Un modèle de vessie murine décentralisé (Ex Vivo) avec le muscle detrusor enlevé pour l'accès direct au Suburothelium pendant le remplissage de la vessie

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Summary

Le modèle de vessie sans detrusor permet un accès direct au suburothélium pour étudier les mécanismes locaux de régulation de la disponibilité du médiateur biologiquement actif dans le suburothélium/lamina propria pendant le stockage et l'annulation de l'urine. La préparation ressemble étroitement au remplissage d'une vessie intacte et permet d'effectuer des études de volume de pression sans influences systémiques.

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Durnin, L., Corrigan, R. D., Sanders, K. M., Mutafova-Yambolieva, V. N. A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling. J. Vis. Exp. (153), e60344, doi:10.3791/60344 (2019).

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Abstract

Des études antérieures ont établi la libération de substances chimiques à partir de feuilles de muqueuse de la vessie plate apposées dans les chambres ussing et exposées à des changements dans la pression hydrostatique ou extensible mécanique et des cellules urothéliales cultivées sur les changements de pression hydrostatique, extensible, gonflement cellulaire, ou les forces de traînée, et dans le lumen de la vessie à la fin du remplissage. Ces résultats ont mené à l'hypothèse que ces médiateurs sont également libérés dans suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) pendant le remplissage de réservoir souple, où ils affectent des cellules profondément dans la paroi de réservoir souple pour finalement régler l'excitabilité de réservoir souple. Il y a au moins deux limites évidentes dans ces études : 1) aucune de ces approches ne fournit d'informations directes sur la présence de médiateurs dans SubU/LP, et 2) les stimuli utilisés ne sont pas physiologiques et ne récapitulent pas le remplissage authentique de la vessie. Ici, nous discutons d'une procédure qui permet un accès direct à la surface suburothéliale de la muqueuse de la vessie au cours du remplissage de la vessie. La préparation sans détruseur de murine que nous avons créée ressemble étroitement au remplissage de la vessie intacte et permet d'effectuer des études de volume de pression sur la vessie en l'absence de signalisation confondante des réflexes spinaux et du muscle lisse de détruseur. En utilisant le nouveau modèle de vessie sans détrusive, nous avons récemment démontré que les mesures intravesical des médiateurs ne peuvent pas être utilisées comme un proxy à ce qui a été libéré ou présent dans le SubU/LP pendant le remplissage de la vessie. Le modèle permet d'examiner les molécules de signalisation dérivées de l'urothélium qui sont libérées, générées par le métabolisme et/ou transportées dans le SubU/LP au cours du remplissage de la vessie pour transmettre des informations aux neurones et au muscle lisse de la vessie et réguler son excitabilité pendant la continence et la micturition.

Introduction

Le but de ce modèle est de permettre un accès direct au côté submucosal de la muqueuse de la vessie pendant différentes phases de remplissage de la vessie.

La vessie doit s'abstenir de contraction prématurée pendant le remplissage et vider lorsque le volume critique et la pression sont atteints. La continence anormale ou l'annulation de l'urine sont fréquemment associées à une excitabilité anormale du muscle lisse du détruseur (DSM) au cours du remplissage de la vessie. L'excitabilité du DSM est déterminée par des facteurs intrinsèques aux cellules musculaires lisses et par des influences générées par différents types de cellules dans la paroi de la vessie. La paroi de la vessie urinaire se compose d'urothelium (mucosa), de suburothélium (SubU)/lamina propria (LP), de muscle lisse detrusor (DSM) et de sérosa (figure 1A). L'urothélium se compose de cellules parapluie (c.-à-d. la couche la plus externe de l'urothélium), de cellules intermédiaires et de cellules basales (c.-à-d., la couche la plus interne de l'urothélium). Divers types de cellules, y compris les cellules interstitielles, les fibroblastes, les terminaux nerveux afférents, les petits vaisseaux sanguins et les cellules immunitaires résident dans le SubU/LP. Il est largement supposé que l'urothélium de la vessie est un organe sensoriel qui initie la micturition réflexe et la continence en libérant des médiateurs dans le submucosa qui affectent les cellules dans le SubU / LP et le DSM1,2,3. Pour la plupart, ces hypothèses sont basées sur des études qui ont démontré la libération de médiateurs: à partir de morceaux de muqueuse exposés à des changements de pression hydrostatique4,5; à partir de cellules urothéliales cultivées exposées à l'étirement6,7, gonflement des cellules induite par l'hypotonie7 ou forces de traînée8; des bandes isolées de paroi de réservoir souple sur l'activationderécepteur ou de nerf 9,10,11,12,13,14; et dans le lumen de réservoir souple à la fin du remplissage de réservoir souple15,16,17,18,19. Bien que ces études aient été déterminantes pour démontrer la libération de médiateurs lors de la stimulation mécanique des segments de la paroi de la vessie ou des cellules urothéliales cultivées, elles doivent être étayées par des preuves directes de la libération de médiateurs dans la sous-muqueuse qui sont obtenues par des stimuli physiologiques qui reproduisent le remplissage de la vessie. Il s'agit d'une tâche difficile étant donné que le SubU /LP est situé profondément dans la paroi de la vessie entraver l'accès direct à proximité de SubU / LP pendant le remplissage de la vessie.

Ici, nous illustrons un modèle décentralisé (ex vivo) de réservoir souple murine avec le muscle detrusor enlevé13 qui a été développé pour faciliter des études sur les mécanismes locaux de la méchanotransduction qui participent à la signalisation entre l'urothelium de la vessie, DSM et d'autres types de cellules dans la paroi de la vessie. Cette approche est supérieure à l'utilisation de feuilles plates de la paroi de la vessie, de bandes de paroi vésicale ou de cellules urothéliales cultivées, car elle permet des mesures directes à proximité de SubU/LP de médiateurs dérivés de l'urothélium qui sont libérés ou formés en réponse aux pressions physiologiques et aux volumes dans la vessie et évite les changements phénotypiques potentiels dans la culture cellulaire. Il peut être utilisé pour mesurer la disponibilité, la libération, le métabolisme et le transport transurothélial des médiateurs dans SubU/LP à différents stades de remplissage de la vessie (Figure 1B). La préparation peut également être employée pour examiner la signalisation urotheliale et la mécanotransduction dans des modèles des syndromes hyperactifs et underactifs de réservoir souple.

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Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux décrits dans ce manuscrit ont été menées selon le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et le Institutional Animal Use and Care Committee de l'Université du Nevada.

REMARQUE: Le modèle présenté ici consiste en l'ablation du muscle du détruseur, tandis que l'urothélium et le SubU/LP restent intacts (figure 1B) pour permettre aux enquêteurs d'accéder directement au SubU/LP au cours du remplissage de la vessie.

1. Dissection de la préparation de la vessie sans détrusseur

  1. Placer la vessie isolée dans un plat disséqué rempli de froid (10 oC) et oxygéné avec 5 % de CO2/95 % O2 Solution de bicarbonate Krebs (KBS) avec la composition suivante (mM) : 118,5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 dextrose, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
  2. Épingler une petite partie du dôme de la vessie isolée à un plat de dissection recouvert de Sylgard rempli de KBS. Assurez-vous que la broche passe à travers un morceau de la sérose ou le bord le plus externe du muscle detrusor loin du bord le plus interne du muscle qui fait face à la SubU / LP.
  3. À l'aide d'un microscope, identifier l'urètre et les uretères et épingler chacun d'eux au fond du plat disséquer.
  4. Enlever l'excès d'adipeux et de tissus conjonctifs de sorte que l'ensemble du corps principal de la vessie, l'urètre et les deux ureters sont affichés.
  5. Attachez les ureters avec des sutures en nylon 6-0. Ensuite, épinglez les extrémités ouvertes des ureters vers le fond du plat disséquant pour fixer la préparation.
  6. À l'aide de forceps fins, tirez délicatement un morceau de serosa au coin entre l'uretère et le corps vésicaire.
  7. Ajuster la lumière du microscope pour augmenter la transparence et distinguer la marge de la submucosa sous le muscle detrusor.
  8. Commencez à couper(pas peler!) la paroi de la vessie avec des ciseaux à pointe fine le long de la surface intérieure de la couche musculaire detrusor tout en tirant doucement le segment de coupe loin de la préparation. En tout temps, assurez-vous que le bord latéral de la muqueuse peut être vu et éviter de le toucher.
  9. Retirez entièrement le muscle du détruseur en retournant le plat disséquant de sorte que la position de la préparation soit confortable pour continuer à disséquer le muscle detrusor.
  10. Laissez un petit morceau de muscle detrusor sur le dessus du dôme de la vessie pour assurer la capacité d'immobiliser la préparation pendant les étapes restantes du protocole.
  11. Faire une double boucle de fil de nylon 6-0, le placer autour du cou de la préparation de la vessie, et laisser la boucle lâche.
  12. Ajoutez une deuxième double boucle de fil de soie 6-0, placez-la autour du cou de la préparation de la vessie, et laissez la boucle perdre. Avoir deux sutures empêche les fuites autour des sutures.
  13. Couper environ 2 cm de tube de 20 PE (cathéter), évaser la pointe en déplaçant lentement la pointe près d'une flamme.
  14. Remplir le cathéter d'un KBS chaud (37 oC).
  15. Insérez le cathéter dans l'orifice de l'urètre vésicale et poussez doucement le cathéter jusqu'à ce que la pointe du cathéter atteigne environ le milieu de la vessie.
  16. Attachez la suture autour du cathéter et du tissu environnant du cou de la vessie.
  17. Remplissez lentement la vessie d'environ 50 à 100 l de KBS oxygéné chaud (37 oC), soulevez-la brièvement (lt;10 s) au-dessus de la surface de KBS et surveillez les fuites aux sutures et au corps vésical.
  18. Si aucune fuite n'est observée, la préparation est prête pour l'expérience. Si une fuite autour de la suture est observée, retirez la suture et remplacez-la. Si une fuite d'un trou dans le corps de la vessie est remarquée, jetez la préparation.

2. Remplissage de la préparation de la vessie dénudée

  1. Perfuse KBS (37 oC) dans une chambre de 3 ml d'un plat d'orgue enveste d'eau (37 oC) avec un fond Sylgard.
  2. Ajuster les lignes d'oxygène et d'aspiration.
  3. Placez la préparation de la vessie dénudée dans la chambre.
  4. Fixer le cathéter sur le côté de la chambre afin que la préparation ne flotte pas au-dessus de la surface de la solution de perfusion.
  5. Connectez le cathéter de la vessie à un tube PE20 plus long (ligne d'infusion) relié au robinet d'arrêt à trois voies en utilisant le même ajustement de taille.
  6. Assurez-vous que les lignes entre la pompe à perfusion, le transducteur de pression et la vessie sont ouvertes.
  7. Remplissez la seringue d'infusion de KBS fraîche, chaude (37 oC) et oxygénée.
  8. Ajuster les paramètres de la pompe : type/volume de seringue (c.-à-d. 1 mL), fonctionnement (c.-à-d. infuser), débit (c.-à-d. constant) et débit (c.-à-d. 15 l/min).
  9. Appuyez sur le bouton Démarrer sur la pompe à seringues pour remplir la vessie.
  10. Surveiller le volume de remplissage et la pression intravesicale pendant le remplissage de la vessie.

3. Détection des médiateurs dans l'aspect SubU/LP de la préparation de la vessie dénudée

  1. Recueillir les aliquots de la solution de bain dans des tubes de microcentrifuge à froid ou des inserts de chromatographie liquide de haute performance (HPLC).
  2. Préparer et traiter les échantillons selon l'application de détection appropriée. Dans le cas de la détection de la disponibilité de la purine, traiter les échantillons par HPLC avec la détection de fluorescence13,18.

