En decentraliserad (ex vivo) murin urinblåsa modell med detrusor muskeln avlägsnas för direkttillgång till Suburothelium underblåsa fyllning

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den detrusor-fri blåsa modell möjliggör direkttillgång till suburothelium att studera lokala mekanismer för reglering av biologiskt aktiv medlare tillgänglighet i suburothelium/lamina propria under lagring och tömning av urin. Preparatet liknar fyllning av en intakt urinblåsa och gör att tryck volym studier kan utföras utan systemisk påverkan.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Durnin, L., Corrigan, R. D., Sanders, K. M., Mutafova-Yambolieva, V. N. A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling. J. Vis. Exp. (153), e60344, doi:10.3791/60344 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tidigare studier har etablerat frisättning av kemiska ämnen från platta urinblåsan slemhinna ark anbringas i Ussing kammare och utsätts för förändringar i hydrostatiska trycket eller mekanisk stretch och från odlade urotelcellscancer celler vid hydrostatiska trycket förändringar, stretch, cell svullnad, eller dragkrafter, och i urinblåsan lumen vid slutet av fyllning. Sådana fynd ledde till antagandet att dessa medlare också släpps i suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) underblåsa fyllning, där de påverkar celler djupt i urinblåsan väggen för att slutligen reglera urinblåsan retbarhet. Det finns minst två uppenbara begränsningar i sådana studier: 1) ingen av dessa metoder ger direkt information om närvaron av medlare i SubU/LP, och 2) de stimuli som används är inte fysiologiska och inte recapitulate autentiska fyllning av urinblåsan. Här diskuterar vi ett förfarande som möjliggör direkttillgång till suburotelial ytan av urinblåsan slemhinnan i samband med blåsa fyllning. Den murina detrusormuskeln-fri förberedelse vi skapade liknar fyllning av intakt urinblåsan och tillåter tryck-volym studier som skall utföras på urinblåsan i avsaknad av confounding signalering från spinal reflexer och detrusormuskeln glatt mus kula man. Med hjälp av romanen detrusor-Free blåsa modell, vi visade nyligen att intravesikal mätningar av medlare inte kan användas som en proxy till vad som har släppts eller finns i subu/LP underblåsa fyllning. Modellen möjliggör undersökning av urotel-härledda signalmolekyler som frigörs, genereras genom metabolism och/eller transporteras till SubU/LP under loppet av urinblåsan fyllning för att överföra information till nervceller och glatt mus kula i urinblåsan och reglera dess retbarhet under kontinens och micturition.

Introduction

Syftet med denna modell är att möjliggöra direkttillgång till submucosala sidan av urinblåsan slemhinnan under olika faser av urinblåsan fyllning.

Urinblåsan måste avstå från för tidig sammandragning under fyllning och tömma när kritisk volym och tryck uppnås. Onormal kontinens eller tömning av urin är ofta förknippade med onormal retbarhet av detrusormuskeln glatta muskeln (DSM) i samband med blåsa fyllning. Retbarhet av DSM bestäms av faktorer som är inneboende i glatta muskelceller och av influenser som genereras av olika celltyper i urinblåsan väggen. Väggen i urinblåsan består av urotel (slemhinna), suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), detrusormuskeln glattmuskulatur (DSM) och Serosa (figur 1a). Urotelet består av paraply celler (dvs. det yttersta skiktet av urotelet), mellanliggande celler, och basal celler (dvs. det innersta skiktet av urotelet). Olika typer av celler, inklusive interstitiella celler, fibroblaster, afferenta nervterminaler, små blodkärl, och immunceller bor i SubU/LP. Det är allmänt antas att urinblåsan urotelet är ett sensoriskt organ som initierar reflex urinering och kontinens genom att frigöra medlare i submucosa som påverkar celler i subu/lp och DSM1,2,3. För det mesta är sådana antaganden baserade på studier som har visat frisättning av medlare: från bitar av slemhinna som utsätts för förändringar i hydrostatiska trycket4,5; från odlade uroteliala celler som utsätts för stretch6,7, hypotonicitet-inducerad cell svullnad7 eller dragkrafter8; från isolerade blåsa vägg remsor på receptor-eller nerv aktivering9,10,11,12,13,14; och i urinblåsan lumen vid slutet av urinblåsan fyllning15,16,17,18,19. Medan sådana studier var avgörande för att demonstrera frisättning av medlare vid mekanisk stimulering av urinblåsan väggsegment eller odlade urotelceller, de måste stödjas av direkta bevis för frisättning av medlare i submucosa som framkallas av fysiologiska stimuli som reproducera blåsa fyllning. Detta är en utmanande uppgift med tanke på att SubU/LP ligger djupt i urinblåsan väggen hindrar enkel tillgång till närheten av SubU/LP underblåsa fyllning.

Här illustrerar vi en decentraliserad (ex vivo) murina urinblåsa modell med detrusormuskeln muskeln bort13 som utvecklades för att underlätta studier på lokala mekanismer för mechanotransduction som deltar i signalering mellan urinblåsan urotel, DSM och andra celltyper i urinblåsan väggen. Detta tillvägagångssätt är överlägsen med hjälp av platta urinblåsan vägg lakan, blåsa vägg remsor eller odlade urotelcellscancer celler eftersom det tillåter direkta mätningar i närheten av subu/lp av urotel-härledda medlare som släpps eller bildas som svar på fysiologiska tryck och volymer i urinblåsan och undviker potentiella fenotypiska förändringar i cellkulturen. Det kan användas för att mäta tillgänglighet, frisättning, metabolism och transurotelial transport av medlare i SubU/LP i olika stadier av blåsa fyllning (figur 1b). Preparatet kan också användas för att undersöka urotelial signalering och mechanotransduction i modeller av överaktiv och under aktiv blåsa syndrom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden med djur som beskrivs i detta manuskript genomfördes enligt National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur och den institutionella djuranvändning och omsorg kommittén vid University of Nevada.

Obs: den modell som presenteras här består av avlägsnande av detrusormuskeln muskeln medan urotel och subu/LP förbli intakt (figur 1B) för att utredarna direkttillgång till subu/lp i samband med blåsa fyllning.

1. dissektion av detrusor-fri blåsa beredning

  1. Placera den isolerade urinblåsan i en dissekterande skål fylld med kyla (10 ° c) och syrade med 5% CO2/95% O2 Krebs BIKARBONATLÖSNING (KBS) med följande sammansättning (mm): 118,5 NaCl, 4,2 KCL, 1,2 mgcl2, 23,8 NAHCO3, 1,2 KH2Po4, 11,0 dextros, 1,8 CaCl2 (pH 7,4)13.
  2. Stift en liten del av kupolen i den isolerade urinblåsan till en Sylgard täckta dissekera skålen fylld med KBS. Se till att stiftet går igenom en bit av Serosa eller den yttersta kanten av detrusormuskeln muskeln långt från den innersta kanten av muskeln som vetter mot SubU/LP.
  3. Med hjälp av ett mikroskop, identifiera urinröret och urinledarna och stift var och en av dem till botten av dissekera skålen.
  4. Ta bort överflödigt fett och bindväv så att hela huvud kroppen i urinblåsan, urinröret och båda urinledarna visas.
  5. Knyt urinledarna med 6-0 nylon suturer. Sedan stift de öppna ändarna av urinledarna mot botten av dissekera skålen för att säkra preparatet.
  6. Med hjälp av Fine-Tip forceps, försiktigt dra en bit av Serosa i hörnet mellan urinledaren och urinblåsan kroppen.
  7. Justera ljuset i mikroskopet för att öka transparensen och urskilja marginalen av submucosa under detrusormuskeln muskeln.
  8. Börja skära (inte peeling!) blåsan väggen med fin-Tip sax längs den inre ytan av detrusormuskeln muskel skiktet samtidigt försiktigt dra snittet segmentet bort från preparatet. Vid alla tidpunkter, se till att den laterala kanten av slemhinnan kan ses och undvika att röra den.
  9. Ta bort detrusormuskeln muskeln helt genom att vrida runt dissekera skålen så att placeringen av preparatet är bekväm att fortsätta dissekera ut detrusormuskeln muskeln.
  10. Lämna en liten bit av detrusormuskeln muskler på toppen av urinblåsan Dome för att säkerställa förmågan att immobilisera preparatet under de återstående stegen i protokollet.
  11. Gör en dubbel slinga av 6-0 nylontråd, placera den runt halsen av blåsan preparatet, och lämna slingan lös.
  12. Tillsätt en andra dubbel slinga av 6-0 silkestråd, placera den runt halsen av blåsan förberedelse, och lämna slingan förlora. Att ha två suturer förhindrar läckage runt suturer.
  13. Skär ca 2 cm av 20 PE slang (kateter), blossa upp spetsen genom att sakta flytta spetsen nära en flamma.
  14. Fyll katetern med varma (37 ° c) syresatt KBS.
  15. För in katetern i urinblåsan urinröret och tryck försiktigt katetern tills katetern spetsen når ungefär mitten av urinblåsan.
  16. Knyt suturen runt katetern och den omgivande vävnaden i urinblåsan halsen.
  17. Fyll långsamt blåsan med ca 50-100 μL av varm (37 ° c) syresatt KBS, lyft den kort (< 10 s) ovanför ytan av KBS, och övervaka för läckor på suturer och urinblåsan kroppen.
  18. Om ingen läcka observeras är preparatet redo för experimentet. Om en läcka runt suturen observeras, ta bort suturen och ersätta den. Om en läcka från ett hål i urinblåsan kroppen märks, kassera preparatet.

2. fyllning av denuded blåsa beredning

  1. Perfuse KBS (37 ° c) i en 3 ml kammare av ett vatten (37 ° c) mantlade orgel skålen med en sylgard botten.
  2. Justera syre och sugledningar.
  3. Placera den förtätade blåsan beredning i kammaren.
  4. Fäst katetern på sidan av kammaren så att preparatet inte flyter över ytan av per fusions lösningen.
  5. Anslut blåsan katetern till en längre PE20 slangar (infusionsslang) ansluten till tre sätt Avstängningskranen med samma storlek montering.
  6. Kontrollera att ledningarna mellan infusionspumpen, tryckgivaren och urinblåsan är öppna.
  7. Fyll på infusionsprutan med friska, varma (37 ° c) och syresatt KBS.
  8. Justera pump parametrarna: typ/volym på sprutan (dvs. 1 mL), drift (dvs. ingjuta), flöde (dvs. konstant) och flödeshastighet (dvs. 15 μL/min).
  9. Tryck på Start -knappen på sprutpumpen för att fylla blåsan.
  10. Övervaka fyllningsvolym och intravesikal tryck underblåsa fyllning.

3. detektion av medlare i SubU/LP aspekt av denuded blåsa beredning

  1. Samla in alikvoter av badet lösningen i iskall mikrocentrifug rör eller högpresterande vätskekromatografi (HPLC) skär.
  2. Förbered och bearbeta proverna enligt lämplig detektions applikation. När det gäller att detektera purintillgänglighet, bearbeta proverna med HPLC med fluorescensdetektion13,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Väggen i murina detrusor-fri blåsa beredning är intakt och innehåller alla skikt utom DSM och Serosa. Proof-of-princip studier visade att den DSM-fria urinblåsan väggen inkluderar urotel och SubU/LP medan Tunica muscularis hinna och Serosa är frånvarande (figur 2)13.

Fyllning av detrusor-fria blåsan approximerar normal blåsa fyllning. Figur 3 visar schematiska experiment inställningar för fyllning av preparat i ex vivo-blåsmaterial vid olika fyllnings hastigheter, volymer och svalgmanometri-tryck. De murina ex vivo intakt och utblottad blåsa preparat kräver ett brett spektrum av fyllnings volymer för att nå tömning tryck13. Trycket-volym relationer är anmärkningsvärt lika i intakt och utblottad preparat (Movie 1, Movie 2, och figur 4). Därför är den DSM-fria beredningen lämplig för funktionella studier av rollen av urotelet och subu/lp i urinblåsan mechanosensation och mechanotransduction.

Möjlig användning av detrusor-fri blåsa modell
Mät tillgängligheten för medlare i urinblåsan lumen och SubU/LP underblåsa fyllning
Den experimentella inställningen för uppsamling av extraluminal (El; t. ex. bad subu/LP) och svalgmanometri (Il)-prov vid fyllning av preparat i urinblåsan under övervakning av blåsa trycket illustreras i figur 5. Lämpligheten av modellen för mätning av urotel-härledda mediatorer som släpps i subu/LP-sidan under påfyllningen testades genom mätning av frisättningen av purinmediatorer (t. ex. adenosin 5 '-trifosfat, ATP; adenosin 5 '-difosfat, ADP; nikotinamid-adenin-dinukleotid, nad; adenosin-5 '-monofosfat, amp; och adenosin, ADO) i lösningen bad subu/lp av utblottad preparatet. Som visats i figur 6A, upptäcktes obetydliga mängder puriner i badet som innehöll en isolerad blåsa beredning med intakt DSM medan mängden av dessa puriner var signifikant högre i prover som samlats in från badet innehåller en utblottad blåsa beredning (figur 6B). I synnerhet skilde sig distributionen av puriner och metaboliter i prover som samlats in från lumen och SubU/LP i slutet av fyllningen signifikant (figur 6C).

Undersöka extracellulär metabolism av mediatorer i SubU/LP underblåsa fyllning
Tillsats av den starkt fluorescerande analog av ATP, 1,N6-Etheno-ATP (εatp), till suburotelial sidan av detrusor-fri beredning resulterade i en minskning av εatp och en ökning av Εatp produkter Εadp, Εamp, och εado (figur 7AA och figur 7AB). Likaså resulterade tillägg av εATP i utarbetandet lumen i en minskning av εATP och en ökning av εADP, εAMP, och εADO i lumen (figur 7BA och figur 7BB). Därför är modellen lämplig för studier av metabolismen av bioaktiva mediatorer på båda sidor av urotelet underblåsa fyllning.

Undersök transurotelial transport av medlare underblåsa fyllning
Tillägg av εatp till subu/LP sidan av den denaturerade beredningen resulterade i uppkomsten av εamp, εado och vissa εadp i lumen, vilket tyder på att puriner kan transporteras från subu/LP till lumen13 (figur 7AC). Likaså resulterade tillägg av εATP i lumen i utseendet av εAMP och εADO i SubU/LP13 (figur 7db). Observera att ingen εATP observerades på motsatt sida av εATP-ansökan. Tillsammans tyder dessa observationer starkt på att detrusor-fri blåsa preparatet lämpar sig för studier av bilateral transurotelial transport av medlare under fyllning.

Figure 1
Figur 1: princip för detrusor-fri urinblåsa modell. (A) Blåsan väggen består av urotel, suburothelium/lamina propria (SubU/LP), detrusormuskeln muskler och Serosa. Var och en av dessa skikt innehåller olika celltyper som är viktiga för urinblåsan funktioner under lagring och tömning av urin. Underblåsa fyllning, biologiskt aktiva medlare frigörs från urotelet i urinblåsan lumen och i SubU/LP att påverka celler djupt i urinblåsan väggen, inklusive detrusormuskeln muskeln. Medan tillgången till urinblåsan lumen är relativt enkelt, det finns ingen direkttillgång till SubU/LP under fyllning för att upptäcka urotel-derived mediatorer som kan påverka celler i urinblåsan väggen och kontroll detrusormuskeln muskel retbarhet. (B) avlägsnande av detrusormuskeln muskel lagren tillsammans med Serosa exponerar hela ytan av SUBU/LP möjliggör direkttillgång till subu/LP där urotel-härledda signalering molekyler kan mätas i olika faser av urinblåsan fyllning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: histologi av murin intakt och detrusor-fria urinblåsan väggar. Massons trikrom färgning av fyllt intakt (a) och detrusormuskeln-fria (B) urinblåsans väggar visar att den denaturerade beredningen innehåller intakt urotel (U) och subu/LP, men inte detrusormuskeln muskeln (D) och Serosa (s). L, lumen. Denna siffra har reproducerats från en tidigare publikation13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: schematisk representation av experimentell inställning som används vid fyllning av preparat från ex vivo-blåsan. Preparatet i obruten eller utblottad urinblåsa (UB) är placerat i en varm (37 ° c) vatten-jacketed organ kammare som är parfymerad med syrade Krebs-bikarbonatlösning (KBS, 37 ° c, pH 7,4). Blåsan preparatet är infunderas med KBS vid olika fyllnings hastigheter och volymer och svalgmanometri blåsa tryck (BP) registreras under hela experimentet denna siffra har reproducerats från en tidigare publikation13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Tryck volym förhållanden i intakta och detrusfria preparat. A) och (B) är representativa inspelningar av intravesikal volym och tryck av ex vivo intakta och denaturerade preparat i urinblåsan som är fyllda med Krebs-bikarbonatlösning vid 15 μl/min. Som väntat utvecklade intakt preparatet övergående sammandragningar (TCs) på grund av närvaron av detrusor. Däremot saknade utblottad preparatet TCS. (C) och (D) Visa sammanfattade data för tryck volym förhållanden i intakta och denaturerade preparat i urinblåsan som hystes > 250 μl lösning. Observera att fyllnings volymerna och intravesikal trycket var anmärkningsvärt lika i intakt och utblottad urinblåsan preparat. Denna siffra har reproducerats från en tidigare publikation13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Schematiskt diagram över den isolerade urinblåsan modell som används för att utvärdera tillgängligheten av urotel-derived mediatorer i SubU/lp och lumen under fyllning. Blåsan preparatet placeras i en vatten-jacketed kammare och översmält med syrade Krebs bikarbonatlösning (KBS). Beredningen av urinblåsan (UB) fylls med varma oxygenerade KBS via en kateter i urinröret ansluten till en infusionspump. Urinblåsan tryck (BP) övervakas via en Trevägskontakt genom infusionsslang underblåsa fyllning. Prover från extraluminal (el, orgel bad) och svalgmanometri (Il) lösningar bearbetas för detektion av medlare (m) enligt detekterings applikationer. Denna siffra har reproducerats från en tidigare publikation13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: detrusor-fri blåsa beredning är lämplig för att mäta tillgängligheten av medlare i SubU/LP under fyllning. Representativa kromatogram som visar tillgången på puriner i de extraluminala proverna i intakta (a) och detrusfria (B) preparat i urinblåsan. Observera att purin mediatorer upptäcks bättre i utblottad preparatet än i intakt preparatet. (C) den relativa bidraget från enskilda puriner till purin pooler upptäcks i lumen och subu/lp av utblottad preparatet är betydligt annorlunda. Denna siffra har reproducerats från en tidigare publikation13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: detrusor-fri blåsa beredning är lämplig för att undersöka metabolism och transurotelial transport av medlare underblåsa fyllning. (a, B) Representativa kromatogram som visar εATP-substrat (AA, ba). När underlaget appliceras på antingen SubU/LP (AB) eller lumen (BB) minskade Εatp och produkterna Εadp, Εamp och εado ökades. Därför är εATP degraderad på vardera sidan av ansökan; men bildandet av εATP produkter är asymmetriskt i SubU/LP och lumen. Observera att εATP-produkterna εAMP och εADO, men inte substratet εATP, dök upp på motsatt sida av εATP-ansökan (AC, BC). Därför puriner verkar transporteras genom väggen i detrusor-fri förberedelse under arkivering. Denna siffra har modifierats från13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1
Video 1: representativ inspelning av intakt blåsa fyllning. Urinblåsan fylldes på 15 μL/min. video spelades in med en zoom stereomikroskop med en laddad kopplad enhet (CCD) kamera vid 5 Hz; inspelningen stoppades vid uppnående av 25 mmHg svalgmanometri tryck. Den fullständiga varaktigheten av bilden är 64x realtid. Denna video har reproducerats från13. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).

Video 1
Video 2: representativ inspelning av detrusor-fri blåsa fyllning. Urinblåsan fylldes med 15 μl/min. video spelades in med en zoom stereomikroskop med en CCD-kamera vid 5 Hz; inspelningen stoppades vid uppnående av 25 mm Hg svalgmanometri tryck. Hela varaktigheten av bilden är 64 gånger i realtid. Denna video har reproducerats från13. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Urinblåsan har två funktioner: lagring och tömning av urin. Normal drift av dessa funktioner kräver ordentlig mekanisk avkänning av svalgmanometri volym och tryck och transduktion av signaler genom celler i urinblåsan väggen för att reglera detrusormuskeln muskel retbarhet. Urinblåsan slemhinnan (urotel) tros reglera urinblåsan retbarhet genom att släppa en mängd olika signalmolekyler i SubU/LP som påverkar många celltyper i urinblåsan väggen. För närvarande, de flesta försök till karakterisering av urotel-härledda medlare innebär användning av urinblåsan preparat (t. ex., platta blåsan vägg lakan, blåsa vägg remsor, eller odlade celler) som inte återger fysiologiska blåsa fyllning. Mätningar av medlare som släpps i urinblåsan lumen i slutet av urinblåsan fyllning används ofta som indikation för frisläppandet av dessa medlare från motsatt sida av urotel. Nyligen genomförda studier tyder dock på att svalgmanometri innehåll av medlare inte är representativt för vad som finns djupt i urinblåsan väggen13. Nya experimentella metoder som möjliggör tillgång till SubU/LP underblåsa fyllning behövs för att ytterligare vår förståelse av lokala mekanismer för signalering mellan urinblåsan urotel, SubU/LP och DSM.

Här visar vi en ny modell djur blåsan där detrusormuskeln muskeln avlägsnas för att ge direkttillgång till medlare frigörs från urotel i SubU/LP under fyllning13. Den utblottad preparatet liknar fyllning av intakt urinblåsa13,18, vilket tyder på att avsaknaden av detrusormuskeln muskeln inte ändrar mechanosensitive egenskaperna hos urotelet underblåsa fyllning. Preparatet tillåter tryck volym studier som skall utföras på urinblåsan i avsaknad av confounding signalering från spinal reflexer och detrusormuskeln muskler. Därför kan mediatorer som släpps i SubU/LP mätas utan systemisk påverkan eller kontaminering från andra källor. Förmågan att direkttillgång till närheten av SubU/LP vid olika volymer och tryck underblåsa fyllning gör modellen lämplig för att studera frisättning, metabolism och transurotelial transport av biologiskt aktiva medlare under lagring och pre-voiding stadier av urinblåsan fyllning.

Det mest kritiska steget i detta protokoll är avlägsnandet av detrusormuskeln glatta muskler samtidigt hålla urotel och SubU/LP intakt. Förfarandet är särskilt enkelt i mus blåsan på grund av den lösa kopplingen mellan detrusormuskeln muskeln och SubU/LP. Förberedelserna visade utmärkt reproducerbarhet med anmärkningsvärt liknande tryck volymegenskaper till intakt blåsor13. Modellen är också möjligt i urinblåsor från större djur där detrusormuskeln muskeln kan delvis eller helt avlägsnas. Till exempel, vi har tidigare visat att modellen kan återges i urinblåsan från cynomolgus Monkey Macaca sidenört och visat att medlare kan mätas i subu/LP under beredning fyllning13.

Den potentiella begränsningen av denna ex vivo-modellen är själva frågan som är styrkan i preparatet, i huvudsak avsaknaden av systemiska effekter av det centralanervsystemet och cirkulation möjliggör noggrann undersökning av lokala mekanismer för slemhinna-detrusor anslutning underblåsa fyllning. Brist på systemiska effekter delas med många ex vivo metoder, inklusive isolerade urinblåsan väggskivor eller remsor eller odlade urotelceller. Den detrusor-fria urinblåsan modell, dock, är överlägsen de ovan nämnda metoder i urotelial forskning i att det ger direkttillgång till SubU/LP i samband med blåsa fyllning. Därför, användning av denna metod kommer att öka förståelsen för mechanosensitive mekanantransduktion mekanismer som har sitt ursprung i urotel under fyllning av urinblåsan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Delar av detta arbete publicerades tidigare i Journal of Physiology (PMCID: PMC6418748; DOI: 10.1113/JP27692413). Tillstånd har beviljats av Wiley och Sons, Inc. för användning av material från denna publikation. Författarna har inga ekonomiska eller andra konflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av det nationella institutet för diabetes och mag-och njursjukdomar Grant DK41315.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2 Fisher C79 Source flexible
Dextrose Fisher D16 Source flexible
Dissecting pins Fine Science Tools 26002-20 Source flexible
Infusion Pump Kent Scientific GenieTouch Source flexible
KCl Fisher P217 Source flexible
KH2PO4 Fisher P284 Source flexible
Light source SCHOTT ACEI Source flexible
Microscope Olympus SZX7 Flexible to use any scope
MgCl2 Fisher M33 Source flexible
NaCl Fisher S671 Source flexible
NaHCO3 Fisher S233 Source flexible
Needles 25G Becton Dickinson 305122 Source flexible
Organ bath Custom made Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing Intramedic 427405 Source flexible
Pressure transducer AD instrument Source flexible
S&T Forceps Fine Science Tools 00632-11 Source flexible
Software pressure-volume AD Instruments Power lab
Suture Nylon, 6-0 AD surgical S-N618R13 Source flexible
Suture Silk, 6-0 Deknatel via Braintree Scientific, Inc. 07J1500190 Source flexible
Syringes 1 mL Becton Dickinson 309602 Source flexible
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Source flexible
Water circulator Baxter K-MOD 100 Source flexible

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
  2. Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 57-62 (2016).
  3. Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
  4. Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
  5. Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
  6. Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
  7. Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
  8. McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
  9. Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
  10. Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
  11. Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
  12. Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
  13. Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
  14. Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
  15. Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
  16. Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
  17. Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
  18. Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
  19. Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics