Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV

Immunology and Infection

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Summary

O leite materno transmite o vírus da imunodeficiência humana (HIV), embora apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV sejam infectados. Lactentes amamentados ingeriram ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora essas células sejam subestudadas. Aqui nós descrevemos a isolação de leucócito do leite de peito e uma análise de sua capacidade fagocitária.

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Powell, R. L., Fox, A. Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets. J. Vis. Exp. (151), e60149, doi:10.3791/60149 (2019).

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Abstract

Mesmo na ausência de medicamentos antirretrovirais, apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV tornam-se infectados, sugerindo um forte efeito protetor do leite materno (BM). A menos que o acesso à água potável e à fórmula infantil apropriada seja confiável, a OMS não recomenda a cessação do aleitamento materno para as mães infectadas pelo HIV. Inúmeros fatores provavelmente funcionam em conjunto para reduzir a transmissão da BM. Lactentes amamentados ingerir ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora o que permanece em grande parte obscuro é a contribuição dessas células para as qualidades antivirais do BM. atualmente, objetivou-se isolar as células do BM humano para medir fagocitose celular anticorpo-dependente (ADCP), uma das respostas imunes inata as mais essenciais e as mais Pervasive, por fagócitos do BM de encontro aos alvos do HIV. As células foram isoladas de 5 amostras de BM humanas obtidas em vários estágios de lactação. A isolação foi realizada através da centrifugação delicada seguida pela remoção cuidadosa da gordura de leite e da lavagem repetida da pelota da pilha. Os grânulos fluorescentes revestidos com o epítopo do envelope do HIV (env) foram usados como alvos para a análise de ADCP. As pilhas foram manchadas com o marcador de superfície CD45 para identificar leucócito. Verificou-se que a atividade da ADCP foi significativa acima dos experimentos de controle e mensurável através de um anticorpo 830A específico para o HIV.

Introduction

O leite materno humano (BM) é constituído por células maternas que são > 90% viáveis1. A composição celular é fortemente impactada pelo estágio de lactação, estado de saúde da mãe e do lactente, e variação individual, que permanece pouco compreendida1,2,3,4. Dado que o BM contem ~ 103− 105 leucócito/ml, pode-se estimar que os infantes amamentados ingerem ~ 105− 108 leucócitos maternos diários5. Vários estudos in vivo demonstraram que os leucócitos maternos fornecem imunidade crítica ao lactente e são funcionais bem além desses sítios de ingestão inicial5,6,7,8 ,9,10,11. Todas as células derivadas da maternally ingeridas pelo lactente têm potencial para realizar funções imunes ao lado ou para compensar os leucócitos próprios do lactente12.

A transmissão materno-infantil (MTCT) do vírus da imunodeficiência humana (HIV) continua a ser uma crise em países com recursos limitados. Como as doenças diarreicas e respiratórias são responsáveis por taxas substanciais de mortalidade entre lactentes em países com recursos limitados, e essas doenças são significativamente reduzidas pelo aleitamento materno exclusivo, os benefícios para as mães infectadas pelo HIV a amamentação supera em muito os riscos13,14,15. A menos que o acesso à água potável e à fórmula infantil adequada seja confiável, a OMS não recomenda a cessação do aleitamento materno para mães infectadas pelo HIV16. Aproximadamente 100.000 MTCTs via BM ocorrem anualmente; no entanto, apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por suas mães infectadas pelo HIV tornam-se infectados, sugerindo um forte efeito protetor da BM17,18,19,20,21. Inúmeros fatores provavelmente funcionam em conjunto para evitar a transmissão. Importante, os anticorpos HIV-específicos (ABS) no BM foram correlacionados com o MTCT reduzido e/ou a morte infantil reduzida da infecção de HIV22,23. O que permanece em grande parte obscuro é a contribuição da fração celular da BM para suas qualidades antivirais.

Muitos ABS facilitam uma variedade de atividades antivirais mediadas pela região ' constante ' da molécula de imunoglobulina, o fragmento cristalizável (FC), através da interação com receptores FC (FcRs) encontrados em praticamente todas as células imunes inatas, praticamente todos os quais são encontrados em humanos BM24. O fagocitose celular anticorpo-dependente (ADCP) foi demonstrado como necessário para o afastamento de infecções virais e foi subestudado no caso da prevenção do MTCT do HIV25,26,27, 28 anos de , 29. dada a escassez de conhecimento sobre a potencial contribuição da atividade da ADCP pelos FAGOÓCITOS da BM para a prevenção da MTCT do HIV, objetivou-se desenvolver um método rigoroso para isolar as células da BM humana, a fim de realizar um estudo de ADCP mediado por células de BM Obtido em vários estágios de lactação.

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Protocol

Cada participante deste estudo foi recrutado e entrevistado de acordo com a aprovação do Conselho de ética e de revisão institucional (IRB) com a orientação e autorização do programa de proteção de sujeitos humanos (PPHS) do Monte Sinai, utilizando um protocolo para obtenção de amostras de leite materno.

1. target microsphere preparação

  1. Selecione um antígeno de destino relevante.
    Nota: neste exemplo, a proteína recombinante V1V2-2f5k foi usada, que foi projetada imitar o vértice trimérico do envelope nativo30do HIV.
  2. Realize a biotinilação usando um kit comercial (tabela de materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
    1. Calcule o mmol do reagente da biotina para adicionar à reação para um excesso do molar de 5 dobras usando a fórmula: mmol biotina = ml proteína x (proteína do magnésio protein/mL) x (proteína da biotina/magnésio do mmol) x (proteína da biotina/mmol de 5 mmol)30,31. Em seguida, calcule μL do reagente de biotina para adicionar utilizando a fórmula: μL de biotina = mmol biotina x (1 milhão μL/L) x (L/10 mmol).
    2. Equilibram a biotina à temperatura ambiente antes da abertura. Dissolva a proteína em 0,5 − 2,0 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) de acordo com o cálculo feito acima.
    3. Prepare uma solução de 10 mM de reagente de biotina em dimetilsulfóxido (DMSO) e adicione o volume apropriado de 10 mM de reagente de biotina à solução proteica, e incubar reação no gelo por 2 h ou em temperatura ambiente por 30 min.
  3. Remover excesso de biotina usando concentradores de proteínas (polietersulfona [PES] membranas, 3 kDa peso molecular Cut-off [MWCO], 0,5 mL; Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Deposite a amostra na câmara superior da coluna de giro e adicione PBS até 400 μL. Cap, em seguida, insira esta câmara de amostra em um tubo de coleta. Centrifugador a 12.000 x g à temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Descarte o fluxo e adicione PBS a 400 μL. Repita a centrifugação. Descarte o fluxo e adicione PBS a 100 μL. Meça a concentração da proteína por um espectrofotômetro.
      Nota: a proteína pode ser aliquotada e congelada a-80 ° c até ser usada.

2. anticorpo-dependente de phagocytosis celular (ADCP) preparação placa de ensaio

  1. Conjugar proteínas biotiniladas a 1 μm de microesferas (' grânulos '; Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Por placa de grânulos conjugados, incubar 6 μg de proteína com 12 μL de grânulos de estoque em 200 μL de 0,1% de albumina sérica bovina (BSA)-PBS à temperatura ambiente por 1 h, vortexing suavemente a cada 20 min.
    2. Centrifugador a 13.000 x g durante 5 min. descarte o sobrenadante, vórtice suavemente e ressuscitará em 1200 μL de 0,1% de BSA-PBS. Repita a rotação e a etapa de lavagem 2x. Ressuscito em 1200 μL de 0,1% de BSA-PBS.
  2. Alíquota 10 μL de solução de cordão por poço em uma placa de fundo redondo 96-well. Prepare diluições de anticorpos ou soros imunes de interesse em 12 μL de HSA HBSS a 2%, tipicamente a partir de 50 μg/mL de anticorpo ou uma diluição sérica de 1/100.
    Nota: nos dados amostrais, utilizou-se o anticorpo monoclonal (mAb) 830A.
  3. Adicionar 10 μL de anticorpo titulado/soro à placa do talão e incubar durante 2 h a 37 ° c. Adicionar 200 μL de HSA HBSS de 2% a cada poço e placa de centrifugação a 2.000 x g durante 10 min.
  4. Remova com cuidado o sobrenadante por um rápido derrubamento e decantação do líquido dos poços da placa em um dissipador para evitar perturbar a pelota invisível do grânulo.

isolação da pilha do leite 3. Breast

  1. Obter leite materno humano de mulheres lactantes saudáveis, expressas usando bombas eletrônicas ou manuais duplas. Isolar células dentro de ~ 4 h de expressão, mantendo o leite à temperatura ambiente.
  2. Usando 50 mL de tubos, centrífuga 50 mL de leite em 800 x g por 15 min. cuidadosamente despeje o leite desnatado e gordura, deixando a pelota celular não perturbado. Limpe o interior do tubo com uma limpeza sem fiapos para remover toda a gordura da parede do tubo.
  3. Adicionar 10 mL de 2% de albúmen de soro humano na solução de sal equilibrado de Hank (2% HSA HBSS [sem CA2 + ou mg+]). Resuspend o pellet por pipetagem suave para evitar a ativação celular e apoptose. Transferir para um tubo de 15 mL e centrifugar a 450 x g durante 10 min.
  4. Despeje o sobrenadante e repita o passo 1,3. Em seguida, reressuscitando suavemente as células em 1 − 2 ml de 2% HSA HBSS dependendo do número de célula esperado, e contagem de células por um hemocitômetro ou um contador de células automatizado, observando também a viabilidade celular.

ensaio 4. ADCP

Nota: os métodos descritos aqui são adaptados de Ackerman et al.32.

  1. Adicionar 50.000 células BM recém-isoladas para cada placa de ensaio ADCP bem em 200 μL de 2% HSA-HBSS. Incubar por 2 h a 37 ° c.
    1. Para experimentos de controle, pré-incubar células a 37 ° c com 10 μg/mL de inibidor de actina (cytochalasin-D), 50 μg/mL de agente de bloqueio FcR (FcBlock), ou uma combinação de ambos antes de sua adição às placas.
  2. Placa centrífuga a 930 x g por 10 min. Adicione 200 μL de 2% de HSA HBSS e repita a centrifugação. Remova cuidadosamente o sobrenadante como na etapa 2,7 e repita a lavagem.
  3. Retire cuidadosamente as células sobrenadantes e de mancha para a viabilidade utilizando 0,5 μg/mL (concentração final) de viabilidade fixável mancha 450 por poço em 50 μL de 2% HSA HBSS. Incubar 20 min à temperatura ambiente no escuro. Placa do centrifugador em 930 x g por 10 minutos e remova o sobrenadante como na etapa 2,7. Adicionar 200 μL de 2% HSA HBSS e placa centrífuga novamente seguido por remoção de sobrenadante como no passo 2,7.
  4. Após a coloração da viabilidade, as pilhas da mancha para marcadores da leucócito do interesse, incluindo minimamente uma mancha CD45-specific tal como o CD45 do PE-rato anti-Human (clone HI30) em uma concentração aperfeiçoada (1 μg/μL em 50 μL de 1% BSA HBSS nos dados do exemplo).
    Nota: quaisquer marcadores específicos de linhagem de interesse podem ser incluídos.
  5. Incubar 20 min à temperatura ambiente no escuro. Placa do centrifugador em 930 x g por 10 minutos e remova o sobrenadante como na etapa 2,7. Adicionar 200 μL de 1% de BSA HBSS e repetir a centrifugação. Remover sobrenadante. Fixar células em 200 μL de 0,5% de formaldeído no escuro à temperatura ambiente durante 30 min ou durante a noite a 4 ° c. Refrigerate no escuro até a análise.

5. análise por citometria de fluxo

  1. Realize a gating inicial para eliminar doublets em um gráfico de dispersão (FSC) versus dispersão lateral (SSC) e detritos (material menor que o FSC = 5000) (veja a Figura 1). Use um SSC vs. viabilidade mancha (V450 neste caso) parcela para eliminar as células mortas (aqueles que são positivos para a mancha de viabilidade).
  2. Use um gráfico SSC vs. CD45 para diferenciar as principais classes de leucócitos (granulócitos, monócitos, linfócitos), conforme descrito extensivamente33,34.
    Nota: esta classificação é apenas sugestivo e marcadores específicos de linhagem são necessários para confirmar o tipo de célula.
  3. Para todas as células CD45 +, ou para cada subconjunto leucocitário de interesse, medir a atividade do ADCP por gating com um marcador nas células talão-positivas em um histograma do isotiocianato de fluoresceina (FITC) canal, onde os grânulos fluorescentes são detectados.
    Nota: os poços de controle negativo em que os grânulos não foram adicionados indicará onde as pilhas grânulo-positivas são aparentes no histograma e conseqüentemente onde coloc o marcador de gating.
  4. Calcule os escores de ADCP como (intensidade de fluorescência mediana [MFI] de células de cordão positivo) x (% do total de células CD45 + na população positiva). Use o software gráfico para plotar pontuações em cada concentração de AB/soro e para executar uma análise de área a curva (AUC).
    Nota: o ADCP é considerado positivo se a AUC for superior a 3x desvio-padrão da AUC da Pontuação do ADCP de um controlo negativo não específico mAb (neste caso, 3865).

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Representative Results

O leite pode ser mantido à temperatura ambiente ou refrigerador (embora não congelado); no entanto, uma vez que observamos uma redução da viabilidade quando o leite foi mantido muito frio (dados não mostrados), e que é mais simples de recolher, armazenar brevemente, e transportar a temperaturas ambiente, recomenda-se que as amostras não são refrigeradas, a fim de reduzir variabilidade amostra-amostra. No leite obtido 7 − 183 dias após o parto, a concentração celular determinada pelo contador automatizado de células variou de 16083 − 222857 Cells/mL. A Figura 1 ilustra a estratégia de gating que elimina doublets, restos, e pilhas inoperantes. A viabilidade era ~ 90 − 99%. Aproximadamente 1,6 − 12,3% do total de células ao vivo foram CD45+ leucócitos (tabela 1). A maioria de monócitos purported pareceu ser precursores/pilhas imaturas como descrito previamente, baseado no SSC sugestivo contra o CD45 que gating34. Os monócitos purported foram definidos como baixointermediário de/CD45 do SSCbaixa, embora poucos exibiram os níveis de mancha CD45 mais elevados distintos da população suposta do linfócito (baixo/CD45doSSC baixo)mais tipicamente associada a monócitos sanguíneos (Figura 1), semelhante aos estudos prévios33,34. Os granulócitos supostos foram definidos como SSCHigh/CD45Intermediate33,34 (tabela 1). Observe que essa classificação é apenas sugestiva e que marcadores específicos de linhagem seriam necessários para confirmar o tipo de célula.

A atividade de ADCP das pilhas recentemente isoladas do BM foi medida usando o humano HIV-específico mAb 830A, que é específico para a região v2 do envelope do HIV e liga-se ao antígeno de V1V2-2F5K testado aqui. A atividade do ADCP foi mensurada para o exemplo aqui utilizando o leite obtido em 1 mês após o parto (Figura 2A). Os dados de exemplo mostram os histogramas FITC (bead +) esperados observados quando se gating em células CD45+ (dados gerados usando 1 μg/ml MAB é mostrado). Os marcadores pretos indicam as populações utilizadas para calcular os escores do ADCP. Nos dados da amostra 830A (primeiro painel da Figura 2a), a porcentagem de células CD45+ e a fluorescência média dessa população são mostradas, que foram utilizadas para calcular o escore do ADCP utilizando a equação na etapa 3,4. As células pré-incubadas com inibidor de actina cytochalasin-D (cytoD) e/ou ABS de bloqueio de FcR (FcBlock) antes de sua incubação com os grânulos AB-Bound/antígeno-acoplados exibiram a atividade de ADCP no nível do controle mAb 3865 ou abaixo, indicando que o ADCP era FcR e actina-dependente (Figura 2). A Pontuação do ADCP determinada para o total de células CD45+ foi de ~ 25 − 35 vezes acima dos níveis de fundo definidos usando o antiantraz de controle negativo MAB 3865. Cada subconjunto principal foi analisado separadamente também. Os granulócitos purported exibiram a atividade de ADCP ~ 12 − 29-dobre mais altamente do que o fundo. O ADCP purported do monocyte era ~ 2 − 3-dobre acima do fundo (Figura 2). Os linfócitos purported como esperado não exibiram nenhuma atividade mensurável de ADCP (menos do que o desvio padrão 3x da AUC da contagem de ADCP do controle negativo não específico mAb 3865; dados não mostrados).

Figure 1
Figura 1: dados de citometria de fluxo de amostras de células isoladas do leite materno. As células foram processadas e manchadas conforme descrito no protocolo. (A) as únicas células foram bloqueadas para eliminar os doublets em um lote FSC-H vs. FSC-a como mostrado, também gating os pequenos detritos < 5000 no FSC-a. (B) esta população foi utilizada para o portão em células ao vivo (que não mancham com o corante de viabilidade) em um gráfico SSC vs. V450 (mancha de viabilidade). (C) essas células ao vivo foram utilizadas em um gráfico FSC vs. SSC. Destaca-se a posição esperada de não-leucócitos, susceptíveis de serem predominantemente células epiteliais mamárias ("E"). (D) o mesmo gráfico FSC vs. SSC é mostrado somente com células CD45+ . Os subconjuntos principais da leucócito anotados são somente as identidades supostas baseadas em parâmetros bem estabelecidos e esperados do SSC (G = granulocytes; M = monócitos; L = linfócitos). (E) células viáveis foram utilizadas para um gráfico SSC vs. CD45 com os principais subconjuntos leucocitário observados. O back-gating deste gráfico rendeu os dados mostrados no painel D. Observe que essa classificação é apenas sugestiva e que marcadores específicos de linhagem são necessários para confirmar o tipo de célula. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: dados da amostra de ADCP utilizando células isoladas do leite materno. O ensaio de ADCP realizado baseia-se no ensaio adaptado de Ackerman et al.30. O ensaio foi realizado conforme descrito no protocolo acima. (A) histogramas de FITC de amostra em 1 μg/ml de MAB, com marcadores indicando as populações de bead/FITC + utilizadas para determinar o escore do ADCP. Os escores foram calculados como (MFI de células talão-positivas) x (% do total de células CD45+ na população de bead/FITC + positivo). O primeiro painel que usa o mAb 830A sozinho igualmente indica a porcentagem do total CD45+ Cells e o valor médio da intensidade da fluorescência usado para calcular a contagem de ADCP nesse exemplo. (B) os escores de ADCP em cada diluição de MAB analisados foram utilizados para calcular os valores da área a curva (AUC) no software gráfico. Para experimentos de controle, o inibidor de actina cytochalasin-D (cytoD), o agente de bloqueio de FcR (FcBlock), ou uma combinação de ambos foram pré-incubados com células antes de sua adição aos complexos imunes (ver lendas). Observe que essa classificação de célula é apenas sugestiva e que marcadores específicos de linhagem são necessários para confirmar o tipo de célula. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostra Células/mL % CD45+ Granulócitos  Monócitos
1 222.857 12,3 ± 1,9 13,6 ± 3,8 65,9 ± 5,6
2 27.361 1,6 ± 0, 1 25,2 ± 4,0 9,1 ± 5,6
3 161.486 3,6 ± 1,1 47,8 ± 6,8 24,3 ± 4,3
4 16.083 2,7 ± 0,1 17,9 ± 3,5 34,4 ± 1,0
5 25.155 4,0 ± 0,7 29,7 ± 2,6 20,5 ± 1,4
* de CD45+ Cells

Tabela 1: exemplos de contagens e características típicas de células do leite materno.

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Discussion

A técnica baseada em citometria de fluxo para medir a atividade da ADCP descrita neste documento foi descrita pela primeira vez em 201130 e desde então tem sido comprovada robusta e citada em mais de 80 estudos. O protocolo descrito aqui adapta esta técnica para uso com células BM primárias pela primeira vez. Estudos prévios sobre a funcionalidade mediada pelo FC por células BM têm sido largamente limitados à mensuração de rajadas oxidativas ou ensaios de fagocitose baseados em histologia usando células isoladas do colostro (0 − 4 dias após o nascimento). Virtualmente nenhum estudo examinou pilhas no BM humano após a fase do colostro. Estudos que utilizam células colostrais geralmente concluíram que os granulócitos no colostro são menos ativos do que os isolados do sangue, comportando-se como uma "célula exsudato" que se moveu para o espaço extravascular35, embora estudos conflitantes tenham relataram capacidades fagocíticas e bactericidas semelhantes36.

Durante décadas, a microscopia tradicional foi utilizada para identificar leucócitos da BM, e esse tipo de identificação visual pode ter levado à misidentificação celular1. Poucos estudos compararam a composição leucocitária da BM além do primeiro mês de lactação, e a maioria se concentrou no colostro. O uso de citometria de fluxo para identificar células é susceptível de identificar com precisão as células, embora apenas um pequeno número de estudos de BM tenha sido feito usando este método, muitas vezes com um número de amostra muito pequeno. Estudos atuais indicaram que o conteúdo leucocitário da BM em todas as fases da lactação varia amplamente, variando de ~ 104− 7 x 105 leucócitos/ml no colostro precoce, diminuindo para 103− 5 x 104 leucócitos/ml em leite maduro, Embora todos os estudos confirmem que a concentração e a composição celular são fortemente impactadas pelo estágio de lactação1,2,3,4,5. Enquanto o leite transita para sua composição madura, a concentração do neutrófilo parece aumentar, embora tais estudos não estendessem tipicamente além do primeiro mês após o parto34.

O protocolo aqui descrito utiliza grânulos fluorescentes como alvo fagocítico, embora possa ser aplicado no estudo do BM ADCP de uma variedade de alvos mais biologicamente relevantes, como imunocomplexos e células infectadas, desencadeados por vários isotipos de AB e Subclasses. Uma pilha maior que mancha o painel pode ser empregada para diferenciar mais os leucócito. Grandes estudos serão essenciais para desenvolver uma compreensão abrangente da ADCP por essas células primárias relevantes. Este protocolo permite o estabelecimento de ADCP por leucócitos BM como um mecanismo potencial para a redução do MTCT do HIV, bem como outros patógenos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Susan Zolla-Pazner no departamento de medicina e departamento de Microbiologia da Icahn School of Medicine no Monte Sinai para revisão do manuscrito. O NIH/NICHD forneceu financiamento para este projeto o número de subvenção R21 HD095772-01A1. Além disso, R. Powell foi apoiado por fundos do departamento de medicina, divisão de doenças infecciosas, Icahn escola de medicina no Monte Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres  Thermo Fisher F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD 560975
Bovine serum Albumin MP Biomedicals 8810025
Corning V-bottom polystyrene 96-well plate  Corning  3894
Cytochalasin D Sigma 22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit  Thermo Fisher 21338
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352196
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352070
Fixable Viability Stain 450  BD 562247
Formaldehyde solution Sigma 252549 
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red Life Technologies 14175-095
Human BD Fc Block BD 564219
Human Serum Albumin MP Biomedicals 2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional  34120
PBS 1x pH 7.4 Thermo Fisher 10010023
Polystyrene 10 mL Serological Pipettes  Corning  4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL Pierce 88512

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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