Un modello di vescica murine decentralizzato (Ex Vivo) con il muscolo del detrusore rimosso per l'accesso diretto al Suburothelium durante il riempimento della vescica

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Summary

Il modello di vescica privo di detrusivi consente l'accesso diretto al suburothelium per studiare i meccanismi locali per la regolazione della disponibilità del mediatore biologicamente attivo in suburothelium/lamina propria durante lo stoccaggio e lo svuotamento delle urine. La preparazione assomiglia da vicino al riempimento di una vescica intatta e consente di eseguire studi sul volume di pressione senza influenze sistemiche.

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Durnin, L., Corrigan, R. D., Sanders, K. M., Mutafova-Yambolieva, V. N. A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling. J. Vis. Exp. (153), e60344, doi:10.3791/60344 (2019).

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Abstract

Studi precedenti hanno stabilito il rilascio di sostanze chimiche da fogli di mucosa della vescica piatta apposti nelle camere di ussing ed esposti a cambiamenti nella pressione idrostatica o tratto meccanico e dalle cellule umaleali coltivate su cambiamenti di pressione idrostatica, stretch, gonfiore cellulare, o forze di trascinamento, e in lucentezza della vescica alla fine del riempimento. Tali risultati hanno portato all'ipotesi che questi mediatori siano rilasciati anche in suburolio (SubU)/lamina propria (LP) durante il riempimento della vescica, dove influenzano le cellule profonde nella parete della vescica per regolare in ultima analisi l'escitabilità della vescica. Ci sono almeno due ovvie limitazioni in tali studi: 1) nessuno di questi approcci forniscono informazioni dirette sulla presenza di mediatori in SubU/LP, e 2) gli stimoli utilizzati non sono fisiologici e non riassumono l'autentico riempimento della vescica. Qui, discutiamo una procedura che consente l'accesso diretto alla superficie suburoteliale della mucosa della vescica nel corso del riempimento della vescica. La preparazione senza detrusioni murine che abbiamo creato assomiglia molto al riempimento della vescica intatta e consente di eseguire studi di volume di pressione sulla vescica in assenza di segnalazione confusa da riflessi spinali e muscolo liscio detrusore. Utilizzando il nuovo modello di vescica priva di detrustori, abbiamo recentemente dimostrato che le misurazioni intrassiche dei mediatori non possono essere utilizzate come proxy per ciò che è stato rilasciato o presente nel SubU/LP durante il riempimento della vescica. Il modello consente l'esame delle molecole di segnalazione derivate dall'urotelium che vengono rilasciate, generate dal metabolismo e/o trasportate nel SubU/LP durante il corso del riempimento della vescica per trasmettere informazioni ai neuroni e al muscolo liscio della vescica e regolarne l'eccitabilità durante la continenza e la miturismo.

Introduction

Lo scopo di questo modello è quello di consentire l'accesso diretto al lato submucosale della mucosa della vescica durante le diverse fasi di riempimento della vescica.

La vescica deve astenersi da una contrazione prematura durante il riempimento e vuota quando si raggiunge il volume critico e la pressione. Continenza anormale o svuotamento delle urine sono spesso associati con eccitabilità anormale del muscolo detrusore liscio (DSM) nel corso del riempimento della vescica. L'eccitabilità del DSM è determinata da fattori intrinseci alle cellule muscolari lisce e da influenze generate da diversi tipi di cellule all'interno della parete della vescica. La parete della vescica urinaria è costituita da urotelium (mucosa), suburotilio (SubU)/lamina propriale (LP), muscolo detrustore liscio (DSM) e sirosa (Figura 1A). L'urotelium è costituito da cellule ombrelli (cioè lo strato più esterno dell'urolium), cellule intermedie e cellule basali (cioè lo strato più interno dell'urothelium). Vari tipi di cellule, tra cui cellule interstitial, fibroblasti, terminali nervosi afferenti, piccoli vasi sanguigni, e le cellule immunitarie risiedono nella SubU/ LP. È ampiamente ipotizzato che l'urotelium della vescica sia un organo sensoriale che avvia la minzione riflessiva e la continenza rilasciando mediatori nella submucosa che colpiscono le cellule nel SubU/ LP e nel DSM1,2,3. Per la maggior parte, tali ipotesi si basano su studi che hanno dimostrato il rilascio di mediatori: da pezzi di mucosa esposti a cambiamenti di pressione idrostatica4,5; da cellule uoreliali coltivate esposte al tratto6,7, cella indotta dall'ipotonicitàgonfiore 7 o forze di trascinamento8; da strisce di parete della vescica isolate alrecettoreo attivazione del nervo9,10,11,12,13,14; e nel lume della vescica alla fine della vescica che riempie15,16,17,18,19. Mentre tali studi sono stati strumentali per dimostrare il rilascio di mediatori sulla stimolazione meccanica di segmenti della parete della vescica o cellule urotelia coltivate, hanno bisogno di essere supportati da prove dirette per il rilascio di mediatori nella submucosa che è suscitata da stimoli fisiologici che riproducono il riempimento della vescica. Questo è un compito impegnativo dato che il SubU / LP si trova in profondità nella parete della vescica ostacolando il semplice accesso alle vicinanze di SubU / LP durante il riempimento della vescica.

Qui, illustriamo un modello di vescica murina decentralizzata (ex vivo) con il muscolo detrusor rimosso13 che è stato sviluppato per facilitare gli studi sui meccanismi locali di meccanotransduzione che partecipano alla segnalazione tra l'urothelium della vescica, DSM e altri tipi di cellule nella parete della vescica. Questo approccio è superiore all'utilizzo di fogli piatti della parete della vescica, strisce di parete della vescica o cellule uroliali coltivate perché consente misurazioni dirette in prossimità di SubU/LP di mediatori derivati dall'urothelium che vengono rilasciati o formati in risposta a pressioni fisiologiche e volumi nella vescica ed evita potenziali cambiamenti fenotipici nella coltura cellulare. Può essere utilizzato per misurare la disponibilità, il rilascio, il metabolismo e il trasporto transuroteliale dei mediatori in SubU/LP in diverse fasi di riempimento della vescica (Figura 1B). La preparazione può essere utilizzata anche per esaminare la segnalazione uoteliale e la meccanotrazione in modelli di sindromi della vescica iperattiva e sottoattiva.

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Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono animali descritte in questo manoscritto sono state condotte secondo il National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e il Institutional Animal Use and Care Committee dell'Università del Nevada.

NOTA: Il modello qui presentato consiste nella rimozione del muscolo detrusore mentre l'urolium e il SubU/LP rimangono intatti(Figura 1B) per consentire agli investigatori l'accesso diretto a SubU/LP nel corso del riempimento della vescica.

1. Dissezione della preparazione della vescica priva di detrusivi

  1. Collocare la vescica isolata in un piatto di dissezione pieno di freddo (10 gradi centigradi) e ossigenato con 5% CO2/95 % O2 Krebs soluzione bicarbonato (KBS) con la seguente composizione (mM): 118.5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 dextrose, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
  2. Pin una piccola porzione della cupola della vescica isolata a un piatto di dissezione sillgarda ricoperto di Sylgard pieno di KBS. Assicurarsi che il perno passi attraverso un pezzo di sirosa o il bordo più esterno del muscolo detrusore lontano dal bordo più interno del muscolo che si affaccia sul SubU/LP.
  3. Utilizzando un microscopio, identificare l'uretra e gli ureteri e fissare ciascuno di essi sul fondo del piatto di dissezione.
  4. Rimuovere i tessuti adiposi e connettivi in eccesso in modo che vengavisualizzato l'intero corpo principale della vescica, l'uretra ed entrambi gli ureteri.
  5. Legare gli ureteri con 6-0 suture di nylon. Quindi, pin le estremità aperte degli ureteri verso il fondo del piatto di dissezione per garantire la preparazione.
  6. Utilizzando pinze a punta fine, tirare delicatamente un pezzo di sirosa all'angolo tra l'uretere e il corpo della vescica.
  7. Regolare la luce del microscopio per aumentare la trasparenza e distinguere il margine della sottomucosa sotto il muscolo detrusore.
  8. Iniziare a tagliare (non peeling!) la parete della vescica con forbici a punta fine lungo la superficie interna dello strato muscolare del detrusore mentre si allontana delicatamente il segmento tagliato dalla preparazione. In ogni momento, assicurarsi che il bordo laterale della mucosa può essere visto ed evitare di toccarla.
  9. Rimuovere completamente il muscolo detrusore girando intorno al piatto di dissezione in modo che la posizione della preparazione sia comoda per continuare a sezionare il muscolo detrusore.
  10. Lasciare un piccolo pezzo di muscolo detrusore sulla parte superiore della cupola della vescica per garantire la capacità di immobilizzare la preparazione durante le fasi rimanenti del protocollo.
  11. Fare un doppio anello di 6-0 filo di nylon, posizionarlo intorno al collo della preparazione della vescica, e lasciare il ciclo sciolto.
  12. Aggiungere un secondo doppio anello di 7-0 filo di seta, posizionarlo intorno al collo della preparazione della vescica e lasciare che il ciclo perda. Avere due suture previene le perdite intorno alle suture.
  13. Tagliare circa 2 cm di 20 pE tubi (catetere), brillare la punta muovendo lentamente la punta vicino a una fiamma.
  14. Riempire il catetere con KBS ossigenato caldo (37 gradi centigradi).
  15. Inserire il catetere nell'orifizio dell'uretra della vescica e spingere delicatamente il catetere fino a quando la punta del catetere raggiunge approssimativamente il centro della vescica.
  16. Legare la sutura intorno al catetere e il tessuto circostante del collo della vescica.
  17. Riempire lentamente la vescica con circa 50-100 gradi di KBS ossigenato (37 gradi centigradi), sollevarla brevemente (<10 s) sopra la superficie di KBS e monitorare le perdite alle suture e al corpo della vescica.
  18. Se non si osserva alcuna perdita, la preparazione è pronta per l'esperimento. Se si osserva una perdita intorno alla sutura, rimuovere la sutura e sostituirla. Se si nota una perdita da un buco nel corpo della vescica, scartare la preparazione.

2. Riempimento della preparazione della vescica denudata

  1. Perfusi KBS (37 ) in una camera da 3 mL di un piatto d'organo rivestito in acqua con fondo Sylgard.
  2. Regolare le linee di ossigeno e aspirazione.
  3. Posizionare la preparazione della vescica denudata nella camera.
  4. Fissare il catetere sul lato della camera in modo che la preparazione non galleggia sopra la superficie della soluzione di perfusione.
  5. Collegare il catetere della vescica a un tubo PE20 più lungo (linea di infusione) collegato al stopcock a tre vie utilizzando il raccordo della stessa dimensione.
  6. Assicurarsi che le linee tra la pompa di infusione, il trasduttore di pressione e la vescica siano aperte.
  7. Riempire la siringa di infusione con KBS fresco, caldo (37 gradi centigradi) e ossigenato.
  8. Regolare i parametri della pompa: tipo/volume della siringa (ad esempio, 1 mL), funzionamento (cioè infuso), flusso (cioè costante) e portata (ad es. 15 l/min).
  9. Premere il pulsante Start sulla pompa della siringa per riempire la vescica.
  10. Monitorare il volume di riempimento e la pressione intravesica durante il riempimento della vescica.

3. Rilevamento dei Mediatori nell'Aspetto SubU/LP della preparazione della vescica denudata

  1. Raccogliere le aliquote della soluzione vasca da bagno in tubi di microcentrifuga a freddo ghiaccio o inserti di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
  2. Preparare ed elaborare i campioni in base all'applicazione di rilevamento appropriata. Nel caso di rilevamento della disponibilità di purine, elaborare i campioni da HPLC con rilevamento della fluorescenza13,18.

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Representative Results

La parete di preparazione della vescica senza detrusori murini è intatta e contiene tutti gli strati tranne il DSM e la sirosa. Studi di prova hanno dimostrato che la parete della vescica senza DSM comprende urothelium e SubU/LP mentre la tunica muscularis e la sirosa sono assenti (Figura 2)13.

Riempimento della vescica detrustore-free approssima il normale riempimento della vescica. La figura 3 mostra gli schemi della configurazione sperimentale per il riempimento dei preparati della vescica ex vivo a diverse velocità di riempimento, volumi e pressioni intraluminali. I preparati vescica murini ex vivo intatti e denuati richiedono una vasta gamma di volumi di riempimento per raggiungere la pressione di svuotamento13. Le relazioni pressione-volume sono notevolmente simili nei preparativi intatti e denudati (Film 1, Film 2e Figura 4). Pertanto, la preparazione senza DSM è adatta per studi funzionali sul ruolo dell'urothelium e del SubU/LP nella meccanoscima della vescica e nella meccanotra.

Possibile utilizzo del modello vescicale privo di detrusor
Misurare la disponibilità di mediatori nel lume della vescica e SubU/LP durante il riempimento della vescica
La configurazione sperimentale per la raccolta di campioni extraluminali (EL; ad esempio, balneazione SubU/LP) e intraluminali (IL) durante il riempimento dei preparati vescichi durante il monitoraggio della pressione della vescica è illustrata nella Figura 5. L'idoneità del modello per la misurazione dei mediatori derivati dall'urote che vengono rilasciati sul lato SubU/LP durante il riempimento è stata testata misurando il rilascio di mediatori purini (ad es. adenosina 5'-triposfato, ATP; adenosina 5'-diphosphate, ADP; nicotinamide adenina dinucleotide, NAD; adenosina 5'-monofosfato, AMP; e adenosina, ADO) nella soluzione bagnando la SubU/LP della preparazione denudata. Come illustrato nella Figura 6A, sono state rilevate quantità trascurabili di purine nella vasca contenente una preparazione della vescica isolata con DSM intatto, mentre le quantità di queste purine erano significativamente più elevate nei campioni raccolti dal bagno contenente una preparazione della vescica denudata (Figura 6B). In particolare, la distribuzione di purine e metaboliti in campioni raccolti dal lume e dal SubU/LP alla fine del riempimento differiva significativamente (Figura 6C).

Esaminare il metabolismo extracellulare dei mediatori in SubU/LP durante il riempimento della vescica
L'aggiunta dell'analogo altamente fluorescente di ATP, 1,N6-etheno-ATP (ATP), al lato suburoteliale della preparazione priva di detrusor ha portato ad una diminuzione di - ATP e ad un aumento dei prodotti sATP, adADP, e ADO(Figura 7Aa e Figura 7Ab). Allo stesso modo, l'aggiunta di un'aggiunta al lume di preparazione ha comportato una diminuzione di - ATP e un aumento di - ADP, sAMP, e ADO nel lume (Figura 7Ba e Figura 7Bb). Pertanto, il modello è adatto per gli studi sul metabolismo dei mediatori bioattivi su entrambi i lati dell'urothelium durante il riempimento della vescica.

Esaminare il trasporto transuroteliale dei mediatori durante il riempimento della vescica
L'aggiunta di un'aggiunta di sATP al lato SubU/LP della preparazione denudata ha portato alla comparsa di sAMP, ADO e alcuni - ADP nel lume, suggerendo che le purine possono essere trasportate dal SubU/LP al lume13 (Figura 7Ac). Allo stesso modo, l'aggiunta di un'aggiunta di ATP nel lume ha comportato la comparsa di , in SubU/LP13 (Figura 7Db). Si noti che non è stato osservato alcun sATP sul lato opposto dell'applicazione di . Insieme, queste osservazioni suggeriscono fortemente che la preparazione della vescica priva di detrusori è adatta per gli studi sul trasporto transuroteliale bilaterale dei mediatori durante il riempimento.

Figure 1
Figura 1: Principio del modello di vescica priva di detrusori. (A) La parete della vescica è composta da urotelium, suburothelium/lamina propria (SubU/LP), muscolo detrusore e siero. Ognuno di questi strati contiene vari tipi di cellule che sono importanti per le funzioni della vescica durante lo stoccaggio e lo svuotamento di urina. Durante il riempimento della vescica, i mediatori biologicamente attivi vengono rilasciati dall'urothelium nel lume della vescica e nel SubU/LP per influenzare le cellule in profondità nella parete della vescica, compreso il muscolo detrusore. Mentre l'accesso al lume della vescica è relativamente semplice, non c'è accesso diretto alla SubU/LP durante il riempimento per rilevare mediatori derivati dall'urotelium che potrebbero influenzare le cellule nella parete della vescica e controllare l'escitabilità muscolare del detrusivo. (B) La rimozione degli strati muscolari detrustori insieme alla serosa espone l'intera superficie del SubU/LP consentendo l'accesso diretto al SubU/LP dove le molecole di segnalazione derivate dall'urothelium possono essere misurate in diverse fasi di riempimento della vescica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Istologia del murino intatto e pareti della vescica prive di detrusori. La colorazione tricromatica di Masson di pareti della vescica riempite intatte (A) e prive di detrusori (B) dimostra che la preparazione denudata contiene urothelium (U) e SubU/LP intatti, ma non il muscolo detrusore (D) e la serosa (S). L, lumen. Questa cifra è stata riprodotta da una precedente pubblicazione13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rappresentazione schematica della configurazione sperimentale utilizzata nel riempimento dei preparati ex vivo della vescica. La preparazione della vescica urinaria intatta o denudata (UB) ex vivo è collocata in una calda camera d'organo con giacca d'acqua (37 gradi centigradi) che viene perfusa con soluzione di bicarbonato ossigenata (KBS, 37 gradi centigradi, pH 7,4). La preparazione della vescica è intrisa di KBS a diversi tassi e volumi di riempimento e la pressione intraluminale della vescica (BP) è registrata durante l'esperimento Questa cifra è stata riprodotta da una precedente pubblicazione13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Relazioni volume di pressione in preparazioni intatte e prive di detrusore. (A) e (B) sono registrazioni rappresentative del volume intravinico e della pressione di preparati vescica intatti e denudati che vengono riempiti con soluzione Krebs-bicarbonate a 15 l/min. Come previsto, la preparazione intatta ha sviluppato contrazioni transitorie (TC) a causa della presenza del detrusore. Al contrario, la preparazione denudata mancava di TC( (C) e (D) mostrano dati riepilogativi delle relazioni pressione-volume di preparazioni vesciche intatte e denudate che ospitavano >250 -L di soluzione. Si noti che i volumi di riempimento e le pressioni intramontanti erano notevolmente simili nei preparati vescicani intatti e denudati. Questa cifra è stata riprodotta da una precedente pubblicazione13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Schematic schematica del modello di vescica isolata utilizzato per valutare la disponibilità di mediatori derivati dall'urolio in SubU/LP e lumen durante il riempimento. La preparazione della vescica è collocata in una camera con giacca d'acqua e superfusa con soluzione bicarbonato Krebs ossigenata (KBS). La preparazione della vescica urinaria (UB) è riempita con KBS ossigenato caldo tramite un catetere nell'uretra collegato a una pompa di infusione. La pressione della vescica (BP) viene monitorata tramite un connettore a tre vie attraverso la linea di infusione durante il riempimento della vescica. I campioni provenienti da soluzioni extraluminali (EL, bagno d'organo) e intraluminali (IL) vengono elaborati per il rilevamento di mediatori (m) in base alle applicazioni di rilevamento. Questa cifra è stata riprodotta da una precedente pubblicazione13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: La preparazione della vescica priva di detrusori è adatta per misurare la disponibilità dei mediatori in SubU/LP durante il riempimento. Cromatogrammi rappresentativi che dimostrano la disponibilità di purine nei campioni extraluminali in preparati intatto (A) e privo di detrusori (B). Si noti che i mediatori purini sono meglio rilevati nella preparazione denudata che nella preparazione intatta. (C) Il contributo relativo delle purine individuali alle purine rilevate nel lume e nel SubU/LP della preparazione denudata è significativamente diverso. Questa cifra è stata riprodotta da una precedente pubblicazione13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: La preparazione della vescica priva di detrustori è adatta per esaminare il metabolismo e il trasporto transuroteliale dei mediatori durante il riempimento della vescica. (A,B) Cromatici rappresentativi che mostrano substrato ATP (Aa,Ba). Quando il substrato viene applicato al SubU/LP (Ab) o al lume (Bb) , sono stati diminuiti e i prodotti sono stati aumentati. Di conseguenza, l'ATP è degradato su entrambi i lati dell'applicazione; tuttavia, la formazione di prodotti aATP è asimmetrica in SubU/LP e lumen. Si noti che i prodotti satP , , e , aDO, ma non il substrato sATP, è apparso sul lato opposto dell'applicazione sATP (Ac,Bc). Pertanto, le purine sembrano essere trasportate attraverso la parete della preparazione priva di detrusori durante l'archiviazione. Questa cifra è stata modificata a partire da13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1
Video 1: Registrazione rappresentativa del riempimento della vescica intatto. La vescica è stata riempita a 15 z/min. Video è stato registrato utilizzando uno stereomicroscopio zoom con una fotocamera a dispositivo accoppiato caricato (CCD) a 5 Hz; la registrazione è stata interrotta dopo aver raggiunto la pressione intraluminale di 25 mm. La durata completa dell'immagine è 64 volte in tempo reale. Questo video è stato riprodotto da13. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Video 1
Video 2: Registrazione rappresentativa del riempimento della vescica privo di detrusori. La vescica è stata riempita a 15 zl/min. Video è stato registrato utilizzando uno stereomicroscopio zoom con una telecamera CCD a 5 Hz; la registrazione è stata interrotta dopo aver raggiunto la pressione intraluminale Hg di 25 mm. La durata completa dell'immagine è 64 volte in tempo reale. Questo video è stato riprodotto da13. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

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Discussion

La vescica ha due funzioni: stoccaggio e svuotamento dell'urina. Il normale funzionamento di queste funzioni richiede un adeguato rilevamento meccanico del volume e della pressione intraluminale e la trasduzione dei segnali attraverso le cellule nella parete della vescica per regolare l'eccitabilità muscolare detrusatrice. La mucosa della vescica (urothelium) è creduta per regolare l'eccitabilità della vescica rilasciando una varietà di molecole di segnalazione nella SubU/LP che colpiscono numerosi tipi di cellule nella parete della vescica. Attualmente, la maggior parte dei tentativi di caratterizzazione di mediatori derivati dall'urolilium comportano l'uso di preparati vescicali (ad esempio, fogli piatti della parete della vescica, strisce di parete della vescica, o cellule coltivate) che non riproducono il riempimento fisiologico della vescica. Le misurazioni dei mediatori che vengono rilasciati nel lume della vescica alla fine del riempimento della vescica sono spesso utilizzate come indicazione per il rilascio di questi mediatori dal lato opposto dell'urothelium. Tuttavia, studi recenti suggeriscono che il contenuto intraluminale dei mediatori non è rappresentativo di ciò che è disponibile in profondità nella parete della vescica13. Sono necessari nuovi approcci sperimentali che consentano l'accesso a SubU/LP durante il riempimento della vescica per approfondire la nostra comprensione dei meccanismi locali di segnalazione tra urothelium della vescica, SubU/LP e DSM.

Qui, dimostriamo un nuovo modello di vescica animale in cui il muscolo detrusore viene rimosso per fornire accesso diretto ai mediatori rilasciati dall'urothelium in SubU/LP durante il riempimento13. La preparazione denuda assomiglia molto al riempimento della vescica intatta13,18, suggerendo che la mancanza del muscolo detrusore non cambia le proprietà meccanosensibili dell'urothelium durante il riempimento della vescica. La preparazione consente di eseguire studi di volume di pressione sulla vescica in assenza di segnalazione confusa da riflessi spinali e muscoli detrusori. Pertanto, i mediatori rilasciati in SubU/LP possono essere misurati senza influenze sistemiche o contaminazioni da altre fonti. La capacità di accedere direttamente alle vicinanze di SubU/LP a diversi volumi e pressioni durante il riempimento della vescica rende il modello adatto allo studio del rilascio, del metabolismo e del trasporto transuroteliale di mediatori biologicamente attivi durante le fasi di stoccaggio e pre-svuotamento del riempimento della vescica.

Il passo più critico in questo protocollo è la rimozione del muscolo detrusore liscio mantenendo intatti l'urolium e il SubU/LP. La procedura è particolarmente semplice nella vescica del mouse a causa della connessione allentata tra il muscolo detrusore e SubU/LP. I preparati hanno mostrato un'eccellente riproducibilità con caratteristiche del volume di pressione notevolmente simili alle vesciche intatte13. Il modello è fattibile anche nelle vesciche di animali più grandi in cui il muscolo detrusore può essere parzialmente o completamente rimosso. Ad esempio, abbiamo già dimostrato che il modello può essere riprodotto in vescica dalla scimmia Cynomolgus Macaca fascicularis e dimostrato che i mediatori possono essere misurati in SubU / LP durante la preparazione riempimento13.

La potenziale limitazione di questo modello ex vivo è il problema stesso che è la forza della preparazione, in sostanza, la mancanza di effetti sistemici del sistema nervoso centrale e la circolazione consente un esame approfondito dei meccanismi locali di connettività mucosa-detrusore durante il riempimento della vescica . La mancanza di effetti sistemici è condivisa con numerosi approcci ex vivo, tra cui fogli di parete o strisce della vescica isolati o cellule uroteliali coltivate. Il modello di vescica priva di detrusori, tuttavia, è superiore ai suddetti approcci nella ricerca uteologica in quanto consente l'accesso diretto al SubU/LP nel corso del riempimento della vescica. Pertanto, l'uso di questo approccio migliorerà la comprensione dei meccanismi meccanotralatici mechanosensibili che hanno origine nell'urotelio durante il riempimento della vescica.

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Disclosures

Parti di questo lavoro sono state precedentemente pubblicate sul Journal of PhysiOlogy (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Il permesso è stato concesso da Wiley and Sons, Inc. Gli autori non hanno conflitti finanziari o di altro tipo da divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Nazionale di Diabete e Malattie Digestive e Neovirali DK41315.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2 Fisher C79 Source flexible
Dextrose Fisher D16 Source flexible
Dissecting pins Fine Science Tools 26002-20 Source flexible
Infusion Pump Kent Scientific GenieTouch Source flexible
KCl Fisher P217 Source flexible
KH2PO4 Fisher P284 Source flexible
Light source SCHOTT ACEI Source flexible
Microscope Olympus SZX7 Flexible to use any scope
MgCl2 Fisher M33 Source flexible
NaCl Fisher S671 Source flexible
NaHCO3 Fisher S233 Source flexible
Needles 25G Becton Dickinson 305122 Source flexible
Organ bath Custom made Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing Intramedic 427405 Source flexible
Pressure transducer AD instrument Source flexible
S&T Forceps Fine Science Tools 00632-11 Source flexible
Software pressure-volume AD Instruments Power lab
Suture Nylon, 6-0 AD surgical S-N618R13 Source flexible
Suture Silk, 6-0 Deknatel via Braintree Scientific, Inc. 07J1500190 Source flexible
Syringes 1 mL Becton Dickinson 309602 Source flexible
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Source flexible
Water circulator Baxter K-MOD 100 Source flexible

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References

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