Hiv Hedeflerinin Antikorbağımlı Hücresel Fagositoz Sataşanında Kullanılmak Üzere İnsan Anne Sütünden Lökositlerin İzolasyon

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Anne sütü insan immün yetmezlik virüsü (HIV) iletir, ancak HIV enfekte anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~% 15 enfekte olur. Anne sütüyle beslenen bebekler günlük ~105−108 maternal lökosit yutmaktadır, ancak bu hücreler incelenmiştir. Burada anne sütü lökositlerinin izolasyonu ve fagositik kapasitelerinin analizini anlatıyoruz.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Powell, R. L., Fox, A. Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets. J. Vis. Exp. (151), e60149, doi:10.3791/60149 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antiretroviral ilaçların yokluğunda bile, HIV ile enfekte olmuş anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~% 15 enfekte olur, anne sütü güçlü bir koruyucu etkisi düşündüren (BM). Temiz suya erişim ve uygun bebek formülü güvenilir olmadığı sürece, WHO HIV bulaşmış anneler için emzirmenin durdurulmasını önermez. Bm iletimini azaltmak için çok sayıda faktör büyük olasılıkla birlikte çalışır. Anne sütüyle beslenen bebekler günlük ~105−108 maternal lökosit yutmaktadır, ancak bu hücrelerin BM'nin antiviral niteliklerine katkısı büyük ölçüde belirsizdir. HIV hedeflerine karşı BM fagositleri tarafından en önemli ve yaygın doğuştan gelen immün yanıtlardan biri olan antikorbağımlı hücresel fagositoz (ADCP). Hücreler emzirmenin çeşitli aşamalarında elde edilen 5 insan BM örneğinden izole edildi. İzolasyon, süt yağının dikkatli bir şekilde çıkarılması ve hücre peletinin tekrartekrar yıkanması ile nazik santrifüj yoluyla gerçekleştirildi. HIV zarfı (Env) epitop ile kaplanmış floresan boncuklar ADCP analizinde hedef olarak kullanılmıştır. Hücreler lökositleri tanımlamak için CD45 yüzey belirteci ile boyandı. BU ADCP aktivitesi kontrol deneyleri yukarıda önemli ve tekrarlanabilir bir HIV özgü antikor 830A kullanarak bulundu.

Introduction

İnsan anne sütü (BM) anne hücrelerinden oluşur >90% canlı1. Hücre bileşimi güçlü emzirme aşamasında etkilenir, anne ve bebeğin sağlık durumu, ve bireysel varyasyon, hangi kötü anlaşılmış kalır1,2,3,4. BM~103−105 lökosit/mL içerdiği göz önüne alındığında, anne sütüyle beslenen bebeklerin günlük5~105−108 maternal lökosit yuttukları tahmin edilebilir. Çeşitli in vivo çalışmalar, maternal lökositlerin bebeğe kritik bağışıklık sağladığını ve bu ilk yutma alanlarının çok ötesinde fonksiyonel olduğunu göstermiştir5,6,7,8 ,9,10,11. Bebek tarafından yutulan tüm anne kaynaklı hücreler yanında bağışıklık fonksiyonları gerçekleştirmek veya bebeğin kendi lökositler telafi etmek için potansiyele sahip12.

İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) anne-çocuk iletimi (MTCT) kaynak sınırlı ülkelerde bir kriz olmaya devam etmektedir. İshal ve solunum yolu hastalıkları kaynak sınırlı ülkelerde bebekler arasında mortalite önemli oranlarda sorumlu olduğundan ve bu hastalıklar önemli ölçüde özel emzirme ile azalır, HIV enfekte anneler için faydaları emzirme çok riskleri ağır basar13,14,15. Temiz su ve uygun bebek formülü erişim güvenilir olmadığı sürece, WHO HIV enfekte anneler için emzirme kesilmesini önermez16. BM üzerinden yılda yaklaşık 100.000 MTCT meydana gelir; henüz, hiv-enfekte anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~ 15% enfekte olur, BM güçlü bir koruyucu etkisi düşündüren17,18,19,20,21. Çok sayıda faktör büyük olasılıkla iletimi önlemek için birlikte çalışır. Daha da önemlisi, BM'de HIV spesifik antikorlar (Abs) azaltılmış MTCT ve / veya HIV enfeksiyonu22,23azaltılmış bebek ölümü ile ilişkili olmuştur. Bm'nin hücresel fraksiyonunun antiviral niteliklerine katkısı büyük ölçüde belirsizdir.

Birçok Abs immünglobulin molekülünün 'sabit' bölgesi tarafından aracılık anti-viral faaliyetleri çeşitli kolaylaştırmak, kristalize parça (Fc), Fc reseptörleri ile etkileşim yoluyla (FcR) hemen hemen tüm doğuştan gelen bağışıklık hücreleri üzerinde bulunan, hemen hemen hepsi insan BM24bulunur. Antikorbağımlı hücresel fagositoz (ADCP) viral enfeksiyonların temizlenmesi için gerekli olarak gösterilmiştir ve HIV MTCT önlenmesi durumunda understudied olmuştur25,26,27, 28.000 , 29. BM fagositleri tarafından ADCP aktivitesinin HIV MTCT'sinin önlenmesine olası katkısı hakkında bilginin azlığı göz önüne alındığında, hücreleri insan BM'den izole etmek için sıkı bir yöntem geliştirmeyi amaçladık. BM emzirmenin çeşitli aşamalarında elde edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmadaki her katılımcı, IRB onaylı bir IRB onaylı kullanılarak Mount Sinai'nin İnsan Deneklerini Koruma Programı'nın (PPHS) rehberliği ve onayı ile etik ve kurumsal inceleme kurulu (IRB) onayı ile işe alındı ve mülakata alındı. anne sütü örnekleri almak için protokol.

1. Hedef Mikrosfer hazırlığı

  1. İlgili bir hedef antijeni seçin.
    NOT: Bu örnekte, rekombinant protein V1V2-2F5K kullanılmıştır, hangi yerli HIV zarf trimerik apeks taklit etmek için tasarlanmıştır30.
  2. Üreticinin protokolüne göre ticari bir kit(Malzeme Tablosu)kullanarak biyotinylation gerçekleştirin.
    1. Formülü kullanarak 5 kat molar fazlalık için reaksiyoneklemek için biotin reaktifmin mmol hesaplayın: mmol biotin = mL protein x (mg protein / mL protein) x (mmol biotin / mg protein) x (5 mmol biotin / mmol protein)30,31. Daha sonra formülü kullanarak eklemek için biotin reaktifinin μL'sini hesaplayın: μL biotin = mmol biotin x (1.000.000 μL/L) x (L/10 mmol).
    2. Açmadan önce biotin'i oda sıcaklığına dengeleyin. Yukarıda yapılan hesaplamaya göre proteini 0.5−2.0 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün.
    3. Dimetilsülfoksit (DMSO) biotin reaktif10 mM çözeltisi hazırlamak ve protein çözeltisi için 10 mM biotin reaktif uygun hacmi ekleyin ve 2 saat veya 30 dakika oda sıcaklığında buz üzerinde inkübat reaksiyonu.
  3. Protein konsantruzları (polyethersulfone [PES] membranları, 3 kDa moleküler ağırlık kesme [MWCO], 0.5 mL; Malzeme Tablosu) üreticinin talimatlarına göre.
    1. Örnek örneği spin sütununun üst haznesine yatırın ve PBS'yi 400 μL. Cap'e kadar ekleyin ve bu numune haznesini bir toplama tüpüne takın. 30 dk oda sıcaklığında 12.000 x g santrifüj.
    2. Akış tan atın ve PBS'yi 400 μL'ye ekleyin. Akış tan atın ve PBS'yi 100 μL'ye ekleyin. Protein konsantrasyonu spektrofotometre ile ölçün.
      NOT: Protein kullanılana kadar -80 °C'de dondurulabilir.

2. Antikorbağımlı Hücresel Fagositosit (ADCP) Teşrin PlakaSı Hazırlama

  1. Biyotinylated proteini 1 μm mikrokürelere ('boncuklar'; Malzeme Tablosu) üreticinin talimatlarına göre.
    1. Konjuge boncuk tabağı başına, 200 μL stok boncuk 12 μL stok boncuk ile 6 μg protein kuluçka 0.1% sığır serum albumin (BSA)-PBS oda sıcaklığında 1 saat, hafifçe her 20 dakikada girdap.
    2. 5 dk. 13.000 x g.'de santrifüj, süpernatant, girdap yavaşça atın ve %0,1 BSA-PBS 1200 μL'de yeniden askıya alın. Tekrar spin ve yıkama adım 2x. 1200 μL'de %0.1 BSA-PBS'de yeniden askıya alın.
  2. Aliquot 10 μL boncuk çözeltisi iyi bir yuvarlak alt 96-iyi plaka. Genellikle 50 μg/mL antikor veya 1/100 serum seyreltme ile başlayan 12 μL hsa HBSS'de antikor veya immün sera seyreltmeler hazırlayın.
    NOT: Örnek lemlerde monoklonal antikor (mAb) 830A kullanılmıştır.
  3. Boncuk plakasına 10 μL titre antikor/sera ekleyin ve 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın. Her kuyuya 200 μL HSA HBSS ve 10 dk için 2.000 x g'lık santrifüj plaka ekleyin.
  4. Görünmez boncuk peletini rahatsız etmemek için plaka kuyularından sıvının bir lavaboya doğru hızlı bir şekilde devrilmesi ve decanting ilerlemesi ile supernatant'ı dikkatlice çıkarın.

3. Anne sütü hücre izolasyonu

  1. Çift elektronik veya manuel pompalar kullanılarak ifade sağlıklı emziren kadınlardan insan anne sütü alın. Sütü oda sıcaklığında tutarak ~4 saat ifade içindeki hücreleri izole edin.
  2. 50 mL tüpler kullanarak, santrifüj 50 mL süt 800 x g için 15 dk. Dikkatli bir şekilde yağsız süt ve yağ dökün hücre pelet rahatsız bırakılırken. Tüpün içini tiftiksiz bir mendille silin ve tüp duvarındaki tüm yağları çıkarın.
  3. Hank'in dengeli tuz çözeltisine %2 insan serum albumeni 10 mL ekleyin (%2 HSA HBSS [Ca2+ veya Mg+ olmadan]). Hücre aktivasyonu ve apoptoz önlemek için nazik pipetleme tarafından pelet resuspend. 10 dk için 450 x g'da 15 mL'lik bir tüp ve santrifüje aktarın.
  4. Supernatant dökün ve adım 1.3 tekrarlayın. Daha sonra, beklenen hücre sayısına bağlı olarak %2 HSA HBSS'nin 1−2 mL'lik hücreleri yavaşça yeniden askıya alan ve hücreleri hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile sayarak hücrecanlılığını da kaydettirin.

4. ADCP tsömonu

NOT: Burada açıklanan yöntemler Ackerman ve ark.32'denuyarlanmıştır.

  1. Her ADCP istreme plakasına %2 HSA-HBSS 200 μL'lik iyi bir şekilde 50.000 adet taze izole BM hücresi ekleyin. 37 °C'de 2 saat kuluçka.
    1. Kontrol deneyleri için, 37 °C'de 10 μg/mL aktin inhibitörü (sitokasin-D), 50 μg/mL FcR engelleme ajanı (FcBlock) veya plakalara ilave edilmeden önce her ikisinin kombinasyonu ile kuluçka öncesi hücreler.
  2. 10 dk. 10 dk. 200 μL 200 μL HSA HBSS ve tekrar santrifüj için 930 x g santrifüj plaka. 2.7 adımdaki gibi supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve tekrar yıkayın.
  3. %2 HSA HBSS'nin 50 μL'sinde 0,5 μg/mL (son konsantrasyon) düzeltilebilir canlılık lekesi kullanılarak süpernatant ve leke hücrelerini dikkatlice çıkarın. Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dk kuluçka. 10 dk için 930 x g santrifüj plaka ve adım 2.7 gibi supernatant kaldırın. 200 μL 2% HSA HBSS ve santrifüj plaka tekrar adım 2.7 gibi supernatant kaldırılması nı takip ekleyin.
  4. Canlılık boyama sonra, ilgi lökosit belirteçleri için leke hücreleri, en az pe-fare anti-insan CD45 (klon HI30) gibi bir CD45 özgü leke dahil optimize edilmiş bir konsantrasyonda (1 μg/ μL 50 μL% 1 BSA HBSS örnek verilerde).
    NOT: Herhangi bir soya özgü ilgi belirteçleri dahil edilebilir.
  5. Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dk kuluçka. 10 dk için 930 x g santrifüj plaka ve adım 2.7 gibi supernatant kaldırın. %1 BSA HBSS 200 μL ekleyin ve tekrar santrifüj. Supernatant çıkarın. Hücreleri 200 μL ve karanlıkta %0,5 formaldehit halinde oda sıcaklığında 30 dakika veya gece boyunca 4 °C'de sabitler. Analiz ene kadar karanlıkta soğutun.

5. Akış sitometrisi ile analiz

  1. İleri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) çizimi ve enkaz (FSC = 5000'den küçük malzeme) üzerindeki doublet'leri ortadan kaldırmak için ilk gating'i gerçekleştirin (Bkz. Şekil 1). Ölü hücreleri (canlılık lekesi için pozitif olanlar) ortadan kaldırmak için bir SSC vs canlılık lekesi (Bu durumda V450) planı kullanın.
  2. Büyük lökosit sınıfları (granülositler, monositler, lenfositler) ayırt etmek için bir SSC vs CD45 arsa kullanın yaygın olarak açıklanan33,34.
    NOT: Bu sınıflandırma sadece müstehcendir ve hücre tipini doğrulamak için soya özgü belirteçlere ihtiyaç vardır.
  3. Tüm CD45+ hücreleri veya ilgi her lökosit alt kümesi için, floresan boncuk tespit edilir floresan izotiyoloit (FITC) kanalının bir histogramboncuk pozitif hücreler üzerinde bir belirteç ile gating tarafından ADCP aktivitesini ölçmek.
    NOT: Boncuk eklenmediği negatif kontrol kuyuları, boncuk pozitif hücrelerin histogramda nerede belirgin olduğunu ve bu nedenle gating markerin nereye yerleştirileceğini gösterir.
  4. ADCP skorlarını (boncuk pozitif hücrelerin ortanca floresan yoğunluğu [MFI] olarak) x (%pozitif popülasyondaki toplam CD45 + hücrelerin toplamı) olarak hesaplayın. Her Ab/serum konsantrasyonundaki puanları çizmek ve eğrinin altında bir alan (AUC) analizi yapmak için grafik yazılımını kullanın.
    NOT: AdCP, ADCP skoru AUC'nin spesifik olmayan negatif kontrol mAb'sinin 3x standart sapmasından büyükse pozitif kabul edilir (bu durumda, 3865).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Süt oda sıcaklığında veya soğutucuda saklanabilir (dondurulmuş olmasa da); ancak, sütün çok soğuk tutulduğunda (veriler gösterilmediğinde) daha az canlılık gözlemlediğimiz ve ortam sıcaklıklarında toplanması, depolanmasını ve taşınmasının daha kolay olduğu göz önüne alındığında, numunelerin soğutulmaması tavsiye edilir. örnek-numune değişkenliği. 7−183 gün sonra elde edilen sütte, otomatik hücre sayacı tarafından belirlenen hücre konsantrasyonu 16.083−222.857 hücre/mL arasında değişmektedir. Şekil 1, çift, enkaz ve ölü hücreleri ortadan kaldıran gating stratejisini göstermektedir. Canlılık ~90−99%' idi. Toplam canlı hücrelerin yaklaşık %1.6−12.3'ü CD45+ lökosittir (Tablo 1). En sözde monositler öncüleri / olgunlaşmamış hücreler daha önce açıklandığı gibi, müstehcen SSC vs CD45 gating34dayalı olduğu ortaya çıktı. Sözde monositler SSCdüşük-orta/CD45düşükolarak tanımlanmıştır, ancak birkaç iddia edilen lenfosit popülasyonundan farklı yüksek CD45 boyama düzeyleri sergilenmiştir (SSCdüşük/ CD45düşük) daha tipik kan monositleri ile ilişkili (Şekil 1), önceki çalışmalara benzer33,34. Sözde granülositler SSCyüksek/CD45 ara33,34 (Tablo 1) olarak tanımlanmıştır. Bu sınıflandırmanın yalnızca müstehcen olduğunu ve hücre türünü doğrulamak için soya özgü belirteçler gerekeceğini unutmayın.

Yeni izole BM hücrelerinin ADCP aktivitesi HIV'e özgü insan mAb 830A kullanılarak ölçüldü, bu hiv zarfının V2 bölgesine özgüdür ve burada test edilen V1V2-2F5K antijenine bağlanır. AdCP aktivitesi burada 1 ay sonrası elde edilen süt kullanılarak ölçüldü (Şekil 2A). Örnek veriler, CD45+ hücrelerde gating yaparken görülen beklenen FITC (boncuk+) histogramlarını gösterir (1 μg/mL mAb kullanılarak oluşturulan veriler gösterilir). Siyah işaretçiler, ADCP puanlarını hesaplamak için kullanılan popülasyonları gösterir. Örnek830A verilerinde (Şekil 2A'nınilk paneli), CD45+ hücrelerin yüzdesi ve bu popülasyonun ortalama floresansı gösterilir ve bu veriler 3.4'teki denklemi kullanarak ADCP puanını hesaplamak için kullanılır. Ab-bound/antijen-çiftleşmiş boncuklarla kuluçkadan önce aktin inhibitörü sitokasin-D (sitod) ve/veya FcR-bloke edici Abs (FcBlock) ile önceden kuluçkaya yatan hücreler, KONTROL mAb 3865 veya altında ADCP aktivitesi sergileyerek ADCP FcR olduğunu gösterir ve aktine bağımlı (Şekil 2). Toplam CD45+ hücreler için belirlenen ADCP skoru negatif kontrol anti-şarbon mAb 3865 kullanılarak tanımlanan arka plan seviyelerinin ~25−35 kat üzerindeydi. Her büyük alt küme ayrı ayrı da analiz edildi. Sözde granülositler ADCP aktivitesi ~ 12−29 kat arka plan daha yüksek sergiledi. Sözde monosit ADCP ~ 2−3 kat arka plan üzerinde(Şekil 2)idi. Beklendiği gibi sözde lenfositler herhangi bir ölçülebilir ADCP aktivitesi göstermedi (non-spesifik negatif kontrol mAb 3865 ADCP skoru AUC az 3x standart sapma; veriler gösterilmedi).

Figure 1
Şekil 1: Anne sütünden izole edilen hücrelerin örnek akış sitometri verileri. Hücreler protokolde açıklandığı gibi işlendi ve lekelendi. (A) Tek hücreler, fsc-h vs FSC-A arsada doublet'leri ortadan kaldırmak için geçitli ydi, ayrıca FSC-A'daki küçük enkaz <5,000'i de dışarı çıkardı. (B) Bu popülasyon, Bir SSC vs. V450 (canlılık lekesi) çiziminde canlı hücrelere (canlılık boyasıyla leke olmayan) geçit yapmak için kullanılmıştır. (C) Bu canlı hücreler Bir FSC vs SSC arsa kullanılmıştır. Ağırlıklı olarak meme epitel hücreleri olması muhtemel olan lökosit olmayanların beklenen konumu vurgulanır ("E"). (D) Aynı FSC vs SSC çizimi yalnızca CD45+ hücreleri ile gösterilir. Belirtilen başlıca lökosit alt kümeleri sadece köklü ve beklenen SSC parametrelerine (G = granülositler; M = monositler; L = lenfositler). (E) Canlı hücreler büyük lökosit alt kümeleri belirtilen bir SSC vs CD45 arsa için kullanılmıştır. Bu çizimden geriye doğru, D panelinde gösterilen verileri ortaya çıkar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Anne sütünden izole edilmiş hücreleri kullanarak ADCP verilerini örneklendirin. Yapılan ADCP tsalimi, Ackerman ve ark.30'danuyarlanan teste dayanmaktadır. Tsurus, yukarıdaki protokolde belirtildiği gibi gerçekleştirilmiştir. (A) ÖRNEK FITC histogramları 1 μg/mL mAb'de, ADCP skorunu belirlemek için kullanılan boncuk/FITC+ popülasyonlarını gösteren belirteçlerle birlikte. Skorlar (boncuk pozitif hücrelerin MFI'si) x (% boncuk/FITC+ pozitif popülasyondaki toplam CD45+ hücrelerin ini) olarak hesaplandı. Sadece mAb 830A kullanan ilk panel, toplam CD45+ hücrelerin yüzdesini ve bu örnekteki ADCP puanını hesaplamak için kullanılan ortalama floresan yoğunluk değerini de gösterir. (B) Grafik yazılımındaki her mAb seyreltme testindeki ADCP puanları, grafik yazılımındaki eğri altı (AUC) değerlerini hesaplamak için kullanılmıştır. Kontrol deneyleri için, aktin inhibitörü sitokasin-D (sitoD), FcR blokaj ajanı (FcBlock), ya da her ikisinin bir kombinasyonu bağışıklık komplekslerine katılmadan önce hücrelerle önceden kuluçkaya yatırılmıştır (bkz. Bu hücre sınıflandırması sadece müstehcen olduğunu ve hücre türünü onaylamak için soya özgü belirteçler gerekli olduğunu unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Örnek Hücreler/mL % CD45+ % Granülositler*  % Monositler*
1 222,857 12.3 ± 1.9 13.6 ± 3.8 65,9 ± 5,6
2 27,361 1.6 ± 0.01 25.2 ± 4.0 9.1 ± 5.6
3 161,486 3.6 ± 1.1 47.8 ± 6.8 24.3 ± 4.3
4 16,083 2.7 ± 0.1 17.9 ± 3.5 34.4 ± 1.0
5 25,155 4.0 ± 0.7 29.7 ± 2.6 20.5 ± 1.4
*CD45+ hücrelerin

Tablo 1: Tipik anne sütü hücre sayıları ve özelliklerine örnekler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada tanımlanan ADCP aktivitesini ölçmek için akış sitometrisi bazlı teknik ilk olarak 201130 yılında tanımlanmış ve o zamandan beri sağlam olduğu kanıtlanmıştır ve 80'den fazla çalışmada belirtilmiştir. Burada açıklanan protokol, bu tekniği ilk kez birincil BM hücreleriyle kullanılmak üzere uyarlar. BM hücreleri tarafından Fc aracılı işlevsellik önceki çalışmalar büyük ölçüde oksidatif patlamalar veya histoloji tabanlı fagositoz testleri kolostrum izole hücreleri kullanarak ölçümü ile sınırlı olmuştur (0−4 gün doğumdan sonra). Hemen hemen hiçbir çalışma kolostrum aşamasında geçmiş insan BM hücreleri inceledik. Kolostral hücreleri kullanarak yapılan çalışmalar genellikle kolostrumgranositlerin kandan izole edilenlerden daha az aktif olduğu sonucuna varmışlardır, ekstravasküler uzaya taşınmış bir 'eksüda hücresi' gibi davranan35, çelişkili çalışmalar olsa da benzer fagositik ve bakterisidal kapasiteleri bildirilmiştir36.

Bm lökositleri tanımlamak için on yıllardır geleneksel mikroskopi kullanıldı ve bu tür görsel tanımlamalar hücre yanlış teşhisine yol açmış olabilir1. Birkaç çalışma da bm lökosit bileşimi emzirmenin ilk ayı ötesinde karşılaştırıldığında var, ve çoğu kolostrum üzerinde duruldu. Hücreleri tanımlamak için akış sitometrisinin kullanımı hücreleri doğru bir şekilde tanımlamak için olasıdır, ancak genellikle çok az bir örnek numarası ile, bu yöntem kullanılarak bm çalışmaları sadece az sayıda yapılmıştır. Mevcut çalışmalar, bm'nin laktasyonun tüm aşamalarındaki lökosit içeriğinin, erken kolostrumda ~104−7 x 105 lökosit/mL arasında değişen, olgun sütte 103−5 x 104 lökosit/mL'ye kadar geniş bir yelpazede değiştiğini göstermiştir. tüm çalışmalar hücre konsantrasyonu ve bileşimi güçlü emzirme aşamasında etkilenir onaylamak rağmen1,2,3,4,5. Süt olgun bileşimine geçerken nötrofil konsantrasyonu artmaktadır, ancak bu tür çalışmalar genellikle doğum sonrası ilk ayın ötesine geçmemiş34.

Burada açıklanan protokol fagositik hedef olarak floresan boncuklar kullanır, ancak immün kompleksler ve enfekte hücreler gibi çeşitli biyolojik olarak ilgili çeşitli hedeflerin BM ADCP'nin incelenmesi nde uygulanabilir ve çeşitli Ab izotipleri tarafından tetiklenebilir ve Alt. Lökositleri daha fazla ayırt etmek için daha büyük bir hücre boyama paneli kullanılabilir. Bu ilgili birincil hücreler tarafından ADCP'nin kapsamlı bir şekilde anlaşılması için büyük çalışmalar esas olacaktır. Bu protokol, HIV MTCT azaltılması için potansiyel bir mekanizma olarak BM lökositler tarafından ADCP kurulması için izin verir, yanı sıra diğer patojenler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi Tıp Bölümü ve Mikrobiyoloji Bölümü'nden Dr. Susan Zolla-Pazner'a makale incelemesi için teşekkür ederiz. NIH/NICHD bu proje için R21 HD095772-01A1 hibe numarası altında fon sağladı. Buna ek olarak, R. Powell Tıp Bölümü, Bulaşıcı Hastalıklar Bölümü, Mount Sinai Icahn Tıp Okulu fonları tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres  Thermo Fisher F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD 560975
Bovine serum Albumin MP Biomedicals 8810025
Corning V-bottom polystyrene 96-well plate  Corning  3894
Cytochalasin D Sigma 22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit  Thermo Fisher 21338
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352196
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352070
Fixable Viability Stain 450  BD 562247
Formaldehyde solution Sigma 252549 
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red Life Technologies 14175-095
Human BD Fc Block BD 564219
Human Serum Albumin MP Biomedicals 2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional  34120
PBS 1x pH 7.4 Thermo Fisher 10010023
Polystyrene 10 mL Serological Pipettes  Corning  4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL Pierce 88512

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29, (2), 171-182 (2013).
  2. Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77, (6), 1537S-1543S (2003).
  3. Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39, (2), 296-306 (1984).
  4. Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3, (5), 713-720 (1984).
  5. Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6, (3), 267-275 (2015).
  6. Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89, (3), 252-258 (2000).
  7. Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13, (3), 282-290 (1992).
  8. Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64, (7 Spec No), 930-933 (1989).
  9. Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101, (4), 570-580 (2000).
  10. Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
  11. Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11, (6), e0156762 (2016).
  12. Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
  13. Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96, (5), 1071-1078 (2012).
  14. Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126, (5 Pt 1), 696-702 (1995).
  15. WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355, (9202), 451-455 (2000).
  16. World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).
  17. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90, (10), 4951-4965 (2016).
  18. Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197, (3 Suppl), S3-S9 (2007).
  19. Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10, (12), e0145150 (2015).
  20. Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85, (18), 9555-9567 (2011).
  21. Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4, (143), 143sr143 (2012).
  22. Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17, (4), 500-506 (2015).
  23. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89, (19), 9952-9961 (2015).
  24. Ackerman, M., Nimmerjahn, F. Antibody Fc. Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
  25. Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166, (12), 7381-7388 (2001).
  26. Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82, (6), 2772-2783 (2008).
  27. Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81, (17), 9551-9555 (2007).
  28. Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
  29. Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92, (2), 262-270 (2011).
  30. Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366, (1-2), 8-19 (2011).
  31. Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90, (24), 11007-11019 (2016).
  32. Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9, (9), e1003618 (2013).
  33. Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31, (3), 148-153 (2011).
  34. Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10, (8), e0135580 (2015).
  35. Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17, (4), 424-433 (1993).
  36. Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44, (1), 1-7 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics