En desentralisert (ex vivo) murine blære modell med Detrusor muskelen fjernet for direkte tilgang til Suburothelium under blære fylling

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den detrusor-frie blæren modellen gir direkte tilgang til suburothelium å studere lokale mekanismer for regulering av biologisk aktive mekler tilgjengelighet i suburothelium/lamina propria under lagring og annullering av urin. Forberedelsene ligner fylling av en intakt blære og gjør at trykk-volum studier skal utføres uten systemiske påvirkninger.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Durnin, L., Corrigan, R. D., Sanders, K. M., Mutafova-Yambolieva, V. N. A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling. J. Vis. Exp. (153), e60344, doi:10.3791/60344 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tidligere studier har etablert utgivelsen av kjemiske stoffer fra flat blære mucosa ark festet i ussing kamre og utsatt for endringer i hydrostatisk trykk eller mekanisk strekk og fra kultivert urotelialt celler på hydrostatisk trykk endringer, strekk, celle hevelse, eller dra krefter, og i blæren lumen på slutten av fylling. Slike funn førte til antagelsen om at disse meglere er også utgitt i suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) under blære fylling, hvor de påvirker celler dypt i blæren veggen til slutt regulere blæren excitability. Det er minst to åpenbare begrensninger i slike studier: 1) ingen av disse tilnærmingene gir direkte informasjon om tilstedeværelsen av meglere i SubU/LP, og 2) stimuli som brukes er ikke fysiologiske og ikke recapitulate autentisk fylling av blæren. Her diskuterer vi en prosedyre som gir direkte tilgang til den suburothelial overflaten av blæren mucosa i løpet av blæren fylling. Den murine detrusor-fri forberedelse vi skapte ligner fylling av intakt blæren og tillater trykk-volum studier som skal utføres på blæren i fravær av forvirrende signalering fra spinal reflekser og detrusor glatt muskel. Ved hjelp av romanen detrusor-fri blære modell, vi nylig viste at intravesical målinger av meglere ikke kan brukes som en proxy til hva som er utgitt eller finnes i SubU/LP under blære fylling. Modellen muliggjør undersøkelse av urothelium-avledet signalering molekyler som er utgitt, generert av metabolisme og/eller transporteres inn i SubU/LP i løpet av blæren fylling å overføre informasjon til neurons og glatte muskelen i blæren og regulere sin excitability under continence og vannlating.

Introduction

Hensikten med denne modellen er å muliggjøre direkte tilgang til den submucosal siden av blæren mucosa under ulike faser av blæren fylling.

Blæren må avstå fra for tidlig sammentrekning under fylling og tom når kritisk volum og trykk er nådd. Unormal continence eller annullering av urin er ofte forbundet med unormal excitability av den detrusor glatte muskelen (DSM) i løpet av blære fylling. Excitability av DSM bestemmes av faktorer som er iboende til den glatte muskelceller og ved påvirkninger generert av ulike celletyper i blæren veggen. Veggen av urin blæren består av urothelium (mucosa), suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), detrusor glatt muskel (DSM) og serosa (figur 1a). Urothelium består av paraply celler (dvs. det ytterste laget av urothelium), mellomliggende celler og basal celler (dvs. det innerste laget av urothelium). Ulike typer celler, inkludert interstitiell celler, fibroblaster, afferente nerve terminaler, små blodkar, og immunceller bor i SubU/LP. Det er allment antatt at blæren urothelium er en sensorisk organ som initierer refleks vannlating og continence ved å slippe meglere i submukosa som påvirker cellene i SubU/LP og DSM1,2,3. For det meste er slike forutsetninger basert på studier som har vist utgivelsen av meglere: fra biter av mucosa utsatt for endringer i hydrostatisk trykk4,5; fra kultivert urotelialt celler utsatt for strekk6,7, hypotonicity-indusert celle hevelse7 eller drag styrker8; fra isolerte blære vegg strimler ved reseptor eller nerve aktivering9,10,11,12,13,14; og i blæren lumen på slutten av blæren fylle15,16,17,18,19. Mens slike studier var medvirkende til å demonstrere utgivelsen av meglere ved mekanisk stimulering av blære vegg segmenter eller kultivert urotelialt celler, må de støttes av direkte bevis for frigjøring av meglere i submukosa som er elicited av fysiologiske stimuli som reproduserer blære fylling. Dette er en utfordrende oppgave gitt at SubU/LP ligger dypt i blæreveggen hindrer enkel tilgang til nærheten av SubU/LP under blære fylling.

Her illustrerer vi en desentralisert (ex vivo) murine blære modell med detrusor muskelen fjernet13 som ble utviklet for å lette studier på lokale mekanismer for mechanotransduction som deltar i signalering mellom blæren urothelium, DSM og andre celletyper i blæren veggen. Denne tilnærmingen er overlegen ved hjelp av flat blæreveggen ark, blære vegg strimler eller kultivert urotelialt celler fordi det tillater direkte målinger i nærheten av SubU/LP av urothelium-avledet meglere som er utgitt eller dannet som svar på fysiologiske trykk og volumer i blæren og unngår potensielle fenotypiske endringer i celle kulturen. Den kan brukes til å måle tilgjengelighet, utgivelse, metabolisme og transurothelial transport av meglere i SubU/LP på ulike stadier av blære fylling (figur 1B). Preparatet kan også brukes til å undersøke urotelialt signalering og mechanotransduction i modeller av overaktiv og underactive blære syndromer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyr som er beskrevet i dette manuskriptet ble gjennomført i henhold til National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr og den institusjonelle Animal use og Care Committee ved Universitetet i Nevada.

Merk: modellen som presenteres her består av fjerning av detrusor muskelen mens Urothelium og SUBU/LP forblir intakt (figur 1B) for å aktivere ETTERFORSKERE direkte tilgang til SubU/LP i løpet av blæren fylling.

1. Disseksjon av Detrusor-fri blære forberedelse

  1. Plasser isolert blæren i en dissekere parabol fylt med kaldt (10 ° c) og oksygenert med 5% CO2/95% O2 KREBS bikarbonat løsning (KBS) med følgende sammensetning (mm): 118,5 NaCl, 4,2 KCl, 1,2 MgCl2, 23,8 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 11,0 druesukker, 1,8 CaCl2 (pH 7,4)13.
  2. PIN en liten del av kuppelen på isolert blæren til en Sylgard-dekket dissekere parabolen fylt med KBS. Pass på at nålen går gjennom et stykke av serosa eller den ytterste kanten av detrusor muskelen langt fra den innerste kanten av muskelen som vender mot SubU/LP.
  3. Ved hjelp av et mikroskop, identifisere urinrøret og urinlederne og PIN hver av dem til bunnen av dissekere parabolen.
  4. Fjern overflødig fett og bindevev slik at hele hoveddelen av blæren, urinrøret og begge urinlederne vises.
  5. Bind urinlederne med 6-0 nylon sting. Deretter PIN de åpne endene av urinlederne mot bunnen av dissekere parabolen å sikre forberedelse.
  6. Ved hjelp av fine-tip tang, trekk forsiktig en bit av serosa på hjørnet mellom ureter og blæren kroppen.
  7. Juster lys på mikroskopet for å øke gjennomsiktigheten og skille margen på submukosa under detrusor muskelen.
  8. Begynn å kutte (ikke peeling!) blæren veggen med fine-tip saks langs den indre overflaten av detrusor muskel lag mens forsiktig trekke kutt segmentet bort fra preparatet. Til enhver tid, sørg for at den laterale kanten av mucosa kan sees og unngå å berøre den.
  9. Fjern detrusor muskelen helt ved å dreie rundt dissekere parabolen slik at plasseringen av preparatet er behagelig å fortsette dissekere ut detrusor muskelen.
  10. Legg igjen et lite stykke detrusor muskel på toppen av blæren kuppelen for å sikre evne til å nakkens forberedelse under de resterende trinnene i protokollen.
  11. Lag en dobbel sløyfe av 6-0 nylon tråd, Legg den rundt halsen på blæren forberedelse, og la loopen løs.
  12. Legg til en ny dobbel sløyfe av 6-0 silketråd, Legg den rundt halsen på blæren forberedelse, og la loopen taper. Å ha to sting hindrer lekkasjer rundt sting.
  13. Skjær ca 2 cm av 20 PE slange (kateter), fakkel opp spissen ved å flytte langsomt spissen nær en flamme.
  14. Fyll kateteret med varmt (37 ° c) oksygenert KBS.
  15. Sett kateteret i munnstykket av blæren urinrøret og trykk forsiktig på kateteret til kateteret spissen når omtrent midten av blæren.
  16. Knyt Sutur rundt kateteret og det omgivende vevet i blærehalsen.
  17. Fyll langsomt blæren med ca 50-100 μL av varm (37 ° c) oksygenert KBS, løft det kort (< 10 s) over overflaten av KBS, og overvåke for lekkasjer på sting og blære kroppen.
  18. Hvis ingen lekkasje er observert, er forberedelsene klar for eksperimentet. Hvis det observeres en lekkasje rundt Sutur, fjerner du Sutur og skifter den ut. Hvis en lekkasje fra et hull i blæren kroppen er lagt merke til, forkaste preparatet.

2. fylling av var avdekt blæren forberedelse

  1. Perfuse KBS (37 ° c) til et 3 mL kammer av vann (37 ° c) Jacketed orgel rett med Sylgard bunn.
  2. Juster oksygen og suge linjer.
  3. Plasser var avdekt blæren forberedelse i kammeret.
  4. Fest kateteret på siden av kammeret, slik at preparatet ikke flyter over overflaten på den.
  5. Koble blære kateteret til en lengre PE20-slange (infusjonslinje) som er koblet til de tre måten stopcock bruker samme størrelse montering.
  6. Pass på at linjene mellom infusjons pumpen, trykkgiveren og blæren er åpne.
  7. Fyll infusjons sprøyten med frisk, varm (37 ° c) og oksygenert KBS.
  8. Juster pumpe parametrene: type/sprøyte volum (dvs. 1 mL), drift (dvs. sette mot), Flow (dvs. konstant) og strømningshastighet (dvs. 15 μL/min).
  9. Trykk på Start -knappen på sprøyte pumpen for å fylle blæren.
  10. Skjerm fyllings volum og intravesical trykk under blære fylling.

3. påvisning av meglere i SubU/LP aspekt av var avdekt blæren forberedelse

  1. Samle alikvoter av bad løsning i iskald mikrosentrifugen rør eller høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) inserts.
  2. Klargjør og behandle prøvene i henhold til det aktuelle gjenkjennings programmet. I tilfelle oppdage purine tilgjengelighet, behandle prøvene ved HPLC med fluorescens deteksjon13,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Veggen av murine detrusor-fri blære forberedelse er intakt og inneholder alle lag unntatt DSM og serosa. Studier med bevis på prinsippet viste at den DSM-frie blæreveggen inkluderer urothelium og SubU/LP mens tunika- muscularis og serosa er fraværende (figur 2)13.

Fylling av detrusor-fri blære tilnærmet normal blære fylling. Figur 3 viser skjematisk av det eksperimentelle oppsettet for fylling av ex vivo blære preparater ved ulike Påfyllings rater, volumer og intraluminal trykk. Murine ex vivo intakt og var avdekt blære preparater krever et bredt spekter av fylle volumer for å nå ugyldig trykk13. Forholdet mellom trykk og volum er bemerkelsesverdig lik i de intakte og var avdekt forberedelsene (film 1, film 2og Figur 4). Derfor er DSM-Free forberedelse egnet for funksjonelle studier av urothelium rolle og SubU/LP i blære mechanosensation og mechanotransduction.

Mulig bruk av Detrusor-Free blære Model
Mål tilgjengeligheten av meglere i blære lumen og SubU/LP under blære fylling
Det eksperimentelle oppsettet for innsamling av extraluminal (EL; f.eks. bading SubU/LP) og intraluminal (IL) prøver under fylling av blære preparater mens overvåking av blære trykk illustreres i figur 5. Egnetheten av modellen for måling av urothelium-avledede meglere som er utgitt i SubU/LP-siden under fylling ble testet ved å måle frigjøring av purine meglere (f. eks adenosin 5 '-trifosfat, ATP; adenosin 5 '-uridindifosfatglukuronosyltransferase, ADP; nikotinamid adenine dinucleotide, NAD; adenosin 5 '-monofosfat, AMP; og adenosin, ADO) i løsningen bading SubU/LP av var avdekt forberedelse. Som demonstrert i figur 6A, ble ubetydelige mengder av puriner påvist i badet som inneholdt en isolert BLÆRE forberedelse med intakt DSM, mens mengdene av disse puriner var signifikant høyere i prøver som ble samlet inn fra badet som inneholdt en var avdekt blære forberedelse (figur 6B). Spesielt var fordelingen av puriner og metabolitter i prøver samlet inn fra lumen og SubU/LP ved slutten av fyllingen signifikant (figur 6C).

Undersøk ekstracellulære metabolismen av meglere i SubU/LP under blære fylling
Tillegg av den svært fluorescerende analog av ATP, 1,N6-Etheno-ATP (εATP), til suburothelial siden av detrusor-fri forberedelse resulterte i en nedgang på εATP og en økning i ΕATP produkter εADP, εAMP, og εADO (figur 7AA og figur 7AB). På samme måte resulterte tillegg av εATP i forberedelsen lumen i en reduksjon av εATP og en økning i εADP, εAMP og εADO i lumen (figur 7ba og figur 7bb). Derfor er modellen egnet for studier av metabolismen av bioaktive meglere på begge sider av urothelium under blære fylling.

Undersøk transurothelial transport av meglere under blære fylling
Tilsetting av εATP til SubU/LP siden av var avdekt forberedelse resulterte i utseendet på εAMP, εADO og noen εADP i lumen, noe som tyder på at puriner kan transporteres fra SubU/LP til lumen13 (figur 7AC). På samme måte, legge εATP i lumen resulterte i utseendet på εAMP og εADO i SubU/LP13 (figur 7DB). Merk at ingen εATP ble observert på motsatt side av εATP søknad. Sammen, disse observasjonene sterkeste tyder på at detrusor-fri blære forberedelse er egnet for studier av bilaterale transurothelial transport av meglere under fylling.

Figure 1
Figur 1: prinsippet for den detrusor-frie blære modellen. (A) Blæren veggen består av urothelium, suburothelium/lamina propria (SubU/LP), detrusor muskel og serosa. Hvert av disse lagene inneholder ulike celletyper som er viktige for blære funksjoner under lagring og annullering av urin. Under blæren fylling, biologisk aktive meglere er frigitt fra urothelium inn i blæren lumen og i SubU/LP for å påvirke cellene dypt i blæren veggen, inkludert detrusor muskelen. Mens tilgangen til blæren lumen er relativt grei, er det ingen direkte tilgang til SubU/LP under fylling å oppdage urothelium-avledet meglere som kan påvirke cellene i blæren veggen og kontroll detrusor muskel excitability. (B) fjerning av detrusor muskel lag sammen med serosa eksponerer hele overflaten av SUBU/LP som muliggjør direkte tilgang til SUBU/LP der urothelium-avledede signalmolekyler kan måles i ulike faser av blære fyllet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: histologi av murine intakt og detrusor-frie blære vegger. Masson ' s trichrome farging av fylt intakt (A) og detrusor-Free (B) blære vegger viser at var avdekt preparatet inneholder intakt urothelium (U) og SubU/LP, men ikke detrusor muskelen (D) og serosa (s). L, lumen. Dette tallet er gjengitt fra en tidligere publikasjon13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skjematisk fremstilling av eksperimentell oppsett brukt ved fylling av ex vivo blære preparater. Den ex vivo intakt eller var avdekt urin blære (UB) forberedelse er plassert i en varm (37 ° c) vann-Jacketed organ kammer som er perfusert med oksygenrikt Krebs-bikarbonat løsning (KBS, 37 ° c, pH 7,4). Blæren preparatet er tilført KBS på ulike fylling priser og volumer og intraluminal blære trykk (BP) er registrert gjennom hele eksperimentet dette tallet er gjengitt fra en tidligere publikasjon13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Trykk-volum relasjoner i intakt og detrusor forberedelser. (A) og (B) er representative innspillinger av intravesical volum og trykk av ex vivo intakt og var avdekt blæren preparater som er fylt med Krebs-bikarbonat løsning på 15 μL/min. Som forventet har intakt forberedelse utviklet forbigående sammentrekninger (TCs) på grunn av tilstedeværelsen av detrusor. I kontrast til det var avdekt preparatet manglet TCs. (C) og (D) viser oppsummerte data for Trykk-volum relasjoner av intakt og var avdekt blære preparater som innkvarteres > 250 μL av oppløsning. Merk at fylling volumer og intravesical presset var bemerkelsesverdig lik i intakt og var avdekt blæren forberedelser. Dette tallet er gjengitt fra en tidligere publikasjon13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: skjematisk diagram av den isolerte blæren modellen brukes til å evaluere tilgjengeligheten av urothelium-avledet meglere i SubU/LP og lumen under fylling. Blæren preparatet er plassert i et vann-Jacketed kammer og superfused med oksygenert Krebs bikarbonat løsning (KBS). Den urin blære (UB) preparatet er fylt med varmt oksygenert KBS via et kateter i urinrøret som er koblet til en infusjon pumpe. Blære trykk (BP) overvåkes via en tre-veis kontakt gjennom infusjons linjen under blære fylling. Prøver fra extraluminal (EL, orgel bad) og intraluminal (IL) løsninger er behandlet for påvisning av meglere (m) i henhold til deteksjon applikasjoner. Dette tallet er gjengitt fra en tidligere publikasjon13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: den detrusor-frie blære preparatet er egnet for måling av tilgjengelighet av meglere i SubU/LP under fylling. Representative kromatogrammene demonstrerer tilgjengeligheten av puriner i extraluminal prøvene i intakt (A) og detrusor-fri (B) blære preparater. Merk at purine meglere er bedre oppdaget i var avdekt forberedelser enn i intakt forberedelse. (C) den relative bidrag av individuelle puriner til purine bassengene oppdages i lumen og i SUBU/LP av var avdekt preparatet er signifikant forskjellig. Dette tallet er gjengitt fra en tidligere publikasjon13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: detrusor-fri blære forberedelse er egnet for å undersøke metabolisme og transurothelial transport av meglere under blære fylling. (A, B) Representative kromatogrammene viser εATP substrat (AA, ba). Når underlaget påføres enten SubU/LP (AB) eller lumen (bb) εATP ble redusert og produktene ΕADP, εAMP og εADO ble økt. Derfor er εATP degradert på hver side av programmet; dannelse av εATP-produkter er imidlertid asymmetrisk i SubU/LP og lumen. Merk at εATP produkter εAMP og εADO, men ikke underlaget εATP, dukket opp på motsatt side av εATP program (AC, BC). Derfor puriner ut til å bli transportert gjennom veggen av detrusor-fri forberedelse under innlevering. Dette tallet er endret fra13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1
Video 1: representativ innspilling av intakt blære fylling. Blæren ble fylt på 15 μL/min. video ble spilt inn ved hjelp av en zoom-stereomikroskopet med et ladet koblet enhet (CCD) kamera ved 5 Hz; innspillingen ble stoppet ved å nå 25 mmHg intraluminal trykk. Den fulle varigheten av bildet er 64x Real-time. Denne videoen har blitt gjengitt fra13. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).

Video 1
Video 2: representativ innspilling av detrusor-fri blære fylling. Blæren ble fylt på 15 μL/min. video ble spilt inn ved hjelp av en zoom-stereomikroskopet med et CCD-kamera ved 5 Hz; innspillingen ble stoppet ved å nå 25 mm HG intraluminal trykk. Den fulle varigheten av bildet er 64 ganger i sanntid. Denne videoen har blitt gjengitt fra13. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Blæren har to funksjoner: lagring og annullering av urin. Normal drift av disse funksjonene krever riktig mekanisk sensing av intraluminal volum og trykk og Transduction av signaler gjennom celler i blæren veggen for å regulere detrusor muskel excitability. Blæren mucosa (urothelium) antas å regulere blæren excitability ved å slippe en rekke signalering molekyler i SubU/LP som påvirker mange celletyper i blæren veggen. For tiden, de fleste forsøk på karakterisering av urothelium-avledede meglere innebære bruk av blære preparater (f. eks flat blære veggplater, blære vegg strimler, eller kultivert celler) som ikke reprodusere fysiologisk blære fylling. Målinger av meglere som er utgitt i blæren lumen på slutten av blæren fylling er ofte brukt som indikasjon for utgivelsen av disse meglere fra motsatt side av urothelium. Men nyere studier tyder på at intraluminal innhold av meglere er ikke representativt for hva som er tilgjengelig dypt i blæren veggen13. Novel eksperimentelle tilnærminger muliggjør tilgang til SubU/LP under blære fylling er nødvendig for å ytterligere vår forståelse av lokale mekanismer for signalering mellom blære urothelium, SubU/LP og DSM.

Her viser vi en roman dyr blære modell der detrusor muskelen er fjernet for å gi direkte tilgang til meglere løslatt fra urothelium i SubU/LP under fylling13. Den var avdekt forberedelsen ligner fylling av intakt blære13,18, noe som tyder på at mangelen på detrusor muskelen ikke endrer mechanosensitive egenskapene til urothelium under blære fylling. Preparatet gjør at trykk-volum studier skal utføres på blæren i fravær av forvirrende signalering fra spinal reflekser og detrusor muskel. Derfor meglere utgitt i SubU/LP kan måles uten systemisk påvirkning eller forurensning fra andre kilder. Muligheten til direkte tilgang til nærheten av SubU/LP på ulike volumer og trykk under blære fylling gjør modellen egnet til å studere utgivelse, metabolisme og transurothelial transport av biologisk aktive meglere under lagring og pre-løse stadier av blære fylling.

Det mest kritiske trinnet i denne protokollen er fjerning av detrusor glatte muskelen samtidig holde urothelium og SubU/LP intakt. Prosedyren er spesielt grei i muse blæren på grunn av den løse forbindelsen mellom detrusor muskelen og SubU/LP. Forberedelsene viste utmerket reproduserbarhet med bemerkelsesverdig lik trykk-volum egenskaper til intakt blærer13. Modellen er også gjennomførbart i blærer fra større dyr der detrusor muskelen kan være delvis eller helt fjernet. For eksempel har vi tidligere vist at modellen kan gjengis i blæren fra Cynomolgus Monkey Macaca fascicularis og viste at meglere kan måles i SUBU/LP under forberedelse fylle13.

Den potensielle begrensningen av denne ex vivo-modellen er selve problemet som er styrken av preparatet, i hovedsak, mangelen på systemiske effekter av sentralnervesystemet og sirkulasjon gir grundig undersøkelse av lokale mekanismer for slimhinnen-detrusor tilkobling under blære fylling. Mangel på systemiske effekter deles med mange ex vivo tilnærminger, inkludert isolerte blæreveggen ark eller strimler eller kultivert urotelialt celler. Den detrusor-frie blæren modellen, derimot, er overlegen de nevnte tilnærminger i urotelialt forskning ved at det gir direkte tilgang til SubU/LP i løpet av blæren fylling. Derfor vil bruk av denne tilnærmingen øke forståelsen av mechanosensitive mechanotransduction mekanismer som kommer i urothelium under fylling av blæren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Deler av dette arbeidet ble tidligere publisert i Journal of fysiologi (PMCID: PMC6418748; DOI: 10.1113/JP27692413). Tillatelse er gitt av Wiley and Sons, Inc. for bruk av materialer fra denne publikasjonen. Forfatterne har ingen økonomiske eller andre konflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of diabetes og fordøyelses-og nyre sykdommer Grant DK41315.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2 Fisher C79 Source flexible
Dextrose Fisher D16 Source flexible
Dissecting pins Fine Science Tools 26002-20 Source flexible
Infusion Pump Kent Scientific GenieTouch Source flexible
KCl Fisher P217 Source flexible
KH2PO4 Fisher P284 Source flexible
Light source SCHOTT ACEI Source flexible
Microscope Olympus SZX7 Flexible to use any scope
MgCl2 Fisher M33 Source flexible
NaCl Fisher S671 Source flexible
NaHCO3 Fisher S233 Source flexible
Needles 25G Becton Dickinson 305122 Source flexible
Organ bath Custom made Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing Intramedic 427405 Source flexible
Pressure transducer AD instrument Source flexible
S&T Forceps Fine Science Tools 00632-11 Source flexible
Software pressure-volume AD Instruments Power lab
Suture Nylon, 6-0 AD surgical S-N618R13 Source flexible
Suture Silk, 6-0 Deknatel via Braintree Scientific, Inc. 07J1500190 Source flexible
Syringes 1 mL Becton Dickinson 309602 Source flexible
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Source flexible
Water circulator Baxter K-MOD 100 Source flexible

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
  2. Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 57-62 (2016).
  3. Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
  4. Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
  5. Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
  6. Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
  7. Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
  8. McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
  9. Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
  10. Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
  11. Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
  12. Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
  13. Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
  14. Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
  15. Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
  16. Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
  17. Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
  18. Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
  19. Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics