A لامركزية (فيفو السابقين) نموذج المثانة Murine مع أزاله العضلات ديتروور للوصول المباشر إلى السوبوروثثيلال اثناء ملء المثانة

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويتيح نموذج المثانة الخالي من الدعامات امكانيه الوصول المباشر إلى السوبوروثثيلال لدراسة أليات المحلية لتنظيم توافر الوسيط النشط بيولوجيا في بروبيوروثيلال/لأمينا بروبروا اثناء تخزين وتفريغ البول. التحضير يشبه بشكل وثيق ملء المثانة السليمة ويسمح باجراء دراسات حجم الضغط دون التاثيرات الجهازية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Durnin, L., Corrigan, R. D., Sanders, K. M., Mutafova-Yambolieva, V. N. A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling. J. Vis. Exp. (153), e60344, doi:10.3791/60344 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد أدت هذه النتائج إلى الافتراض بأنه يتم أيضا إطلاق سراح هؤلاء الوسطاء في سوبيوروثثيلال (SubU)/لأمينا بروبرونا (LP) اثناء ملء المثانة ، حيث تؤثر علي الخلايا العميقة في جدار المثانة لتنظيم استثاره المثانة في نهاية المطاف. هناك ما لا يقل عن اثنين من القيود الواضحة في مثل هذه الدراسات: 1) اي من هذه النهج توفر معلومات مباشره عن وجود وسطاء في SubU/LP ، و 2) المحفزات المستخدمة ليست فسيولوجية ولا تلخص ملء أصيله من المثانة. هنا ، نناقش الاجراء الذي يتيح الوصول المباشر إلى سطح سوبوروثيليال من الغشاء المخاطي للمثانة في سياق ملء المثانة. الاعداد الخالي من الدعامات التي انشاناها بشكل وثيق يشبه ملء المثانة السليمة ويسمح باجراء دراسات حجم الضغط علي المثانة في غياب الإشارات المربكة من ردود الفعل الشوكية والعضلات الملساء. وباستخدام نموذج المثانة الخالي من الدعامات الجديدة ، أظهرنا مؤخرا انه لا يمكن استخدام القياسات المثانته للوسطاء كوكيل لما تم الإفراج عنه أو تقديمه في السوبو/LP اثناء ملء المثانة. يسمح النموذج بفحص جزيئات الإشارات المشتقة من اوروثيثيلال التي يتم إصدارها ، والتي يتم إنشاؤها عن طريق الأيض و/أو نقلها إلى السوبو/LP اثناء ملء المثانة لنقل المعلومات إلى الخلايا العصبية والعضلات الملساء للمثانة وتنظيم استثاره لها اثناء الزهد والولادة.

Introduction

والغرض من هذا النموذج هو تمكين الوصول المباشر إلى الجانب تحت المخاطية من الغشاء المخاطي في المثانة خلال مراحل مختلفه من ملء المثانة.

يجب ان تمتنع المثانة عن الانكماش السابق لأوانه اثناء التعبئة والتفريغ عند الوصول إلى الحجم الحرج والضغط. غالبا ما ترتبط الزهد غير الطبيعية أو إفراغ البول مع استثاره غير طبيعيه للعضلات الملساء (DSM) في سياق ملء المثانة. يتم تحديد الاستثارة من DSM من قبل العوامل المتاصله في خلايا العضلات الملساء والتاثيرات المتولدة عن أنواع مختلفه من الخلايا داخل جدار المثانة. يتكون جدار المثانة البولية من اوروثيثيلال (الغشاء المخاطي) ، وسوبيوروثثيلال (سوبو)/لأمينا بروبروسا (LP) ، العضلات الملساء (DSM) و مصلي (الشكل 1a). يتكون المسالك البولية من خلايا شمسيه (اي الطبقة الخارجية لمجري البول البولي) ، والخلايا المتوسطة ، والخلايا القاعدية (اي الطبقة الأعمق من المسالك البولية). أنواع مختلفه من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الخلالي ، الليفية ، والمحطات العصبية الزبائ ، والاوعيه الدموية الصغيرة ، والخلايا المناعية الموجودة في subu/LP. ومن المفترض علي نطاق واسع ان المثانة البولية هو الجهاز الحسي الذي يبدا الزهد منعكس والإفراج عن وسطاء في الغشاء المخاطي الذي يؤثر علي الخلايا في subu/LP و DSM1,2,3. وتستند هذه الافتراضات في معظمها إلى الدراسات التي أظهرت إطلاق الوسطاء: من قطع الغشاء المخاطي المعرضة للتغيرات في الضغط الهيدروستاتيكي4,5; من الخلايا البولية المستزرعة المعرضة لتمتد6,7, الوتر الناجمة عن تورم الخلية7 أو سحب القوات8; من معزولة جدار المثانة شرائط علي مستقبلات أو تنشيط العصب9,10,11,12,13,14; وفي تجويف المثانة في نهاية المثانة ملء15،16،17،18،19. في حين ان هذه الدراسات كانت مفيده لإظهار الإفراج عن الوسطاء علي التحفيز الميكانيكي للأجزاء جدار المثانة أو الخلايا البولية المستزرعة ، فانها تحتاج إلى ان تكون مدعومة بادله مباشره للإفراج عن وسطاء في الغشاء المخاطي الذي يتم استخلاصه من قبل المحفزات الفسيولوجية التي تتكاثر ملء المثانة. هذه مهمة صعبه بالنظر إلى ان SubU/LP يقع عميقا في جدار المثانة يعوق الوصول المباشر إلى المنطقة المجاورة لل SubU/LP اثناء ملء المثانة.

هنا ، ونحن نوضح لامركزية (الجسم الغريب) نموذج المثانة murine مع أزاله العضلات deدعامات13 التي تم تطويرها لتسهيل الدراسات علي أليات المحلية للمحولات الميكانيكية التي تشارك في الإشارات بين المثانة البولية ، DSM وأنواع الخلايا الأخرى في جدار المثانة. ويمكن استخدامه لقياس التوافر ، والإفراج ، والتمثيل الغذائي والنقل الترانسوروثيليال للوسطاء في SubU/LP في مراحل مختلفه من ملء المثانة (الشكل 1B). ويمكن أيضا ان تستخدم اعداد لفحص الإشارات البولية والميكانيكية في نماذج من فرط نشاط ومتلازمات المثانة السفلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانية الموصوفة في هذه المخطوطة وفقا للدليل الوطني للمعاهد الصحية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية واللجنة المؤسسية لاستخدام ورعاية الماشية في جامعه نيفادا.

ملاحظه: النموذج المعروض هنا يتكون من أزاله العضلات العضلية في حين ان المسالك البولية وسوبو/lp تبقي سليمه (الشكل 1ب) لتمكين المحققين من الوصول المباشر إلى subu/lp في سياق ملء المثانة.

1. تشريح المثانة الحرة التحضير

  1. وضع المثانة المعزولة في صحن تشريح مليئه الباردة (10 درجه مئوية) والأوكسيجين مع 5 ٪ CO2/95 ٪ O2 krebs بيكربونات الحل (كال) مع التكوين التالي (مم): 118.5 Nacl, 4.2 Kcl, 1.2 mgcl2, 23.8 ناهكو3, 1.2 KH2PO4, 11.0 سكر العنب, 1.8 cacl2 (pH 7.4)13.
  2. دبوس جزء صغير من قبة المثانة المعزولة إلى صحن تشريح المغطية Sylgard مليئه بالنسبة لل. تاكد من ان دبوس يمر من خلال قطعه من مصلي أو الحافة الخارجية للعضلات العضلات بعيدا عن الحافة الأعمق للعضلات التي تواجه subu/LP.
  3. باستخدام المجهر ، حدد مجري البول والحالب ودبوس كل واحد منهم إلى الجزء السفلي من الطبق تشريح.
  4. أزاله الدهون الزائدة والانسجه الضامة بحيث يتم عرض الجسم الرئيسي بأكمله من المثانة ، ومجري البول والحالبين علي حد سواء.
  5. اربط الحالب مع خيوط النايلون 6-0. ثم ، دبوس نهايات مفتوحة من الحالب نحو الجزء السفلي من الطبق تشريح لتامين التحضير.
  6. باستخدام ملقط الطرف الرفيع ، اسحب قطعه من المصليين برفق في الزاوية بين الحالب وجسم المثانة.
  7. ضبط ضوء المجهر لزيادة الشفافية والتمييز بين هامش الغشاء المخاطي تحت العضلات ديتروور.
  8. بدء القطع (لا تقشير!) جدار المثانة مع مقص غرامه علي طول السطح الداخلي للطبقة العضلات في حين سحب بلطف قطعه قطع بعيدا عن الاعداد. في جميع الأوقات ، وضمان ان الحافة الجانبية من الغشاء المخاطي يمكن ان ينظر اليها وتجنب لمسها.
  9. أزاله العضلات deدعامات تماما عن طريق الدوران حول الطبق تشريح بحيث موقف التحضير هو مريح لمواصله تشريح العضلات deدعامات.
  10. اترك قطعه صغيره من العضلات علي قمة قبة المثانة لضمان القدرة علي شل الاعداد اثناء الخطوات المتبقية من البروتوكول.
  11. جعل حلقه مزدوجة من الخيط النايلون 6-0 ، وضعه حول الرقبة من اعداد المثانة ، وترك حلقه فضفاضة.
  12. أضافه حلقه مزدوجة ثانيه من الخيط الحرير 6-0 ، وضعه حول الرقبة من اعداد المثانة ، وترك حلقه تفقد. وجود اثنين من الغرز يمنع تسرب حول الغرز.
  13. قطع حوالي 2 سم من 20 PE الأنابيب (القسطرة) ، وإشعال الطرف عن طريق التحرك ببطء غيض علي مقربه من اللهب.
  14. أملا القسطرة بالأكسجين الدافئ (37 درجه مئوية).
  15. ادخل القسطرة في فوهه مجري البول وادفع القسطرة برفق حتى يصل طرف القسطرة إلى منتصف المثانة تقريبا.
  16. اربط الخيط حول القثطار والانسجه المحيطة بعنق المثانة.
  17. ببطء ملء المثانة مع حوالي 50-100 μL من الدافئة (37 درجه مئوية) الأوكسيجين الأكسجين ، ورفعه لفتره وجيزة (< 10 ثانيه) فوق سطح الجهاز ، ورصد للتسرب في الغرز والمثانة الجسم.
  18. وإذا لم يلاحظ حدوث تسرب ، فان الاعداد جاهز للتجربة. إذا لوحظ تسرب حول خياطه ، وأزاله خياطه واستبدالها. إذا لاحظت تسرب من ثقب في الجسم المثانة ، وتجاهل التحضير.

2. تعبئة التحضير للمعري المثانة

  1. Perfuse الكيلو (37 درجه مئوية) في غرفه 3 مل من الماء (37 درجه مئوية) صحن الجهاز مع القاع Sylgard.
  2. ضبط الأكسجين وخطوط الشفط.
  3. وضع اعداد المثانة المعري في الغرفة.
  4. تامين القسطرة إلى جانب الغرفة بحيث لا تطفو علي سطح الاعداد الحل ترويه.
  5. قم بتوصيل قسطرة المثانة بأنبوب PE20 أطول (خط ضخ) متصل بالطريقة الثلاثة محبس باستخدام نفس حجم المناسبة.
  6. تاكد من ان الخطوط بين مضخة ضخ ، ومحول الضغط والمثانة مفتوحة.
  7. ملء حقنه ضخ مع الطازجة والدافئة (37 درجه مئوية) والأوكسيجين.
  8. ضبط المعلمات مضخة: نوع/حجم الحقنه (اي ، 1 مل) ، عمليه (اي لبث) ، وتدفق (اي ، ثابت) ، ومعدل التدفق (اي ، 15 μL/min).
  9. اضغط علي زر أبدا علي مضخة حقنه لملء المثانة.
  10. رصد حجم التعبئة والضغط مثانة اثناء ملء المثانة.

3. الكشف عن وسطاء في الجانب SubU/LP من اعداد المثانة المعري

  1. جمع الارصفه من محلول الحمام في الجليد الباردة أنابيب الطرد المركزي أو اللوني السائل عاليه الأداء (HPLC) ادراج.
  2. اعداد ومعالجه العينات وفقا لتطبيق الكشف المناسب. في حاله الكشف عن توافر البيورين ، ومعالجه العينات من قبل hplc مع الكشف عن الفلورية13،18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الجدار من murine خاليه من المثانة اعداد خاليه سليمه ويحتوي علي جميع الطبقات باستثناء DSM و serosa. أظهرت الدراسات إثبات من المبدا ان الجدار المثانة DSM خاليه تشمل اوروثثيلال وسوبو/LP في حين ان موسكولاريس غلاله والمصلي غائبه (الشكل 2)13.

ملء المثانة الخالية من الدعامات يقترب من حشوه المثانة الطبيعية. ويظهر الشكل 3 مخططات الاعداد التجريبي لملء الاستعدادات السابقة لمثانة الجسم الحي بمعدلات تعبئة مختلفه واحجام وضغوط داخل ألمنيوم. و murine السابقين الجسم السليم والاستعدادات المثانة المعري تتطلب مجموعه واسعه من الاحجام ملء للوصول إلى تفريغ الضغط13. علاقات حجم الضغط متشابهة بشكل ملحوظ في التحضيرات السليمة والمعرية (الفيلم 1 ، الفيلم 2، والشكل 4). ولذلك ، فان الاعداد DSM الحرة هي مناسبه للدراسات الوظيفية لدور المسالك البولية و SubU/LP في ميكانيكيه المثانة والميكانيكية.

الاستخدام المحتمل لنموذج المثانة الخالي من الديتروور
قياس توافر الوسطاء في تجويف المثانة و SubU/LP اثناء ملء المثانة
ويوضح الشكل 5الاعداد التجريبي لجمع العينات الخارجية (EL ؛ مثل الاستحمام subu/LP) وعينات الداخل اثناء ملء مستحضرات المثانة اثناء مراقبه ضغط المثانة. تم اختبار ملاءمة النموذج لقياس الوسطاء المشتقة من المسالك البولية التي يتم إصدارها في الجانب SubU/LP اثناء التعبئة من خلال قياس الإفراج عن وسطاء البيورين (علي سبيل المثال ، 5 '-ثلاثي فوسفات ، ATP ، نيكوتيناميد 5 '-ثنائي الفوسفات ، ADP ؛ الغدة السينية الدينوكليوتيد ، NAD ؛ النائب العام 5 '-مونوفوسفاتي ، أمبير ؛ و ادنويوس ، ADO) في الحل الاستحمام SubU/LP من اعداد المعري. كما هو موضح في الشكل 6ا، تم الكشف عن كميات ضئيله من البيورينات في الحمام الذي يحتوي علي اعداد المثانة معزولة مع DSM سليمه في حين ان كميات من هذه البيونات كانت اعلي بكثير في العينات التي تم جمعها من الحمام الذي يحتوي علي اعداد المثانة المعري (الشكل 6ب). وعلي وجه الخصوص ، اختلف توزيع البيونات ونواتج الأيض في العينات التي جمعت من التجويف و SubU/LP في نهاية الحشو بشكل ملحوظ (الشكل 6ج).

فحص الأيض خارج الخلية من الوسطاء في SubU/LP اثناء ملء المثانة
بالاضافه إلى التناظرية عاليه الفلورسنت من ATP ، 1 ،ن6-ايثينو-atp (εatp) ، إلى الجانب سوبوروثيليال من التحضير خاليه من ديتروتور ادي إلى انخفاض εatp وزيادة في المنتجات Εatp Εadp ، Εamp ، و Εado (الشكل 7Aa والشكل 7Ab). المثل ، أسفرت أضافه εATP إلى التجويف اعداد في انخفاض εATP وزيادة في εADP ، εAMP ، و εADO في التجويف (الشكل 7Ba والشكل 7Bb). ولذلك ، فان النموذج هو مناسبه لدراسات التمثيل الغذائي للوسطاء النشطة بيولوجيا علي كلا الجانبين من اوروثيثيليوم اثناء ملء المثانة.

فحص ترانسوروثيليال نقل الوسطاء اثناء ملء المثانة
أسفرت أضافه εATP إلى الجانب SubU/LP من اعداد المعري في ظهور εAMP ، εADO وبعض εADP في التجويف ، مما يوحي بان البيونات يمكن نقلها من SubU/LP إلى التجويف13 (الشكل 7Ac). المثل ، أدت أضافه εATP في التجويف إلى ظهور εAMP و εADO في SubU/LP13 (الشكل 7ديسيبل). لاحظ انه لم يتم ملاحظه εATP علي الجانب الآخر من تطبيق εATP. معا ، تشير هذه الملاحظات بقوة إلى ان اعداد المثانة الخالي من الدعامات مناسب للدراسات المتعلقة بالنقل ترانسوروثيليال الثنائي للوسطاء اثناء التعبئة.

Figure 1
الشكل 1: مبدا نموذج المثانة الخالي من الدعامات. (ا) يتكون جدار المثانة من المسالك البولية ، سوبيوروثثيلال/لأمينا بروبروسا (SubU/LP) ، والعضلات والدعامات serosa. كل من هذه الطبقات يحتوي علي أنواع الخلايا المختلفة التي هي مهمة لوظائف المثانة اثناء تخزين وتفريغ البول. اثناء ملء المثانة ، يتم الإفراج عن الوسطاء النشطين بيولوجيا من المسالك البولية في تجويف المثانة وفي SubU/LP للتاثير علي الخلايا العميقة في جدار المثانة ، بما في ذلك العضلات ديتروور. في حين ان الوصول إلى تجويف المثانة هو واضح نسبيا ، لا يوجد وصول مباشر إلى SubU/LP اثناء التعبئة للكشف عن الوسطاء المشتقة من المسالك البولية التي قد تؤثر علي الخلايا في جدار المثانة والتحكم في استثاره العضلات. (ب) أزاله الطبقات العضلية المنزوعة الدعامات إلى جانب المصلي يكشف السطح الكامل لل SUBU/lp الذي يمكن من الوصول المباشر إلى ال subu/lp حيث يمكن قياس جزيئات الإشارات المشتقة من المسالك البولية في مراحل مختلفه من حشوه المثانة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الانسجه السليمة لجدران المثانة الخالية من المرارة والمنزوعة الدعامات. ان تلطيخ ماسون الثلاثي لجدران المثانة المملوءة (A) والخالية من الدعامات (B) يدل علي ان اعداد المعري يحتوي علي المسالك البولية السليمة (U) و subu/LP ، ولكن ليس العضلات العضلية (D) و مصلي (s). L ، التجويف. وقد استنسخ هذا الرقم من منشور سابق هو13. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التمثيل التخطيطي للاعداد التجريبي المستخدم في ملء مستحضرات المثانة المجرية السابقة. يتم وضع السابق فيفو سليمه أو المعري المثانة البولية (UB) اعداد في دافئه (37 درجه مئوية) المياه التي تغلفها الغرفة الجهاز الذي يتم perfused استخدام مع محلول الأوكسيجين كريبس-بيكربونات (بانك ، 37 درجه مئوية ، pH 7.4). يتم غرس اعداد المثانة مع الوحدة بمعدلات تعبئة واحجام مختلفه ويتم تسجيل ضغط المثانة داخل العين طوال التجربة وقد استنسخ هذا الرقم من منشور سابق هو13. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: علاقات حجم الضغط في الاستعدادات السليمة والخالية من الدعامات. (ا) و (ب) هي تسجيلات تمثيليه من مثانة الحجم والضغط من الجسم السابق سليمه والاستعدادات المثانة المعرية التي تمتلئ محلول كريبس-بيكربونات في 15 μl/min. كما هو متوقع ، وضعت الاعداد سليمه انقباضات عابره (اللجان الخاصة) بسبب وجود الدعامات. وعلي النقيض من ذلك ، افتقر التحضير للمعري إلى اللجان الخاصة (ج) و (د) لعرض بيانات موجزه عن علاقات حجم الضغط لمستحضرات المثانة السليمة والمعرية التي تستوعب > 250 μl من المحلول. لاحظ ان كميات التعبئة والضغوط المثانته كانت متشابهة بشكل ملحوظ في الاستعدادات السليمة والمعرية للمثانة. وقد استنسخ هذا الرقم من منشور سابق هو13. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: رسم تخطيطي لنموذج المثانة المعزولة المستخدم لتقييم توافر وسطاء مشتقين من المسالك البولية في السوبو/LP والتجويف اثناء التعبئة. يتم وضع اعداد المثانة في غرفه مغطاه بالماء والفائقة مع محلول بيكربونات كريبس الأوكسيجين (بانك). يتم تعبئة اعداد المثانة البولية (UB) بالأكسجين الدافئ بواسطة القسطرة في مجري البول المتصل بمضخة ضخ. يتم رصد ضغط المثانة (BP) عن طريق موصل ثلاثي الاتجاات من خلال خط الضخ اثناء ملء المثانة. يتم معالجه عينات من خارج ألومنيوم (EL ، حمام الجهاز) والحلول داخل ألومنيوم (IL) للكشف عن وسطاء (م) وفقا لتطبيقات الكشف. وقد استنسخ هذا الرقم من منشور سابق هو13. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: يعد اعداد المثانة الخالي من الدعامات مناسبا لقياس توافر الوسطاء في السوبو/LP اثناء التعبئة. اللونية التمثيلية مما يدل علي توافر البيونات في العينات الخارجة في المستحضرات السليمة (ا) والخالية من المثانة (B). لاحظت ان [بوررين] وسطاء يكون علي نحو أفضل اكتشفت في التحضير المعري من في التحضير سليمه. (ج) المساهمة النسبية للبيونات الفردية في أحواض التطهير المكتشفة في التجويف وفي السوبو/لب الاوعيه المعرية تختلف اختلافا كبيرا. وقد استنسخ هذا الرقم من منشور سابق هو13. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: يعد اعداد المثانة الخالي من الدعامات مناسبا لفحص عمليه الأيض والنقل الترانسوروثيليال للوسطاء اثناء ملء المثانة. (الف ، باء) ممثل الكروماتوجرام التي تظهر الركيزة εATP (Aa ، Ba). عندما يتم تطبيق الركيزة اما SubU/LP (Ab) أو التجويف (Bb) تم إنقاص εatp وزيادة المنتجات Εadp ، Εamp ، و εado. لذلك ، يتم المتدهورة εATP في اي من جانبي التطبيق; ومع ذلك ، فان تشكيل المنتجات εATP غير متناظرة في SubU/LP والتجويف. لاحظ ان المنتجات εATP εAMP و εADO ، ولكن ليس الركيزة εATP ، ظهرت علي الجانب الآخر من تطبيق εATP (Ac ، Bc). لذلك ، يبدو ان البورينات يتم نقلها عبر جدار التحضير الخالي من الدعامات اثناء الإيداع. وقد تم تعديل هذا الرقم من13. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Video 1
فيديو 1: تسجيل تمثيلي لملء المثانة سليمه. تم تعبئة المثانة في 15 μL/min. تم تسجيل الفيديو باستخدام مجسم التكبير/التصغير مع كاميرا الجهاز المقترن (CCD) المشحونة في 5 هرتز; تم إيقاف التسجيل عند الوصول إلى 25 ضغط زئبقي داخل ألومنيوم. المدة الكاملة للصورة هي 64x في الوقت الحقيقي. وقد استنسخ هذا الفيديو من13. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

Video 1
الفيديو 2: التسجيل التمثيلي لحشوه المثانة الخالية من الدعامات. تم تعبئة المثانة في 15 μl/min. تم تسجيل الفيديو باستخدام مجسم التكبير/التصغير مع كاميرا CCD في 5 هرتز; تم إيقاف التسجيل عند الوصول إلى 25 مم من الضغط داخل الزئبق. المدة الكاملة للصورة هي 64 مرات في الوقت الحقيقي. وقد استنسخ هذا الفيديو من13. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المثانة لديها وظيفتين: تخزين وتفريغ البول. التشغيل العادي لهذه الوظائف يتطلب الاستشعار الميكانيكي السليم لحجم داخل ألومنيوم والضغط وتوصيل الإشارات من خلال الخلايا في جدار المثانة لتنظيم الاستثارة العضلية. ويعتقد ان الغشاء المخاطي المثانة (اوروثثيلال) لتنظيم استثاره المثانة عن طريق الإفراج عن مجموعه متنوعة من الجزيئات الإشارات في SubU/LP التي تؤثر علي أنواع عديده من الخلايا في جدار المثانة. وفي الوقت الحالي ، فان معظم محاولات توصيف الوسطاء المشتقين من المسالك البولية تنطوي علي استخدام مستحضرات المثانة (مثل صفائح المثانة المسطحة ، وشرائط جدار المثانة ، أو الخلايا المستزرعة) التي لا تستنسخ حشوه المثانة الفسيولوجية. وكثيرا ما تستخدم قياسات الوسطاء التي يتم الإفراج عنها في تجويف المثانة في نهاية ملء المثانة كمؤشر للإفراج عن هؤلاء الوسطاء من الجانب الآخر من المسالك البولية. ومع ذلك ، تشير الدراسات الاخيره إلى ان المحتوي داخل الوسطاء لا يمثل ما هو متاح في عمق جدار المثانة13. وهناك حاجه إلى نهج تجريبية جديده تمكن من الوصول إلى SubU/LP اثناء ملء المثانة لتعزيز فهمنا للأليات المحلية للإشارات بين المثانة البولية ، SubU/LP و DSM.

هنا ، ونحن نظهر نموذج المثانة الحيوانية الجديدة التي تتم أزاله العضلات deدعامات لتوفير الوصول المباشر إلى وسطاء أفرج عنه من اوروثثيليوم في SubU/LP خلال ملء13. التحضير للمعري يشبه بشكل وثيق ملء المثانة السليمة13،18، مما يوحي بان عدم وجود العضلات العضلية لا يغير الخصائص اليه للحالب البولي اثناء ملء المثانة. يسمح الاعداد باجراء دراسات حجم الضغط علي المثانة في غياب الإشارات المربكة من ردود الفعل الشوكية والعضلات العضلية. ولذلك ، يمكن قياس الوسطاء المفرج عنهم في SubU/LP دون التاثيرات الجهازية أو التلوث من مصادر أخرى. القدرة علي الوصول مباشره إلى المنطقة المجاورة لل SubU/LP في احجام مختلفه والضغوط اثناء ملء المثانة يجعل نموذج مناسب لدراسة الإفراج ، والتمثيل الغذائي والنقل الترانسوروثيليال للوسطاء نشطه بيولوجيا اثناء التخزين ومرحله ما قبل التفريغ من ملء المثانة.

الخطوة الأكثر اهميه في هذا البروتوكول هو أزاله العضلات الملساء مع الحفاظ علي المسالك البولية و SubU/LP سليمه. الاجراء واضح بشكل خاص في المثانة الماوس بسبب اتصال فضفاضة بين العضلات العضلية و SubU/LP. اظهر التحضيرات استنساخ ممتازة مع بشكل ملحوظ مماثله [برسور-فولسم] صفه إلى قرب سليمه13. النموذج هو أيضا ممكن في قربه من الماشية الكبيرة التي يمكن أزاله العضلات جزئيا أو كليا. علي سبيل المثال ، لقد أظهرنا سابقا ان النموذج يمكن ان تستنسخ في المثانة من الفاسشولاريس القردة Macaca المونكي وأظهرت ان الوسطاء يمكن قياسها في subu/LP اثناء اعداد ملء13.

القيود المحتملة لهذا النموذج السابق الفيفو هو القضية نفسها التي هي قوه التحضير ، في جوهرها ، وعدم وجود الآثار الجهازية للجهاز العصبي المركزي والتداول يسمح فحص دقيق للأليات المحلية للغشاء المخاطي-ديتروور الاتصال اثناء ملء المثانة . ويتم تقاسم الافتقار إلى التاثيرات الجهازية مع العديد من النهج السابقة المجرية ، بما في ذلك صفائح جدار المثانة المعزولة أو شرائط أو الخلايا البولية المستزرعة. نموذج المثانة خاليه من الدعامات ، ومع ذلك ، متفوقة علي النهج المذكورة أعلاه في البحوث البولية في انه يسمح بالوصول المباشر إلى SubU/LP في سياق ملء المثانة. ولذلك ، فان استخدام هذا النهج سوف يعزز فهم أليات اليه الميكانيكية التي تنشا في المسالك البولية اثناء ملء المثانة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وقد نشرت أجزاء من هذا العمل من قبل في مجلة علم وظائف الأعضاء (PMCID: PMC6418748; DOI: 10.1113/JP27692413). وقد منحت الاذن من قبل وآيلي وأولاده ، وشركه لاستخدام المواد من هذا المنشور. وليس لدي أصحاب البلاغ اي نزاعات مالية أو خلافات أخرى للكشف عنها.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسكري والجهاز الهضمي وامراض الكلي المنحة DK41315.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2 Fisher C79 Source flexible
Dextrose Fisher D16 Source flexible
Dissecting pins Fine Science Tools 26002-20 Source flexible
Infusion Pump Kent Scientific GenieTouch Source flexible
KCl Fisher P217 Source flexible
KH2PO4 Fisher P284 Source flexible
Light source SCHOTT ACEI Source flexible
Microscope Olympus SZX7 Flexible to use any scope
MgCl2 Fisher M33 Source flexible
NaCl Fisher S671 Source flexible
NaHCO3 Fisher S233 Source flexible
Needles 25G Becton Dickinson 305122 Source flexible
Organ bath Custom made Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing Intramedic 427405 Source flexible
Pressure transducer AD instrument Source flexible
S&T Forceps Fine Science Tools 00632-11 Source flexible
Software pressure-volume AD Instruments Power lab
Suture Nylon, 6-0 AD surgical S-N618R13 Source flexible
Suture Silk, 6-0 Deknatel via Braintree Scientific, Inc. 07J1500190 Source flexible
Syringes 1 mL Becton Dickinson 309602 Source flexible
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Source flexible
Water circulator Baxter K-MOD 100 Source flexible

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
  2. Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 57-62 (2016).
  3. Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
  4. Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
  5. Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
  6. Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
  7. Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
  8. McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
  9. Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
  10. Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
  11. Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
  12. Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
  13. Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
  14. Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
  15. Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
  16. Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
  17. Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
  18. Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
  19. Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics