मल्टीकोशियलर त्रि-आयामी स्फेरॉइड पैदा करने के लिए लैब-ऑन-ए-सीडी प्लेटफॉर्म

Bioengineering

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Summary

हम एक मोटर संचालित अपकेंद्रित्र माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस पेश करते हैं जो सेल स्फेरॉइड की खेती कर सकता है। इस डिवाइस का उपयोग करके, एकल या कई सेल प्रकारों के स्फेरॉइड को उच्च गुरुत्वाकर्षण स्थितियों के तहत आसानी से सहसंस्कारित किया जा सकता है।

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Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee, J. C., Park, J. Y. Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids. J. Vis. Exp. (153), e60399, doi:10.3791/60399 (2019).

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Abstract

एक त्रि-आयामी स्फेरॉइड सेल संस्कृति सेल प्रयोगों में अधिक उपयोगी परिणाम प्राप्त कर सकती है क्योंकि यह दो-आयामी कोशिका संस्कृति की तुलना में जीवित शरीर के सेल माइक्रोवातावरण को बेहतर ढंग से अनुकरण कर सकती है। इस अध्ययन में, हमने एक इलेक्ट्रिकल मोटर-ड्रिवेन लैब-ऑन-ए-सीडी (कॉम्पैक्ट डिस्क) प्लेटफॉर्म बनाया, जिसे एक अपकेंद्रित्र माइक्रोफ्लूइडिक आधारित स्फेरॉइड (सीएमएस) संस्कृति प्रणाली कहा जाता है, जो उच्च अपकेंद्रित्र बल को लागू करने वाले त्रि-आयामी (3डी) सेल स्फेरॉइड बनाने के लिए है। यह डिवाइस 1 x g से 521 x ग्रामतक गुरुत्वाकर्षण स्थितियों को उत्पन्न करने के लिए रोटेशन गति भिन्न हो सकती है। सीएमएस प्रणाली व्यास में 6 सेमी है, एक सौ 400 माइक्रोवेल्स है, और एक कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण मशीन द्वारा प्रीमेड पॉलीकार्बोनेट मोल्ड में पॉलीडिमिथाइलसिलिक्सान के साथ मोल्डिंग द्वारा बनाया जाता है। सीएमएस प्रणाली के चैनल प्रवेश द्वार पर एक बाधा दीवार चिप के अंदर समान रूप से कोशिकाओं को फैलाने के लिए अपकेंद्रित्र बल का उपयोग करता है । चैनल के अंत में, एक स्लाइड क्षेत्र है जो कोशिकाओं को माइक्रोवेल्स में प्रवेश करने की अनुमति देता है। एक प्रदर्शन के रूप में, स्फेरॉइड प्रणाली का उपयोग करके उच्च गुरुत्वाकर्षण स्थितियों के तहत मानव एडीपोव-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं और मानव फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट की मोनोकल्चर और सहसंस्कृति द्वारा उत्पन्न किए गए थे। सीएमएस प्रणाली ने गाढ़ा, जानस और सैंडविच की विभिन्न संरचनाओं के सहसंस्कृति स्फेरॉइड का उत्पादन करने के लिए एक सरल ऑपरेशन योजना का उपयोग किया। सीएमएस प्रणाली सेल जीव विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग अध्ययन में उपयोगी होगी जिसमें एकल या कई सेल प्रकारों की स्फेरॉइड और ऑर्गेनॉइड संस्कृति की आवश्यकता होती है।

Introduction

दो आयामी (2डी) सेल संस्कृति (जैसे, पारंपरिक पेट्री डिश सेल संस्कृति) के साथ त्रि-आयामी (3 डी) स्फेरॉइड सेल संस्कृति के साथ वीवो माइक्रोवातावरण में जैविक अनुकरण करना आसान है ताकि अधिक शारीरिक यथार्थवादी प्रयोगात्मक उत्पादन किया जा सके परिणाम1. वर्तमान में उपलब्ध स्फेरॉइड गठन विधियों में हैंगिंग ड्रॉप तकनीक2,तरल ओवरले तकनीक3,कार्बोक्सिमेथिल सेल्यूलोज तकनीक4,चुंबकीय बल आधारित माइक्रोफ्लूइडिक तकनीक5,और उपयोग शामिल हैं बायोरिएक्टर6. यद्यपि प्रत्येक विधि के अपने लाभ हैं, प्रजनन क्षमता, उत्पादकता और सहसंस्कृति स्फेरॉइड पैदा करने में और सुधार आवश्यक है। उदाहरण के लिए, जबकि चुंबकीय बल आधारित माइक्रोफ्लूइडिक तकनीक5 अपेक्षाकृत सस्ती है, जीवित कोशिकाओं पर मजबूत चुंबकीय क्षेत्रों के प्रभाव ों पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। विशेष रूप से मेसेनचिमल स्टेम सेल भेदभाव और प्रसार के अध्ययन में स्फेरॉइड संस्कृति केलाभोंकी जानकारी कई अध्ययनों7,8,9में दी गई है ।

अपकेंद्रित्र माइक्रोफ्लूइडिक प्रणाली, जिसे लैब-ऑन-ए-सीडी (कॉम्पैक्ट डिस्क) के रूप में भी जाना जाता है, आसानी से तरल पदार्थ को अंदर नियंत्रित करने और सब्सट्रेट के रोटेशन का शोषण करने के लिए उपयोगी है और इस प्रकार इम्यूनोअस10जैसे जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में उपयोग किया गया है, बायोकेमिकल मार्कर11,न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन (पीसीआर) परख, स्वचालित रक्त विश्लेषण प्रणाली12,और सभी में एक अपकेंद्रित्र माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों13का पता लगाने के लिए रंगीन परख । द्रव को नियंत्रित करने वाला प्रेरक बल रोटेशन द्वारा बनाया गया सेंटीपेटल बल है। इसके अतिरिक्त, मिश्रण, वाल्विंग और नमूना बंटवारे के कई कार्य इस एकल सीडी मंच में बस किए जा सकते हैं। हालांकि, उपर्युक्त जैव रासायनिक विश्लेषण विधियों की तुलना में, संस्कृति कोशिकाओं, विशेष रूप से स्फेरॉइड14पर सीडी प्लेटफार्मों को लागू करने वाले कम परीक्षण हुए हैं।

इस अध्ययन में, हम मानव एडीपोव-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एचएससी) और मानव फेफड़े के फाइब्रोब्लास्ट (एमआरसी-5) की मोनोकल्चर या सहसंस्कृति द्वारा अपेंडिफ्यूगल माइक्रोफ्लूइडिक आधारित स्फेरॉइड (सीएमएस) प्रणाली के प्रदर्शन को दिखाते हैं। यह पत्र विस्तार से हमारे समूह की अनुसंधान पद्धति15का वर्णन करता है । इस प्रकार, स्फेरॉइड कल्चर लैब-ऑन-ए-सीडी प्लेटफॉर्म को आसानी से पुन: पेश किया जा सकता है। एक सीएमएस जनरेटिंग प्रणाली जिसमें एक सीएमएस संस्कृति चिप, एक चिप धारक, एक डीसी मोटर, एक मोटर माउंट, और एक घूर्णन मंच शामिल है, प्रस्तुत किया जाता है । मोटर माउंट acrylonitrile butadiene styrene (ABS) के साथ मुद्रित 3 डी है । चिप धारक और घूर्णन मंच सीएनसी (कंप्यूटर न्यूमेरिकल कंट्रोल) पीसी (पॉलीकार्बोनेट) के साथ मशीनी हैं। पल्स-चौड़ाई मॉड्यूलेशन के आधार पर पीआईडी (आनुपातिक-अभिन्न-व्युत्पन्न) एल्गोरिदम को एन्कोडिंग करके मोटर की घूर्णन गति को 200 से 4,500 आरपीएम तक नियंत्रित किया जाता है। इसके आयाम 100 मिमी x 100 मिमी x 150 मिमी हैं और इसका वजन 860 ग्राम है, जिससे इसे संभालना आसान हो जाता है। सीएमएस प्रणाली का उपयोग करके, स्फेरॉइड विभिन्न गुरुत्वाकर्षण स्थितियों के तहत 1 x g से 521 x ग्रामतक उत्पन्न किए जा सकते हैं, इसलिए उच्च गुरुत्वाकर्षण के तहत सेल भेदभाव संवर्धन का अध्ययन 2डी कोशिकाओं16,17 से 3 डी तक बढ़ाया जा सकता है स्फेरॉइड। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का सहसंस्कृति भी वीवो पर्यावरण18में प्रभावी ढंग से नकल करने के लिए एक प्रमुख तकनीक है । सीएमएस प्रणाली आसानी से मोनोकल्चर स्फेरॉइड, साथ ही विभिन्न संरचना प्रकारों (जैसे, गाढ़ा, जानस और सैंडविच) के सहसंस्कृति स्फेरॉइड उत्पन्न कर सकती है। सीएमएस प्रणाली का उपयोग मानव अंग संरचनाओं पर विचार करने के लिए न केवल सरल स्फेरॉइड अध्ययनों में बल्कि 3डी ऑर्गेनॉइड अध्ययनों में भी किया जा सकता है।

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Protocol

1. सेंट्रलिफ्यूगल माइक्रोफ्लूइडिक आधारित स्फेरॉइड (सीएमएस) कल्चर चिप फैब्रिकेशन

  1. सीएनसी मशीनिंग द्वारा सीएमएस संस्कृति चिप के ऊपर और नीचे की परतों के लिए पीसी मोल्ड बनाएं। चिप के विस्तृत आयाम चित्र 1में दिए गए हैं ।
  2. 5 मिन के लिए 10:1 (डब्ल्यू/डब्ल्यू) के अनुपात में पीडीएम बेस और पीडीएम क्यूरिंग एजेंट को मिलाएं और हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 1 घंटे के लिए एक डिसिकेटर में रखें ।
  3. सीएमएस संस्कृति चिप के सांचों में पीडीएम मिश्रण डालने के बाद, 1 घंटे अधिक के लिए हवा के बुलबुले निकालें और 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी कक्ष में इलाज करें।
  4. उन्हें सतहों के साथ वैक्यूमप्लाज क्लीनर में रखें ताकि उन्हें 30 एस के लिए 18 डब्ल्यू की शक्ति पर हवा में सहायता प्राप्त प्लाज्मा में बेनकाब किया जा सके।
  5. सीएमएस कल्चर चिप की दो परतों को बांधें और आसंजन शक्ति बढ़ाने के लिए 30 न्यूनतम के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर हीट चैंबर में रखें।
  6. सीएमएस कल्चर चिप को 121 डिग्री सेल्सियस और 15 साई पर ऑटोक्लेव स्टरलाइजर में स्टरलाइज करें।

2. सेल तैयारी

  1. 2 मिन के लिए 36.5 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 5 × 105-1 × 106 hASCs या MRC-5s कोशिकाओं वाली शीशी के 1 mL गल।
  2. एक शीशी में Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM) के 1 mL जोड़ें और धीरे से एक १,००० μL पिपेट के साथ मिश्रण ।
  3. डीएमईएम के 15 मिलील को पिपेट का उपयोग करके 150 मिमी व्यास पेट्री डिश में 36.5 डिग्री सेल्सियस तक रखें और शीशी से कोशिकाओं को जोड़ें।
  4. 1 दिन के बाद, डीएमईएम को एस्पिरेट करें और ताजा डीएमईएम के 15 एमएल के साथ बदलें। इसके बाद हर 2 या 3 दिन में मीडिया बदलें।
  5. पेट्री डिश से कोशिकाओं को अलग करने के लिए, पेट्री व्यंजनों में ट्राइप्सिन के 4 मिलील जोड़ें और उन्हें 36.5 डिग्री सेल्सियस और 4 मिन के लिए 5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में रखें।

3. मोनोकल्चर स्फेरॉइड गठन

  1. सीएमएस कल्चर चिप(चित्रा 2A)के इनलेट होल में 4% (w/v) प्लोरोनिक एफ-127 समाधान के 2.5 mL रखो, जबकि 500-1,000 आरपीएम पर चिप घूर्णन और फिर सीएमएस प्रणाली(चित्रा 2B)का उपयोग कर 3 मिन के लिए 4,000 आरपीएम पर चिप घुमाएं।
    नोट: प्लुरोनिक कोटिंग इनलेट पोर्ट के लिए सेल लगाव को रोकता है, जबकि चिप घूमता है । सुनिश्चित करें कि हवा माइक्रोवेल्स में नहीं फंसी है।
  2. सीएमएस संस्कृति चिप 5% सीओ2में 36.5 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्लूरोनिक समाधान से भरा इनक्यूबेट ।
  3. प्लोनिक समाधान निकालें, डीएमईएम के साथ शेष प्लोनिक समाधान को धोएं, और एक साफ बेंच पर 12 घंटे के लिए चिप को सुखालें।
  4. सीएमएस संस्कृति चिप के लिए DMEM के २.५ mL जोड़ें और चिप के अंदर prewetting के लिए 3 मिन के लिए ~४,००० आरपीएम पर चिप घुमाएं ।
  5. रोटेशन बंद करो और सेल निलंबन इंजेक्शन के लिए जगह बनाने के लिए DMEM के १०० μL बाहर खींच ।
  6. सेल निलंबन के 100 μL जोड़ें जिसमें या तो 5 × 105 एचएससी या 8 × 105 MRC-5s होते हैं, जो पुनर्सस्पेंशन के लिए 3-5x पाइपिंग करके कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करते हैं।
  7. 3 मिन के लिए 3,000 आरपीएम पर चिप घुमाएं ताकि प्रत्येक माइक्रोवेल में कोशिकाओं को सेंट्रलाइज बल द्वारा ट्रैप किया जा सके।
    नोट: अत्यधिक घूर्णन गति समाधान इंजेक्शन छेद के माध्यम से सेल भागने का कारण बन सकती है।
  8. इनक्यूबेटर में 3 दिनों के लिए कोशिकाओं को 36.5 डिग्री सेल्सियस, और 95% आर्द्रता, और 5% सीओ2,1,000-2,000 आरपीएम पर घूर्णन करें। हर दिन संस्कृति माध्यम बदलें।

4. कोकल्चर स्फेरॉइड गठन

  1. गाढ़ा स्फेरॉइड गठन
    1. पहली कोशिकाओं, 2.5 × 105 hASCs जोड़ें, और 3,000 आरपीएम पर चिप घुमाएं। 3 मिन के बाद दूसरी कोशिकाओं, 4 ×105 एमआरसी-5एस जोड़ें और चिप को 3 मिन के लिए 3,000 आरपीएम पर घुमाएं। पाइपिंग द्वारा कुल 100 माइक्रोन सेल निलंबन का इंजेक्शन दें। जब कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है, तो घूर्णन गति को 500-1,000 आरपीएम में स्थानांतरित करें।
    2. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 36.5 डिग्री सेल्सियस, और 95% आर्द्रता%, और 5% सीओ2 को 1,000-2,000 आरपीएम पर घुमाकर संस्कृति करें। गाढ़ा स्फेरॉइड 24 घंटे के भीतर बनाए जाते हैं। लंबी अवधि की संस्कृति के लिए हर दिन संस्कृति माध्यम बदलें।
  2. जानस स्फेरॉइड गठन
    1. पहली कोशिकाओं वाले सेल निलंबन के 100 माइक्रोन जोड़ें, 2.5 × 105 एचएसएसी, पाइपिंग द्वारा, जबकि चिप 500-1,000 आरपीएम पर घूमती है। इसके बाद 3,000 आरपीएम पर 3,000 आरपीएम पर 3 मिन के लिए चिप घुमाएं।
    2. चिप को 36.5 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता और 5% सीओ2 पर 3 घंटे के लिए 1,000-2,000 आरपीएम पर घुमाकर इनक्यूबेट करें।
    3. कोशिकाओं के दूसरे सेट, 4 × 105 MRC-5s युक्त सेल निलंबन के 100 μL जोड़ें, पाइपिंग द्वारा, जबकि चिप 500-1,000 आरपीएम पर घूमता है। इसके बाद 3,000 आरपीएम पर 3,000 आरपीएम पर 3 मिन के लिए चिप घुमाएं।
    4. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 36.5 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता और 5% सीओ2 को 1,000-2,000 आरपीएम पर घुमाकर संस्कृति करें। जानस स्फेरॉइड 24 घंटे के भीतर बनाए जाते हैं। लंबी अवधि की संस्कृति के लिए हर दिन संस्कृति माध्यम बदलें।
  3. सैंडविच स्फेरॉइड गठन
    1. पहली कोशिकाओं वाले सेल निलंबन के 100 माइक्रोन जोड़ें, 1.5 × 105 एचएसएसी, पाइपिंग द्वारा, जबकि चिप 500-1,000 आरपीएम पर घूमती है। इसके बाद 3,000 आरपीएम पर 3,000 आरपीएम पर 3 मिन के लिए चिप घुमाएं।
    2. चिप को 36.5 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता और 5% सीओ2 पर 3 घंटे के लिए 1,000-2,000 आरपीएम पर घुमाकर इनक्यूबेट करें।
    3. दूसरी कोशिकाओं वाले सेल निलंबन के 100 माइक्रोन जोड़ें, 3 × 105 MRC-5s, पाइपिंग द्वारा, जबकि चिप 500-1,000 आरपीएम पर घूमती है। इसके बाद 3,000 आरपीएम पर 3,000 आरपीएम पर 3 मिन के लिए चिप घुमाएं।
    4. चिप को 3 6.5 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता% और 5% सीओ2 पर 3 घंटे के लिए 1,000-2,000 आरपीएम पर घुमाकर इनक्यूबेट करें।
    5. तीसरी कोशिकाओं वाले सेल निलंबन के 100 माइक्रोन जोड़ें, 1.5 × 105 एचएसएसी, पाइपिंग करके, जबकि चिप 500-1,000 आरपीएम पर घूमती है। इसके बाद 3,000 आरपीएम पर 3,000 आरपीएम पर 3 मिन के लिए चिप घुमाएं।
    6. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 36.5 डिग्री सेल्सियस, और 95% आर्द्रता%, और 5% सीओ2 को 1,000-2,000 आरपीएम पर घुमाकर संस्कृति करें। सैंडविच स्फेरॉइड 12 घंटे के भीतर बनाए जाते हैं। लंबी अवधि की संस्कृति के लिए हर दिन संस्कृति माध्यम बदलें।

5. सेल धुंधला

  1. कमरे के तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेल फ्लोरेसेंस डाया गर्म करें।
  2. 1 एमएम समाधान बनाने के लिए प्रति शीशी निर्जल डाइमेथिलसल्फाक्साइड (डीएमएसओ) के 20 माइक्रोन जोड़ें।
  3. डीएमईएम का उपयोग करके 1 माइक्रोन की अंतिम कार्य एकाग्रता के लिए फ्लोरेसेंस को पतला करें।
  4. सेल निलंबन के लिए फ्लोरेसेंस जोड़ें और धीरे से एक पिपेट का उपयोग कर फिर से निलंबित।
  5. इनक्यूबेट 20 मिन पर 36.5 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता और 95%, और 5% सीओ2.

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Representative Results

उपरोक्त प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 6 सेमी व्यास सीएमएस कल्चर चिप(चित्रा 2)सफलतापूर्वक बनाई गई थी। पहले, चिप एक शीर्ष परत और एक नीचे परत से अलग से बनाया गया था और फिर प्लाज्मा संबंध द्वारा एक साथ बंधुआ । जिसके परिणामस्वरूप स्फेरॉइड आसानी से चिप को अलग करके इकट्ठा किया जा सकता है। सीएमएस संस्कृति चिप के चैनल में एक इनलेट पोर्ट और सेंट्रल, स्लाइड और माइक्रोवेल क्षेत्र(चित्रा 3)शामिल हैं। सेल, मध्यम और प्लोरोनिक समाधान 5 मिमी व्यास के साथ एक इनलेट छेद के माध्यम से इंजेक्ट किए जाते हैं। इंजेक्शन कोशिकाओं को समान रूप से इनलेट बंदरगाह क्षेत्र में 3-5x पुनर्निलंबन द्वारा वितरित किया जाता है। कोशिकाओं को मध्य क्षेत्र में अपकेंद्रित्र बल के अधीन किया जाता है और बाहरी रूप से फैलता है। क्योंकि मध्य क्षेत्र माइक्रोवेल की तुलना में अधिक है, इसमें अधिक मीडिया हो सकता है, जिससे स्फेरॉइड लंबे समय तक जीवित रह सकते हैं। माइक्रोवेल की ऊंचाई 0.4 मिमी है और मध्य क्षेत्र की ऊंचाई 1.5 मिमी है। आंतरिक समाधानों को आसानी से हटाने के लिए केंद्रीय क्षेत्र के केंद्र में सक्शन छेद मौजूद हैं। स्लाइड क्षेत्र मध्य क्षेत्र और माइक्रोवेल क्षेत्र को जोड़ने वाला एक ढलान वाला क्षेत्र है। कोशिकाएं 45 डिग्री ढलान के साथ जाती हैं और माइक्रोवेल क्षेत्र में बसजाती हैं, जहां कोशिकाएं स्फेरॉइड बनाने के लिए व्यवस्थित, बढ़ती और उलझन में होती हैं। चिप के केंद्र से 14 मिमी स्थित माइक्रोवेल्स 400 माइक्रोन की ऊंचाई और 400 माइक्रोन के व्यास के साथ अर्धचक्रीय हैं। 100 माइक्रोवेल में एक साथ कुल 100 स्फेरॉइड जेनरेट किए जा सकते हैं।

तैयार सीएमएस चिप का उपयोग करके, प्रोटोकॉल(चित्रा 4)में दिखाए गए क्रम में स्फेरॉइड उत्पन्न किए जा सकते हैं। एचएएससी और एमआरसी-5 कोशिकाओं के साथ मोनोकल्चर और कोकल्चर स्फेरॉइड उत्पन्न किए गए थे। प्रत्येक प्रकार की कोशिका का मोनोकल्चर स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए, 5 × 105 एचएससी या 8 × 105 एमआरसी-5एस इंजेक्शन लगाए गए थे। इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या कोशिका आकार से स्वतंत्र थी । कोशिकाओं के दोनों प्रकार के समय चूक छवियों सेल संस्कृति के दिन 3 तक २,००० आरपीएम पर लिया गया(चित्र 5)। एचसी और एमआरसी-5एस के सहसंस्कृति स्फेरॉइड भी गाढ़ा, जानस और सैंडविच संरचनाओं के साथ उत्पन्न किए गए थे। गाढ़ा स्फेरॉइड बनाने के लिए, पहली कोशिकाओं (2.5 × 105 एचएससी) इंजेक्शन थे और दूसरी कोशिकाओं (4 × 105 MRC-5s) को बाद में 3 मिन इंजेक्शन दिया गया था(चित्रा 6A)। जब पहली कोशिकाओं को इंजेक्ट किया गया, तो वे उच्च गुरुत्वाकर्षण के कारण यू-आकार के हो गए, और जब दूसरी कोशिकाओं को इंजेक्शन दिया गया, तो वे यू-आकार के बीच में चले गए। समय के साथ, पहली यू-आकार कोशिकाओं ने दूसरी कोशिकाओं को घेर लिया और गाढ़ा स्फेरॉइड पूरा किया। जानस स्फेरॉइड बनाने के लिए, पहली कोशिकाओं (2.5 × 105 एचएससी) इंजेक्शन थे, और दूसरी कोशिकाओं (4 × 105 MRC-5s) 3 घंटे बाद इंजेक्शन दिया गया(चित्रा 6B)। जब दोनों कोशिकाओं के बीच इंजेक्शन अंतराल लंबा था, तो पहली कोशिकाओं का आकार यू-आकार से कोशिका एकत्रीकरण द्वारा एक अंडाकार आकार में बदल गया। एक बार जब दूसरी कोशिकाओं को पहली कोशिकाओं के अंडाकार आकार में जोड़ा गया, तो जानस स्फेरॉइड उत्पन्न हुए। सैंडविच स्फेरॉइड के मामले में, पहली कोशिकाओं (1.5 × 105 एचएससी) इंजेक्शन थे, दूसरी कोशिकाओं (3 × 105 MRC-5s) 3 घंटे बाद इंजेक्शन थे, और तीसरी कोशिकाओं (1.5 × 105 hASCs) एक और 3 घंटे (चित्रा 6C) के बाद इंजेक्शन दिया गया ). जानस स्फेरॉइड के समान, प्रत्येक कोशिका एक अंडाकार आकार में एकत्रित होती है, और सैंडविच स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए खड़ी तीन परतें। अंत में, सीएमएस की दीर्घकालिक संस्कृति क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, HASCs सुसंस्कृत थे, 7 दिनों के लिए उच्च गुरुत्वाकर्षण के संपर्क में एक जीवित/मृत परख के बाद दिखाने के लिए कि ज्यादातर कोशिकाओं बच(चित्र7)। इसके अलावा, सीएमएस के सभी माइक्रोवेल्स की तस्वीरें एमआरसी-5s खेती के 3 दिनों के बाद उत्कृष्ट एकरूपता और स्फेरॉइड(चित्रा 8)की स्थीरी दिखाने के लिए ली गई थीं ।

Figure 1
चित्रा 1: एक सीएमएस संस्कृति चिप के ऊपर और नीचे परतों के आयाम । पीसी मोल्ड एक सीएनसी मशीन का उपयोग कर बनाया गया था और PDMS के साथ दोहराया एक सीएमएस संस्कृति चिप बनाने के लिए एक 3 डी सीएडी (कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन) कार्यक्रम द्वारा बनाई गई ड्राइंग के आधार पर । ऊपर और नीचे की परतों के किनारों पर चार सर्कल दो परतों को संरेखित करने के लिए हैं। आयाम मिलीमीटर में हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सीएमएस प्रणाली की तस्वीरें। }पूरा सीएमएस कल्चर चिप की तस्वीरें । चिप का व्यास 6 सेमी और माइक्रोवेल का व्यास 400 माइक्रोमीटर है। माइक्रोवेल्स के ऊपर की संख्या 1 से 100 तक माइक्रोवेल्स की व्यक्तिगत संख्या ओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन नंबरों को सांचे में उत्कीर्ण किया गया था । स्केल बार = 400 माइक्रोन। (ख)पूरे सीएमएस सिस्टम की तस्वीर । सीएमएस सिस्टम में सीएमएस कल्चर चिप, चिप होल्डर, डीसी मोटर और घूर्णन मंच शामिल हैं। सीएमएस उपकरण घूर्णन बल के माध्यम से 521 x ग्राम तक गुरुत्वाकर्षण स्थितियां उत्पन्न कर सकते हैं। चिप धारक उच्च गुरुत्वाकर्षण के कारण सीएमएस कल्चर चिप को अलग होने से रोकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सीएमएस के चैनल घटक। (A)योजनाबद्ध छवियां और(बी)सीएमएस संस्कृति चिप के एक क्रॉस-सेक्शन की तस्वीरें । सीएमएस संस्कृति चिप में एक इनलेट पोर्ट और सेंट्रल, स्लाइड और माइक्रोवेल क्षेत्र होते हैं। क्योंकि इंजेक्शन कोशिकाओं को कम से कम १,००० आरपीएम की घूर्णन गति से बाधा के माध्यम से पारित नहीं करते हैं, बाधा सेल के पुनर्निलंबन और यहां तक कि माइक्रोवेल के लिए वितरण में मदद करता है । स्केल बार = 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सीएमएस संस्कृति चिप में कोशिकाओं को लोड करने की प्रक्रिया। (A)कोशिकाओं को चिप के नीचे से चिपके रहने से रोकने के लिए, 4,000 आरपीएम पर प्लोरोनिक एफ-127 समाधान के 2.5 मिलीलीटर के साथ कोट करें। कोटिंग लागू होने के लिए एक दिन इंतजार करें। (ख)प्लोरोनिक सॉल्यूशन निकालें और डीएमईएम मीडियम के 2.5 mL के साथ चैनल को प्रीफिल करें। }डीएमईएम के 100 माइक्रोन निकालें और सेल सस्पेंशन के 100 माइक्रोन जोड़ें। इस समय, 3-5x को फिर से निलंबित करें ताकि कोशिकाओं को समान रूप से वितरित किया जा सके। (D)चिप घुमाकर कोशिकाओं को माइक्रोवेल में ले जाएं, और फिर कोशिकाओं को 1,000 से 2,000 आरपीएम पर 3 दिनों के लिए संस्कृति दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एचएससी और एमआरसी-5 कोशिकाओं के मोनोकल्चर स्फेरॉइड की समय-चूक तस्वीर। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 2,000 आरपीएम पर उगाया गया था। स्फेरॉइड 24 घंटे स्केल बार = 400 माइक्रोन के भीतर उत्पन्न किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र6: सहसंस्कृति स्फेरॉइड की फ्लोरेसेंस छवियां। (A)गाढ़ा स्फेरॉइड आकार जिसमें एचएससी कोशिकाएं (हरी) एमआरसी-5 कोशिकाओं (लाल) को घेरती हैं। (ख)जानस स्फेरॉइड आकार जिसमें दो कोशिकाएं सममित होती हैं। (ग)सैंडविच स्फेरॉइड आकार जिसमें एचएससी परतें दो एमआरसी-5 परतों के बीच खड़ी होती हैं। स्केल बार = 400 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: 7 दिन पर HASC के लाइव/मृत परख । हरा फ्लोरोसेंट रंग जीवित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है और लाल फ्लोरोसेंट रंग मृत कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 400 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: 3 दिन पर MRC-5 स्फेरॉइड । कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत निरंतर संख्या प्रत्येक माइक्रोवेल में प्रवेश करती है और सीएमएस प्रणाली में अपेक्षाकृत निरंतर स्हेरिसिटी वाले स्फेरॉइड बनाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्र9: हार्वेस्टिंग स्फेरॉइड। संस्कारी स्फेरॉइड को सीएमएस कल्चर चिप की दो परतों को विभाजित करके काटा जा सकता है। दो प्लाज्मा बंधुआ परतों को आसानी से हाथ से अलग किया जा सकता है। फिर स्फेरॉइड को नीचे की परत में माइक्रोवेल्स से बस पाइपिंग द्वारा एकत्र किया जाता है। स्केल बार = 400 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सीएमएस एक बंद प्रणाली है जिसमें सभी इंजेक्शन कोशिकाओं कचरे के बिना माइक्रोवेल में प्रवेश, यह पारंपरिक माइक्रोवेल आधारित स्फेरॉइड उत्पादन तरीकों की तुलना में अधिक कुशल और किफायती बना रही है । सीएमएस सिस्टम में चिप(चित्रा 3ए)में मीडिया को हटाने के लिए बनाए गए सक्शन होल के जरिए मीडिया को हर 12-24 एच में बदल दिया जाता है । मीडिया सक्शन प्रक्रिया के दौरान, मीडिया और माइक्रोवेल की दीवार के बीच सतह तनाव के कारण बमुश्किल कोई मीडिया माइक्रोवेल के अंदर से बच जाता है । एक यूजर चिप के माइक्रोवेल क्षेत्र के पास उंगली से दबाकर फंसी मीडिया को आसानी से हटा सकता है, क्योंकि पीडीएम से बनी चिप लोचदार और लचीली होती है। माइक्रोवेल में कोशिकाएं बचने के बिना स्थिर रहती हैं, यहां तक कि कई मीडिया परिवर्तनों के साथ भी। सभी 100 माइक्रोवेल्स में स्फेरॉइड की एक ही गुणवत्ता को प्राप्त करने के लिए, डिवाइस का घूर्णन सनकी नहीं होना चाहिए, और चिप स्वयंसमहोना चाहिए। अन्यथा, कोशिकाओं की एक चर संख्या प्रत्येक अच्छी तरह से प्रवेश कर सकती है और स्फेरॉइड का आकार और आकार अलग हो सकता है। पारंपरिक माइक्रोवेल सिस्टम में, क्योंकि हवा अक्सर माइक्रोवेल में फंस जाती है, हवा के बुलबुले को हटाना आवश्यक है। हालांकि, सीएमएस सिस्टम को बुलबुला हटाने की प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं होती है क्योंकि रोटेशन द्वारा उत्पन्न उच्च अपकेंद्रित्र बल मीडिया को बुलबुले को धक्का देने और उन्हें माइक्रोवेल्स से निचोड़ने का कारण बनता है।

सीएमएस प्रणाली भी पारंपरिक तरीकों की तुलना में अपनी सीमाएं हैं। सीएमएस प्रणाली के लिए एक बड़ी संस्कृति स्थान (जैसे, बड़े इनक्यूबेटर स्पेस) की आवश्यकता होती है क्योंकि इसमें एक मोटर, घूर्णन मंच और एक नियंत्रक शामिल है, और इसका कुल आकार लगभग 100 मिमी x 100 मिमी x 150 मिमी(चित्रा 2 बी)है। इसके अलावा, यह मामूली लेकिन लगातार कंपन का कारण बनता है। हम उम्मीद करते हैं कि सिस्टम का लघुकरण (उम्मीद है कि 6 अच्छी प्लेटों के आकार के समान) इन मुद्दों को हल करेगा।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संस्कारी स्फेरॉइड को सीएमएस सिस्टम(चित्रा 9)की दो प्लाज्मा-बंधुआ परतों को अलग करके एकत्र किया जा सकता है। सिस्टम ऑपरेशन के दौरान मीडिया को लीक होने से रोकने के लिए दोनों परतों की बॉन्डिंग काफी मजबूत होती है। हालांकि, छोटे बॉन्डिंग क्षेत्र के कारण, यह हाथ से विभाज्य है। स्फेरॉइड को पाइपिंग द्वारा नीचे की परत से एकत्र किया जा सकता है।

सीएमएस प्रणाली में स्फेरॉइड उत्पादन के पारंपरिक तरीकों की तुलना में बेहतर प्रजनन क्षमता और उत्पादकता है। पारंपरिक तरीके, जैसे सामान्य माइक्रोवेल या हैंगिंग ड्रॉपलेट विधियां, श्रम-प्रधान हैं। हालांकि, सीएमएस सिस्टम में, चिप आकार को बढ़ाकर स्फेरॉइड की संख्या बढ़ाना बहुत आसान है। इस डिवाइस के साथ, ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करना भी संभव है जिसके लिए मल्टीसेल प्रकार की संस्कृति की आवश्यकता होती है, जो पारंपरिक संस्कृति विधियों में करना आसान नहीं है। इस अध्ययन (एचएसएससी और एमआरसी-5) में कोशिकाओं के अलावा, सीएमएस का उपयोग विभिन्न अन्य प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग करके स्फेरॉइड उत्पादन के लिए किया जा सकता है जो स्फेरॉइड बना सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को एनआरएफ के बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम (2016आर1D1A1B03934418) और बायो एंड मेडिकल टेक्नोलॉजी डेवलपमेंट प्रोग्राम (2018M3A9H1023141) द्वारा समर्थित किया गया था, और कोरियाई सरकार, एमएसआईटी द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Cubicon 3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) ATCC PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA Thermo Fisher Scientific C2925 10 mM
CellTracker Red CMTPX Thermo Fisher Scientific C34552 10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver Roland DGA EGX-350
DC motor Nurielectricity Inc. MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020 Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5) ATCC CCL-171
Inventor 2019 Autodesk 3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm JetBiofill CAD010150 Surface Treated
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 11/6/9003 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC) Acrylmall AC15PC 200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Trypsin Gibco 12604021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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