Isolamento dei leucociti dal latte materno umano per l'uso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli HIV

Immunology and Infection

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Summary

Il latte materno trasmette il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), anche se solo il 15% dei neonati allattati al seno da madri affette da HIV si infetta. I neonati allattati al seno ingeriscono 105x 108 leucociti materni al giorno, anche se queste cellule sono poco studiate. Qui descriviamo l'isolamento del latte materno leucociti e un'analisi della loro capacità fagocitica.

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Powell, R. L., Fox, A. Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets. J. Vis. Exp. (151), e60149, doi:10.3791/60149 (2019).

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Abstract

Anche in assenza di farmaci antiretrovirali, solo il 15% dei neonati allattati al seno da madri affette da HIV si infetta, suggerendo un forte effetto protettivo del latte materno (BM). A meno che l'accesso all'acqua pulita e la formula per neonati appropriata non siano affidabili, l'OMS non raccomanda la cessazione dell'allattamento al seno per le madri infette dall'HIV. Numerosi fattori probabilmente funzionano in tandem per ridurre la trasmissione di BM. I neonati allattati al seno ingeriscono al giorno 105x 108 leucociti materni, anche se ciò che rimane ampiamente poco chiaro è il contributo di queste cellule alle qualità antivirali della BM. la fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP), una delle risposte immunitarie innatee più essenziali e pervasive, da parte dei fagociti BM contro i bersagli HIV. Le cellule sono state isolate da 5 campioni di BM umani ottenuti in varie fasi dell'allattamento. L'isolamento è stato effettuato attraverso una delicata centrifugazione seguita da un'attenta rimozione del grasso di latte e il lavaggio ripetuto del pellet cellulare. Le perle fluorescenti rivestite con inviluppo HIV (Env) epitopo sono state utilizzate come obiettivi per l'analisi di ADCP. Le cellule sono state macchiate con il marcatore di superficie CD45 per identificare i leucociti. È stato scoperto che l'attività ADCP era significativa sopra gli esperimenti di controllo e riproducibilmente misurabile utilizzando un anticorpo specifico dell'HIV 830A.

Introduction

Il latte materno umano (BM) è costituito da cellule materne che sono >90% vitali1. La composizione cellulare è fortemente influenzata dallo stadio di allattamento, dallo stato di salute della madre e del bambino e dalla variazione individuale, che rimane poco compresa1,2,3,4. Dato che la BM contiene 103x 105 leucociti/mL, si può stimare che i neonati allattati al seno ingeriscano 105x 108 leucociti materni al giorno5. Vari studi in vivo hanno dimostrato che i leucociti materni forniscono immunità critica al bambino e sono funzionali ben oltre questi siti di ingestione iniziale5,6,7,8 ,9,10,11. Tutte le cellule di derivazione materna ingerite dal neonato hanno il potenziale per svolgere funzioni immunitarie a fianco o per compensare i leucociti del bambino12.

La trasmissione madre-bambino (MTCT) del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) rimane una crisi nei paesi con risorse limitate. Poiché le malattie diarrea e respiratorie sono responsabili di notevoli tassi di mortalità tra i neonati nei paesi con risorse limitate, e queste malattie sono significativamente ridotte dall'allattamento esclusivo al seno, i benefici per le madri infette da HIV l'allattamento al seno superano di gran lunga i rischi13,14,15. A meno che l'accesso all'acqua pulita e la formula per neonati appropriata non siano affidabili, l'OMS non raccomanda la cessazione dell'allattamento al seno per le madri infette da HIV16. Circa 100.000 MTCT tramite BM si verificano ogni anno; tuttavia, solo il 15% dei neonati allattati al seno dalle loro madri infette da HIV si infettano, suggerendo un forte effetto protettivo di BM17,18,19,20,21. Numerosi fattori probabilmente funzionano in tandem per impedire la trasmissione. È importante sottolineare che gli anticorpi specifici per l'HIV (Abs) in BM sono stati correlati alla riduzione dell'MTCT e/o alla riduzione della morte infantile per infezione da HIV22,23. Ciò che rimane in gran parte poco chiaro è il contributo della frazione cellulare di BM alle sue qualità antivirali.

Molti Abs facilitano una varietà di attività anti-virali mediate dalla regione "costante" della molecola di immunoglobulina, il frammento cristallizzabile (Fc), attraverso l'interazione con i recettori Fc (FcR) che si trovano praticamente su tutte le cellule immunitarie innate, praticamente tutte si trovano nell'uomo BM24. La fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP) è stata dimostrata come necessaria per lo sgombero delle infezioni virali ed è stata poco studiata nel caso della prevenzione dell'MTCT dell'HIV25,26,27, 28 mi la più del 24 , 29.Data la scarsità di conoscenze sul potenziale contributo dell'attività ADCP da parte dei fagociti BM alla prevenzione della MTCT dell'HIV, abbiamo mirato a sviluppare un metodo rigoroso per isolare le cellule dalla BM umana al fine di intraprendere uno studio di ADCP mediato da cellule da BM ottenuto in varie fasi di allattamento.

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Protocol

Ogni partecipante a questo studio è stato assunto e intervistato in accordo con l'approvazione dell'ente di revisione etico e istituzionale (IRB) con la guida e l'autorizzazione del Programma del Monte Sinai per la protezione dei soggetti umani (PPHS) utilizzando un per ottenere campioni di latte materno.

1. Preparazione della microsfera target

  1. Selezionare un antigene bersaglio pertinente.
    NOTA: In questo esempio è stata utilizzata la proteina ricombinante V1V2-2F5K, progettata per imitare l'apice trimerico della busta HIV nativa30.
  2. Eseguire la biotinylation utilizzando un kit commerciale (Tabella dei materiali) secondo il protocollo del produttore.
    1. Calcolare il mmol del reagente di biotina da aggiungere alla reazione per un eccesso molare di 5 volte utilizzando la formula: biotina mmol x proteina mL x (proteina mg/mL) x (proteina biotina mmol/mg) x (5 proteina biotina/mmolmmo)30,31. Quindi calcolare l'unità di reagente di biotina da aggiungere utilizzando la formula: biotina e biotina mmol x (1.000.000 x L/L) x (L/10 mmol).
    2. Biotina equilibrate a temperatura ambiente prima dell'apertura. Sciogliere le proteine in 0,5 mL di salina con buffer fosfato (PBS) secondo il calcolo sopra fatto.
    3. Preparare una soluzione di 10 mM di reagente di biotina in dimetilfossido di dimetilzolaro (DMSO) e aggiungere il volume appropriato di 10 mM reagente di biotina alla soluzione proteica, e incubare la reazione sul ghiaccio per 2 h o a temperatura ambiente per 30 min.
  3. Rimuovere la biotina in eccesso utilizzando concentratori proteici (poliethersulfone [PES] membrane, 3 kDa taglio del peso molecolare [MWCO], 0,5 mL; Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
    1. Depositare il campione nella camera superiore della colonna di spin e aggiungere PBS fino a 400 . Centrifuga a 12.000 x g a temperatura ambiente per 30 min.
    2. Scartare il flow-through e aggiungere PBS a 400 .L. Ripeti centrizione. Scartare il flow-through e aggiungere PBS a 100 .L. Misurare la concentrazione di proteine da uno spettrometro.
      NOTA: Le proteine possono essere congelate e congelate a -80 gradi centigradi fino all'uso.

2. Preparazione della piastra di analisi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP)

  1. Proteine biohoonilate coniugate a 1 semisfera ('perle'; Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
    1. Per piastra di perline coniugate, incubare 6 g di proteine con 12 litri di perline di stock in 200 -L di 0,1% di albumina di siero bovino (BSA)-PBS a temperatura ambiente per 1 h, vortice dolcemente ogni 20 min.
    2. Centrifuga a 13.000 x g per 5 min. Scartare supernatante, vorticare delicatamente e risospendere in 1200 - L di 0,1% BSA-PBS. Ripetere la rotazione e lavare il passaggio 2x. Risospendere in 1200 - L dello 0,1% BSA-PBS.
  2. Aliquota 10 l di soluzione di perline per bene in una piastra rotonda inferiore 96-bene. Preparare le diluizioni di anticorpi o di infiammazione immunitaria in una diminuzione del 2% del 2% di HSA HBSS, in genere a partire da 50 g/mL di anticorpo o una diluizione di 1/100 di siero.
    NOTA: nei dati di esempio è stato utilizzato l'anticorpo monoclonale (mAb) 830A.
  3. Aggiungere 10 l di anticorpi/sera titolati alla piastra di perline e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi. Aggiungere 200 L del 2% HSA HBSS ad ogni pozzo e centrifugare piastra a 2.000 x g per 10 min.
  4. Rimuovere con attenzione il supernatante con un rapido ribaltamento e decantazione del liquido dai pozzetti della piastra in un lavandino per evitare di disturbare il pellet di perline invisibile.

3. Isolamento delle cellule del latte materno

  1. Ottenere latte materno umano da donne in lattazione sane, espresso utilizzando doppie pompe elettroniche o manuali. Isolare le cellule entro 4 h di espressione, mantenendo il latte a temperatura ambiente.
  2. Utilizzando tubi da 50 mL, centrificare 50 mL di latte a 800 x g per 15 min. versare con attenzione il latte scremato e il grasso lasciando il pellet cellulare indisturbato. Pulire l'interno del tubo con una salvietta senza laminetta per rimuovere tutto il grasso dalla parete del tubo.
  3. Aggiungi 10 mL di albume di siero umano del 2% nella soluzione di sale equilibrato di Hank (2% HSA HBSS [senza Ca2 o Mg]). Risospendere il pellet con un leggero pipettaggio per evitare l'attivazione delle cellule e l'apoptosi. Trasferire in un tubo da 15 mL e centrifugare a 450 x g per 10 min.
  4. Versare il supernatante e ripetere il passaggio 1.3. Quindi, risospendere delicatamente le celle in 1-2 mL del 2% HSA HBSS a seconda del numero di cellulare previsto e contare le celle con un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato, notando anche la fattibilità cellulare.

4. Assay ADCP

NOTA: i metodi descritti di seguito sono adattati da Ackerman et al.32.

  1. Aggiungere 50.000 celle BM appena isolate a ciascun aumento di aspetto ADCP ben in 200 -L di 2% HSA-HBSS. Incubare per 2 h a 37 .
    1. Per gli esperimenti di controllo, le cellule pre-incubate a 37 s con 10 g/mL di actinio (cytochalasin-D), 50 agenti di blocco FCR (FcBlock) o una combinazione di entrambi prima della loro aggiunta alle piastre.
  2. Piastra di centrifuga a 930 x g per 10 min. Rimuovere con cautela il supernatante come nel passaggio 2.7 e ripetere il lavaggio.
  3. Rimuovere con attenzione le celle sovrnatali e macchiate per la redditività utilizzando 0,5 g/mL (concentrazione finale) macchia di vitalità fissabile 450 per pozzo in 50 : L del 2% HSA HBSS. Incubare 20 min a temperatura ambiente al buio. Centrifuga a 930 x g per 10 min e rimuovere supernatante come nel passo 2.7. Aggiungere di nuovo 200 L del 2% HSA HBSS e centrifugare, seguita dalla rimozione del super-natante come nel punto 2.7.
  4. Dopo la colorazione della vitalità, le celle di colorazione per i marcatori di leucocito di interesse, minimamente includendo una macchia specifica del CD45 come il CD45 anti-umano del topo PE (clone HI30) ad una concentrazione ottimizzata (1g/LL in 50 - L di 1% BSA HBSS nei dati di esempio).
    NOTA: è possibile includere eventuali indicatori di interesse specifici del lignaggio.
  5. Incubare 20 min a temperatura ambiente al buio. Centrifuga a 930 x g per 10 min e rimuovere supernatante come nel passo 2.7. Aggiungere 200 -L dell'1% di BSA HBSS e ripetere la centrifugazione. Rimuovere supernatante. Fissare le cellule in 200 - L di 0,5% formaldeide al buio a temperatura ambiente per 30 min o durante la notte a 4 gradi centigradi. Conservare in frigorifero al buio fino all'analisi.

5. Analisi per citometria di flusso

  1. Eseguire il gating iniziale per eliminare i doppietti su un grafico a dispersione in avanti (FSC) e in un grafico a dispersione laterale (SSC) e detriti (materiale più piccolo di FSC - 5000) (vedere la figura 1). Utilizzare un grafico SSC vs viability (V450 in questo caso) per eliminare le cellule morte (quelle positive per la colorazione di vitalità).
  2. Utilizzare un grafico SSC vs CD45 per differenziare le principali classi di leucociti (granulociti, monociti, linfociti) come ampiamente descritto33,34.
    NOTA: questa classificazione è solo suggestiva e sono necessari marcatori specifici per il lignaggio per confermare il tipo di cella.
  3. Per tutte le cellule CD45, o per ogni sottoinsieme di interesse leucocito, misurare l'attività ADCP gating con un marcatore sulle cellule di perline-positive in un istogramma del canale isotoniocianato (FITC) fluorescenano, dove vengono rilevate le perline fluorescenti.
    NOTA: I pozzi di controllo negativo in cui non sono state aggiunte perline indiche indiche indiche indicheranno dove le cellule sono evidenti nel tallone e quindi dove posizionare il marcatore di gating.
  4. Calcolare i punteggi ADCP come (intensità di fluorescenza mediana [MFI] di cellule perline positive) x (% del CD45 totale - cellule nella popolazione positiva). Utilizzare il software grafico per tracciare i punteggi ad ogni concentrazione ab/siero ed eseguire un'analisi dell'area sotto la curva (AUC).
    NOTA: ADCP è considerato positivo se l'AUC è maggiore di 3 volte deviazione standard del punteggio ADCP AUC di un mAb di controllo negativo non specifico (in questo caso, 3865).

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Representative Results

Il latte può essere mantenuto a temperatura ambiente o più fresco (anche se non congelato); tuttavia, dato che abbiamo osservato una minore vitalità quando il latte è stato mantenuto molto freddo (dati non mostrati), e che è più semplice raccogliere, conservare brevemente e trasportare a temperature ambiente, si raccomanda che i campioni non siano refrigerati al fine di ridurre variabilità da campione a campione. Nel latte ottenuto 7-183 giorni dopo il parto, la concentrazione cellulare determinata dal contatore cellulare automatizzato variava da 16.083,222.857 cellule/mL. La figura 1 illustra la strategia di gating eliminando doppie, detriti e cellule morte. Viabilità era di 90-99%. Circa l'1,6-12,3% delle cellule vive totali erano CD45- leucociti(tabella 1). La maggior parte dei presunti monociti sembravano essere precursori /cellule immature come descritto in precedenza, sulla base del suggestivo SSC contro CD45 gating34. I presunti monociti sono stati definiti come SSCa basso inter-intermedio/CD45basso, anche se pochi hanno esibito i più alti livelli di colorazione CD45 distinti dalla presunta popolazione di linfociti (SSClow/CD45low) più tipicamente associati a monociti del sangue (Figura 1), simili agli studi precedenti33,34. I presunti granulociti sono stati definiti come SSChigh/CD45intermediate33,34 ( Tabella1). Si noti che questa classificazione è solo suggestiva e che sarebbero necessari marcatori specifici del lignaggio per confermare il tipo di cella.

L'attività ADCP delle cellule BM appena isolate è stata misurata utilizzando il mAb 830A umano specifico dell'HIV, che è specifico per la regione V2 dell'involucro HIV e si lega all'antigene V1V2-2F5K testato qui. L'attività ADCP è stata misurata per l'esempio utilizzando latte ottenuto a 1 mese dopo il parto (Figura 2A). I dati di esempio mostrano gli istogrammi FITC previsti (perline) osservati durante il gating su CD45- celle (vengono mostrati i dati generati utilizzando 1 mAb g/mL). I marcatori neri indicano le popolazioni utilizzate per calcolare i punteggi ADCP. Nell'esempio vengono mostrati i dati 830A (primo pannello della figura 2A), vengono mostrate le celle CD45e la possibile fluorescenza media di tale popolazione, utilizzate per calcolare il punteggio ADCP utilizzando l'equazione nel passaggio 3.4. Le cellule pre-incubate con citochalasina-D inibitore di actina (cytoD) e/o Abs (FcBlock) che bloccano fcR (FcBlock) prima della loro incubazione con le perline ab-bound/antigene mostravano un'attività ADCP a livello di mAb 3865 di controllo o inferiore, indicando che ADCP era FcR dipendenti dall'actina (Figura 2). Il punteggio ADCP determinato per il totale del CD45- le cellule erano pari a 25-35 volte sopra i livelli di fondo definiti utilizzando il controllo negativo anti-anttrace mAb 3865. Ogni sottoinsieme principale è stato analizzato anche separatamente. I presunti granulociti mostravano un'attività ADCP di 12/29 volte superiore a quella dello sfondo. Il presunto moncito ADCP era di 2-3 volte sopra lo sfondo (Figura 2). I presunti linfociti come previsto non hanno mostrato alcuna attività ADCP misurabile (meno di 3 volte la deviazione standard dell'AUC del punteggio ADCP del controllo negativo non specifico mAb 3865; dati non mostrati).

Figure 1
Figura 1: Dati di citometria del flusso di campionamento di cellule isolate dal latte materno. Le cellule sono state elaborate e macchiate come descritto nel protocollo. (A) Le celle singole sono state chiuse per eliminare i doppietti in un complotto FSC-H contro FSC-A, come mostrato, sgravando anche i piccoli detriti <5.000 in FSC-A. (B) Questa popolazione è stata utilizzata per tenere il cancello sulle cellule vive (che non macchiano con il colorante di vitalità) in un terreno SSC vs V450 (viità). (C) Queste cellule vive sono state utilizzate in un grafico FSC contro SSC. Viene evidenziata la posizione prevista dei non leucociti, che potrebbero essere prevalentemente cellule epiteliali mammarie ("E"). (D) Lo stesso grafico FSC e SSC viene visualizzato solo con lecelle CD45. I principali sottoinsiemi di leukociti osservati sono solo presunte identità basate su parametri SSC ben consolidati e previsti (G - granulociti; M - monociti; L - linfociti). (E) Le cellule vitali sono state utilizzate per un grafico SSC vs CD45 con i principali sottoinsiemi di leucociti notati. Il back-gating da questo grafico ha prodotto i dati mostrati nel pannello D. Si noti che questa classificazione è solo suggestiva e che sono necessari marcatori specifici del lignaggio per confermare il tipo di cella. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Campionare i dati ADCP utilizzando cellule isolate dal latte materno. Il saggio ADCP eseguito si basa sul saggio adattato da Ackerman et al.30. Il saggio è stato eseguito come descritto nel protocollo precedente. (A) Esempi di istogrammi FITC a 1 mAb g/mL, con marcatori che indicano le popolazioni di perline/FITC, utilizzate per determinare il punteggio ADCP. I punteggi sono stati calcolati come (FIA di cellule perline-positive) x (% del CD45 totale- celle nella popolazione positiva di bead/FITC). Il primo pannello che utilizza mAb 830A da solo indica anche la percentuale dellecellule CD45 - e il valore di intensità media di fluorescenza utilizzato per calcolare il punteggio ADCP in questo esempio. (B) I punteggi ADCP ad ogni diluizione mAb sono stati utilizzati per calcolare i valori di area sotto la curva (AUC) nel software grafico. Per gli esperimenti di controllo, l'inibitore dell'actina cytochalasin-D (cytoD), l'agente di blocco FcR (FcBlock) o una combinazione di entrambi sono stati pre-incubati con le cellule prima della loro aggiunta ai complessi immunitari (vedi legende). Si noti che questa classificazione delle celle è solo suggestiva e che sono necessari marcatori specifici del lignaggio per confermare il tipo di cella. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

campione Celle/mL %CD45 % Granulociti  % Monociti
1 222,857 12,3 - 1,9 13,6 x 3,8 65,9 x 5,6
2 27,361 1,6 - 0,01 25,2 x 4,0 9.1 - 5,6
3 161,486 3,6 x 1,1 47,8 - 6,8 24,3 x 4,3
4 16,083 2,7 - 0,1 17,9 x 3,5 34,4 x 1,0
5 25,155 4.0 - 0.7 29,7 x 2,6 20,5 x 1,4
N. di CD45- celle

Tabella 1: Esempi di tipici conteggi e caratteristiche delle cellule del latte materno.

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Discussion

La tecnica a flusso di citometria per misurare l'attività ADCP descritta qui è stata descritta per la prima volta nel 201130 e da allora è stata dimostrata robusta e citata in più di 80 studi. Il protocollo qui descritto adatta questa tecnica per l'uso con le cellule BM primarie per la prima volta. Precedenti studi sulla funzionalità mediata da Fc da cellule BM sono stati in gran parte limitati alla misurazione di esplosioni ossidative o analisi di fagocitosi a base di estasi utilizzando cellule isolate dal colostro (0-4 giorni dopo la nascita). Praticamente nessuno studio ha esaminato le cellule in BM umano oltre la fase di colostro. Studi che utilizzano cellule colostrali hanno generalmente concluso che i granulociti nel colostrum sono meno attivi di quelli isolati dal sangue, comportandosi come una "cellula esossata" che si è spostata nello spazio extravascolare35, anche se studi contrastanti hanno simili capacità fagocitiche e battericide36.

Per decenni, la microscopia tradizionale è stata utilizzata per identificare i leucociti BM, e questo tipo di identificazione visiva può aver portato a un errore di identificazione cellulare1. Pochi studi hanno confrontato la composizione di BM leucocyte oltre il primo mese di allattamento, e la maggior parte si sono concentrati sul colostrum. L'uso della citometria di flusso per identificare le cellule è probabile che identifichi nocito con precisione le cellule, anche se solo un piccolo numero di studi sulla BM è stato fatto utilizzando questo metodo, spesso con un numero di campione molto piccolo. Gli studi attuali hanno indicato che il contenuto di leucociti di BM in tutte le fasi dell'allattamento varia ampiamente, che vanno da 104x 105 leucociti/mL nel colostro precoce, diminuendo a 103x 5 x 104 leucociti/mL nel latte maturo, anche se tutti gli studi confermano che la concentrazione e la composizione cellulare sono fortemente influenzate dallo stadio di allattamento1,2,3,4,5. Mentre il latte passa alla sua composizione matura, la concentrazione di neutrofili sembra aumentare, anche se tali studi non si sono in genere estesi oltre il primo mese dopo il parto34.

Il protocollo qui descritto utilizza le perle fluorescenti come obiettivo fagocitico, anche se è probabile che possa essere applicato allo studio di BM ADCP di una varietà di obiettivi più biologicamente rilevanti come i complessi immunitari e le cellule infette, innescati da vari isotipi Ab e Sottoclassi. Un pannello di colorazione cellulare più grande può essere impiegato per differenziare ulteriormente i leucociti. Grandi studi saranno essenziali per sviluppare una comprensione completa di ADCP da queste cellule primarie rilevanti. Questo protocollo consente la creazione di ADCP da parte dei leucociti BM come potenziale meccanismo per la riduzione dell'MTCT dell'HIV, così come altri patogeni.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo la Dott.ssa Susan e il Dipartimento di Microbiologia della Icahn School of Medicine del Monte Sinai per la revisione del manoscritto. Il NIH/NICHD ha fornito finanziamenti per questo progetto con il numero di sovvenzione R21 HD095772-01A1. Inoltre, R. Powell è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Medicina, Divisione delle Malattie Infettive, Icahn School of Medicine del Monte Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres  Thermo Fisher F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD 560975
Bovine serum Albumin MP Biomedicals 8810025
Corning V-bottom polystyrene 96-well plate  Corning  3894
Cytochalasin D Sigma 22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit  Thermo Fisher 21338
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352196
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352070
Fixable Viability Stain 450  BD 562247
Formaldehyde solution Sigma 252549 
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red Life Technologies 14175-095
Human BD Fc Block BD 564219
Human Serum Albumin MP Biomedicals 2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional  34120
PBS 1x pH 7.4 Thermo Fisher 10010023
Polystyrene 10 mL Serological Pipettes  Corning  4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL Pierce 88512

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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