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Representative Results

La paroi de la préparation de la vessie sans détrusseur de murine est intacte et contient toutes les couches sauf le DSM et le sérosa. Des études de preuve de principe ont démontré que la paroi vésicale exempte de DSM comprend l'urothélium et le SubU/LP, tandis que les tunica muscularis et les sérosses sont absents (figure 2)13.

Le remplissage de la vessie sans detrusor se rapproche du remplissage normal de la vessie. La figure 3 montre les schémas de la configuration expérimentale pour remplir les préparations de la vessie ex vivo à différents taux de remplissage, volumes et pressions intra-luminales. Les préparations de la vessie murine ex vivo intacte et dénudée nécessitent une large gamme de volumes de remplissage pour atteindre la pression de vidange13. Les relations pression-volume sont remarquablement similaires dans les préparations intactes et dénudées(Film 1, Movie 2, et Figure 4). Par conséquent, la préparation Sans DSM convient aux études fonctionnelles du rôle de l'urothélium et du SubU/LP dans la mécanosensation de la vessie et la mécanotransduction.

Utilisation possible du modèle de vessie sans détrusseur
Mesurer la disponibilité des médiateurs dans le lumen vésiculeet et subU/LP pendant le remplissage de la vessie
La configuration expérimentale pour la collecte d'échantillons extraluminal (EL; p. ex., bain SubU/LP) et intraluminal (IL) pendant le remplissage des préparations de la vessie tout en surveillant la pression de la vessie est illustrée à la figure 5. La pertinence du modèle de mesure des médiateurs dérivés de l'urothélium qui sont libérés dans le côté SubU/LP pendant le remplissage a été testée en mesurant la libération de médiateurs purine (p. ex., adenosine 5'-triphosphate, ATP; adenosine 5'-diphosphate, ADP; nicotinamide adenine dinucleotide, NAD; adenosine 5'-monophosphate, AMP; and adenosine, ADO) in the solution bathing the SubU/LP of the denuded preparation. Comme le démontre la figure 6A, des quantités négligeables de purines ont été détectées dans le bain contenant une préparation isolée de la vessie avec du DSM intact alors que les quantités de ces purines étaient significativement plus élevées dans les échantillons prélevés dans le bain contenant une préparation de la vessie dénudée (figure 6B). Notamment, la distribution des purines et des métabolites dans les échantillons prélevés dans le lumen et le SubU/LP à la fin du remplissage différait considérablement(figure 6C).

Examiner le métabolisme extracellulaire des médiateurs dans SubU/LP pendant le remplissage de la vessie
L'ajout de l'analogue hautement fluorescent de l'ATP, 1,N6-etheno-ATP (ATP), au côté suburothélial de la préparation sans detrusor a entraîné une diminution de l'ATP et une augmentation des produits de l'ATP ADP, 'AMP, et 'ADO (Figure 7Aa et Figure 7Ab). De même, l'ajout de l'ATP au lumen de préparation a entraîné une diminution de l'ATP et une augmentation du PDA, de l'AMP et de l'ADO dans le lumen(figure 7Ba et figure 7Bb). Par conséquent, le modèle est approprié pour des études du métabolisme des médiateurs bioactifs des deux côtés de l'urothelium pendant le remplissage de la vessie.

Examiner le transport transurothélial des médiateurs pendant le remplissage de la vessie
L'ajout de l'ATP au côté SubU/LP de la préparation dénudée a donné l'impression d'un AMP, d'un ADO et d'un certain PDA dans le lumen, ce qui suggère que les purines peuvent être transportées du SubU/LP au lumen13 (figure 7Ac). De même, l'ajout de l'ATP dans le lumen a donné lieu à l'apparition de l'AMP et de l'ADO dans SubU/LP13 (Figure 7Db). Notez qu'aucun 'ATP n'a été observé sur le côté opposé de l'application de 'ATP. Ensemble, ces observations suggèrent fortement que la préparation sans detrusor de réservoir souple est appropriée pour des études du transport transurothelial bilatéral des médiateurs pendant le remplissage.

Figure 1
Figure 1 : Principe du modèle de vessie sans détrusseur. (A) La paroi de la vessie est composée d'urothélium, de suburothélium/lamina propria (SubU/LP), de muscle detrusor et de serosa. Chacune de ces couches contient divers types de cellules qui sont importants pour les fonctions de la vessie pendant le stockage et l'annulation de l'urine. Pendant le remplissage de la vessie, des médiateurs biologiquement actifs sont libérés de l'urothélium dans le lumen de la vessie et dans le SubU/LP pour affecter les cellules profondément dans la paroi de la vessie, y compris le muscle detrusor. Bien que l'accès au lumen de la vessie soit relativement simple, il n'y a pas d'accès direct au SubU/LP pendant le remplissage pour détecter les médiateurs dérivés de l'urothélium qui pourraient affecter les cellules de la paroi de la vessie et contrôler l'excitabilité musculaire du détruseur. (B) L'enlèvement des couches musculaires du detrusor ainsi que le sérosémie expose toute la surface de SubU/LP permettant un accès direct au SubU/LP où les molécules de signalisation dérivées de l'urothélium peuvent être mesurées à différentes phases de remplissage de la vessie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Histologie des parois de la vessie murine intacte et sans détrusseur. La coloration trichrome de Masson des parois vésicales intactes (A) et sans detrusor (B) démontre que la préparation dénudée contient de l'urothélium intact (U) et du SubU/LP, mais pas le muscle detrusor (D) et le sérosa (S). L, lumen. Ce chiffre a été reproduit à partir d'une publication précédente13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Représentation schématique de la configuration expérimentale utilisée pour remplir les préparations de la vessie ex vivo. La préparation de la vessie urinaire ex vivo intacte ou dénudée est placée dans une chambre d'organe chaude (37 oC) à cloisonnage d'eau qui est perfusée d'une solution de krebs-bicarbonate oxygénée (KBS, 37 oC, pH 7,4). La préparation de la vessie est infusée avec KBS à différents taux de remplissage et les volumes et la pression de la vessie intraluminale (BP) est enregistrée tout au long de l'expérience Ce chiffre a été reproduit à partir d'une publication précédente13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Relations pression-volume dans des préparations intactes et sans détrusseur. (A) et (B) sont des enregistrements représentatifs du volume intravesical et de la pression des préparations de vessie ex vivo intactes et dénudées qui sont remplies de solution Krebs-bicarbonate à 15 l/min. Comme prévu, la préparation intacte a développé des contractions transitoires (TC) en raison de la présence du détruseur. En revanche, la préparation dénudée manquait de TC. (C) et (D) montrent des données résumées des relations pression-volume des préparations de vessie intactes et dénudées qui ont accueilli la solution de la solution. Notez que les volumes de remplissage et les pressions intraveineuse étaient remarquablement semblables dans les préparations intactes et dénudées de la vessie. Ce chiffre a été reproduit à partir d'une publication précédente13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Diagramme schématique du modèle de vessie isolé utilisé pour évaluer la disponibilité des médiateurs dérivés de l'urothélium dans SubU/LP et lumen pendant le remplissage. La préparation de la vessie est placée dans une chambre recouverte d'eau et superfused avec une solution de bicarbonate Krebs oxygénée (KBS). La préparation de la vessie urinaire (UB) est remplie de KBS oxygéné chaud par l'intermédiaire d'un cathéter dans l'urètre relié à une pompe à perfusion. La pression de la vessie (BP) est surveillée par un connecteur à trois voies à travers la ligne d'infusion pendant le remplissage de la vessie. Les échantillons provenant de solutions extraluminal (EL, bain d'organe) et intraluminal (IL) sont traités pour la détection des médiateurs (m) selon les applications de détection. Ce chiffre a été reproduit à partir d'une publication précédente13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : La préparation de la vessie sans détrusseur convient à la mesure de la disponibilité des médiateurs dans SubU/LP pendant le remplissage. Chromatogrammes représentatifs démontrant la disponibilité des purines dans les échantillons extraluminal dans les préparations intactes (A) et sans détrusseur (B) de la vessie. Notez que les médiateurs de purine sont mieux détectés dans la préparation dénudée que dans la préparation intacte. (C) La contribution relative des purines individuelles aux bassins de purine détectés dans le lumen et dans SubU/LP de la préparation dénudée est significativement différente. Ce chiffre a été reproduit à partir d'une publication précédente13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : La préparation de la vessie sans détrusseur convient à l'examen du métabolisme et au transport transurothélial des médiateurs pendant le remplissage de la vessie. (A,B) Chromatogrammes représentatifs montrant un substrat d'ATP (Aa,Ba). Lorsque le substrat est appliqué soit sur le SubU/LP (Ab) ou le lumen (Bb) 'ATP a été diminué et les produits 'ADP, 'AMP, et 'ADO ont été augmentés. Par conséquent, le «ATP» est dégradé de part et d'autre de l'application; cependant, la formation de produits 'ATP est asymétrique dans SubU/LP et lumen. Notez que les produits 'ATP 'AMP et 'ADO, mais pas le substrat 'ATP, est apparu sur le côté opposé de l'application 'ATP (Ac,Bc). Par conséquent, les purines semblent être transportées à travers le mur de la préparation sans détruseur pendant le dépôt. Ce chiffre a été modifié à partir de13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Video 1
Vidéo 1 : Enregistrement représentatif du remplissage intact de la vessie. La vessie a été remplie à 15 ans et plus. La vidéo a été enregistrée à l'aide d'un stéréomicroscope zoom avec une caméra couplée chargée (CCD) à 5 Hz; l'enregistrement a été arrêté en atteignant la pression intraluminal de 25 mmHg. La durée complète de l'image est 64x en temps réel. Cette vidéo a été reproduite à partir de13. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).

Video 1
Vidéo 2 : Enregistrement représentatif du remplissage de la vessie sans détrusseur. La vessie a été remplie à 15 ans et plus. La vidéo a été enregistrée à l'aide d'un stéréomicroscope zoom avec une caméra CCD à 5 Hz; l'enregistrement a été arrêté en atteignant la pression intraluminal de Hg de 25 mm. La durée totale de l'image est 64 fois en temps réel. Cette vidéo a été reproduite à partir de13. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).

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Discussion

La vessie a deux fonctions : le stockage et l'annulation de l'urine. Le fonctionnement normal de ces fonctions exige une bonne détection mécanique du volume et de la pression intraluminesses et la transduction des signaux à travers les cellules de la paroi de la vessie pour réguler l'excitabilité musculaire du détruseur. La muqueuse de la vessie (urothélium) est censée réguler l'excitabilité de la vessie en libérant une variété de molécules de signalisation dans le SubU/LP qui affectent de nombreux types de cellules dans la paroi de la vessie. À l'heure actuelle, la plupart des tentatives de caractérisation des médiateurs dérivés de l'urothélium impliquent l'utilisation de préparations de la vessie (p. ex., feuilles plates de la paroi de la vessie, bandes de paroi vésicale ou cellules cultivées) qui ne reproduisent pas le remplissage physiologique de la vessie. Les mesures des médiateurs qui sont libérés dans le lumen de réservoir souple à l'extrémité du remplissage de réservoir souple sont fréquemment employées comme indication pour libérer ces médiateurs du côté opposé de l'urothelium. Cependant, des études récentes suggèrent que le contenu intra-luminal des médiateurs n'est pas représentatif de ce qui est disponible profondément dans la paroi de la vessie13. De nouvelles approches expérimentales permettant l'accès à SubU/LP pendant le remplissage de la vessie sont nécessaires pour mieux comprendre les mécanismes locaux de signalisation entre l'urothélium vésical, le SubU/LP et le DSM.

Ici, nous démontrons un nouveau modèle de vessie animale dans lequel le muscle detrusor est enlevé pour fournir un accès direct aux médiateurs libérés de l'urothelium dans SubU/LP pendant le remplissage13. La préparation dénudée ressemble étroitement au remplissage de la vessie intacte13,18, suggérant que l'absence du muscle detrusor ne change pas les propriétés mécanosensibles de l'urothélium pendant le remplissage de la vessie. La préparation permet d'effectuer des études de volume de pression sur la vessie en l'absence de signalisation confondante des réflexes de la colonne vertébrale et du muscle detrusor. Par conséquent, les médiateurs libérés dans SubU/LP peuvent être mesurés sans influences systémiques ou contamination provenant d'autres sources. La capacité d'accéder directement au voisinage de SubU/LP à différents volumes et pressions pendant le remplissage de la vessie rend le modèle approprié pour étudier la libération, le métabolisme et le transport transurothélial des médiateurs biologiquement actifs pendant les étapes de stockage et de pré-voiding du remplissage de la vessie.

L'étape la plus critique dans ce protocole est l'enlèvement du muscle lisse detrusor tout en gardant l'urothelium et SubU/LP intact. La procédure est particulièrement simple dans la vessie de souris en raison de la connexion lâche entre le muscle detrusor et SubU/LP. Les préparations ont montré une excellente reproductibilité avec des caractéristiques de volume de pression remarquablement similaires aux vessies intactes13. Le modèle est également faisable dans les vessies de plus grands animaux dans lesquels le muscle detrusor peut être partiellement ou complètement enlevé. Par exemple, nous avons déjà démontré que le modèle peut être reproduit dans la vessie du singe Cynomolgus Macaca fascicularis et démontré que les médiateurs peuvent être mesurés en SubU/LP pendant le remplissage de préparation13.

La limitation potentielle de ce modèle ex vivo est la question même qui est la force de la préparation, en substance, l'absence d'effets systémiques du système nerveux central et la circulation permet un examen approfondi des mécanismes locaux de connectivité muqueuse-détruseur pendant le remplissagede la vessie . Le manque d'effets systémiques est partagé avec de nombreuses approches ex vivo, y compris des feuilles ou des bandes isolées de la paroi de la vessie ou des cellules urothéliales cultivées. Le modèle de vessie sans detrusor, cependant, est supérieur aux approches mentionnées ci-dessus dans la recherche urothelial en ce qu'il permet l'accès direct au SubU/LP dans le cadre du remplissage de la vessie. Par conséquent, l'utilisation de cette approche améliorera la compréhension des mécanismes mécanosensibles de mécanotransduction qui proviennent de l'urothelium pendant le remplissage de la vessie.

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Disclosures

Certaines parties de ces travaux ont déjà été publiées dans le Journal of Physiology (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Wiley and Sons, Inc. a accordé l'autorisation d'utiliser des documents de cette publication. Les auteurs n'ont aucun conflit financier ou autre à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grant DK41315.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2 Fisher C79 Source flexible
Dextrose Fisher D16 Source flexible
Dissecting pins Fine Science Tools 26002-20 Source flexible
Infusion Pump Kent Scientific GenieTouch Source flexible
KCl Fisher P217 Source flexible
KH2PO4 Fisher P284 Source flexible
Light source SCHOTT ACEI Source flexible
Microscope Olympus SZX7 Flexible to use any scope
MgCl2 Fisher M33 Source flexible
NaCl Fisher S671 Source flexible
NaHCO3 Fisher S233 Source flexible
Needles 25G Becton Dickinson 305122 Source flexible
Organ bath Custom made Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing Intramedic 427405 Source flexible
Pressure transducer AD instrument Source flexible
S&T Forceps Fine Science Tools 00632-11 Source flexible
Software pressure-volume AD Instruments Power lab
Suture Nylon, 6-0 AD surgical S-N618R13 Source flexible
Suture Silk, 6-0 Deknatel via Braintree Scientific, Inc. 07J1500190 Source flexible
Syringes 1 mL Becton Dickinson 309602 Source flexible
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Source flexible
Water circulator Baxter K-MOD 100 Source flexible

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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