Изоляция лейкоцитов от грудного молока человека для использования в антитела-зависимых клеточного фагоцитоза Ассей ВИЧ Цели

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Грудное молоко передает вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), хотя только 15% младенцев, накормленных ВИЧ-инфицированными матерями, заражаются. Грудное вскармливание младенцев глотать 105и 108 материнских лейкоцитов ежедневно, хотя эти клетки недостаточно изучены. Здесь мы описываем изоляцию лейкоцитов грудного молока и анализ их фагоцитарной способности.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Powell, R. L., Fox, A. Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets. J. Vis. Exp. (151), e60149, doi:10.3791/60149 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Даже при отсутствии антиретровирусных препаратов, только 15% младенцев, накормленных ВИЧ-инфицированными матерями, заражаются, что свидетельствует о сильном защитном эффекте грудного молока (БМ). Если доступ к чистой воде и соответствующим детским смесям не является надежным, ВОЗ не рекомендует прекратить грудное вскармливание для ВИЧ-инфицированных матерей. Многочисленные факторы, вероятно, работают в тандеме, чтобы уменьшить передачу БМ. Грудное вскармливание младенцев глотать 105и 108 материнских лейкоцитов ежедневно, хотя то, что остается в значительной степени неясно, является вклад этих клеток в противовирусные качества БМ. В настоящее время мы стремились изолировать клетки от человека БМ для того, чтобы измерить антитела-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), один из самых важных и всепроникающих врожденных иммунных реакций, бМ-фагоцитов против ЦЕЛЕй ВИЧ. Клетки были выделены из 5 образцов БМ человека, полученных на различных стадиях лактации. Изоляция осуществлялась с помощью мягкой центрифугации с последующим тщательным удалением молочного жира и повторным промыванием клеточных гранул. Флуоресцентные бусы, покрытые эпитопом конверта С ВИЧ (Env), использовались в качестве мишеней для анализа ADCP. Клетки были окрашены маркером поверхности CD45 для идентификации лейкоцитов. Было установлено, что активность ADCP была значительно выше контрольных экспериментов и воспроизводима с помощью АНТИтела 830А, характерного для ВИЧ.

Introduction

Грудное молоко человека (BM) состоит из материнских клеток, которые являются жизнеспособными1. Состав клеток сильно влияет на стадию лактации, состояние здоровья матери и младенца, и индивидуальный вариант, который остается плохоизученным1,2,3,4. Учитывая, что БМ содержит 103й 105 лейкоцитов/мл, можно подсчитать, что грудное вскармливание младенцев глотать 105и 108 материнских лейкоцитов ежедневно5. Различные исследования in vivo показали, что материнские лейкоциты обеспечивают критический иммунитет к младенцу и функционируют далеко за пределами этих мест первоначального приема5,6,7,8 ,9,10,11. Все материнские клетки, проглоченные младенцем, обладают потенциалом для выполнения иммунных функций наряду или для компенсации собственных лейкоцитов младенца12.

Передача вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) от матери ребенку остается кризисом в странах с ограниченными ресурсами. Поскольку диарейные и респираторные заболевания являются причиной значительных показателей смертности среди младенцев в странах с ограниченными ресурсами, и эти болезни значительно сокращаются за счет исключительно грудного вскармливания, выгоды для ВИЧ-инфицированных матерей грудное вскармливание намного перевешивает риски13,14,15. Если доступ к чистой воде и соответствующим детским смесям не является надежным, ВОЗ не рекомендует прекратить грудное вскармливание для ВИЧ-инфицированных матерей16. Приблизительно 100 000 MTCTs через БМ происходят ежегодно; тем не менее, только 15% младенцев, накормленных грудью их ВИЧ-инфицированных матерей заражаются, предполагая сильный защитный эффект BM17,18,19,20,21. Многочисленные факторы, вероятно, работают в тандеме, чтобы предотвратить передачу инфекции. Важно отметить, что ВИЧ-специфические антитела (Abs) в БМ были коррелированы с сокращением MTCT и / или снижение младенческой смертности от ВИЧ-инфекции22,23. Что остается в значительной степени неясным является вклад клеточной фракции БМ его противовирусные качества.

Многие Abs облегчить различные антивирусные деятельности при посредничестве "постоянной" области молекулы иммуноглобулина, кристаллизуемый фрагмент (Fc), через взаимодействие с рецепторами FC (FcRs) найти практически на всех врожденных иммунных клеток, практически все из которых встречаются в человеке BM24. Антитела-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) был продемонстрирован как необходимый для очистки вирусных инфекций и был недостаточно изучен в случае профилактики MTCT ВИЧ25,26,27, 28 , 29. Учитывая нехватку знаний о потенциальном вкладе активности ADCP бМ фагоцитов в профилактику MTCT ВИЧ, мы стремились разработать строгий метод изоляции клеток от человеческого БМ для проведения исследования ADCP при посредничестве клеток из БМ, полученный на различных стадиях лактации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Каждый участник этого исследования был набран и опрошен в соответствии с утверждением этического и институционального совета по обзору (IRB) с руководством и разрешением Программы по защите человеческих субъектов (PPHS) с использованием одобренного IRB протокол для получения образцов грудного молока.

1. Целевая подготовка микросферы

  1. Выберите соответствующий целевой антиген.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере был использован рекомбинантный белок V1V2-2F5K, который был разработан, чтобы имитировать тримерную вершину родного конверта ВИЧ30.
  2. Выполняйте биотинилацию с использованием коммерческого комплекта(Таблица материалов)в соответствии с протоколом производителя.
    1. Рассчитайте ммоль биотина реагента, чтобы добавить к реакции для 5-кратного избытка моляра с помощью формулы: ммоль биотин и белок мл x (мг белка/мл белка) x (5 ммоль биотин/ ммоль белка)30,31. Затем вычислите qL биотина реагента, чтобы добавить с помощью формулы: qL биотин мммол биотин х (1,000,000 л / л) х (L/10 ммоль).
    2. Равновесие биотин до комнатной температуры перед открытием. Растворите белок в 0,5-2,0 мл фосфатно-буферизированного сольятого раствора (PBS) согласно приведенным выше расчетам.
    3. Подготовьте раствор биотина объемом 10 мМ в диметилсульфокид (ДМСО) и добавьте соответствующий объем биотинового реагента 10 мМ в белковый раствор и инкубируют реакцию на льду в течение 2 ч или при комнатной температуре 30 мин.
  3. Удалить избыток биотина с помощью концентраторов белка (политерсульфон (PES) мембраны, 3 kDa молекулярного веса отсечения (MWCO), 0,5 мл; Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    1. Депозит образец в верхней камере спин-колонки и добавить PBS до 400 л. Cap, а затем вставить этот образец камеры в трубку сбора. Центрифуга при температуре 12 000 х при комнатной температуре 30 мин.
    2. Откажитесь от потока через и добавьте PBS до 400 Л. Повторите центрифугацию. Откажитесь от протекать и добавить PBS до 100 Л. Измерьте концентрацию белка спектрофотометром.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белок может быть алицитирован и заморожен при -80 градусов до тех пор, пока не будет использован.

2. Антитела-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) Ассай Плита Подготовка

  1. Спряжение биоинтинилатированного белка до 1 мкм микросферы ('бусы'; Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    1. На тарелку конъюгированных бусин, инкубировать 6 мкг белка с 12 йл бульонных бусин в 200 л 0,1% бычьего сыворотки альбумина (BSA)-PBS при комнатной температуре в течение 1 ч, вихревая мягко каждые 20 минут.
    2. Центрифуга при 13 000 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант, вихрь мягко и повторно приостанавливайте в 1200 л 0,1% BSA-PBS. Повторите спина и мыть шаг 2x. Повторное действие в 1200 л 0,1% BSA-PBS.
  2. Aliquot 10 л раствора бисины в скважине в круглой нижней 96-хорошо пластины. Приготовьте разбавления антител или иммунной серы, представляющие интерес в 12 зЛ 2% HSA HBSS, обычно начиная с 50 мкг/мл антител или 1/100 разбавления сыворотки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В выборочных данных использовалось моноклональное антитело (mAb) 830A.
  3. Добавьте 10 зЛ тисированных антител/серы в тарелку бисера и инкубировать в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия. Добавьте 200 л 2% HSA HBSS к каждой скважине и центрифугу пластины на 2000 х г в течение 10 мин.
  4. Тщательно удалите супернатант путем быстрого опрокидывания и декантирования жидкости из пластины колодцев в раковину, чтобы не беспокоить невидимые гранулы из биса.

3. Изоляция клеток грудного молока

  1. Получить грудное молоко человека от здоровых кормящих женщин, выраженных с помощью двойных электронных или ручных насосов. Изолировать клетки в пределах 4 ч экспрессии, сохраняя молоко при комнатной температуре.
  2. Используя 50 мл трубок, центрифуга 50 мл молока при 800 х г в течение 15 мин. Осторожно слить обезжиренное молоко и жир, оставляя клетки гранулы спокойно. Протрите внутреннюю часть трубки с без ворса протрите, чтобы удалить все жиры из стенки трубки.
  3. Добавьте 10 мл 2% сывороточного альбома человека в сбалансированном солейном растворе Хэнка (2% HSA HBSS (без Ca2) или Mg). Resuspend гранулы нежный пипетка, чтобы избежать активации клеток и апоптоза. Перенесите на трубку 15 мл и центрифугу при 450 х г в течение 10 мин.
  4. Налейте супернатант и повторите шаг 1.3. Затем аккуратно переприостанавливайте клетки в 1,2 мл 2% HSA HBSS в зависимости от ожидаемого числа клеток, и подсчитайте клетки гемоситометром или автоматизированным счетчиком клеток, отметив также жизнеспособность клетки.

4. ADCP асссе

ПРИМЕЧАНИЕ: Методы, описанные здесь, адаптированы из Ackerman et al.32.

  1. Добавьте 50 000 свежеисзоледов бМ-клеток к каждой пластине ADCP assay хорошо в 200 зл 2% HSA-HBSS. Инкубировать в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
    1. Для контрольных экспериментов, предварительно инкубировать клетки при 37 кв с 10 мкг /мл ингибитор актина (цитохалазин-D), 50 мкг /мл FcR блокирующий агент (FcBlock), или сочетание обоих до их добавления к пластинам.
  2. Centrifuge пластины на 930 х г в течение 10 мин. Добавить 200 зл/ 2% HSA HBSS и повторить центрифугирование. Аккуратно удалите супернатант, как в шаге 2.7 и повторите мыть.
  3. Тщательно удалите супернатантные и пятнаные клетки для жизнеспособности с помощью 0,5 мкг/мл (окончательная концентрация) фиксируемое пятно жизнеспособности 450 на скважину в 50 Л 2% HSA HBSS. Инкубировать 20 мин при комнатной температуре в темноте. Centrifuge пластины на 930 х г в течение 10 мин и удалить супернатант, как в шаге 2.7. Добавить 200 л 2% HSA HBSS и центрифуги пластины снова следуют удаления супернатанта, как в шаге 2.7.
  4. После окрашивания жизнеспособности, пятна клеток для лейкоцитов маркеров интереса, минимально в том числе CD45 конкретных пятен, таких как PE-мышь анти-человеческого CD45 (клон HI30) в оптимизированной концентрации (1 мкг / л в 50 л 1% BSA HBSS в примере данных).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любые линии конкретных маркеров интерес могут быть включены.
  5. Инкубировать 20 мин при комнатной температуре в темноте. Centrifuge пластины на 930 х г в течение 10 мин и удалить супернатант, как в шаге 2.7. Добавьте 200 л 1% BSA HBSS и повторите центрифугацию. Удалить супернатант. Исправьте клетки в 200 qL 0.5% формальдегида в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию. Охладите в темноте до анализа.

5. Анализ по цитометрии потока

  1. Выполните первоначальный gating для устранения дублетов на переднем рассеянии (FSC) против бокового рассеяния (SSC) участок и мусора (материал меньше, чем FSC 5000) (см. Рисунок 1). Используйте SSC против жизнеспособности пятно (V450 в данном случае) участок для устранения мертвых клеток (те, которые являются положительными для жизнеспособности пятно).
  2. Используйте SSC против CD45 участок дифференцировать основные классы лейкоцитов (гранулоциты, моноциты, лимфоциты), как широко описано33,34.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта классификация является лишь наводящим и линии конкретных маркеров, необходимых для подтверждения типа ячейки.
  3. Для всех клеток CD45 ,, или для каждого поднабора лейкоцитов интереса, измеряют активность ADCP путем gating с маркером на шарик-положительных клетках в гистограмме канала флуоресцеина изотоцианата (FITC), где обнаружены флуоресцентные бусы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательные контрольные скважины, в которые не были добавлены бисер, будут указывать, где шарикоположительные клетки проявляются в гистограмме и, следовательно, где разместить маркер gating.
  4. Рассчитайте оценки ADCP как (средняя интенсивность флуоресценции (МФИ) бисо-положительных клеток) x (% от общего количества CD45 - клеток в положительной популяции). Используйте графическое программное обеспечение для анализа баллов при каждой концентрации Ab/сыворотки и для выполнения анализа области под кривой (AUC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: ADCP считается положительным, если AUC больше, чем 3x стандартное отклонение ADCP оценка AUC неспецифических отрицательных mAb управления (в данном случае, 3865).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Молоко можно хранить при комнатной температуре или прохладнее (хотя и не замороженное); однако, учитывая, что мы наблюдали снижение жизнеспособности, когда молоко было сохранено очень холодно (данные не показали), и что проще собирать, хранить кратко, и транспортировать при температуре окружающей среды, рекомендуется, чтобы образцы не охлаждались, чтобы уменьшить изменчивость образца к образцу. В молоке, полученном через 7–183 дня после родов, концентрация клеток, определяемая автоматизированным счетчиком клеток, колебалась от 16 083–222 857 клеток/мл. Рисунок 1 иллюстрирует стратегию gating, исключающую дублеты, мусор и мертвые клетки. Выживаемость составила 90–99%. Приблизительно 1,6–12,3% от общего числа живых клеток были CD45и лейкоциты(таблица 1). Большинство предполагаемых моноцитов, как представляется, предшественники / незрелые клетки, как уже говорилось ранее, на основе наводящий SSC против CD45 gating34. Предполагаемые моноциты были определены как SSCс низким уровнем промежуточных/CD45низким, хотя лишь немногие выставлены более высокие уровни окрашивания CD45 отличается от предполагаемого населения лимфоцитов (SSCнизкий/CD45низкий) более типично связанных с моноцитами крови(рисунок 1), похожий на предыдущие исследования33,34. Предполагаемые гранулоциты были определены как SSCвысокий/CD45промежуточных33,34 (Таблица 1). Обратите внимание, что эта классификация является лишь наводящим и что для подтверждения типа ячейки потребуются маркеры, специфичные для линии.

Активность ADCP только что изолированных бМ-клеток была измерена с помощью ВИЧ-специфического человеческого mAb 830A, который специфичен для v2 области оболочки ВИЧ и связывается с V1V2-2F5K антигена, протестированного здесь. Активность ADCP была измерена для примера здесь с помощью молока, полученного на 1 месяц после родов(рисунок 2A). Примеры данных показывают ожидаемые гистограммы FITC (бисиня), наблюдаемые при налете на клетках CD45(показаны данные, генерируемые с использованием 1 мкг/мл мАб). Черные маркеры указывают на популяции, используемые для расчета баллов ADCP. В образце 830A показаны данные 830A (первая панель рисунка 2А),показан процент клеток CD45и средняя флуоресценция этой популяции, которые использовались для расчета оценки ADCP с помощью уравнения в шаге 3.4. Клетки предварительно инкубировали с ингибитором актина cytochalasin-D (cytoD) и/или FcR-блокируя Abs (FcBlock) до их инкубации с Ab-связанными/антиген-связанными шариками exhibited деятельность ADCP на уровне управления mAb 3865 или ниже, показывая ADCP было FcR и актин-зависимый(рисунок 2). Оценка ADCP, определяемая для общего количества клетокCD45, была в 25-35 раз выше фоновых уровней, определенных с помощью отрицательного контроля против антэрракса mAb 3865. Отдельно анализировался и каждое крупное подмножество. Предполагаемые гранулоциты продемонстрировали активность ADCP в 12-29 раз выше фона. Предполагаемый моноцит ADCP был в 2-3 раза выше фона(рисунок 2). Предполагаемые лимфоциты, как и ожидалось, не продемонстрировали никакой измеримой активности ADCP (менее 3x стандартного отклонения ADCP оценка AUC неспецифического отрицательного контроля mAb 3865; данные не показаны).

Figure 1
Рисунок 1: Образец потока цитометрии данные клеток, изолированных от грудного молока. Клетки были обработаны и окрашены, как описано в протоколе. (A) Одиночные клетки были закрыты на устранение дублетов в FSC-H против FSC-A участок, как показано на рисунке, а также gating из небольшого мусора lt;5,000 в FSC-A. (B) Эта популяция была использована для ворот на живых клетках (которые не пятно с жизнеспособностью красителя) в SSC против V450 (жизнеспособность пятно) участок. (C) Эти живые клетки были использованы в FSC против SSC участка. Подчеркивается ожидаемое положение нелейкоцитов, которые, вероятно, будут преимущественно клеточными эпителиальными клетками ("Е"). (D) Тот же участок FSC против SSC отображается только с клетками CD45. Основные подмножества лейкоцитов, отмеченные, являются лишь предполагаемыми удостоверениями, основанными на устоявшихся и ожидаемых параметрах SSC (G и гранулоциты; М и моноциты; L и лимфоциты). (E) жизнеспособные клетки были использованы для SSC против CD45 участок с основными подмножествами лейкоцитов отметил. Обратный отрезок из этого участка дал данные, показанные в панели D. Обратите внимание, что эта классификация является лишь наводящим и что линии конкретных маркеров, необходимых для подтверждения типа ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Образец данных ADCP с использованием клеток, изолированных от грудного молока. ADCP ассси выполняется на основе ассея адаптированы из Ackerman и др.30. Ассем был выполнен в том виде, в котором говорится в вышеупомянутом протоколе. (A) Образец гистограмм FITC на 1 мкг/мл маб, с маркерами, указывающими на популяции бис/ФИТК, используемые для определения оценки ADCP. Оценки были рассчитаны как (МФО бисины-положительных клеток) x (% от общего числа CD45- клетки в положительной популяции бис/ФИТК). Первая панель, используюая только mAb 830A, также указывает процент от общего количества клеток CD45и среднее значение интенсивности флуоресценции, используемое для расчета оценки ADCP в этом примере. (B) Оценки ADCP на каждом mAb разбавления assayon были использованы для расчета области под кривой (AUC) значения в графическом программном обеспечении. Для контрольных экспериментов, актин ингибитор цитохалазин-D (цитоД), FcR блокирующий агент (FcBlock), или сочетание обоих были предварительно инкубированы с клетками до их добавления к иммунным комплексам (см. легенды). Обратите внимание, что эта классификация ячеек является лишь наводящей и что для подтверждения типа ячейки необходимы маркеры, специфичные для линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Образец Клетки/мл %CD45 % Гранулоцитов  % моноцитов
1 222,857 12,3 и 1,9 13,6 и 3,8 65,9 и 5,6
2 27,361 1,6 и 0,01 25,2 и 4,0 9.1 и 5,6
3 161,486 3,6 и 1,1 47,8 и 6,8 24.3 и 4.3
4 16,083 2,7 и 0,1 17,9 и 3,5 34,4 и 1,0
5 25,155 4,0 и 0,7 29,7 и 2,6 20,5 и 1,4
(из клеток CD45)

Таблица 1: Примеры типичных количества клеток грудного молока и характеристик.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод цитометрии на основе потока для измерения активности ADCP, описанный в настоящем вопросе, был впервые описан в 2011году 30 и с тех пор был доказан надежным и цитируется в более чем 80 исследованиях. Описанный здесь протокол впервые адаптирует этот метод для использования с первичными клетками БМ. Предыдущие исследования fc-опосредоченной функциональности клетками BM больш ограничивали к измерению окислительных врывателей или гистологических-основанных анализов фагоцитоза используя клетки изолированные от colostrum (0'4 дня после рождения). Практически никакие исследования не исследовали клетки в человеческом БМ прошлом фазе colostrum. Исследования с использованием колостральных клеток, как правило, пришли к выводу, что гранулоциты в молозиве менее активны, чем те, изолированные от крови, ведя себя как "экссудатная клетка", которая переехала во внесосудистое пространство35, хотя противоречивые исследования имеют сообщили аналогичные фагоцитарные и бактерицидные мощности36.

На протяжении десятилетий, традиционная микроскопия была использована для идентификации БМ лейкоцитов, и этот тип визуальной идентификации, возможно, привело к неправильной идентификации клеток1. Немногие исследования сравнили состав БМ лейкоцитов после первого месяца лактации, и большинство из них были сосредоточены на колутром. Использование цитометрии потока для идентификации клеток, вероятно, точно определить клетки, хотя только небольшое количество исследований БМ было сделано с помощью этого метода, часто с очень небольшим числом выборки. Текущие исследования показали, что содержание лейкоцитов БМ на всех стадиях лактации варьируется в широких пределах, начиная от 104х 7 х 105 лейкоцитов/мл в раннем молоустрине, уменьшаясь до 103х 5 х 104 лейкоцитов/мл в зрелом молоке, хотя все исследования подтверждают, что концентрация клеток и состав сильно влияет на стадии лактации1,2,3,4,5. По мере перехода молока к зрелому составу концентрация нейтрофилов, по-видимому, увеличивается, хотя такие исследования обычно не выходят за рамки первого месяца послеродового34.

В описанном здесь протоколе используется флуоресцентные бусы в качестве фагоцитической цели, хотя он, вероятно, может быть применен для изучения БМ ADCP различных более биологически значимых целей, таких как иммунные комплексы и инфицированные клетки, вызванные различными изотипами Ab и Подклассы. Большая панель окрашивания клеток может быть использована для дальнейшего дифференцировать лейкоциты. Большие исследования будут иметь важное значение для разработки всеобъемлющего понимания ADCP этих соответствующих первичных клеток. Этот протокол позволяет установить ADCP бМ лейкоцитами в качестве потенциального механизма для снижения МРТ ВИЧ, а также других патогенных микроорганизмов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим д-ра Сьюзан Золла-Пазнер на кафедре медицины и кафедре микробиологии в Медицинской школе Икан на горе Синай за отзыв рукописей. NIH/NICHD предоставила финансирование этого проекта под грантовый номер R21 HD095772-01A1. Кроме того, Р. Пауэлл был поддержан за счет средств из Департамента медицины, Отдел инфекционных заболеваний, Icahn школы медицины на горе Синай.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres  Thermo Fisher F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD 560975
Bovine serum Albumin MP Biomedicals 8810025
Corning V-bottom polystyrene 96-well plate  Corning  3894
Cytochalasin D Sigma 22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit  Thermo Fisher 21338
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352196
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352070
Fixable Viability Stain 450  BD 562247
Formaldehyde solution Sigma 252549 
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red Life Technologies 14175-095
Human BD Fc Block BD 564219
Human Serum Albumin MP Biomedicals 2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional  34120
PBS 1x pH 7.4 Thermo Fisher 10010023
Polystyrene 10 mL Serological Pipettes  Corning  4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL Pierce 88512

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29, (2), 171-182 (2013).
  2. Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77, (6), 1537S-1543S (2003).
  3. Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39, (2), 296-306 (1984).
  4. Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3, (5), 713-720 (1984).
  5. Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6, (3), 267-275 (2015).
  6. Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89, (3), 252-258 (2000).
  7. Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13, (3), 282-290 (1992).
  8. Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64, (7 Spec No), 930-933 (1989).
  9. Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101, (4), 570-580 (2000).
  10. Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
  11. Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11, (6), e0156762 (2016).
  12. Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
  13. Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96, (5), 1071-1078 (2012).
  14. Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126, (5 Pt 1), 696-702 (1995).
  15. WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355, (9202), 451-455 (2000).
  16. World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).
  17. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90, (10), 4951-4965 (2016).
  18. Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197, (3 Suppl), S3-S9 (2007).
  19. Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10, (12), e0145150 (2015).
  20. Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85, (18), 9555-9567 (2011).
  21. Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4, (143), 143sr143 (2012).
  22. Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17, (4), 500-506 (2015).
  23. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89, (19), 9952-9961 (2015).
  24. Ackerman, M., Nimmerjahn, F. Antibody Fc. Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
  25. Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166, (12), 7381-7388 (2001).
  26. Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82, (6), 2772-2783 (2008).
  27. Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81, (17), 9551-9555 (2007).
  28. Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
  29. Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92, (2), 262-270 (2011).
  30. Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366, (1-2), 8-19 (2011).
  31. Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90, (24), 11007-11019 (2016).
  32. Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9, (9), e1003618 (2013).
  33. Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31, (3), 148-153 (2011).
  34. Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10, (8), e0135580 (2015).
  35. Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17, (4), 424-433 (1993).
  36. Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44, (1), 1-7 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics