800 × ز لمدة 15 دقيقة. مسح داخل الأنبوب مع مسح ة خالية من الوبر لإزالة جميع الدهون من جدار الأنبوب.
  3. إضافة 10 مل من 2٪ ألبوم المصل البشري في محلول الملح متوازن ة هانك (2٪ HSA HBSS [دون Ca2+ أو Mg+]). إعادة تعليق بيليه عن طريق الأنابيب لطيف لتجنب تنشيط الخلية والمبرمج. نقل إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي في 450 × ز لمدة 10 دقيقة.
  4. صب قبالة supernatant وكرر الخطوة 1.3. ثم، إعادة تعليق الخلايا بلطف في 1-2 مل من 2٪ HSA HBSS اعتمادا على رقم الخلية المتوقع، وحساب الخلايا بواسطة مقياس الهيموكيتوماتومتر أو عداد الخلية الآلي، مع الإشارة أيضا إلى صلاحية الخلية.

4- التبيّاق ADCP

ملاحظة: الطرق الموصوفة هنا مقتبسة من Ackerman et al.32.

  1. إضافة 50،000 خلايا BM معزولة حديثا إلى كل لوحة ADCP تخفيض جيدا في 200 درجة مئوية من 2٪ HSA-HBSS. حضانة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    1. لتجارب التحكم، خلايا ما قبل الحضانة في 37 درجة مئوية مع 10 ميكروغرام / مل أكتين المانع (سيتوتشاليسين-D)، 50 ميكروغرام / مل FCR وكيل حجب (FcBlock)، أو مزيج من كليهما قبل إضافتها إلى لوحات.
  2. لوحة الطرد المركزي في 930 × ز لمدة 10 دقيقة إضافة 200 درجة مئوية من 2٪ HSA HBSS وتكرار الطرد المركزي. إزالة supernatant بعناية كما هو الحال في الخطوة 2.7 وكرر غسل.
  3. إزالة بعناية الخلايا الفائقة ووصمة عار للبقاء باستخدام 0.5 ميكروغرام / مل (التركيز النهائي) وصمة عار قابلة للإصلاح 450 لكل بئر في 50 ميكرولتر من 2٪ HSA HBSS. حضانة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. لوحة الطرد المركزي في 930 × ز لمدة 10 دقائق وإزالة supernatant كما هو الحال في الخطوة 2.7. إضافة 200 درجة مئوية من 2٪ HSA HBSS ولوحة الطرد المركزي تليها مرة أخرى إزالة supernatant كما هو الحال في الخطوة 2.7.
  4. بعد تلطيخ الصلاحية، والخلايا وصمة عار لعلامات الكريات البيض من الفائدة، بما في ذلك وصمة عار CD45 محددة مثل PE-الماوس المضادة للبشرية CD45 (استنساخ HI30) في تركيز الأمثل (1 ميكروغرام / ميكرولتر في 50 ميكرولتر من 1٪ BSA HBSS في البيانات المثال).
    ملاحظة: يمكن تضمين أي علامات اهتمام خاصة بالنسب.
  5. حضانة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. لوحة الطرد المركزي في 930 × ز لمدة 10 دقائق وإزالة supernatant كما هو الحال في الخطوة 2.7. إضافة 200 درجة مئوية من 1٪ BSA HBSS وتكرار الطرد المركزي. إزالة supernatant. إصلاح الخلايا في 200 درجة مئوية من 0.5٪ الفورمالديهايد في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. يُحفظ في الثلاجة حتى يُلبر.

5. تحليل عن طريق قياس التدفق

  1. القيام بعملية تغرير الأولية للقضاء على الدوبلات على قطعة مبعثرة أمامية (FSC) مقابل قطعة وحطام جانبي (SSC) (مادة أصغر من FSC = 5000) (انظر الشكل 1). استخدام وصمة عار SSC مقابل البقاء الصلاحية (V450 في هذه الحالة) مؤامرة للقضاء على الخلايا الميتة (تلك التي هي إيجابية لوصمة عار الصلاحية).
  2. استخدام SSC مقابل CD45 مؤامرة للتمييز بين الطبقات الكريات البيض الرئيسية (المحببات، الخلايا الأحادية، الخلايا الليمفاوية) كما هو موضح على نطاق واسع33،34.
    ملاحظة: هذا التصنيف هو فقط علامات موحية والنسب محددة مطلوبة لتأكيد نوع الخلية.
  3. لجميع خلايا CD45+ ، أو لكل مجموعة فرعية من الكريات البيض من الفائدة ، وقياس نشاط ADCP عن طريق gating مع علامة على الخلايا الإيجابية حبة في الرسم البياني لقناة الإيزوثيوسينات الفلورية (FITC) ، حيث يتم الكشف عن الخرز الفلورسنت.
    ملاحظة: سوف الآبار التحكم السلبية التي لم يتم إضافة الخرز تشير إلى حيث الخلايا الإيجابية حبة واضحة في الرسم البياني وبالتالي حيث لوضع علامة gating.
  4. حساب درجات ADCP على أنها (متوسط كثافة الفلورة [MFI] من الخلايا الإيجابية حبة) س (٪ من إجمالي CD45 + الخلايا في السكان إيجابية). استخدم برنامج الرسومات لرسم الدرجات في كل تركيز Ab/serum وإجراء تحليل لمنطقة تحت المنحنى (AUC).
    ملاحظة: يعتبر ADCP إيجابية إذا كانت AUC أكبر من الانحراف المعياري 3x من ADCP درجة ADCP AUC من mAb التحكم السلبي غير محددة (في هذه الحالة، 3865).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن الاحتفاظ بالحليب في درجة حرارة الغرفة أو برودة (وإن لم تكن مجمدة)؛ ومع ذلك، وبالنظر إلى أننا لاحظنا انخفاض القدرة على البقاء عندما تم الاحتفاظ الحليب الباردة جدا (البيانات لم تظهر)، وأنه من الأبسط لجمع وتخزين لفترة وجيزة، والنقل في درجات الحرارة المحيطة، فمن المستحسن أن العينات لا يتم تبريدها من أجل الحد من تباين العينة إلى العينة. في الحليب الذي تم الحصول عليه 7-183 يوما بعد الولادة، تراوح تركيز الخلايا الذي يحدده عداد الخلايا الآلي بين 16,083-222,857 خلية/مل. يوضح الشكل 1 استراتيجية التغرير للقضاء على الدوبلووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووو كانت الصلاحية حوالي 90-99%. وكان ما يقرب من 1.6-12.3٪ من مجموع الخلايا الحية CD45+ الكريات البيض(الجدول 1). ويبدو أن معظم الخلايا الأحادية المزعومة هي السلائف/ الخلايا غير الناضجة كما سبق وصفها، استنادا إلى SSC موحية مقابل CD45 gating34. تم تعريف الخلايا الأحادية المزعومة بأنهاSSC منخفضة المتوسط/ CD45منخفضة، على الرغم من أن عدد قليل أظهرت مستويات أعلى CD45 تلطيخ متميزة عن السكان الخلايا الليمفاوية المزعومة (SSCمنخفضة/ CD45منخفضة)أكثر عادة المرتبطة بخلايا الدم(الشكل 1)،على غرار الدراسات السابقة33،34. تم تعريف الخلايا الحبيبية المزعومة بأنهاعاليةSSC / CD45المتوسطة33،34 ( الجدول1). لاحظ أن هذا التصنيف هو موحية فقط وأنه ستكون هناك حاجة إلى علامات خاصة النسب لتأكيد نوع الخلية.

وقد تم قياس نشاط ADCP لخلايا BM المعزولة حديثا ً باستخدام mAb 830A البشري الخاص بفيروس نقص المناعة البشرية، وهو خاص بمنطقة V2 من مغلف فيروس نقص المناعة البشرية ويربط بمستضد V1V2-2F5K الذي تم اختباره هنا. وقد تم قياس نشاط برنامج مكافحة المخدرات على سبيل المثال هنا باستخدام الحليب الذي تم الحصول عليه في شهر واحد بعد الولادة(الشكل 2ألف). تظهر بيانات المثال الرسوم البيانية المتوقعة لـ FITC (حبة+) التي يتم رؤيتها عند التليق على CD45+ الخلايا (تظهر البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام 1 ميكروغرام/مل ماب). تشير العلامات السوداء إلى التجمعات السكانية المستخدمة لحساب درجات ADCP. في عينة 830A البيانات (اللوحة الأولى من الشكل 2A)،يتم عرض النسبة المئوية لCD45+ الخلايا ومتوسط الفلورة من تلك المجموعة، والتي استخدمت لحساب درجة ADCP باستخدام المعادلة في الخطوة 3.4. الخلايا التي تم احتضانها مسبقاً مع مثبطات الأكتين سيتوتشالاسين-D (سيتود) و/أو FcR-حجب عبس (FcBlock) قبل احتضانها مع الخرز المعضم إلى Ab/antigen أظهرت نشاط ADCP على مستوى التحكم mAb 3865 أو أقل، مما يشير إلى أن ADCP كان FcR والأكتين تعتمد(الشكل 2). وكانت درجة ADCP المحددة لمجموع CD45+ الخلايا ~ 25-35 أضعاف مستويات الخلفية المحددة باستخدام التحكم السلبي المضادة للجمرة الخبيثة mAb 3865. تم تحليل كل مجموعة فرعية رئيسية بشكل منفصل أيضا. أظهرت المحببات المزعومة نشاط ADCP أعلى من الخلفية بحوالي 12-29 ضعفًا. كان ال [مونسيت] مزعومة [أبوإكس] ~2−3 أضعاف فوق خلفيّة (شكل 2). ولم تظهر الخلايا الليمفاوية المزعومة كما هو متوقع أي نشاط قابل للقياس من نشاط ADCP (أقل من الانحراف المعياري 3x من درجة ADCP AUC من mAb 3865 السيطرة السلبية غير المحددة؛ لم تظهر البيانات).

Figure 1
الشكل 1: بيانات قياس تدفق العينة للخلايا المعزولة عن حليب الثدي. تمت معالجة الخلايا وتلوينها كما هو موضح في البروتوكول. (أ)تم وضع بوابات للخلايا المفردة للقضاء على الدوبلات في قطعة FSC-H مقابل FSC-A كما هو موضح، كما هو موضح، كما تم سحب الحطام الصغير <5,000 في FSC-A. (ب)تم استخدام هذا السكان لبوابة على الخلايا الحية (التي لا وصمة عار مع صبغة الصلاحية) في SSC مقابل V450 (وصمة عار الصلاحية). (C)تم استخدام هذه الخلايا الحية في مؤامرة FSC مقابل SSC. يتم تسليط الضوء على الوضع المتوقع من الخلايا غير الكريات البيض، التي من المرجح أن تكون الخلايا الظهارية الثديية في الغالب ، ("E"). (D)يتم عرض نفس FSC مقابل SSC مؤامرة فقط مع CD45+ الخلايا. المجموعات الفرعية الرئيسية الكريات البيض لاحظت هي فقط الهويات المزعومة على أساس المعلمات SSC راسخة ومتوقعة (G = المحببات; M = الخلايا الأحادية; L = الخلايا الليمفاوية). (E)تم استخدام الخلايا القابلة للحياة لمؤامرة SSC مقابل CD45 مع المجموعات الفرعية الكريات البيض الرئيسية المشار إليها. وقد أسفر التراجع عن هذه المؤامرة عن البيانات المبينة في اللوحة دال. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: عينة من بيانات ADCP باستخدام خلايا معزولة عن حليب الثدي. ويستند التقييم الذي أُجريه برنامج مكافحة المخدرات على التبيّن المقتبس من Ackerman وآخرون30. تم إجراء التقييم على النحو المبين في البروتوكول أعلاه. (أ)نموذج الرسوم البيانية FITC في 1 ميكروغرام / مل mAb، مع علامات تشير إلى حبة / FITC + السكان المستخدمة لتحديد درجة ADCP. تم حساب الدرجات على أنها (MFI من الخلايا الإيجابية حبة) س (٪ من إجمالي CD45+ الخلايا في حبة / FITC + السكان إيجابية). اللوحة الأولى التي تستخدم mAb 830A وحدها تشير أيضاإلى النسبة المئوية لإجمالي CD45+ الخلايا ومتوسط قيمة كثافة الفلورة المستخدمة لحساب درجة ADCP في هذا المثال. (B)تم استخدام درجات ADCP في كل مقتم تخفيف mAb لحساب قيم المنطقة تحت المنحنى (AUC) في برامج الرسومات. لتجارب التحكم، مثبطات أكتين سيتوتشالاسين-D (سيتود)، وكيل حظر FcR (FcBlock)، أو مزيج من كليهما تم احتضانها مسبقا مع الخلايا قبل إضافتها إلى المجمعات المناعية (انظر الأساطير). لاحظ أن تصنيف الخلايا هذا موحية فقط وأن هناك حاجة إلى علامات خاصة بالنسب لتأكيد نوع الخلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عينه الخلايا / مل النسبة المئوية CD45+ النسبة المئوية للخلايا المحببة*  النسبة المئوية للخلايا الأحادية*
1 222,857 12.3 ± 1.9 13.6 ± 3.8 65.9 ± 5.6
2 27,361 1.6 ± 0.01 25.2 ± 4.0 9.1 ± 5.6
3 161,486 3.6 ± 1.1 47.8 ± 6.8 24.3 ± 4.3
4 16,083 2.7 ± 0.1 17.9 ± 3.5 34.4 ± 1.0
5 25,155 4.0 ± 0.7 29.7 ± 2.6 20.5 ± 1.4
* من CD45+ الخلايا

الجدول 1: أمثلة على عدد خلايا لبن الأم النموذجية وخصائصها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد وُصفت لأول مرة في عام 201130 تقنية قياس التدفق القائم على قياس السيتومترية لقياس نشاط ADCP الوارد وصفها هنا، وقد ثبت منذ ذلك الحين أنها قوية واستشهد بها في أكثر من 80 دراسة. البروتوكول الموصوف هنا يتكيف مع هذه التقنية للاستخدام مع خلايا BM الأولية للمرة الأولى. كانت الدراسات السابقة للوظائف التي توسطت فيها Fc من قبل خلايا BM تقتصر إلى حد كبير على قياس الانفجارات التأكسدية أو اختبارات الفولوجيا القائمة على الأنسجة باستخدام خلايا معزولة عن اللبأ (0-4 أيام بعد الولادة). تقريبا أي دراسات قد درست الخلايا في BM البشرية بعد مرحلة اللبأ. وقد خلصت الدراسات التي تستخدم الخلايا النجمية بشكل عام إلى أن المحببات في اللبأ هي أقل نشاطا من تلك المعزولة عن الدم، وتتصرف ك 'خلية طاردة' التي انتقلت إلى الفضاء خارج الأوعية الدموية35، على الرغم من أن الدراسات المتضاربة لديها وذكرت قدرات الفيغوسية والمبيدة للجراثيممماثلة 36.

على مدى عقود، تم استخدام الفحص المجهري التقليدي لتحديد الكريات البيض BM، وهذا النوع من التعرف البصري قد أدى إلى سوء تحديد الخلية1. وقد قارنت دراسات قليلة تكوين الكريات البيض BM بعد الشهر الأول من الرضاعة، ومعظمها ركزت على اللبأ. استخدام قياس التدفق للخلايا لتحديد الخلايا من المرجح أن يحدد الخلايا بدقة، على الرغم من أن عددا قليلا فقط من دراسات BM قد أجريت باستخدام هذه الطريقة، في كثير من الأحيان مع عدد عينة صغيرة جدا. وقد أشارت الدراسات الحالية إلى أن محتوى الكريات البيض من BM في جميع مراحل الرضاعة يختلف على نطاق واسع، وتتراوح بين ~ 104−7 × 105 الكريات البيض / مل في اللبأ في وقت مبكر، وانخفاض إلى 103−5 × 104 الكريات البيض / مل في الحليب الناضجة، على الرغم من أن جميع الدراسات تؤكد أن تركيز الخلايا وتكوينها يتأثر بقوة بمرحلة الرضاعة1و2و3و4و5. كما ينتقل الحليب إلى تكوينها ناضجة, تركيز العدلات يبدو أن زيادة, على الرغم من أن مثل هذه الدراسات لم تمتد عادة إلى ما بعد الشهر الأول بعد الولادة34.

يستخدم البروتوكول الموضح هنا الخرز الفلورسنت كهدف phagocytic، على الرغم من أنه من المرجح أن يمكن تطبيقها لدراسة BM ADCP من مجموعة متنوعة من الأهداف ذات الصلة بيولوجيا أكثر مثل المجمعات المناعية والخلايا المصابة، التي أثارها مختلف isotypes Ab و الفئات الفرعيه. يمكن استخدام لوحة تلطيخ الخلايا الأكبر لزيادة التمييز بين الكريات البيض. وستكون الدراسات الكبيرة ضرورية للتوصل إلى فهم شامل للبرنامج من جانب هذه الخلايا الأولية ذات الصلة. ويسمح هذا البروتوكول بإنشاء برنامج مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية/متلازمة نقص المناعة البشرية/متلازمة نقص المناعة البشرية/الإيدز كآلية محتملة للحد من انتقال فيروس نقص المناعة البشرية من الأم إلى الطفل، فضلا عن مسببات الأمراض الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتورة سوزان زوللا بازنر في قسم الطب وقسم الأحياء الدقيقة في كلية إيكان للطب في جبل سيناء على مراجعة المخطوطات. وقدمت المؤسسة الوطنية للصحة/المعهد الوطني للصحة/المعهد الوطني للصحة/المركز الوطني للصحة/المركز الوطني للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة والقضاء على تنفيذ القدرات تمويلاً لهذا المشروع في إطار المنحة رقم R21 HD0 وبالإضافة إلى ذلك، تلقى ر. باول الدعم من أموال من قسم الطب، شعبة الأمراض المعدية، كلية إيكان للطب في جبل سيناء.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres  Thermo Fisher F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD 560975
Bovine serum Albumin MP Biomedicals 8810025
Corning V-bottom polystyrene 96-well plate  Corning  3894
Cytochalasin D Sigma 22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit  Thermo Fisher 21338
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352196
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352070
Fixable Viability Stain 450  BD 562247
Formaldehyde solution Sigma 252549 
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red Life Technologies 14175-095
Human BD Fc Block BD 564219
Human Serum Albumin MP Biomedicals 2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional  34120
PBS 1x pH 7.4 Thermo Fisher 10010023
Polystyrene 10 mL Serological Pipettes  Corning  4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL Pierce 88512

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29, (2), 171-182 (2013).
  2. Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77, (6), 1537S-1543S (2003).
  3. Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39, (2), 296-306 (1984).
  4. Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3, (5), 713-720 (1984).
  5. Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6, (3), 267-275 (2015).
  6. Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89, (3), 252-258 (2000).
  7. Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13, (3), 282-290 (1992).
  8. Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64, (7 Spec No), 930-933 (1989).
  9. Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101, (4), 570-580 (2000).
  10. Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
  11. Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11, (6), e0156762 (2016).
  12. Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
  13. Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96, (5), 1071-1078 (2012).
  14. Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126, (5 Pt 1), 696-702 (1995).
  15. WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355, (9202), 451-455 (2000).
  16. World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).
  17. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90, (10), 4951-4965 (2016).
  18. Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197, (3 Suppl), S3-S9 (2007).
  19. Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10, (12), e0145150 (2015).
  20. Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85, (18), 9555-9567 (2011).
  21. Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4, (143), 143sr143 (2012).
  22. Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17, (4), 500-506 (2015).
  23. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89, (19), 9952-9961 (2015).
  24. Ackerman, M., Nimmerjahn, F. Antibody Fc. Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
  25. Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166, (12), 7381-7388 (2001).
  26. Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82, (6), 2772-2783 (2008).
  27. Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81, (17), 9551-9555 (2007).
  28. Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
  29. Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92, (2), 262-270 (2011).
  30. Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366, (1-2), 8-19 (2011).
  31. Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90, (24), 11007-11019 (2016).
  32. Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9, (9), e1003618 (2013).
  33. Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31, (3), 148-153 (2011).
  34. Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10, (8), e0135580 (2015).
  35. Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17, (4), 424-433 (1993).
  36. Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44, (1), 1-7 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics